Login| Sign Up| Help| Contact|

Patent Searching and Data


Title:
ORF7 DEFICIENT VARICELLA VIRUS, VACCINE COMPRISING THE VIRUS AND USE THEREOF
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2011/011971
Kind Code:
A1
Abstract:
Provided are an ORF7 deficient varicella virus, an vaccine comprising the virus and use thereof, as well as a method for the production of the virus.

Inventors:
ZHU HUA (US)
LI YIMIN (CN)
XIA NINGSHAO (CN)
CHENG TONG (CN)
YE XIANGZHONG (CN)
Application Number:
PCT/CN2010/001139
Publication Date:
February 03, 2011
Filing Date:
July 27, 2010
Export Citation:
Click for automatic bibliography generation   Help
Assignee:
NEW JERSEY MEDICAL SCHOOL (US)
BEIJING WANTAI BIOLOGICAL PHARMACY ENTPR CO LTD (CN)
UNIV XIAMEN (CN)
ZHU HUA (US)
LI YIMIN (CN)
XIA NINGSHAO (CN)
CHENG TONG (CN)
YE XIANGZHONG (CN)
International Classes:
C12N7/00; A61K39/25; A61P31/22; C12N5/10; C12N7/01; C12N7/04; C12N15/63
Foreign References:
US3985615A1976-10-12
US4000256A1976-12-28
Other References:
ZHANQ Z. ET AL.: "A highly efficient protocol of generating and analyzing VZV ORF deletion mutants based on a newly developed luciferase VZV BAC system.", JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS., vol. 148, no. 1-2, 22 January 2008 (2008-01-22), pages 197 - 204, XP022487610
TAKAHASHI M; OTSUKA T; OKUNO Y ET AL.: "Live vaccine used to prevent the spread of varicella in children in hospital", LANCET, vol. 2, 1974, pages 1288 - 90
LANCET, vol. 2, 1974, pages 1288 - 1290
"Requirement for Varicella Vaccine (Live) Adopted 1984", WHO TECHNICAL REPORT SERIES, 1985, pages 102 - 104
SCHMID D.S ET AL.: "Impact of varicella vaccine on varicella-zoster virus dynamics", CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, January 2010 (2010-01-01), pages 202 - 217
ZHANG ET AL., JOURNAL OF VIROLOGY, September 2007 (2007-09-01), pages 9024 - 9033
J. SAMBROOK ET AL.: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", SCIENCE PRESS
JENNIFER F.M., JOURNAL OF VIROLOGY, September 1995 (1995-09-01), pages 5236 - 5242
See also references of EP 2460878A4
Attorney, Agent or Firm:
CCPIT PATENT AND TRADEMARK LAW OFFICE (CN)
中国国际贸易促进委员会专利商标事务所 (CN)
Download PDF:
Claims:
要求 1. 神水痘病毒, 其基因 F 全部或部分缺失、 或者 介 或 取代或插 , 且 水痘病毒不能 感染 的 和 兇神 。

. 要求 1 的水痘病毒,其 , F 全部或部分 抗生素 基因和/或者 功能的核酸序列 取代。

. 要求 的水痘病毒, 其 抗生素 基 因 自 、 、 以及 那 素的 基因。

. 要求 的水痘病毒, 其 功能的核酸 序列是 特反向 的 F 段。

. 要求 的水痘病毒, 其 特反向

的 F 段的序列 E N 所示。

. 神水痘病毒, 其保藏 No. , 保藏日期 , 保藏羊 是中固微生物 神保藏管理委 普 通微生物中

. 要求 1 的水痘病毒的 各方法, 包括 下步驟 1)將野生 水痘病毒的基因 到 B 休上, 然 細菌 重組, 使得水痘病毒的基因 F 全部或部分缺失、 或者 介或 取代或插 , 得到的水痘病毒不能 感染 的 和 兇神

) 1) 中得到的水痘病毒的 DN , e 的重組 特 e o細胞或 細胞或 PE細胞或 B 細胞或 細胞或 B 細胞等

) e 的作用在 e o細胞或 細胞或 PE細胞 或 B 細胞或 1 細胞或 B 細胞等中刪除B . 要求 的方法, 其 , 所 野生 水痘病毒是 P a , 且步驟1)中 的 F an取代, 或者 特反向 的 F 段 E N 取代。

. 組合物, 其含有 要求 1 中任 項 的水痘

1 . 預防水痘和/或 的疫苗,其含有 要求 中任 項 的水痘病毒, 以及疫苗 賦形 或 休。

11. 要求1 中任 項 的水痘病毒在 各預防水痘和 /或 的疫苗中的用途。

. 要求1 中任 項 的水痘病毒的 N 在 各 休中的用途。

1 . 休, 其由 B 和插 到 B 中的 要求 1 中任 項 的水痘病毒的 DN 組成。

1 . 休,其力 要求 1 中任 項 的水痘 毒的 N.

1 . 重組 休 其含有 要求 1 或 1 的 休 以及插 的外 基因。

1 . 重組 ,其含有 要求 1 或 1 的 休、 或者 要求 1 的重組 休。

. 要求 1 的重組 , 其中, 所用的宿主細胞 自 下細胞 > e o PE B > 以及 B . 1 . 預防水痘和/或 的方法, 包括給予患者接神有 效量的 要求 1 的疫苗的 。

Description:
F7缺陷 病毒、 含有 病毒的疫苗 木領域

本 于病毒 和生物 領域。 休而言, 本 提供 了 F 缺陷 水痘病毒、 含有核病毒的疫苗及其 , 力水痘 病毒等的預防提供良好的 疫苗 。 木背景

水痘 病毒 ( a ce a zo e V u

"水痘病毒"或 " " )是 特 性的病毒, 是 致 水痘或 的致病因子。 其中 P ka 是由 Takaha h 等于 1 1 在日本 ka姓氏的 男孩的水痘 中分 出未的, 細胞 得的, 被 具有引 水痘和 功能 (Takaha h , uka T kuno e a .L ve Vacc neu ed op even he Sp ead O Va ce a n Ch d en n ho p a. Lance 2 90.) 。

1 中公升了 P ka 胚胎 PE ) 和 細胞多次 , 戶生 毒的 ka病毒, 各 預防水痘的 ka 疫苗。 中 了用 仟 細胞 病毒1 次生 疫苗。 但迄今 , 只有 P ka 鉅細胞 得的 "水痘病毒

" (特公9 1 Lance 1 , ) 批准的唯 于預防水痘或 疫苗 各的 , 各的疫苗在全球得到了 使用 [ equ e en o a ce a acc e L ve) dop ed Techn ca epo e e No. , pp.1 1 , 但是 水痘疫苗接 的 群比水痘自然感染 群的 生率低, 大 兔 功 能低下 , 但是, 是不爭的事 且 患者的 中分 到 ka ( ch d . , e a. pac O a ce a acc ne O a ce a o e u yna c , L N L B L E E , Jan. 1 p. 2 1 )

N 1 涉及水痘病毒 同 的 且 分子 水平上揭示 是由 不同序列組成的混合 。 可能 存在于其中 于 ka疫苗接 者戶生 ka 的 已 有 。 故核減 的 在危害 近是存在的, 但是, 現在近 有其它預防 的疫苗 上市。 核病毒具有 特 , 是其唯 的自然宿主 沒有合這的 模型研究 基因功能 再者核病毒 宿主細胞具有 結合性, 的病毒

得可供特化的 病毒 N 非常 , 故很未 同以未 病毒基 因功能研究的 。

但是, 看細菌 工染 休 B )在研究中的 , 銀 木的 , 生物 器官移植屏障的突破 ( 合兔疫缺陷 小鼠的 , 拓寬了科局特 的 基因功能研究的 同, 可 以在休外或移植到 休 基因功能研究。

azuh o N.等在 on ng O he Va ce a zo te V ugeno e a an n ec ou bac e a a c a Ch o o o e n E che ch a Co 文中揭示 到 B 休上的 ka 全基因 , 可以在大腸 和 細胞中增殖, B 可 同 到 中的 e 切除, 戶生的重 病毒 具有 p ka 同 完全具有 本病毒的特性。 B 的 用力 的功能研究 未了 大便利, 可以 基因 功能 研究, 速了 基因功能研究的 。 水痘m帝狀疤疹病毒 ( VZV ) 的 ORF7 位于病毒基因組的 8607-9386bp之同,蝙碼 g

占介2 kDa的蛋白,可,刨立于皮居結枸中, 它的功能目前仍不清楚。

本友明人婪迪不懈的研究, 恃奇&友現, ORF7決定看 ZV感染 人皮伕和感覓神努市的功能。 占 ORF7缺陷即友生女下情況之,- ,以及丰 介或多介 .: 全部或部分缺失、被插入終 密硝子 喊基取代, 特別是奶叭余了 RF7或者 RF7戶生番時告反向移硝突交吋,ORF7的功 能喪失, 即 zv不感染皮肢和感覓神鉅市, 故不存在戶生水痘或再 活化戶生帝狀 疹的潘在危害 (我們在本友明中私之力 oRF7缺陷 引起的功"喪失,所迷功"是指能移感染人的皮 和感覓神婪市)。 RF7刪除的水痘病毒沫 (VZV-7D BAC或VZV-7DRM BA ) 可以在大 肋杆茵中迸一、步鉅抗生素篩迭或半乳糖篩迭 (走棟基氏培芥札上戶 生亮虹色斑片早到羊,一文,隆沫,不存于j 合型 v-ka株的*$在危害, 速力升友更加安全有效的疫苗帝未了希望。 友明內容

本友明的占介方面涉及一神J

Zt(痘病毒 (例 -ka株) , 其基 因組 RF7全部或部分缺失、 或者才&一介或多介乃戈基取代或插入, 井且刀卜戈的水痘病毒不能移感染人的皮伕和 感覓神銓市。

ORF7 (8607-9386bP) 的序列

ATGCAGACGGTGTG GCT:

TGCCAGCTTATGTGGATAT TCGAATACCAACTGAAGAGCCATCTTATGAAG AGGTGCGTGTAAACACGCACCCCCAAGGAGCCGCCCTGCTCCGCCTCCAAGAGGCTTTAA CCGCTGTGAAT GGATTATTGCCTGCACCTCTAACGTTAGAAGACGTAGTCGCTTCTGCAGATAATACCCGT CGTTTGGTCCG CGCCCAGGCTTTGGCGCGAACTTACGCTGCATGTTCTCGTAACATTGAATGTTTAAAACA GCACCATTTTACTGAAGATAACCCCGGTCTTAACGCCGTGGTCCGTTCACACATGGAAAA CTCAAAACGGCTTGCTGATATG TGTTTAGCTGCAATTACCCATTTGTATTTATCGGTTGGCGCGGTGGATGTTACTACGGAT GATATTGTCGA TCAAACCCTGAGAATGACCGCTGAAAGTGAAGTGGTCATGTCTGATGTTGTTCTTTTGGA GAAAACTCTTG GGGTCGTTGCTAAACCTCAGGCATCGTTTGATGTTTCCCACAACCATGAATTATCTATAG CTAAAGGGGAA AATGTGGGTTTAAAAACATCACCTATTAAATCGGAGGCGACACAATTATCTGAAATTAAA CCCCCACTTAT AGAAGTATCGGATAATAACACATCTAACCTAACAAAAAAAACGTATCCGACAGAAACTCT TCAGCCCGTGT TGACCCCAAAACAGACGCAAGATGTACAACGCACAACCCCCGCGATCAAGAAATCCCATG TTATGCTTGTA TAA ( SEQ ID NO: 1 )

在本友明的.一介奕施方案+,oRF7全部或部分 抗生素抗,性基 因和/或者元功能的核酸序列所取 。 所迷元功能的核酸序列是指 ;亥核酸序列不使 oRF7 功能灰夏, 即水痘病毒仍不

核酸序列可以是不編碼融合"感染皮肢和感 覓神銓市, 核元功能的 蛋白的, 也,可以 是編硝蛋白的核酸序列, 只要 「編碼的蛋自不舍使 ORF7功能的恢 夏。 在本友明的一介奕施方案中, 所迷元功

交的 ORF7 片段。

或部"的核酸序列是翻特反 向移硝突

d肖吾 "ORF7 片段 是指ORF7的全部 分核酸序列。

在本友明的一介奕施方案+, 所迷翻特反向移碼突交的 oRF7 片段的序列如SEQ ID NO: 13所示。

在本友明的一 奕施方案中, 所迷抗生素抗,性基因迭自 : 青霉 素、 鏈霉素、 以及卡那霉素的抗性基因。

在 介具休的奕施方式中,友明人以未自力廿旦福 大孚匡孚院D,. Ann Arv卜in奕盼室的 P- ka帖床分萬株力材丰卜 以 VZV-BAC ( - k ) 力框架, 座用細菌同源重組原理戶生重組克隆。 全未 oRF7被Kan 基因取代而戶生VZV-7D BAC株或被翻抬告反向移碼突交的 ORF7部分 片段取代而戶生VZV-7DRM BAC株。 其中, Kan基因的序列如下:

ATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGAT GCTGATT TATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGAT TGTATGGGAAG CCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACA GATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCAT TTTATCCGTACTCCTGATGATG CGTGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGAAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATC CTGATTCAGGT GAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGT AATTGTCCTTT TAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTTGT TGATGCGAGTG ATTTTGATGACGAGCATAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAAC TTTTGCCATTC T T T T T T T TT T T E N

休 , 本 提供 水痘病毒, 其保藏 M O. , 休 日期 , 保藏羊 是中 微生物 神保藏管理委 普通微生物中

休 外 核病毒 不感染 和 兇神 故 可 能不存在 水痘或再活化戶生 的 在危害 可在

Me O、 或 PE細胞上生長, 且同 P ka 未特 致, 且也沒有 病毒在胸腺 坎的生未增殖特 留了 P ka 的所有 自 其兔 性理 同 P ka 的兔疫力相同 是通 an 或 乳糖 羊 克 , 不存于混合 ka 的 在危害 由于 刪除 或以 特反向 , B 或 B 不可能戶生 , 因而, 以 B 或 B 各 疫苗更 安全和有效。 本 的另 方面涉及上 的水痘病毒的 各方法, 包括 下 )將野生 水痘病毒的基因 到 B 休上, 然 內重組 使得水痘病毒的基因 F 全部或部分缺失、 或者 介或多 取代或插 , 得到的水痘病毒不能 感染 的 和 兇神

) 1 中得到的水痘病毒的 N , e 的重組 特 e o細胞或 細胞或 P 細胞

) e 的作用在 e o細胞或 細胞或 PE細胞 中刪除B . 在本 的 介 方案中, 野生 水痘病毒是P ka , 且步驟 1) 中 的 F a 取代, 或者 特反向

的 F 段 取代。 在 介 休的 方式中, 特反向

的 F 段是 N . 本 的近 方面涉及 組合物, 其含有上 的任 水痘 病毒。

本 的近 方面涉及 預防水痘和/或 的疫苗, 其含有上 的任 神水痘病毒 以及疫苗 賦形 或 休。

在本 明中 木倍 "預防水痘和/或 的疫苗"是指水 痘疫苗、 疫苗、 以及預防水痘和 的疫苗。

本 的近 方面涉及上 的任 水痘病毒在 各預防水 痘和/或 的 中的用途。

本 的近 方面涉及上 的任 水痘病毒的 N 在 各 休中的用途。

的 方面涉及 休, 其由 B 和插 lB 中 的上 的任 水痘病毒的 N 組成。 休, 其力上 的 任 水痘病毒的 N 。上 的 休至少可以插 kb的外 基因而不 本身 未和增殖, 可用于 外 基因, 且

休由于 F 功能缺失而 得安全。 也可以將 休

基因 ( hange a.Jou na O o ogy ep , 0 , p ) , 于休 外 功能研究的監測。

的近 方面涉及 重組 休, 其含有上 的 休以 及插 的外 基因。

的近 方面涉及 重組細胞, 其含有上 的 休或 重組 休。 本 的 介 方案 重組細胞所用的宿主細胞 自 下細胞

e o PE B 以及 B

本 的近 方面涉及 預防水痘和/或 的方法, 包括給予患者接 有效量的上 疫苗的步驟。

在本 明中, 木 " P "是 "day po ec on" 的 , 是指病毒感染 的天 。 F g. p ka B B 休 。

F g.2 F 缺失B B ) 的 各。

F g. F 缺失的 病毒的 。

F g. 病毒的 。 . 野生 T) 、 ( ) 、 缺陷 ( )在 e o細胞中的生未 。 B. ( T)、 ( )、缺陷 ( )在背 ( ) 中的生未 。

F g. F ( ) 水痘病毒的 各。

F g. 有 的 ( u ) 病毒在 休 e o細 胞中生未 。

F g. 有 的 ( u 病毒在 胸腺

(T )物中的生未 。

F g. 有 的 uc D 病毒在 銀 ( )物中的生長 。

F g. . T 和 J DN 特 e o細胞 和 細胞瘤 ( ) 細胞。 不能在 細胞瘤 中生長。 B. (D ) 胚胎的脊髓中分 所得。 . 移植到重症 合兔疫缺陷 ( h 小鼠的 , 或 病毒感染 , 測試病毒生未, 不 能在 hu 植 組 的重症 合兔疫缺陷 ) 中生未。 . 感染 FP強度增 , 野生 ( ) 在 物中 未。 休 方式

下面將結合 本 的 方案 。 本領 域 木 將 理解, 下面的 于 明本 而不 視力限定本 的 固。 中未注明 休 木或余 者, 按 照本領域 的 的 木或余 例 參考 J.

等著, 等 的 《分子 指南》 第三 , 出版 社) 或者按照 。 所用試 或 未注明

者 均力可以 得的常規 。 1 p ka B B ) 休

1) B 休 ( U F , 含有 起始序列 ( 、 和分 基因 「epE, pa and pa B) 基因 ( a ) > 綠 光蛋自 g p , bp 段a和b ) 、 oXP (白 。 pU F Ba 消化成域性結 , 通 同源 重組將pU F 插 的科 pv pe

p ka基因 模式 由 1 kb 組成, 包括 介未 段 L 和 介 段 ) 。 完整基因 消化成

的 基因 段, 到 中 戶生 重組pvF p pv pe pvP e 和pv pe pU F ? 重組插 在 pv pe 的 F 和 F 1 同 ) B 休 ( U F ) 的 pv pe 其它 斯底 特 e o細胞, 重組病毒 ( B )能在 e o細胞中夏 戶生綠 。

另外, 操作 也可以參見F g.1。

比較 B 病毒和野生 p ka病毒的生未 。 病毒感染 每天 汞 形成羊位數 PFU) 。 結果 B 病毒 (綠 ) 沒有出現 未缺陷 本病毒休外 未 致。 F 缺失的B ( DB 的 各以及檢驗 F 刪除的 休的 可以參照 1 hange a . ou na O o ogy, ep 2 , p 操作 也可以參見F g. 以及下面的步驟

1. 的 余 各包含 bp的 那 基因同源 序列和 F 刪除 起始或終止密碼子相連的 bp同源序列。

F 、 下

F T TT T T T T TT T T T T T T T T ( E N ),

T TTT TT TT T T T T TT T T T T ( E N ).

那 基因 p E o /kan J (Ne e a d ang e a. ) P 物用 pn 消化, agen 提取 收。

. 以 1. kv, u 的 B o ad ene Pu e 1 將大 約 ng的 P 特 載有 Luc B 的 D 休中。

. 大 林作力高 同源重組 統, 所需同源 序列 至 bp。 利用重組 1C 抑制的特性, 完成 an 基因占 的同源重姐, OR ,

F7被Kan基因取代, 在 32 下水人含有 30 、

Jg/m 卡那霉素的涼脂J i迄梓羊克隆的重、a子, 八大肪杆菌 中分萬水痘病毒突交株 ( RF7缺失) VZV-BAC的 DNA

4. 所得病毒基因組完整,性由 Hind 醉切;淦驗, 重組 DNA婪pC 金盼。 征明4早到了 RF7缺失的 BAC株(VZV-7DBAC), 其 RF7 被 a"'基因取代。 奕施例 3: ORF7翻特反向移碼突交BAC株 ( ZV-7DRMBA )的 制各以及栓驗

思路女下:用 ga k基因取弋野生型病毒中的ORF7序列,含galk 基 、

因的 zv在以半乳糖力唯,一碳源的表棟基氏掠脂, 界物上戶生亮 缸色斑, 用;之利,方法篩迭出羊克Rt; 再用翻特反向移碼突交序列取 代galk,在完全土吾芥基和基珀培芥基上篩迭 克隆,茨得VZV-7DRM BAC

步驟如下:

1. 玫汁正反向引物 5"端各含有 bp ORF7基因丙端側翼同源 序列的 galk基因表迭框的扯增引物F2和R2。伙pga k上折增galk 基因序列 (1-82bp力后功子, -123lbp力 galk的 ORF), 序列如 T( EQ ID NO:5) :

CCTGTTGACAATTAATCATCGGCATAGTATATCGGCATAGTATAATACGACAAGGTGAGG AACTAAA CCCAGGAGGCAGATCATGAGTCTGAAAGAAAAAACACAATCTCTGTTTGCCAACGCATTT GGCTACCCTGC CACTCACACCATTCAGGCGCCTGGCCGCGTGAATTTGATTGGTGAACACACCGACTACAA CGACGGTTTCG TTCTGCCCTGCGCGATTGATTATCAAACCGTGATCAGTTGTGCACCACGCGATGACCGTA AAGTTCGCGTG ATGGCAGCCGATTATGAAAATCAGCTCGACGAGTTTTCCCTCGATGCGCCCATTGTCGCA CATGAAAACTATCAATGGGCTAACTACGTTCGTGGCGTGGTGAAACATCTGCAACTGCGT AACAACAGCTTCGGCGGCGTGG ACATGGTGATCAGCGGCAATGTGCCGCAGGGTGCCGGGTTAAGTTCTTCCGCTTCACTGG AAGTCGCGGTC GGAACCGTATTGCAGCAGCTTTATCATCTGCCGCTGGACGGCGCACAAATCGCGCTTAAC GGTCAGGAAGC AGAAAACCAGTTTGTAGGCTGTAACTGCGGGATCATGGATCAGCTAATTTCCGCGCTCGG CAAGAAAGATC ATGCCTTGCTGATCGATTGCCGCTCACTGGGGACCAAAGCAGTTTCCATGCCCAAAGGTG TGGCTGTCGTC ATCATCAACAGTAACTTCAAACGTACCCTGGTTGGCAGCGAATACAACACCCGTCGTGAA CAGTGCGAAAC CGGTGCGCGTTTCTTCCAGCAGCCAGCCCTGCGTGATGTCACCATTGAAGAGTTCAACGC TGTTGCGCATG AACTGGACCCGATCGTGGCAAAACGCGTGCGTCATATACTGACTGAAAACGCCCGCACCG TTGAAGCTGCCAGCGCGCTGGAGCAAGGCGACCTGAAACGTATGGGCGAGTTGATGGCGG AGTCTCATGCCTCTATGCGCGA TGATTTCGAAATCACCGTGCCGCAAATTGACACTCTGGTAGAAATCGTCAAAGCTGTGAT TGGCGACAAAG GTGGCGTACGCATGACCGGCGGCGGATTTGGCGGCTGTATCGTCGCGCTGATCCCGGAAG AGCTGGTGCCT GCCGTACAGCAAGCTGTCGCTGAACAATATGAAGCAAAAACAGGTATTAAAGAGACTTTT TACGTTTGTAA ACCATCACAAGGAGCAGGACAGTGCTGA (SEQ ID NO:5) F2和R2序列如下:

F2 : ACCGAATCGTCGGTTTGGAGGATTTATCCATAGTTCAATACGTTGGAAAGCCAG TCAATCATGCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA (SEQ ID NO:6);

R2 : TAATTTTATATACAAAATAAAAACATACACCAGAAACGTTTTTAGTTTTTATTT CAATATTCAGCACTGTCCTGCTCCTT (SEQ ID NO: );

2. 用此引物妒增 ga k基因表迭框,用 Dpn 消化迪夜后鈍化; 3. 用 VZV BAC特4匕大肋杆茵 SWlO2;

4. 挑取羊克隆接科到 5ml LB-CM (含氯霉素 LB) 的培莽基, 在 32 ° 吾莽3土夜;

5. 用迂夜培芥菌*美利,到 2 ml LB-CM 吾才糾液中, 32 C振蕩培 莽到 OD 直迭到 0.4-0.6;

6. 制各屯持細 & ( ZVbaC特 的大舫杆菌 SW 2) ;

7. 取1-2Ftl (約 2OOng)步驟2鈍化的 PCR戶物按奕施例 2中 的屯特參敬屯特到步驟 6中制各的 VZVBAC大肋杆菌 S 2感受志 細胞中;

8. 向丰叫匕細胞中加 m LB井于 32qC培芥l lJ 吋; 9. 恢夏后, 用 l,Mg益如下洗潦細菌 3次: 1320ORPM萬 沉 涎培莽物 15秒, 吸取萬 上清, 用 l,Mg盎重惠沉涎, 如上萬 tJ 重夏洗潦一次。 銓 3次洗潦后, 弄除上清液, 沉涎用 l,Mg盎 m 重惠。 重惠物、 10倍稀粹物、 100倍稀釋物加到含半乳糖、 亮氨酸、 生物素和氯霉素的M 基拙培莽基上。

10. 3 C培芥3天;

11. 挑取几介克隆到含有半乳糖、氯霉素指示刑的 走棟基氏球 脂培莽板上培芥, 茨得羊克隆。 培芥3天出現的克隆座核是Gal 污染,茨得羊一亮虹色克隆吋迸行下一步試. , 但是, 力了排除Ga- 盼 是非常重要的;

12. 挑取羊一亮虹色(半乳糖力唯一碳源的友棟基 培莽基上 。

培芥, G +)克隆, 接科到 5 ml LB-CM培莽液中, 32C迂夜培芥; 用迪夜培芥物制各BACDNA, 井用 PCR硝征含有 ga k基因, 所用引 物如下:

F3: CCTGTTGACAATTAATCATCGGC (SEQ ID NO:8);

R3: TCA GCACTGTCCTGCTCCT (SEQ ID NO:9);

13.以 F4(SEQIDNO:10)和R4(SEQIDNO:11)力引物的 RF7 近 3,端 457bp的 PCR折增 (457bp棲碼框序列 (SEQ ID NO:12) ) 。 由 于 F4 R4 引物玫汁引入了 1位城基移硝, 故折增戶物戶生移硝突 交。

F4和R4引物序列如下:

F4 : CGAATCGTCGGTTTGGAGGATTTATCCATAGTTCAATACGTTGGAAAGCCAGTC AATTTAATGGGATTTCTTGATCGCGGGG -(SEQ ID NO: 0)

R4 : AATTTTATATACAAAATAAAAACATACACCAGAAACGTTTTTAGTTTTTATTTC AATATGTGGTCCGTTCACACATGGAAAA SEQ ID NO:11)

457bp祺硝框序列如下:

GTCCGTTCACACATGGAAAACTCAAAACGGCTTGCTGATATGTGTTTAGCTGCAATTACC CATTTGT ATTTATCGGTTGGCGCGGTGGATGTTACTACGGATGATATTGTCGATCAAACCCTGAGAA TGACCGCTGAAAGTGAAGTGGTCATGTCTGATGTTGTTCTTTTGGAGAAAACTCTTGGGG TCGTTGCTAAACCTCAGGCATC GTTTGATGTTTCCCACAACCATGAATTATCTATAGCTAAAGGGGAAAATGTGGGTTTAAA AACATCACCTA TTAAATCGGAGGCGACACAATTATCTGAAATTAAACCCCCACTTATAGAAGTATCGGATA ATAACACATCT AACCTAACAAAAAAAACGTATCCGACAGAAACTCTTCAGCCCGTGTTGACCCCAAAACAG ACGCAAGATGT

aCaaCgCaCaaCCCCCgCgatCaagaaatCCCatg(SEQ ID N :12)

然后參照本奕施例的步驟4-10制各屯特感受志SW 2細胞。 14.2OOng含占步驟 alk基因側翼同源的 PCR戶物餐熱激吋告 化 50 1步驟 13的感受志細茵。 特it戶物加至u含l0 lL 吾莽.液的 5Oml堆形瓶中, 32C 4

7t.浴振蕩培莽4.5小忖迸行灰夏。 3之利,未吋同 恢夏旨在茨得只含目析序列的重組vzvBAc( 、

舍弄含ga k表匕框的VZV BAC) 。 因力 F4由 6Obp OFR7 5,端側翼同源序列和ORF7 j 3' 端 457bp反向序列組成, R4由 b FR7 3,端側翼同源序列和ORF7 近3,端 457bp正向序列組,成。 所以折增戶物勻 FR74立魚上的 ga k 基因同源重組吋, 3'端 4 7bp序列戶生翻特反向連接, 戶生翻特反 向移硝突奕突交(sEQ ID No:13), 不具表迭功能。 翻持反向移碼突 交序列如下:

CATGGGATTTCTTGATCGCGGGGGTTGTGCGTTGTACATCTTGCGTCTGTTTTGGGGTCA ACACGGG CTGAAGAGTTTCTGTCGGATACGTTTTTTTTGTTAGGTTAGATGTGTTATTATCCGATAC TTCTATAAGTG GGGGTTTAATTTCAGATAATTGTGTCGCCTCCGATTTAATAGGTGATGTTTTTAAACCCA CATTTTCCCCT TTAGCTATAGATAATTCATGGTTGTGGGAAACATCAAACGATGCCTGAGGTTTAGCAACG ACCCCAAGAGTTTTCTCCAAAAGAACAACATCAGACATGACCACTTCACTTTCAGCGGTC ATTCTCAGGGTTTGATCGACAA TATCATCCGTAGTAACATCCACCGCGCCAACCGATAAATACAAATGGGTAATTGCAGCTA AACACATATCA GCAAGCCGTTTTGAGTTTTCCATGTGTGAACGGAC(SEQ ID NO:13).

15. 如步踝 耗作, ;冗涎 m 吾芥物, 用 l,Mg盎洗潦細茵 3 次, ;冗涎用 l,Mg盎 m 重患。 重惠物和 104吾稀粹物各 0O 加 到 甘油、 、 生物 、 氧 乳糖和 素的

上。

1. 1C

1 . 羊 特到LB 和 a k

的平板上。 在LB M 未而在 上不生未的羊 , 提取 病毒基因 nd 完整性, 重組 N P 。 得到了 F 特反向 的 B ( B ) o 上 步驟所用試 的 下面的 1所示

和 病毒的 各

1. 得的 B 中提取 N , 特

中 、 增殖、 提取、 化。 . 將提取 化的 N 羊 特 至 ( a ch n , L u e a. 1) 細胞, B 上帝的 FP可以用于病毒在細胞中生長 增殖研究)或 e 休 同 特 至 a ch n L ue a .

) 細胞, B e 端的 oxP 完全 , 戶生 病毒。

似 ,可以得到 特反向 取代 的 病 毒, 由于 的 F 只有部分且 特反向序列, 所以, 此 段不能 , 更 F 功能。 因此, 具有相 同的功能。 病毒的

中 得的 病毒感染未成羊 的 細胞, 牛血清的 E , 胞病交友 , , 病交細胞 提取 N , 以 P ka 。 P

F 和 F 基因, H nd 消化 和 P ka 的 DN P 物和 nd 1消化 物用 0. 的 ,

F g. 。 D在 F 的 P 同 P ka的 致, 但在 F J沒有余 , F 缺失。 H nd 1 病毒的

上, 和P ka 同看不出差別。 病毒的

的外科剪刀和 子 胚胎的 和 脊骨的 ( ), 的 1 / 素的 PB , 然 特到 的 ( E , 1 熱天活的 牛血清和 1 / ) , 將 羊狂 到 中 覆蓋的 玻 上, 0. , , 次。 細胞 中 各 e o , 于 測和生長 分析(F g. )。 P ka, 和 新近感染的 e o細胞, 于 至 。

羊 在 中 的 玻 上。 1 于 病毒 , 于 e o細胞感染的生未 。 其余細胞 用力 ,細胞碎 p n 。 上 均分, 于感染 , 1 L , 另外, ( ) 于感染另 介 , ,下 小 , PB , 再 新 。

次 活性。 1 ug 的 c e n 1 , 器和軟件分析光子 。 結果 F g. B

結果表明, 在 e oJ 未正常, 而在背 市中 乎不生未。 不感染 細胞, 安全的 疫苗奠定了 。 病毒的 休 ( ) 各以及 F 缺失 否不 可以用 nd 而且可以 基因的同源重組 得完整的 以 。 即 細菌同源重組 拯救出完整的 , F g. 。 可以利用 nv ogen的高 aq N 聚合 P F 段, 將 到底 p E ox zeo的No 和Bg 魚 間 而形成p E zeo F 。 段 序分析 且 P 沒有 子 引 F 中。 以 p E zeo F

下 P zeo F 。

T T T T TT T T T T T T T T E D N )

T TT TT TT TT T T T T T T T T E D

得到的P 是 各 段 bp的 基因序列, kan 序列相連的, 于刪除的 F 上。 將得到的 合 上文提到的方法 特化到 有 F B 的 休中。重組休要通 含有 g/ 的 zeoc n nv ogen)和 1 . / 的 素的 平板 。 的

它們 抗生素的敏感狀況而 得。 的 是

、 、 zeoc n 、 那 敏感性以及 敏感 性的。 步 消化和P 分析 。

將 的 (即 有 F 缺失或者 uc B 拯 救子的大 接神于 1. 9/ 1的 素的 LB 中 C 小 。 B 的 N B DN 大量提取 ( B o c ence , Pa o o 得到, 且利用 特 Fu ene oche, nd anapo N)按照使用 特 細胞。 中的 2L( )在特 N 特 的使用比例 1. g 1。 般情況 可凡水痘病毒 。 水痘病毒基因 中去除B 休 ( 有 oxP ,可將 e 休 Z B 起 ( a ch L u e a. 1) , 利用 e 的特性而 切除B , 戶 生完整的

水痘 F 的病毒具有同 P ka病毒相同的生未和增 殖特性。 F 的功能可以 交手段得到 。 病毒的 e o細胞 中未成羊 的 e o 細胞分別 Luc 的 和P ka 感染, 以未感染的 e o細胞 , e o細胞 在 下 牛血清的 E 。 感染 小 , uc en 到 的細胞 中, 1 g/

1 , 不同孔的生物 休 像 統 e e enogen o po a on a eda )同 測量光子 , 每天測量 感染細胞, 測量 , 細胞 病毒 取代 uc e n

。 病毒 小 測量 次, 連 測量 。

測量的數 均值 同 制生未 。 結果 F g. 。

e o 細胞不 感染或者 水痘 病毒野生 ( uc )或者 或者 ( uc )感 染、 。 感染 每天 統測量光子 , 測量 的均值 同 制生未 中 測量 的 。 本 表明 M病毒和 病毒和野生 都可以在 e o 細胞中正常生未。 同 , 結果表明將B 插

常增殖, B J的基因也 常 , 即 可以 用作外 基因 的 休。 D 病毒在 胸腺 鎳的

胸腺 合移植休 休移植到雄性的 B /be ge 。 胸腺 合移植休 和使用 Jenn F. (Jou n o o ogy ept. 1 p. 的方法 。 移 植 , 胸腺 移植休 外科手木暴露 , 直接注射 1 至 1 PFU的 e o 的含有 的 D 和P ka,

細胞 , 每科病毒感染 只小鼠, 以未感染

感染 每天測量 。 腹腔注射 即 uc e n 生物 休內 像 統 在移植 的方法測量 , 每科病毒測量 只小鼠。 F g. 。 的 胸腺 不受病毒感染或者 野生 或者 感染, 。感染 每天 統測量光子 。 只 測量的光子 均值 同 制生未 。 中 只測 量 的 。 本 表明 缺陷 像野生 能在 胸腺 鋁 (T 細胞) 中生長。

似的 , 缺陷 也像野生 能在胸腺 T 細胞 中生未。 1 病毒的

胚胎 完整 Jenn e F. (Jou na O o ogy ep. p. ) 的方法 休移植到重症 合兔 疫缺陷( )小鼠皮下。移植 , 的

和P ka 感染 , 神病毒感染 只小鼠, 以未感染 , 感染 每天測量 。 腹腔注射 1 , 即 uc e , 生物 休 像 統 在移植 的方法測量 , 每科病毒測量 只小鼠。 結果 F g. 。

的 病毒野生 ( k ) 或者 F 缺失 ( )或者 F ( 感染、 以不 感染 的 , 。 感染 每天 統測量光子

只測量的光子均值 同 制生未 。 中 只測量 的 哉。 在 中有 重生未缺陷 功能 缺陷在 可以 。

似的 , 在 中也有 重生未 陷, 且 神功能缺陷在 可以 。 11 F 感染 必需的

1. 細胞瘤細胞感染

野生 T) F 刪除 ( ) 和 F

( ) 的 B N 特 e o細胞和 細胞瘤 ( ) 細胞。 研究 , T 在Me o細胞和 鉅細胞瘤細胞上 未正常, 但 不能在 細胞瘤細胞上 未 (F g. ) 研究結果 很可能是 感染 細胞所必需的。

. 移植休感染

了 步 本 中 的 使用植

( 移植休的重症 合兔疫缺陷 ( hu)模型 。 結果 , 野生 在 移植休中 介 暫的

(有 光現象) , 很可能 直 看。 但是, 不能在D 移植休中夏 。 結果表明, F 很可能是 Z 的 因 子 (F g. B ) o

以上 F 是 感染 必需的。 疫苗的 各以及 病毒的兔

.1感染未成羊 的 PE或M 細胞,病毒在 細胞上 附 , 向 中 病毒 于 C 。 細胞病交 到 左右 (通常 , . E T 消化 , 、 保 破碎和澄清 疫苗。

疫苗 皮下接 休 9 , 只/ ,

pFU/ . / , , 強兔 1 以P ka和 ka 迸行試淦。

加強兔疫后2周鉅 腔采血, 用gp-E SA栓測允疫血清抗休滴 度。 用兔疫抑制法栓測兔疫血清吋病毒的中和能力 。 兔疫血清或兔 前血清10倍稀釋后勻病毒1: 1混合, 37C培莽6 0分舛, 培芥混合液 感染MRC-5匆胞, 于37 5%

「 二氧化碳培芥箱中培芥7天后, 弄去培莽 液, 用考巧斯藍染包 汁蝕斑數再換算病毒滴度, 用100, (被兔 前血清中和的病毒滴度-被兔后血清中和的病 滴度) /被兔后血清 中和的病毒滴度。 栓定結果凡表2。

奕盼結果表明VZV-7DRM有良女子的兔疫 性, 抗休水平和V- ka 的相占, 且VZV-7DRM兔疫血清吋三株病毒都有良好的中和 用, 初 步昱示有疫苗升友前景。

美似的奕醃昱示, vzv-7D也具有良好的兔疫原性, 具有疫苗升 友前景。 奕施例13: VZV-7 DRM力栽休的生物活性原 h 各

用含ORF7側翼匹同源序列的EV7 l-VPl引物八PT-VP 席粒上PCR 妒增EV 7 l-VPl岡棲框。

岡棲框序列0□下:

TGGGAGATAGGGTAGCAGATGTAATTGAAAGCTCCATAGGAGATAGCGTGAGCAGAGCCC TCACTCA CGCTCTACCAGCACCCACAGGCCAGAACACACAGGTGAGCAGTCATCAACTGGATACAGG CAAGGTTCCAG CACTCCAAGCTGCTGAAATTGGAGCATCATCAAATGCTAGTGACGAGAGCATGATTGAGA CACGCTGTGTT CTTAACTCGCACAGCACAGCTGAGACCACTCTTGATAGTTTCTTCAGCAGAGCGGGATTA GTTGGAGAGAT AGATCTCCCTCTTAAAGGCACAACTAACCCAAATGGTTATGCCAACTGGGACATAGATAT AACAGGTTACG CGCAAATGCGTAGAAAGGTGGAGCTATTCACCTACATGCGCTTTGATGCAGAGTTCACTT TTGTTGCGTGC ACACCCACCGGGGAAGTTGTCCCACAATTGCTCCAATATATGTTTGTGCCACCTGGAGCC CCTAAGCCAGA TTCCAGGGAATCCCTCGCATGGCAAACCGCCACCAACCCCTCGGTTTTTGTCAAGCTGTC AGACCCTCCAGCGCAGGTTTCAGTGCCATTCATGTCACCTGCGAGCGCTTACCAATGGTT TTATGACGGATATCCCACATTC GGAGAACACAAACAGGAGAAAGATCTTGAATATGGGGCATGTCCTAATAACATGATGGGC ACGTTCTCAGT GCGGACTGTAGGGACCTCCAAGTCCAAGTACCCTTTAGTGGTTAGGATTTACATGAGAAT GAAGCACGTTA GGGCGTGGATACCTCGCCCGATGCGTAACCAGAACTACCTATTCAAAGCCAACCCAAATT ATGCTGGCAAC TCCATTAAGCCAACTGGTACCAGTCGTACAGCGATCACTACTCTTTAA (SEQ ID NO:1 )

pCR引物序列:

F6 ( RF7 5"端側翼匹同源序列, 起始密硝子和EV7l-VPl同源 序 :

CGAATCGTCGGTTTGGAGGATTTATCCATAGTTCAATACGTTGGAAAGCCAGT CAATCATGGGAGATAGGGTAGCAGATGTAA(SEQ ID NO:17)

R6 (ORF7 3"端側翼匹同源序列和EV7l-VPl同源序 J :

AATTTTATATACAAAATAAAAACATACACCAGAAACGTTTTTAGTTTTTATTTCAATATT TAAAGAGTAGTGATCGCTGTACGACTGGTA(SEQ ID NO: 8)

PCR戶物采用屯特手段特入含VZV-7DRMBAC的S 2細菌中, 按 照奕施例2篩迭重組菌, 銓荃定正硝后, 迢量培芥, d是取

VZV-7DRM-VPl BAC, 占 Cre表迭韋 扛一同屯特染至ARPE細胞, BAC 被C

「e酵伙其丙端的 oxP酵切位魚完全切除, 戶生VZV-7DRM-VPl重 組病毒。 重組病毒感染未成羊居的ARPE細胞, 35C培莽3-4天, 細 胞出現病交。 ,&集的病毒3吾莽上清、 細胞惠液婪反夏株融或超戶裂 解后的萬 f上清原4吾上梓, 采用EV71特弄的汲抗休夫 法栓測VPl 活性, 用EV7l和VZV-7DRM作吋照。 結果 (見表3)在VZV-7DRM-VPl 病毒感染的ARPE細胞中#金測到VPl活性, 表明VPl重組到VZV-7DRM 中。 ,比例表明vzv-7DRM能用作外源基因的表迭栽休 迭目杯蛋自。

表3: VZV-7DRM-VPl重組病毒的VPl活,性#金測 (灰抗休夫tJ法)

似的 , 可以用于 各 外 自的 休。 本 的 休 方式已 得到 的 , 本領域 木 特 理解。 已 公升的所有教寺 可以 那些 行各 修改和 , 均在本 的保 固 內。 本 的全部 固由 要求及其任何等同 。