本 于病毒 和生物 領域。 休而言， 本 提供 了 F 缺陷 水痘病毒、 含有核病毒的疫苗及其 ， 力水痘 病毒等的預防提供良好的 疫苗 。 木背景

水痘 病毒 ( a ce a zo e V u

"水痘病毒"或 " " )是 特 性的病毒， 是 致 水痘或 的致病因子。 其中 P ka 是由 Takaha h 等于 1 1 在日本 ka姓氏的 男孩的水痘 中分 出未的， 細胞 得的， 被 具有引 水痘和 功能 (Takaha h , uka T kuno e a .L ve Vacc neu ed op even he Sp ead O Va ce a n Ch d en n ho p a. Lance 2 90.) 。

1 中公升了 P ka 胚胎 PE ) 和 細胞多次 ， 戶生 毒的 ka病毒， 各 預防水痘的 ka 疫苗。 中 了用 仟 細胞 病毒1 次生 疫苗。 但迄今 ， 只有 P ka 鉅細胞 得的 "水痘病毒

" (特公9 1 Lance 1 , ) 批准的唯 于預防水痘或 疫苗 各的 ， 各的疫苗在全球得到了 使用 [ equ e en o a ce a acc e L ve) dop ed Techn ca epo e e No. , pp.1 1 , 但是 水痘疫苗接 的 群比水痘自然感染 群的 生率低， 大 兔 功 能低下 ， 但是， 是不爭的事 且 患者的 中分 到 ka ( ch d . , e a. pac O a ce a acc ne O a ce a o e u yna c , L N L B L E E , Jan. 1 p. 2 1 )

N 1 涉及水痘病毒 同 的 且 分子 水平上揭示 是由 不同序列組成的混合 。 可能 存在于其中 于 ka疫苗接 者戶生 ka 的 已 有 。 故核減 的 在危害 近是存在的， 但是， 現在近 有其它預防 的疫苗 上市。 核病毒具有 特 ， 是其唯 的自然宿主 沒有合這的 模型研究 基因功能 再者核病毒 宿主細胞具有 結合性， 的病毒

得可供特化的 病毒 N 非常 ， 故很未 同以未 病毒基 因功能研究的 。

但是， 看細菌 工染 休 B )在研究中的 ， 銀 木的 ， 生物 器官移植屏障的突破 ( 合兔疫缺陷 小鼠的 ， 拓寬了科局特 的 基因功能研究的 同， 可 以在休外或移植到 休 基因功能研究。

azuh o N.等在 on ng O he Va ce a zo te V ugeno e a an n ec ou bac e a a c a Ch o o o e n E che ch a Co 文中揭示 到 B 休上的 ka 全基因 ， 可以在大腸 和 細胞中增殖， B 可 同 到 中的 e 切除， 戶生的重 病毒 具有 p ka 同 完全具有 本病毒的特性。 B 的 用力 的功能研究 未了 大便利， 可以 基因 功能 研究， 速了 基因功能研究的 。 水痘m帝狀疤疹病毒 ( VZV ) 的 ORF7 位于病毒基因組的 8607-9386bp之同，蝙碼 g

占介2 kDa的蛋白，可，刨立于皮居結枸中， 它的功能目前仍不清楚。

本友明人婪迪不懈的研究， 恃奇&友現， ORF7決定看 ZV感染 人皮伕和感覓神努市的功能。 占 ORF7缺陷即友生女下情況之，- ，以及丰 介或多介 ．: 全部或部分缺失、被插入終 密硝子 喊基取代， 特別是奶叭余了 RF7或者 RF7戶生番時告反向移硝突交吋，ORF7的功 能喪失， 即 zv不感染皮肢和感覓神鉅市， 故不存在戶生水痘或再 活化戶生帝狀 疹的潘在危害 (我們在本友明中私之力 oRF7缺陷 引起的功"喪失，所迷功"是指能移感染人的皮� ��和感覓神婪市)。 RF7刪除的水痘病毒沫 (VZV-7D BAC或VZV-7DRM BA ) 可以在大 肋杆茵中迸一、步鉅抗生素篩迭或半乳糖篩迭 (走棟基氏培芥札上戶 生亮虹色斑片早到羊，一文，隆沫，不存于j� �合型 v-ka株的*$在危害， 速力升友更加安全有效的疫苗帝未了希望。 友明內容

本友明的占介方面涉及一神J

Zt(痘病毒 (例 -ka株) ， 其基 因組 RF7全部或部分缺失、 或者才&一介或多介乃戈基取代或插入， 井且刀卜戈的水痘病毒不能移感染人的皮伕和 感覓神銓市。

ORF7 (8607-9386bP) 的序列

ATGCAGACGGTGTG GCT:

TGCCAGCTTATGTGGATAT TCGAATACCAACTGAAGAGCCATCTTATGAAG AGGTGCGTGTAAACACGCACCCCCAAGGAGCCGCCCTGCTCCGCCTCCAAGAGGCTTTAA CCGCTGTGAAT GGATTATTGCCTGCACCTCTAACGTTAGAAGACGTAGTCGCTTCTGCAGATAATACCCGT CGTTTGGTCCG CGCCCAGGCTTTGGCGCGAACTTACGCTGCATGTTCTCGTAACATTGAATGTTTAAAACA GCACCATTTTACTGAAGATAACCCCGGTCTTAACGCCGTGGTCCGTTCACACATGGAAAA CTCAAAACGGCTTGCTGATATG TGTTTAGCTGCAATTACCCATTTGTATTTATCGGTTGGCGCGGTGGATGTTACTACGGAT GATATTGTCGA TCAAACCCTGAGAATGACCGCTGAAAGTGAAGTGGTCATGTCTGATGTTGTTCTTTTGGA GAAAACTCTTG GGGTCGTTGCTAAACCTCAGGCATCGTTTGATGTTTCCCACAACCATGAATTATCTATAG CTAAAGGGGAA AATGTGGGTTTAAAAACATCACCTATTAAATCGGAGGCGACACAATTATCTGAAATTAAA CCCCCACTTAT AGAAGTATCGGATAATAACACATCTAACCTAACAAAAAAAACGTATCCGACAGAAACTCT TCAGCCCGTGT TGACCCCAAAACAGACGCAAGATGTACAACGCACAACCCCCGCGATCAAGAAATCCCATG TTATGCTTGTA TAA ( SEQ ID NO: 1 )

在本友明的．一介奕施方案+，oRF7全部或部分� ��抗生素抗，性基 因和/或者元功能的核酸序列所取 。 所迷元功能的核酸序列是指 ;亥核酸序列不使 oRF7 功能灰夏， 即水痘病毒仍不

核酸序列可以是不編碼融合"感染皮肢和感 覓神銓市， 核元功能的 蛋白的， 也，可以 是編硝蛋白的核酸序列， 只要 「編碼的蛋自不舍使 ORF7功能的恢 夏。 在本友明的一介奕施方案中， 所迷元功

交的 ORF7 片段。

或部"的核酸序列是翻特反 向移硝突

d肖吾 "ORF7 片段 是指ORF7的全部 分核酸序列。

在本友明的一介奕施方案+， 所迷翻特反向移碼突交的 oRF7 片段的序列如SEQ ID NO: 13所示。

在本友明的一 奕施方案中， 所迷抗生素抗，性基因迭自 : 青霉 素、 鏈霉素、 以及卡那霉素的抗性基因。

在 介具休的奕施方式中，友明人以未自力廿旦福 大孚匡孚院D，． Ann Arv卜in奕盼室的 P- ka帖床分萬株力材丰卜 以 VZV-BAC ( - k ) 力框架， 座用細菌同源重組原理戶生重組克隆。 全未 oRF7被Kan 基因取代而戶生VZV-7D BAC株或被翻抬告反向移碼突交的 ORF7部分 片段取代而戶生VZV-7DRM BAC株。 其中， Kan基因的序列如下:

ATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGAT GCTGATT TATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGAT TGTATGGGAAG CCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACA GATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCAT TTTATCCGTACTCCTGATGATG CGTGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGAAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATC CTGATTCAGGT GAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGT AATTGTCCTTT TAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTTGT TGATGCGAGTG ATTTTGATGACGAGCATAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAAC TTTTGCCATTC T T T T T T T TT T T E N

休 ， 本 提供 水痘病毒， 其保藏 M O. ， 休 日期 ， 保藏羊 是中 微生物 神保藏管理委 普通微生物中

休 外 核病毒 不感染 和 兇神 故 可 能不存在 水痘或再活化戶生 的 在危害 可在

Me O、 或 PE細胞上生長， 且同 P ka 未特 致， 且也沒有 病毒在胸腺 坎的生未增殖特 留了 P ka 的所有 自 其兔 性理 同 P ka 的兔疫力相同 是通 an 或 乳糖 羊 克 ， 不存于混合 ka 的 在危害 由于 刪除 或以 特反向 ， B 或 B 不可能戶生 ， 因而， 以 B 或 B 各 疫苗更 安全和有效。 本 的另 方面涉及上 的水痘病毒的 各方法， 包括 下 )將野生 水痘病毒的基因 到 B 休上， 然 內重組 使得水痘病毒的基因 F 全部或部分缺失、 或者 介或多 取代或插 ， 得到的水痘病毒不能 感染 的 和 兇神

) 1 中得到的水痘病毒的 N ， e 的重組 特 e o細胞或 細胞或 P 細胞

) e 的作用在 e o細胞或 細胞或 PE細胞 中刪除B . 在本 的 介 方案中， 野生 水痘病毒是P ka ， 且步驟 1) 中 的 F a 取代， 或者 特反向

的 F 段 取代。 在 介 休的 方式中， 特反向

的 F 段是 N . 本 的近 方面涉及 組合物， 其含有上 的任 水痘 病毒。

本 的近 方面涉及 預防水痘和/或 的疫苗， 其含有上 的任 神水痘病毒 以及疫苗 賦形 或 休。

在本 明中 木倍 "預防水痘和/或 的疫苗"是指水 痘疫苗、 疫苗、 以及預防水痘和 的疫苗。

本 的近 方面涉及上 的任 水痘病毒在 各預防水 痘和/或 的 中的用途。

本 的近 方面涉及上 的任 水痘病毒的 N 在 各 休中的用途。

的 方面涉及 休， 其由 B 和插 lB 中 的上 的任 水痘病毒的 N 組成。 休， 其力上 的 任 水痘病毒的 N 。上 的 休至少可以插 kb的外 基因而不 本身 未和增殖， 可用于 外 基因， 且

休由于 F 功能缺失而 得安全。 也可以將 休

基因 ( hange a.Jou na O o ogy ep , 0 , p ) ， 于休 外 功能研究的監測。

的近 方面涉及 重組 休， 其含有上 的 休以 及插 的外 基因。

的近 方面涉及 重組細胞， 其含有上 的 休或 重組 休。 本 的 介 方案 重組細胞所用的宿主細胞 自 下細胞

e o PE B 以及 B

本 的近 方面涉及 預防水痘和/或 的方法， 包括給予患者接 有效量的上 疫苗的步驟。

在本 明中， 木 " P "是 "day po ec on" 的 ， 是指病毒感染 的天 。 F g. p ka B B 休 。

F g.2 F 缺失B B ) 的 各。

F g. F 缺失的 病毒的 。

F g. 病毒的 。 ． 野生 T) 、 ( ) 、 缺陷 ( )在 e o細胞中的生未 。 B． ( T)、 ( )、缺陷 ( )在背 ( ) 中的生未 。

F g. F ( ) 水痘病毒的 各。

F g. 有 的 ( u ) 病毒在 休 e o細 胞中生未 。

F g. 有 的 ( u 病毒在 胸腺

(T )物中的生未 。

F g. 有 的 uc D 病毒在 銀 ( )物中的生長 。

F g. . T 和 J DN 特 e o細胞 和 細胞瘤 ( ) 細胞。 不能在 細胞瘤 中生長。 B． (D ) 胚胎的脊髓中分 所得。 ． 移植到重症 合兔疫缺陷 ( h 小鼠的 ， 或 病毒感染 ， 測試病毒生未， 不 能在 hu 植 組 的重症 合兔疫缺陷 ) 中生未。 ． 感染 FP強度增 ， 野生 ( ) 在 物中 未。 休 方式

下面將結合 本 的 方案 。 本領 域 木 將 理解， 下面的 于 明本 而不 視力限定本 的 固。 中未注明 休 木或余 者， 按 照本領域 的 的 木或余 例 參考 J．

等著， 等 的 《分子 指南》 第三 ， 出版 社) 或者按照 。 所用試 或 未注明

者 均力可以 得的常規 。 1 p ka B B ) 休

1) B 休 ( U F ， 含有 起始序列 ( 、 和分 基因 「epE, pa and pa B) 基因 ( a ) > 綠 光蛋自 g p ， bp 段a和b ) 、 oXP (白 。 pU F Ba 消化成域性結 ， 通 同源 重組將pU F 插 的科 pv pe

p ka基因 模式 由 1 kb 組成， 包括 介未 段 L 和 介 段 ) 。 完整基因 消化成

的 基因 段， 到 中 戶生 重組pvF p pv pe pvP e 和pv pe pU F ? 重組插 在 pv pe 的 F 和 F 1 同 ) B 休 ( U F ) 的 pv pe 其它 斯底 特 e o細胞， 重組病毒 ( B )能在 e o細胞中夏 戶生綠 。

另外， 操作 也可以參見F g．1。

比較 B 病毒和野生 p ka病毒的生未 。 病毒感染 每天 汞 形成羊位數 PFU) 。 結果 B 病毒 (綠 ) 沒有出現 未缺陷 本病毒休外 未 致。 F 缺失的B ( DB 的 各以及檢驗 F 刪除的 休的 可以參照 1 hange a . ou na O o ogy, ep 2 , p 操作 也可以參見F g． 以及下面的步驟

1． 的 余 各包含 bp的 那 基因同源 序列和 F 刪除 起始或終止密碼子相連的 bp同源序列。

F 、 下

F T TT T T T T TT T T T T T T T T ( E N ),

T TTT TT TT T T T T TT T T T T ( E N ).

那 基因 p E o /kan J (Ne e a d ang e a. ) P 物用 pn 消化， agen 提取 收。

． 以 1. kv, u 的 B o ad ene Pu e 1 將大 約 ng的 P 特 載有 Luc B 的 D 休中。

． 大 林作力高 同源重組 統， 所需同源 序列 至 bp。 利用重組 1C 抑制的特性， 完成 an 基因占 的同源重姐， OR ，

F7被Kan基因取代， 在 32 下水人含有 30 、

Jg/m 卡那霉素的涼脂J i迄梓羊克隆的重、a子， 八大肪杆菌 中分萬水痘病毒突交株 ( RF7缺失) VZV-BAC的 DNA

4． 所得病毒基因組完整，性由 Hind 醉切;淦驗， 重組 DNA婪pC 金盼。 征明4早到了 RF7缺失的 BAC株(VZV-7DBAC)， 其 RF7 被 a"'基因取代。 奕施例 3: ORF7翻特反向移碼突交BAC株 ( ZV-7DRMBA )的 制各以及栓驗

思路女下:用 ga k基因取弋野生型病毒中的ORF7序列，含galk 基 、

因的 zv在以半乳糖力唯，一碳源的表棟基氏掠脂，� ��界物上戶生亮 缸色斑， 用;之利，方法篩迭出羊克Rt; 再用翻特反向移碼突交序列取 代galk，在完全土吾芥基和基珀培芥基上篩迭� �克隆，茨得VZV-7DRM BAC

步驟如下:

1． 玫汁正反向引物 5"端各含有 bp ORF7基因丙端側翼同源 序列的 galk基因表迭框的扯增引物F2和R2。伙pga k上折增galk 基因序列 (1-82bp力后功子， -123lbp力 galk的 ORF)， 序列如 T( EQ ID NO:5) :

CCTGTTGACAATTAATCATCGGCATAGTATATCGGCATAGTATAATACGACAAGGTGAGG AACTAAA CCCAGGAGGCAGATCATGAGTCTGAAAGAAAAAACACAATCTCTGTTTGCCAACGCATTT GGCTACCCTGC CACTCACACCATTCAGGCGCCTGGCCGCGTGAATTTGATTGGTGAACACACCGACTACAA CGACGGTTTCG TTCTGCCCTGCGCGATTGATTATCAAACCGTGATCAGTTGTGCACCACGCGATGACCGTA AAGTTCGCGTG ATGGCAGCCGATTATGAAAATCAGCTCGACGAGTTTTCCCTCGATGCGCCCATTGTCGCA CATGAAAACTATCAATGGGCTAACTACGTTCGTGGCGTGGTGAAACATCTGCAACTGCGT AACAACAGCTTCGGCGGCGTGG ACATGGTGATCAGCGGCAATGTGCCGCAGGGTGCCGGGTTAAGTTCTTCCGCTTCACTGG AAGTCGCGGTC GGAACCGTATTGCAGCAGCTTTATCATCTGCCGCTGGACGGCGCACAAATCGCGCTTAAC GGTCAGGAAGC AGAAAACCAGTTTGTAGGCTGTAACTGCGGGATCATGGATCAGCTAATTTCCGCGCTCGG CAAGAAAGATC ATGCCTTGCTGATCGATTGCCGCTCACTGGGGACCAAAGCAGTTTCCATGCCCAAAGGTG TGGCTGTCGTC ATCATCAACAGTAACTTCAAACGTACCCTGGTTGGCAGCGAATACAACACCCGTCGTGAA CAGTGCGAAAC CGGTGCGCGTTTCTTCCAGCAGCCAGCCCTGCGTGATGTCACCATTGAAGAGTTCAACGC TGTTGCGCATG AACTGGACCCGATCGTGGCAAAACGCGTGCGTCATATACTGACTGAAAACGCCCGCACCG TTGAAGCTGCCAGCGCGCTGGAGCAAGGCGACCTGAAACGTATGGGCGAGTTGATGGCGG AGTCTCATGCCTCTATGCGCGA TGATTTCGAAATCACCGTGCCGCAAATTGACACTCTGGTAGAAATCGTCAAAGCTGTGAT TGGCGACAAAG GTGGCGTACGCATGACCGGCGGCGGATTTGGCGGCTGTATCGTCGCGCTGATCCCGGAAG AGCTGGTGCCT GCCGTACAGCAAGCTGTCGCTGAACAATATGAAGCAAAAACAGGTATTAAAGAGACTTTT TACGTTTGTAA ACCATCACAAGGAGCAGGACAGTGCTGA (SEQ ID NO:5) F2和R2序列如下:

F2 : ACCGAATCGTCGGTTTGGAGGATTTATCCATAGTTCAATACGTTGGAAAGCCAG TCAATCATGCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA (SEQ ID NO:6);

R2 : TAATTTTATATACAAAATAAAAACATACACCAGAAACGTTTTTAGTTTTTATTT CAATATTCAGCACTGTCCTGCTCCTT (SEQ ID NO: );

2． 用此引物妒增 ga k基因表迭框，用 Dpn 消化迪夜后鈍化; 3． 用 VZV BAC特4匕大肋杆茵 SWlO2;

4． 挑取羊克隆接科到 5ml LB-CM (含氯霉素 LB) 的培莽基， 在 32 ° 吾莽3土夜;

5． 用迂夜培芥菌*美利，到 2 ml LB-CM 吾才糾液中， 32 C振蕩培 莽到 OD 直迭到 0．4-0.6;

6． 制各屯持細 & ( ZVbaC特 的大舫杆菌 SW 2) ;

7． 取1-2Ftl (約 2OOng)步驟2鈍化的 PCR戶物按奕施例 2中 的屯特參敬屯特到步驟 6中制各的 VZVBAC大肋杆菌 S 2感受志 細胞中;

8． 向丰叫匕細胞中加 m LB井于 32qC培芥l lJ 吋; 9． 恢夏后， 用 l，Mg益如下洗潦細菌 3次: 1320ORPM萬 沉 涎培莽物 15秒， 吸取萬 上清， 用 l，Mg盎重惠沉涎， 如上萬 tJ 重夏洗潦一次。 銓 3次洗潦后， 弄除上清液， 沉涎用 l，Mg盎 m 重惠。 重惠物、 10倍稀粹物、 100倍稀釋物加到含半乳糖、 亮氨酸、 生物素和氯霉素的M 基拙培莽基上。

10. 3 C培芥3天;

11． 挑取几介克隆到含有半乳糖、氯霉素指示刑的 走棟基氏球 脂培莽板上培芥， 茨得羊克隆。 培芥3天出現的克隆座核是Gal 污染，茨得羊一亮虹色克隆吋迸行下一步試． ， 但是， 力了排除Ga- 盼 是非常重要的;

12． 挑取羊一亮虹色(半乳糖力唯一碳源的友棟基� �培莽基上 。

培芥， G +)克隆， 接科到 5 ml LB-CM培莽液中， 32C迂夜培芥; 用迪夜培芥物制各BACDNA， 井用 PCR硝征含有 ga k基因， 所用引 物如下:

F3: CCTGTTGACAATTAATCATCGGC (SEQ ID NO:8);

R3: TCA GCACTGTCCTGCTCCT (SEQ ID NO:9);

13.以 F4(SEQIDNO:10)和R4(SEQIDNO:11)力引物的 RF7 近 3，端 457bp的 PCR折增 (457bp棲碼框序列 (SEQ ID NO:12) ) 。 由 于 F4 R4 引物玫汁引入了 1位城基移硝， 故折增戶物戶生移硝突 交。

F4和R4引物序列如下:

F4 : CGAATCGTCGGTTTGGAGGATTTATCCATAGTTCAATACGTTGGAAAGCCAGTC AATTTAATGGGATTTCTTGATCGCGGGG -(SEQ ID NO: 0)

R4 : AATTTTATATACAAAATAAAAACATACACCAGAAACGTTTTTAGTTTTTATTTC AATATGTGGTCCGTTCACACATGGAAAA SEQ ID NO:11)

457bp祺硝框序列如下:

GTCCGTTCACACATGGAAAACTCAAAACGGCTTGCTGATATGTGTTTAGCTGCAATTACC CATTTGT ATTTATCGGTTGGCGCGGTGGATGTTACTACGGATGATATTGTCGATCAAACCCTGAGAA TGACCGCTGAAAGTGAAGTGGTCATGTCTGATGTTGTTCTTTTGGAGAAAACTCTTGGGG TCGTTGCTAAACCTCAGGCATC GTTTGATGTTTCCCACAACCATGAATTATCTATAGCTAAAGGGGAAAATGTGGGTTTAAA AACATCACCTA TTAAATCGGAGGCGACACAATTATCTGAAATTAAACCCCCACTTATAGAAGTATCGGATA ATAACACATCT AACCTAACAAAAAAAACGTATCCGACAGAAACTCTTCAGCCCGTGTTGACCCCAAAACAG ACGCAAGATGT

aCaaCgCaCaaCCCCCgCgatCaagaaatCCCatg(SEQ ID N :12)

然后參照本奕施例的步驟4-10制各屯特感受志SW 2細胞。 14.2OOng含占步驟 alk基因側翼同源的 PCR戶物餐熱激吋告 化 50 1步驟 13的感受志細茵。 特it戶物加至u含l0 lL 吾莽．液的 5Oml堆形瓶中， 32C 4

7t．浴振蕩培莽4．5小忖迸行灰夏。 3之利，未吋同 恢夏旨在茨得只含目析序列的重組vzvBAc( 、

舍弄含ga k表匕框的VZV BAC) 。 因力 F4由 6Obp OFR7 5，端側翼同源序列和ORF7 j 3' 端 457bp反向序列組成， R4由 b FR7 3，端側翼同源序列和ORF7 近3，端 457bp正向序列組，成。 所以折增戶物勻 FR74立魚上的 ga k 基因同源重組吋， 3'端 4 7bp序列戶生翻特反向連接， 戶生翻特反 向移硝突奕突交(sEQ ID No:13)， 不具表迭功能。 翻持反向移碼突 交序列如下:

CATGGGATTTCTTGATCGCGGGGGTTGTGCGTTGTACATCTTGCGTCTGTTTTGGGGTCA ACACGGG CTGAAGAGTTTCTGTCGGATACGTTTTTTTTGTTAGGTTAGATGTGTTATTATCCGATAC TTCTATAAGTG GGGGTTTAATTTCAGATAATTGTGTCGCCTCCGATTTAATAGGTGATGTTTTTAAACCCA CATTTTCCCCT TTAGCTATAGATAATTCATGGTTGTGGGAAACATCAAACGATGCCTGAGGTTTAGCAACG ACCCCAAGAGTTTTCTCCAAAAGAACAACATCAGACATGACCACTTCACTTTCAGCGGTC ATTCTCAGGGTTTGATCGACAA TATCATCCGTAGTAACATCCACCGCGCCAACCGATAAATACAAATGGGTAATTGCAGCTA AACACATATCA GCAAGCCGTTTTGAGTTTTCCATGTGTGAACGGAC(SEQ ID NO:13).

15． 如步踝 耗作， ;冗涎 m 吾芥物， 用 l，Mg盎洗潦細茵 3 次， ;冗涎用 l，Mg盎 m 重患。 重惠物和 104吾稀粹物各 0O 加 到 甘油、 、 生物 、 氧 乳糖和 素的

上。

1. 1C

1 ． 羊 特到LB 和 a k

的平板上。 在LB M 未而在 上不生未的羊 ， 提取 病毒基因 nd 完整性， 重組 N P 。 得到了 F 特反向 的 B ( B ) o 上 步驟所用試 的 下面的 1所示

和 病毒的 各

1． 得的 B 中提取 N ， 特

中 、 增殖、 提取、 化。 ． 將提取 化的 N 羊 特 至 ( a ch n , L u e a. 1) 細胞， B 上帝的 FP可以用于病毒在細胞中生長 增殖研究)或 e 休 同 特 至 a ch n L ue a .

) 細胞， B e 端的 oxP 完全 ， 戶生 病毒。

似 ，可以得到 特反向 取代 的 病 毒， 由于 的 F 只有部分且 特反向序列， 所以， 此 段不能 ， 更 F 功能。 因此， 具有相 同的功能。 病毒的

中 得的 病毒感染未成羊 的 細胞， 牛血清的 E ， 胞病交友 ， ， 病交細胞 提取 N ， 以 P ka 。 P

F 和 F 基因， H nd 消化 和 P ka 的 DN P 物和 nd 1消化 物用 0． 的 ，

F g． 。 D在 F 的 P 同 P ka的 致， 但在 F J沒有余 ， F 缺失。 H nd 1 病毒的

上， 和P ka 同看不出差別。 病毒的

的外科剪刀和 子 胚胎的 和 脊骨的 ( )， 的 1 / 素的 PB ， 然 特到 的 ( E ， 1 熱天活的 牛血清和 1 / ) ， 將 羊狂 到 中 覆蓋的 玻 上， 0． ， ， 次。 細胞 中 各 e o ， 于 測和生長 分析(F g. )。 P ka, 和 新近感染的 e o細胞， 于 至 。

羊 在 中 的 玻 上。 1 于 病毒 ， 于 e o細胞感染的生未 。 其余細胞 用力 ，細胞碎 p n 。 上 均分， 于感染 ， 1 L ， 另外， ( ) 于感染另 介 ， ，下 小 ， PB ， 再 新 。

次 活性。 1 ug 的 c e n 1 ， 器和軟件分析光子 。 結果 F g. B

結果表明， 在 e oJ 未正常， 而在背 市中 乎不生未。 不感染 細胞， 安全的 疫苗奠定了 。 病毒的 休 ( ) 各以及 F 缺失 否不 可以用 nd 而且可以 基因的同源重組 得完整的 以 。 即 細菌同源重組 拯救出完整的 ， F g． 。 可以利用 nv ogen的高 aq N 聚合 P F 段， 將 到底 p E ox zeo的No 和Bg 魚 間 而形成p E zeo F 。 段 序分析 且 P 沒有 子 引 F 中。 以 p E zeo F

下 P zeo F 。

T T T T TT T T T T T T T T E D N )

T TT TT TT TT T T T T T T T T E D

得到的P 是 各 段 bp的 基因序列， kan 序列相連的， 于刪除的 F 上。 將得到的 合 上文提到的方法 特化到 有 F B 的 休中。重組休要通 含有 g/ 的 zeoc n nv ogen)和 1 ． / 的 素的 平板 。 的

它們 抗生素的敏感狀況而 得。 的 是

、 、 zeoc n 、 那 敏感性以及 敏感 性的。 步 消化和P 分析 。

將 的 (即 有 F 缺失或者 uc B 拯 救子的大 接神于 1. 9/ 1的 素的 LB 中 C 小 。 B 的 N B DN 大量提取 ( B o c ence , Pa o o 得到， 且利用 特 Fu ene oche, nd anapo N)按照使用 特 細胞。 中的 2L( )在特 N 特 的使用比例 1． g 1。 般情況 可凡水痘病毒 。 水痘病毒基因 中去除B 休 ( 有 oxP ，可將 e 休 Z B 起 ( a ch L u e a. 1) ， 利用 e 的特性而 切除B ， 戶 生完整的

水痘 F 的病毒具有同 P ka病毒相同的生未和增 殖特性。 F 的功能可以 交手段得到 。 病毒的 e o細胞 中未成羊 的 e o 細胞分別 Luc 的 和P ka 感染， 以未感染的 e o細胞 ， e o細胞 在 下 牛血清的 E 。 感染 小 ， uc en 到 的細胞 中， 1 g/

1 ， 不同孔的生物 休 像 統 e e enogen o po a on a eda )同 測量光子 ， 每天測量 感染細胞， 測量 ， 細胞 病毒 取代 uc e n

。 病毒 小 測量 次， 連 測量 。

測量的數 均值 同 制生未 。 結果 F g． 。

e o 細胞不 感染或者 水痘 病毒野生 ( uc )或者 或者 ( uc )感 染、 。 感染 每天 統測量光子 ， 測量 的均值 同 制生未 中 測量 的 。 本 表明 M病毒和 病毒和野生 都可以在 e o 細胞中正常生未。 同 ， 結果表明將B 插

常增殖， B J的基因也 常 ， 即 可以 用作外 基因 的 休。 D 病毒在 胸腺 鎳的

胸腺 合移植休 休移植到雄性的 B /be ge 。 胸腺 合移植休 和使用 Jenn F. (Jou n o o ogy ept. 1 p. 的方法 。 移 植 ， 胸腺 移植休 外科手木暴露 ， 直接注射 1 至 1 PFU的 e o 的含有 的 D 和P ka,

細胞 ， 每科病毒感染 只小鼠， 以未感染

感染 每天測量 。 腹腔注射 即 uc e n 生物 休內 像 統 在移植 的方法測量 ， 每科病毒測量 只小鼠。 F g． 。 的 胸腺 不受病毒感染或者 野生 或者 感染， 。感染 每天 統測量光子 。 只 測量的光子 均值 同 制生未 。 中 只測 量 的 。 本 表明 缺陷 像野生 能在 胸腺 鋁 (T 細胞) 中生長。

似的 ， 缺陷 也像野生 能在胸腺 T 細胞 中生未。 1 病毒的

胚胎 完整 Jenn e F. (Jou na O o ogy ep. p． ) 的方法 休移植到重症 合兔 疫缺陷( )小鼠皮下。移植 ， 的

和P ka 感染 ， 神病毒感染 只小鼠， 以未感染 ， 感染 每天測量 。 腹腔注射 1 ， 即 uc e ， 生物 休 像 統 在移植 的方法測量 ， 每科病毒測量 只小鼠。 結果 F g. 。

的 病毒野生 ( k ) 或者 F 缺失 ( )或者 F ( 感染、 以不 感染 的 ， 。 感染 每天 統測量光子

只測量的光子均值 同 制生未 。 中 只測量 的 哉。 在 中有 重生未缺陷 功能 缺陷在 可以 。

似的 ， 在 中也有 重生未 陷， 且 神功能缺陷在 可以 。 11 F 感染 必需的

1． 細胞瘤細胞感染

野生 T) F 刪除 ( ) 和 F

( ) 的 B N 特 e o細胞和 細胞瘤 ( ) 細胞。 研究 ， T 在Me o細胞和 鉅細胞瘤細胞上 未正常， 但 不能在 細胞瘤細胞上 未 (F g. ) 研究結果 很可能是 感染 細胞所必需的。

. 移植休感染

了 步 本 中 的 使用植

( 移植休的重症 合兔疫缺陷 ( hu)模型 。 結果 ， 野生 在 移植休中 介 暫的

(有 光現象) ， 很可能 直 看。 但是， 不能在D 移植休中夏 。 結果表明， F 很可能是 Z 的 因 子 (F g. B ) o

以上 F 是 感染 必需的。 疫苗的 各以及 病毒的兔

．1感染未成羊 的 PE或M 細胞，病毒在 細胞上 附 ， 向 中 病毒 于 C 。 細胞病交 到 左右 (通常 ， ． E T 消化 ， 、 保 破碎和澄清 疫苗。

疫苗 皮下接 休 9 ， 只/ ，

pFU/ . / ， ， 強兔 1 以P ka和 ka 迸行試淦。

加強兔疫后2周鉅 腔采血， 用gp-E SA栓測允疫血清抗休滴 度。 用兔疫抑制法栓測兔疫血清吋病毒的中和能力 。 兔疫血清或兔 前血清10倍稀釋后勻病毒1: 1混合， 37C培莽6 0分舛， 培芥混合液 感染MRC-5匆胞， 于37 5%

「 二氧化碳培芥箱中培芥7天后， 弄去培莽 液， 用考巧斯藍染包 汁蝕斑數再換算病毒滴度， 用100， (被兔 前血清中和的病毒滴度-被兔后血清中和的病� �滴度) /被兔后血清 中和的病毒滴度。 栓定結果凡表2。

奕盼結果表明VZV-7DRM有良女子的兔疫 性， 抗休水平和V- ka 的相占， 且VZV-7DRM兔疫血清吋三株病毒都有良好的中和� ��用， 初 步昱示有疫苗升友前景。

美似的奕醃昱示， vzv-7D也具有良好的兔疫原性， 具有疫苗升 友前景。 奕施例13: VZV-7 DRM力栽休的生物活性原 h 各

用含ORF7側翼匹同源序列的EV7 l-VPl引物八PT-VP 席粒上PCR 妒增EV 7 l-VPl岡棲框。

岡棲框序列0□下:

TGGGAGATAGGGTAGCAGATGTAATTGAAAGCTCCATAGGAGATAGCGTGAGCAGAGCCC TCACTCA CGCTCTACCAGCACCCACAGGCCAGAACACACAGGTGAGCAGTCATCAACTGGATACAGG CAAGGTTCCAG CACTCCAAGCTGCTGAAATTGGAGCATCATCAAATGCTAGTGACGAGAGCATGATTGAGA CACGCTGTGTT CTTAACTCGCACAGCACAGCTGAGACCACTCTTGATAGTTTCTTCAGCAGAGCGGGATTA GTTGGAGAGAT AGATCTCCCTCTTAAAGGCACAACTAACCCAAATGGTTATGCCAACTGGGACATAGATAT AACAGGTTACG CGCAAATGCGTAGAAAGGTGGAGCTATTCACCTACATGCGCTTTGATGCAGAGTTCACTT TTGTTGCGTGC ACACCCACCGGGGAAGTTGTCCCACAATTGCTCCAATATATGTTTGTGCCACCTGGAGCC CCTAAGCCAGA TTCCAGGGAATCCCTCGCATGGCAAACCGCCACCAACCCCTCGGTTTTTGTCAAGCTGTC AGACCCTCCAGCGCAGGTTTCAGTGCCATTCATGTCACCTGCGAGCGCTTACCAATGGTT TTATGACGGATATCCCACATTC GGAGAACACAAACAGGAGAAAGATCTTGAATATGGGGCATGTCCTAATAACATGATGGGC ACGTTCTCAGT GCGGACTGTAGGGACCTCCAAGTCCAAGTACCCTTTAGTGGTTAGGATTTACATGAGAAT GAAGCACGTTA GGGCGTGGATACCTCGCCCGATGCGTAACCAGAACTACCTATTCAAAGCCAACCCAAATT ATGCTGGCAAC TCCATTAAGCCAACTGGTACCAGTCGTACAGCGATCACTACTCTTTAA (SEQ ID NO:1 )

pCR引物序列:

F6 ( RF7 5"端側翼匹同源序列， 起始密硝子和EV7l-VPl同源 序 :

CGAATCGTCGGTTTGGAGGATTTATCCATAGTTCAATACGTTGGAAAGCCAGT CAATCATGGGAGATAGGGTAGCAGATGTAA(SEQ ID NO:17)

R6 (ORF7 3"端側翼匹同源序列和EV7l-VPl同源序 J :

AATTTTATATACAAAATAAAAACATACACCAGAAACGTTTTTAGTTTTTATTTCAATATT TAAAGAGTAGTGATCGCTGTACGACTGGTA(SEQ ID NO: 8)

PCR戶物采用屯特手段特入含VZV-7DRMBAC的S 2細菌中， 按 照奕施例2篩迭重組菌， 銓荃定正硝后， 迢量培芥， d是取

VZV-7DRM-VPl BAC， 占 Cre表迭韋 扛一同屯特染至ARPE細胞， BAC 被C

「e酵伙其丙端的 oxP酵切位魚完全切除， 戶生VZV-7DRM-VPl重 組病毒。 重組病毒感染未成羊居的ARPE細胞， 35C培莽3-4天， 細 胞出現病交。 ，&集的病毒3吾莽上清、 細胞惠液婪反夏株融或超戶裂 解后的萬 f上清原4吾上梓， 采用EV71特弄的汲抗休夫 法栓測VPl 活性， 用EV7l和VZV-7DRM作吋照。 結果 (見表3)在VZV-7DRM-VPl 病毒感染的ARPE細胞中#金測到VPl活性， 表明VPl重組到VZV-7DRM 中。 ，比例表明vzv-7DRM能用作外源基因的表迭栽休� ��迭目杯蛋自。

表3: VZV-7DRM-VPl重組病毒的VPl活，性#金測 (灰抗休夫tJ法)

似的 ， 可以用于 各 外 自的 休。 本 的 休 方式已 得到 的 ， 本領域 木 特 理解。 已 公升的所有教寺 可以 那些 行各 修改和 ， 均在本 的保 固 內。 本 的全部 固由 要求及其任何等同 。