【발명의 설명】

【발명의 명칭】

전이금속 복합체를 포함하는 산화-환원 고분자 및 이를 이용한 전기화학적 바이오센서

【기술분야】

관련 출원（들）과의 상호 인용

본 출원은 2018년 9월 18일자 한국특허출원 제 10-2018-0111633호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며， 해당 한국 특허 출원의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.

본 발명은 기존에 대비하여 간이한 단계로 제조가가능하며， 전이금속 복합체의 고정화율이 증가되고 작용기 또는 링커의 도입이 용이한, 전이금속 복합체를 포함하는 산화-환원 중합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

【발명의 배경이 되는 기술】

최근 의료 분야부터 환경 및 식품 분야까지 목표 분석물의 정량, 정성 분석을 위해 바이오센서의 개발에 대한 관심이 날로 증대되고 있다. 특히 효소를 이용한 바이오센서는 생물체의 기능 물질 또는 미생물 등 생물체가 특정 물질과 예민하게 반응하는 생물 감지 기능을 이용하여 시료에 함유되어 있는 화학 물질을 선택적으로 검줄 계즉하는 데 사용하는 화학 센서로 주로 혈당 센서와 같은 의료 계측 용도로 개발되었으며, 그 외 식품 공학이나 환경 계측 분야의 응용에서 역시 연구가 활발하게

이루어지고 있다.

당뇨 관리에 있어 혈당의 주기적인 측정은 대단히 중요하며， 이에 휴대용 계측기를 이용하여 손쉽게 혈당을 측정할 수 있도록 다양한 혈당 측정기가 제작되고 있다. 이러한 바이오센서의 작동원리는 광학적 방법 또는 전기화학적 방법에 기초하고 있고, 이러한 전기화학적 바이오센서는 종래의 광학적 방법에 의한 바이오센서와는 달리 산소에 의한 영향을 줄일 수 있으며， 시료가 혼탁하더라도 시료를 별도 전처리 없이 사용 가능하다는 장점을 갖는다. 따라서, 정확성과 정밀성을 갖춘 다양한 종류의 전기화학적 바이오센서가 널리 쓰이고 있다. 2020/059997 2 1»（：1^1{2019/006000

현재 상용화 된 전기화학적 혈당센서는 주로 효소 전극을 이용하는 것으로서，보다구체적으로는 전기적 신호를 변환할수 있는 전극 위에 글루코스산화효소를 화학적 또는 물리적 방법으로 고정시킨 구조를 가진다. 이러한 전기화학적 혈당센서는 혈액 등의 분석물 내의 글루코스가 효소에 의해 산화되어 발생하는 전자를 전극에 전달하여 생성되는 전류를 측정함으로써 분석물 내의 글루코스 농도를측정하는 원리에 의한 것이다. 효소 전극을 이용하는 바이오센서의 경우 효소의 활성 중심과의 거리가 너무 멀기 때문에 기질이 산화되어 발생 되는 전자를 직접적으로 전극에 전달하는 것이 용이하지 않은 문제가 발생한다. 따라서 이러한 전자 전달 반응을용이하게 수행하기 위하여 산화환원 매개체, 즉 전자전달매개체가 필수적으로 요구된다. 따라서， 혈당을측정하는 전기화학적 바이오센서의 특성을 가장크게 좌우하는 것은사용하는 효소의 종류와 전자 전달 매개체의 특성이다.

채혈 혈당 센서의 개발추이는 혈액 (정맥혈,모세혈 등)에 따라 달라지는산소 분압(1)0 ₂ ) 차이에 따른측정치 변화를 차단하기 위하여 혈액 내 글루코오스와의 효소 반응에서 산소가 참여하는 00 대신에 효소반응에 산소가 배제된 사용으로 전환되고 있으며, 전자 전달 매개체의 경우 습도에 따른 안정성이 민감한 습도에 따른 안정성이 우수한 퀴논 유도체

같은유기화합물과 오스뮴 착물과 같은 유기금속 화합물로 대체되고 있다.

가장보편적으로사용되는 전자 전달 매개체로는

포타슘페리시아나이드 [K ₃ Fe(CN) ₆ ]가 있는데, 가격이 저렴하고 반응성이 좋아서 이용한 센서 모두에 유용하다. 그러나, 이 전자 전달 매개체를 이용한 센서는 혈액에 존재하는

측정오차가 발생하고, 온도와습도에 의하여 변질되기 쉽기 때문에 제조와 보관에 각별히 주의해야 하며， 장시간보관후 바탕전류의 변화로 낮은 농도의 글루코오스를 정확하게 검출하는데 어려움이 있다.

핵사아민루테늄클로라이드 [1111어¾) ₆ (：1 ₃ ]는 페리시아나이드에 비하여 2020/059997 3 1»（：1^1{2019/006000

산화환원 안정성이 높아 이 전자 전달 매개체를 사용한 바이오센서는 제조와 보관이 용이하고 장시간 보관에도 바탕전류의 변화가 작아 안정성이 높은 장점을 갖지만, FAD-GDH와 사용하기에는 반응성이 서로 맞지 않아 상업적으로 유용한 센서로 제작하기가 어렵다는 단점이 있다.

또한, 이와 같은 바이오센서를 사용함에 있어 소량의 시료로

정확하게 빠른 측정값을 얻는 것은 사용자의 편리를 극대화한다는 점에서 대단히 중요한 문제이다.

따라서， 이와 같은 종래 전자 전달 매개체의 단점 및 측정 시간의 단축을 달성할 수 있는 새로운 전자 전달 매개체의 개발은 여전히 요구되고 있는 실정이다. 한편, 혈당을 지속적으로 관찰하여 당뇨병 등의 질환을 관리하기 위하여 연속적인 혈당 모니터링 (continuous glucose monitoring; CGM) 시스템을 이용하는데 손가락 끝에서 혈액을 채취하는 기존 효소센서는 채혈시 바늘로 인하여 상당한 고통을 유발하기 때문에 측정 빈도를 제한하므로 이러한

CGM에 이용될 수 없다. 이러한 문제점을 해소하기 위해서 최근에는 신체에 부착할 수 있어 침습을 최소화하는 개선된 버전의 효소센서가 개발되어오고 있다. 이러한 연속적인 혈당 모니터링 효소 센서의 경우 인체 내에 센서의 일부가 들어가기 때문에, 상기와 같이 전이금속 등을 포함하는 전자 전달 매개체가 인체에 흡수되어 독성 및 부작용을 발생하지 않도록 폴리비닐피리딘이나 폴리비닐이미다졸 등과 같은 중합체 백본으로 고정하여, 전자 전달 매개체의 인체 내 유실로 인한 문제점을 방지하고자 한다.

이와 같이， 전자 전달 매개체가 연결된 산화-환원 고분자의 경우 종래에는 주로 고분자 주골격에 전이금속 복합체를 효율적으로 고정하기 위하여, 활성화 에스테르 (active ester)인 N-하이드로석신이미드 (N- hydroxysuccinimide: NHS)를 이용한 짝지음 반응을 주로 사용하였다. 그러나, 이러한 기존 합성 방법에 의하는 경우 최종적으로 제조되는 산화-환원 고분자로 합성되기까지 매우 복잡한 단계를 거쳐야 하고, NHS를 사용한 짝지음 반응 진행시에 가수분해로 인한 전이금속 복합체의 고정화 효율이 실제로 높지 않으며， 고분자의 주골격에 다른 종류의 링커나 기능기를 2020/059997 4 1»（：1^1{2019/006000

도입하기 어렵다는문제가존재하였는바， 이러한문제를 해결할 수 있는 바이오센서용산화-환원 고분자의 개발에 대한요구가증가하고 있다.

【발명의 내용】

【해결하고자 하는 과제】

본 발명은 상기와 같은문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 기존에 대비하여 간이한 단계로 제조가가능하며, 전이금속 복합체의 고정화율이 증가되고 작용기 또는 링커의 도입이 용이한， 전이금속 복합체를 포함하는산화-환원 중합체 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른목적은 전이금속 복합체를 포함하는산화-환원 중합체를포함하는 전가화학적 바이오센서를 제공하는 것이다.

【과제의 해결 수단】

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 구리 촉매 및 열을 사용한 아자이드-알킨의 사이클로 부가반응과 빛을 이용한싸이올-엔 반응 등의 클릭 반응을 이용해 합성이 간단하고， 향상된 전이금속 복합체의 고정화율을 나타내며,추가적인 작용기 또는 링커의 도입이 용이한, 전이금속 복합체를 포함하는산화-환원 중합체 및 전기화학적 바이오센서, 예컨대 혈당 센서를 제공한다.

본 발명에 따른상기 전이금속 복합체를포함하는산화-환원 중합체는 폴리비닐피리딘 （1 ^> 0沙（ 11>¾） ₁₁ 句: 혹은 폴리비닐이미다졸 （1）017（ 11>¾1111（切2:01句: ） 같은 중합체 골격여 ）과 _· 오스뮴, 루쎄늄, 이리듐， 로듐, 철,코발트 등과 같은 전이금속 및 이의 배위자를 포함하는 전이금속 복합체, 그리고 상기 중합체 골격과 전이금속 복합체를 연결하는 링커 구조를 포함하는 것으로, 구체적으로는 하기 화학식 1 내지 4의 구조를 가진다: 2020/059997 1»（：1/10公019/006000

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[화학식 1]

2020/059997 1»（：1/10公019/006000

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[화학식 4]

상기 식에서，

M 은 0 ,모 11, 이루어진 군으로부터 선택되는

1종의 전이금속이고;

상기 식에서, 1 _^ 1 및 는 서로 합쳐져 하기 화학식 5 내지 7로부터 선택되는 바이덴테이트 리간드를 형성하고;

합쳐져 하기 화학식 5 내지 7로부터 선택되는 바이덴테이트 리간드를 형성하고;

느5 및 I 는 각각 서로 합쳐져 하기 화학식 5 내지 7로부터 선택되는 바이덴테이트 리간드를 형성하고;

[화학식 5]

2020/059997 7 1»(：1^1{2019/006000

[화학식 7]

상기 III,모2 및 ^1 은 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬기， 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알코올기， 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알킬할로젠기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 싸이올기， 치환 또는 비치환된 탄소수 3 내지 20의 알킬아자이드기， 치환 또는 비치환된 탄소수 7 내지 30의 아릴아자이드기， 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 40의 알케닐기, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 40의 알키닐기， 시아노기， 할로겐기， 중수소 및 수소로 이루어진 군으로부터 선택되고,

상기 113 내지 1120은 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 3 내지 40의 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 50의 아릴기， 치환 또는 비치환된 탄소수 3 내지 50의 헤테로아릴기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알콕시기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알코올기， 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알킬할로젠기， 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 싸이올기， 치환 또는 비치환된 탄소수 3 내지 20의

알킬아자이드기, 치환 또는 비치환된 탄소수 7 내지 30의 아릴아자이드기， 치환또는 비치환된 탄소수 6 내지 30의 아릴옥시기， 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알킬아미노기， 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 30의 아릴아미노기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알킬실릴기, 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 30의 아릴실릴기 , 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 50의 아릴알킬아미노기 , 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 40의 알케닐기， 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 40의 알키닐기 , 시아노기， 할로겐기, 중수소 및 수소로 이루어진 군으로부터 선택되고;

상기 쇼선는 1차 및 2차 아민기, 암모늄기, 할로젠기, 에폭시기， 2020/059997 1»（：1^1{2019/006000

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아자이드기 , 아크릴레이트기， 알케닐기 , 알키닐기 , 싸이올기 , 이소시아네이트, 알코올기, 맟 실란기로 이루어진 군으로부터 선택되고;

상기 X는 반대 이온 (counter ion)이고;

상기 a는 1 내지 15 의 정수이고;

상기 b는 1 내지 15 의 정수이고;

상기 c는 1 내지 15 의 정수이고;

상기 m은 10 내지 600 의 정수이고;

상기 n은 10 내지 600 의 정수이고;

상기 o는 0 내지 600 의 정수이다. 본 발명에서 제공되는 전이금속 복합체를 포함하는 산화-환원 중합체는 특유의 링커 구조를 가지고 있어， 기존에 대비하여 합성 단계가 감소하여 간이한 단계로 제조가 가능하며, 전이금속 복합체의 고정화율이 증가되고 작용기 또는 링커의 도입이 용이하다는 장점을 갖는다. 또한 본 발명에서 제공되는 전이금속 복합체를 포함하는 산화-환원 중합체는 3종의 바이덴테이트 리간드를 갖는 것이 바람직하다. 따라서, 이러한 산화-환원 중합체를 포함하는 전기화학적 바이오센서, 바람직하게는 연속적인 혈당 모니터링 센서는 제조시 경제적이고, 전이금속으로 인한 독성 및 부작용이 현저히 감소하고， 제조시 수율이 높다는 장점이 있다.

본 발명의 예는 적어도 두개의 전극을 갖춘 기판에, 상기 화학식 1 내지 4를 갖는 산화-환원 중합체에 액체성 생체시료를 산화환원시킬 수 있는 효소를 도포한 후 건조하여 제작한 전기화학적 바이오센서에 관한 것이다. 상기 전극의 예로는 작동전극 (working electrode)과 대향전극 (counter

electrode)일 수 있으며， 예컨대 효소와 전이금속 중합체는 작동전극에 도포되거나 그에 근접하여 위치할 수 있다.

본 발명의 구체예는 전기화학적 바이오센서의 적용 가능한 예로서 글루코오스를 측정하기 위한 바이오센서를 예시하고 있지만, 본 발명의 시약조성물에 포함되는 효소의 종류를 달리함으로써 콜레스테롤, 락테이트， 크레아티닌, 과산화수소, 알코올, 아미노산, 글루타메이트와 같은 다양한 물질의 정량을 위한 바이오센서에 적용할 수 있다. 2020/059997 9 1»（：1^1{2019/006000

이하， 본 발명을 더욱 자세히 설명한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 상기 화학식 1 내지 4의 산화-환원 중합체에서 상기 의 반대이온은, 음이온， 예를 들어,民（：1, 및 I로 이루어지는 군에서 선택될 수 있는 할라이드， 설페이트， 포스페이트， 핵사플루오로포스페이트, 테트라플루오로보레이트， 또는 양이온（바람직하게 1가 양이온）, 예를 들어 리륨, 나트륨， 칼륨, 테트라알킬암모늄 및 암모늄에서 선택되는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게， 상기 X는 클로라이드일 수 있다. 바람직하게, 상기 는 2 내지 10 의 정수일 수 있다.

바람직하게, 상기 는 2 내지 10 의 정수일 수 있다.

바람직하게， 상기 0는 2 내지 10 의 정수일 수 있다.

바람직하게， 상기 III은 15 내지 550 의 정수일 수 있다.

바람직하게, 상기 II은 15 내지 550 의 정수일 수 있다.

바람직하게, 상기 ₀ 는 0 내지 300 의 정수일 수 있다. ^' 바람직하게， 본 발명에 따른 산화-환원 중합체 매개체는 하기 화학식 8 또는 9의 구조를 가지는 것일 수 있으며 이에 제한되는 것은 아니다.

2020/059997 1»（：1^1{2019/006000

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[화학식 8]

본 발명에 따른 화학식 1 내지 4에서 선택되는 구조를 갖는 산화- 환원 중합체 중의 전이금속 복합체는 구체적으로는 오스뮴 복합체, 예를 2020/059997 1 1 1»（：1/10公019/006000

들어 3가오스뮴 복합체와 2가오스뮴 복합체를 포함할수 있으며， 바람직하게는산화상태의 화합물 (3가 Os 화합물)일 수 있다. 본 발명의 산화처리에 사용되는산화제는 특별히 한정하지 않으며， 구체적인 예는

NaOCl, H ₂ O ₂ , O ₂ , O ₃ , Pb ⁽ ) ₂ , M11O ₂ , KM11O ₄ , CIO ₂ , F ₂ , CI ₂ , H ₂ Cr ⁽ ) ₄ , N ₂ O, Ag ₂ 〔 ⁾ , OSO ₄ , H ₂ S ₂ O ₈ , 세릭 암모늄 나이트레이트 (CAN: Ceric ammonium nitrate) 피리디늄 클로로크로메이트 (pyridinium chlorochromate), 및 2,2’-디피리딜디설파이드 (2,2’- Dipyridyldisulfide)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 또한, 전이금속 복합체로서 산화상태와환원상태의 화합물을 포함하는 혼합물인 경우，산화 처리하여 산화상태의 전이금속 복합체 또는 산화상태의 전이금속 복합체의 염화합물을 제공할수 있다.

본 발명에 따른 전이금속 복합체는 적당한 반대 이온 및 이온을 갖고있는 염형태일 수 있으며， 염 화합물은 물 혹은 다른 수용액 혹은 유기용매에 높은 용해도를 가지므로 더욱 바람직하다. 상기 염화합물중에서 F, Cr 및 Br 등과 같은 작은 반대 음이온으로 이루어지는 경우 물 혹은 다양한수용액에 잘녹는 경향이 있으며 I , 핵사플루오로포스페이트 (PF ₆ 0 및 테트라플루오로보레이트 (BF ₄ ) 등과 같은 큰 반대 음이온으로 이루어진 군들은유기용매에 잘녹는 경향을 갖고 있다. 따라서 반대 음이온은， F, C1, Br및 I로 이루어지는 군에서 선택될 수 있는 할라이드와

핵사플루오로포스페이트 및 테트라플루오로보레이트， 또는 반대

양이온으로서 Li염， Na염, K염， Rb염, Cs염, Fr염, 테트라알킬암모늄 및 암모늄으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 염화합물일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적인 실시예에서, 본 발명에 따른산화-환원 중합체는 클릭 반응 (Click reaction)에 의해 중합체 골격과 전이금속 복합체를 반응시켜 합성할수 있다. 구체적으로 본 발명에 따른산화-환원 중합체 중 화학식 1에 따른 화합물은 하기와 같은 아자이드-알킨 휘스겐 사이클로

부가반응 (Azide-alkyne Huisgen cycloaddition)에 의해 제조될 수 있으며 , 이를 반응식 1에 나타냈으나, 이에 제한되는 것은 아니다. \¥0 2020/059997 1»(：1^1{2019/006000

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[반응식 1]

또한, 상기 화학식 2의 화합물은 다음과 같은 싸이올-엔 반응（!¾ ₀ 1- 의해 제조될 수 있으며 , 이를 반응식 2에 따라 나타낼 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.

[반응식 2]

바람직하게, 상기 반응식 1 또는 2에 따라 산화-환원 중합체를 제조하기 위한 출발물질로서 , 폴리비닐피리딘 또는 폴리비닐이미다졸을 기능화시켜 폴리비닐피리딘 또는 폴리비닐이미다졸 전구체로 할 수 있다. 이러한 기능화된 폴리비닐피리딘 또는 폴리비닐이미다졸 전구체는 각각 하기 화학식 10 또는 화학식 11의 구조를 갖는 것일 수 있다. 2020/059997 1»(：1/10公019/006000

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[화학식 10]

상기 고분자 전구체 구조에서 및 ¾ 는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알코올기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알킬할로젠기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 싸이올기， 치환 또는 비치환된 탄소수 3 내지 20의 알킬아자이드기, 치환 또는 비치환된 탄소수 7 내지 30의 아릴아자이드기, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 40의 알케닐기， 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 40의 알키닐기로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 기능화된 폴리비닐피리딘 또는 폴리비닐이미다졸 전구체는 예를 들어 하기 반응식 3에 나타낸 바와 같이 합성할 수 있다.

[반응식 3]

2020/059997 1»(：1/10公019/006000

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바람직하게，상기 반응식 1 또는 2에 따라산화-환원 중합체를 제조하기 위한출발물질로서， 전이금속 복합체를 기능화시킬 수 있다.

이러한 기능화된 전이금속 복합체는 예를 들어 하기 반응식 4와 5에 나타낸 바와 같이 합성할수 있다.

[반응식 4]

따라서, 추가적인 하나의 양태로서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 화학식 1 또는 2의 산화-환원 중합체의 제조방법에 관한 것이다:

0)폴리비닐피리딘 또는 폴리이미다졸을 기능화 시켜 폴리비닐피리딘 전구체 혹은폴리이미다졸 전구체를 제조하는 단계;

(11) 전이금속 복합체를 기능화시키는 단계; 및 2020/059997 15 1»（：1^1{2019/006000

（111）상기 단계 （ 에서 제조된 폴리비닐피리딘 전구체 혹은

폴리이미다졸 전구체 및 상기 단계 어）에서 제조된 기능화된 전이금속 복합체를 클릭 반응에 의해 반응시켜 상기 화학식 1 또는 2의 산화-환원 중합체를 제조하는 단계. 상기 각 단계의 구체적인 양태는 앞서 설명한 바와 같다. 이러한본 발명에 따른산화-환원 중합체의 전이금속 복합체는 정확하고, 재현성있고,신속하고 연속적으로 대상물질의 분석이 가능하게 할 뿐 아니라, 간이하고 경제적으로 높은 수율로 제조될 수 있고, 전이금속 유출로 인하여 발생할수 있는 독성이나부작용 문제가 현저하게 낮다는 장점을 갖는다. 본 발명에 따른산화-환원 중합체는 작동전극에 도포 또는

적층되거나 작동전극주변에 위치（예를 들어 용액 내에서 전극을 둘러싸는 구조）하여 작동전극과분석 대상물질 사이에서의 전자를 효소를 통하여 전달한다. 이러한산화-환원 중합체는 전기화학적 바이오 센서 내에서 작동 전극상에 여과될 수 없는 코팅을 형성할수 있다. 본 발명의 추가 일 양태는 액체성 생체시료를산화환원시킬 수 있는 효소와상기 산화-환원 중합체를 포함하는 전기화학적 바이오센서용 조성물에 관한 것이다.

산화환원효소는 생체의 산화환원반응을 촉매하는 효소를총칭하는 것으로, 본 발명에서는 측정하고자 하는 대상물질， 예컨대 바이오센서의 경우에는측정하고자 하는 대상물질과 반응하여 환원되는 효소를 의미한다. 이와 같이 환원된 효소는 전자 전달 매개체와 반응하며, 이 때 발생한 전류변화등의 신호를 측정하여 대상물질을 정량하게 된다. 본 발명에 사용 가능한산화환원효소는 각종 탈수소효소（（1 7（11'0§61 86）,산화효소（0닌（ 8句, 에스테르화 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있으며，산화환원 또는 검출 대상물질에 따라서, 상기 효소 군에 속하는 2020/059997 1»（：1^1{2019/006000

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효소들 중에서 상기 대상물질을 기질로 하는 효소를 선택하여 사용할수 있다.

보다구체적으로 상기 산화환원효소는 글루코오스탈수소효소 (glucose dehydrogenase), 글루탐산탈수소 JL소 (glutamate dehydrogenase),

글루코오스산화효소 (glucose oxidase), 콜레스테롤산화효소 (cholesterol oxidase), 콜레스테롤에스테르화효소 (cholesterol esterase), 락테이트산화효소 (lactate oxidase), 아스코르브산산화효소 (ascorbic acid oxidase), 알코올산화효소 (alcohol oxidase), 알코올탈수소효소 (alcohol dehydrogenase), 빌리루빈산화효소 (bilirubin oxidase)등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

한편，상기 산화환원효소는측정하고자 하는 대상물질 (예컨대， 대상물질)로부터 산화환원효소가 뺏어온 수소를 보관하는 역할을 하는 보조인자 (cofactor)를 함께 포함할수 있는데, 예컨대, 플라빈 아데닌 디뉴클레오타티드 (flavin adenine dinucleotide, FAD), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (nicotinamide adenine dinucleotide, NAD), 피롤로퀴놀린 퀴논 (Pyrroloquinoline quinone, PQQ)등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

예컨대, 혈중 글루코오스 농도를 측정하고자 하는 경우， 상기

산화환원효소로서 글루코오스 탈수소효소 (glucose dehydrogenase, GDH)를 사용할수 있으며, 상기 글루코오스 탈수소효소는 보조인자로서 FAD를 포함하는 플라빈아데닌디뉴클레오티드-글루코오스탈� �소효소 (flavin adenine dinucleotide- glucose dehydrogenase, FAD-GDH), 및/또는보조인자로서 FAD- GDH를 포함하는 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드-글루코� �스탈수소효소 (nicotinamide adenine dinucleotide- glucose dehydrogenase)일 수 있다.

구체예에서，상기 사용 가능한산화환원효소는 FAD-GDH (예컨대, EC 1.1.99.10등)， NAD-GDH (예컨대, EC 1.1.1.47 등)， PQQ-GDH (예컨대, EC1.1.5.2 등), 글루탐산탈수소효소 (예컨대, EC 1.4.1.2 등)， 글루코오스산화효소 (예컨대, EC 1.1.3.4등), 콜레스테롤산화효소 (예컨대, EC 1.1.3.6 등),

콜레스테롤에스테르화효소 (예컨대, EC 3.1.1.13 등), 락테이트산화효소

(예컨대, EC 1丄 ³ . ² 등), 아스코빅산산화효소 (예컨대, EC 1.10. ³ . ³ 등), 알코올산화효소 (예컨대, EC L1.3.13 등)， 알코올탈수소효소 (예컨대， EC U.1.1 2020/059997 17 1»（：1^1{2019/006000

등)， 빌리루빈산화효소 (예컨대， EC 1.3.3.5 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

본 발명에 따른조성물은 산화환원효소 100 중량부를 기준으로산화- 환원 중합체 20내지 700중량부, 예컨대 60내지 700 중량부 또는 30내지 340중량부를 함유할수 있다. 상기 산화-환원 중합체의 함량은

산화환원효소의 활성도에 따라서 적절히 조절할수 있다. 또한,본 발명에 따른 조성물은 가교제를 더 포함할수 있다.

한편,본 발명에 따른조성물은 계면활성제, 수용성 고분자, 4차 암모늄염, 지방산， 점증제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 첨가제를 시약 용해시의 분산제, 시약 제조시의 점착제, 장기 보관의 안정제 등의 역할을 위하여 추가로 포함할수 있다.

상기 계면활성제는 조성물을 분주할 때 조성물이 전극위에서 골고루 퍼져서 균일한두께로 분주되게 하는 역할을 하는 것일 수 있다. 상기 계면활성제로 트리톤 X- 100 (Triton X- 100), 소듐도데실설페이트 (sodium dodecyl sulfate), 퍼플루오로옥탄설포네이트 (perfluorooctane sulfonate), 소둠스테아레이트 (sodium stearate) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을사용할수 있다. 본 발명에 따른 시약조성물은, 시약을 분주할 때 시약이 전극위에서 골고루 퍼져서 시약이 균일한두께로 분주되게 하는 역할을 적절하게 수행하도록 하기 위하여， 상기 계면활성제를산화환원효소 100중량부를 기준으로 3 내지 25 중량부， 예컨대 10 내지 25 중량부의 양으로 함유할수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우산화환원효소 100중량부를 기준으로 계면활성제 10 내지 25 중량부를 함유할수 있으며,산화환원효소의 활성도가 이보다높아지면, 계면활성제의 함량을 이보다낮게 조절할수 있다.

상기 수용성 고분자는 시약조성물의 고분자지지체로서 효소의 안정화 및 분산 (dispersing)을 돕는 역할을 수행하는 것일 수 있다. 상기 수용성 고분자로는 폴리비닐피롤리돈 (polyvinyl pyrrolidone; PVP),

폴리비닐알코올 (polyvinyl alcohol; PVA), 폴리플루오로설포네이트 (perfluoro sulfonate), 하이드록시에틸 셀룰로오즈 (hydroxyethyl cellulose; HEC), 2020/059997 18 1»（：1^1{2019/006000

하이드록시프로필 셀룰로오즈 (hydroxypropyl cellulose; HPC), 카르복시메틸 셀룰로오즈 (carboxy methyl cellulose; CMC), 셀룰로오즈 아세테이트 (cellulose acetate), 폴리아미드 (polyamide)등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할수 있다. 본 발명에 따른 시약 조성물은, 산화환원효소의 안정화 및 분산 (dispersing)을 돕는 역할을중분하고 적절하게 발휘하도록 하기 위하여， 상기 수용성 고분자를산화환원효소 100 중량부를 기준으로 10 내지 70 중량부, 예컨대 30 내지 70 중량부의 양으로 함유할수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를사용하는 경우산화환원효소 100 중량부를 기준으로수용성 고분자 30내지 70중량부를 함유할 수 있으며, 산화환원효소의 활성도가 이보다높아지면,수용성 고분자의 함량을 이보다 낮게 조절할수 있다.

상기 수용성 고분자는 지지체 및 효소의 안정화 및 분산

(dispersing)을 돕는 역학을 효과적으로 수행하기 위하여 중량평균분자량이 2,500내지 3,000,000 정도， 예컨대, 5,000 내지 1,000,000 정도일 수 있다.

상기 점증제는 시약을 전극에 견고하게 부착하도록 하는 역할을 한다. 상기 점증제로는 나트로졸, 디에틸아미노에틸-텍스트란하이드로클로라� �드 (DEAE-Dextran hydrochloride)등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할수 있다. 본 발명에 따른 전기화학적 센서는,본 발명에 따른 산화- 환원 중합체가 전극에 견고하게 부착되도록 하기 위하여, 상기 점증제를 산화환원효소 100중량부를 기준으로 10 내지 90중량부, 예컨대 30 내지 90 중량부의 양으로 함유할수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인

산화환원효소를사용하는 경우산화환원효소 100 중량부를 기준으로 점증제 30 내지 90중량부를 함유할수 있으며, 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면, 점증제의 함량을 이보다낮게 조절할수 있다. 추가적인 양태로서, 본 발명은상기 산화-환원 중합체를 포함하는 전기화학적 바이오센서를 제공한다.

구체적으로, 상기 전기화학적 바이오센서의 종류에는 제한이 없으나， 바람직하게는 연속적인 혈당모니터링 센서일 수 있다.

이러한 연속적인 혈당모니터링 센서의 구성으로， 본 발명은, 예를 2020/059997 19 1»（：1^1{2019/006000

들어 전극, 절연체 (insulator), 기판, 상기 산화-환원 중합체 및 산화환원효소를 포함하는 센싱 막 (sensing layer), 확산 막 (diffusion layer), 보호 막 (protection layer) 등을포함할수 있다. 전극의 경우， 작동 전극 및 대향 전극과 같은 2종의 전극을 포함할수도 있고, 작동 전극, 대향 전극 및 기준 전극과 같은 3종의 전극을 포함할수도 있다. 일 구현예에서,본 발명에 따른

바이오센서는， 적어도두개, 바람직하게는 두개 또는 세개의 전극을 갖춘 기판에, 상기 화학식 1 또는 2를 갖는 산화-환원 중합체와 액체성

생체시료를산화환원시킬 수 있는 효소를포함하는 시약조성물을 도포한 후 건조하여 제작한 전기화학적 바이오센서일 수 있다. 예를 들면, 전기화학적 바이오센서에 있어서 작동 전극 및 대향 전극이 기판의 서로 반대면에 구비되고，상기 작동 전극 위에 본 발명에 따른산화-환원 중합체가포함되는 센싱 막이 적층되고, 작동 전극 및 대향 전극이 구비된 기판의 양쪽 면에 차례로 절연체， 확산막 및 보호막이 적층되는 것을 특징으로 하는 평면형 전기화학적 바이오센서가 제공된다. 구체적인 양태로서, 상기 기판은 PET(polye仕 lylene tereph仕 lalate),

PC(polycarbonate) 및 Pl(polyimide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 소재로 된 것일 수 있다.

또한, 작동 전극은 탄소， 금， 백금, 은 또는 은/염화은 전극을사용할 수 있다.

또한, 2 전극을 갖는 전기화학적 바이오센서의 경우 대향 전극이 기준 전극의 역할까지 같이 하기 때문에， 대향 전극으로 금， 백금，은 또는 은/염화은 전극을사용할수 있고, 기준 전극까지 포함하는 3 전극의 전기화학적 바이오센서의 경우, 기준 전극으로 금， 백금， 은또는 은/염화은 전극을사용할 수 있고, 대향 전극으로 탄소 전극을사용할수 있다.

확산막으로는 Nafion, cellulose acetate, silicone rubber를사용할수 있으며 ,보호막으로는 silicone rubber, polyurethane, polyurethane기반 copolymer 등을사용할수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

제한되지 않은 예로서, 2 전극인 경우 대향전극이 기준전극의 역할까지 같이 하기 때문에 염화은 또는 은이 사용 될 수 있으며, 3 전극일 2020/059997 1»（：1^1{2019/006000

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경우 기준전극이 염화은또는 은이 사용되고, 대향 전극은 탄소 전극을 사용할수 있다.

【발명의 효과】

본 발명에 따른산화-환원 중합체는 생산시 공정 단계의 수가 적어 경제적이고, 전이금속 복합체의 고정화율이 증가되고 작용기 또는 링커의 도입이 용이하여 이를 적용한 전기화학적 바이오센서는 간편하며 검출이 신속하고 경제적이라는 장점이 있다.

【도면의 간단한설명】

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서의 구조를 나타낸 도면이다.

도 2는 본 발명에 따른 전자 전달 매개체용산화-환원 중합체인 화학식 8의 화합물과 단일 03복합체를사용하여 순환 전압 전류 곡선을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.

【발명을실시하기 위한구체적인 내용】

이하,본 발명을 더욱상세하게 설명한다. 이하，본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니다.

［실시예］ 제조예 1:『화학식 81로표시되는산화-환원 중합체 화합물의 합성

1-1. 2,2，-바이이미다졸합성

500 11止의 3구 둥근 바닥플라스크에 40%글라이옥살（민 표 ） 수용액 79 11止（0.69 11101）를 넣고 0 ¾로 냉각후 암모늄아세테이트 370 11止（2.76X101）를 드롭핑 깔때기를 통해 3시간동안온도 상승에 주의해가며（30 이하） 천천히 적가하였다. 적가종료 후 45-50 °0 에서 하룻밤교반후 2020/059997 21 1»（：1^1{2019/006000

상온으로 냉각하였다. 생성된 고체는 여과후 에틸레글리콜에 녹여 핫-필터 (hot-filter)로 정제해 최종적으로 2, 2’-바이이미다졸을 얻었다. (10.1& 수율: 33%)

1-2. 메틸- 2, -바이이미다졸 합성

250 11止의 3구 둥근 바닥 플라스크에 2, 2’-바이이미다졸 2 g (l5

_ ₀ 1)을 넣고 무수디메틸포름아마이드 60 11止 에 녹인 후 0ᄋ 0：로 냉각한다. 수소화소듐 0.6은 (15 11111101)을 온도 상승에 주의해가며 소량씩 넣는다. 이 혼합물은 0ᄋ(：에서 한 시간 동안 교반 후에 아이오도메탄 1 11止(15 _01)를 실린지 펌프를 통해 천천히 적가한다. 적가 종료 후 상온에서 12시간 동안 교반한다. 최종 반응용액에 에틸아세테이트 100 11止를 넣고 생성된

요오드화소듐은 여과하여 제거한다. 여액은 감압농축하여 용매 제거 후 남은 고체는 에틸아세테이트와 핵산을 전개용매로 하여 컬럼크로마토그래피로 정제한다. 최종적으로 메틸- 2,2’-바이이미다졸을 얻었다. (0.8 _& 수율: 37%)

1-3. -디메틸- 2,2’-바이이미다졸 합성

500 mL의 3구 둥근 바닥 플라스크에 2,2’-바이이미다졸 5 g (37 mmol)을 넣고 무수디메틸포름아마이드 60 mL 에 녹인 후 우로 냉각한다. 수소화소듐 3 g (40 mmol)을 온도 상승에 주의해가며 소량씩 넣는다. 이 혼합물은 0 °C에서 한 시간 동안 교반 후에 아이오도메탄 2.5 mL (40 mmol)를 실린지 펌프를 통해 천천히 적가한다. 적가 종료 후 상온에서 24시간 동안 교반한다. 최종 반응용액에 물을 넣고 에틸아세테이트 (200 mL X 3) 와 함께 추출한후 유기층은 모아서 황산마그네슘으로 건조한다. 유기층은

감압농축하여 용매 제거 후 에틸 아세테이트와 핵산을 전개용매로 하여 2020/059997 1»(：1/10公019/006000

22

컬럼크로마토그래피로 정제한다. 최종적으로尺 '-디메틸- 2,2’-바이이미다졸을 얻었다. (5.1 _& 84%)

1-4. 부티닐- 메틸- 2,2’-바이이미다졸합성

NaH, Nal

0, 24 11

100 mL의 3구 둥근 바닥플라스크에 7V-메틸- 2,2’-바이이미다졸 1.5 g (lO mmol)을 넣고 질소하에서 무수디메틸포름아마이드 30 mL 에 녹인 후 수소화소듐 0.5 g (13 mmol)을 가한다. 이 혼합물은 상온에서 한 시간동안 교반후에 4 -브로모- 1-부틴 1.7 g (13 mmol)과요오드화소듐 1.5 g (10 mmol)을 넣는다. 반응용액은 질소하에서 80 °C로 가열하여 24 시간동안 교반한다. 최종 반응용액은 상온으로 냉각후 물 (100 mL)과 에틸아세테이트 (200 mL X 3) 와함께 추출한후유기층은 모아서 황산마그네슘으로 건조한다.

유기증은 감압농죽하여 용매 제거 하고 에틸 아세테이트와 핵산을

전개용매로 하여 컬럼크로마토그래피로 정제한다. 최종적으로 AT-부티닐- iv'- 메틸- 2,2’-바이이미다졸을 얻었다. (1.5 g, 74%)

1-5. [오스뮴 (111)( 八"-디메틸- 2,2’-바이이미다졸) ₂ ( -부티닐-八^-메틸- 2,2’- 바이이미다졸)] (핵사플루오로포스핀) 3 합성

100 mL의 3구 둥근 바닥플라스크에 환류응축기 , 기체유입구 및 온도계를 장착하고 N,N’-다메틸- 2,2’-바이이미다졸 2 g (13 mmol),

암모늄핵사클로로 오스메이트 (IV) 3 g (6.5 mmol)과 50 mL의 에틸렌글리콜을 2020/059997 1»（：1/10公019/006000

23

질소하에서 140 °(：로 24시간동안교반한다. -부티닐- -메틸- 2,2’- 바이이미다졸 1.3 _§ (6.5 _01)은 10 11 의 에틸렌글리콜에 녹인 후 상기 반응혼합물에 실린지를 이용해 넣는다. 이 혼합물은 다시 질소하에서 140 로 24시간동안교반한다. 반응 종류후 반응혼합물은 상온으로 냉각하고 생성된 붉은색 잔여물을 여과하여 제거한다. 여액은 300 11 의 물로 묶힌 후에 01X4클로라이드 레진을 넣고 공기중에서 충분히 산화시키기 위해 24시간동안교반한다. 상기 용액은 암모늄핵사플로오로포스핀 수용액에 적가하여 이온 교환된 금속 복합체를 침전물을 얻는다. 생성된 고체는 여과 후 물로 여러 번 씻어준 후 진공오븐에서 건조시켜 최종화합물 오스뮴 (III) 복합체를 얻는다. (5 _& 67%)

1-6.폴리 (4-(2 -아지도에틸)피리디늄)- -(4-(2 -아미노에틸)피리디늄)-에- ⁴ -비닐피리딘) 합성

250 mL의 3구둥근 바닥플라스크에 환류응축기, 기체유입구 및 온도계를 장착하고 폴리비닐피리딘 (poly(4-vinylpyridine): number average molecular weight: -160,000 g/mol) 20 g을 150 mL의 디메틸포름아마이드에 녹인다. 이 용액에 1-아지도- 2 -브로모에탄 4.5 g (30 mmol)과 2 - 브로모에틸아민 6.0 g (30 mmol)을 넣는다. 이 용액은 기계식 교반기를 이용해 90 °C에서 24시간동안교반한다. 반응 종류후 반응혼합물은 상온으로 냉각하고 에틸아세테이트 용액에 부어 침전물을 생성한다. 용매는 따라 버리고 생성된 고체는 메탄올 300 mL에 다시 녹여 감압농축한후 (150 mL) 다시 디에틸에터에서 침전물을 생성한다. 생성된 고체는 진공오븐에서 건조시켜 폴리비닐피리딘 전구체를 얻는다. (27 _& 90%) 2020/059997 1»(：1/10公019/006000

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1-7.산화-환원 중합체 1 합성 ［화학식 8］

50 mL의 컬쳐튜브에 폴리 (4-(2 -아지도에틸)피리디늄) -co-(4-(2- 아미노에틸)피리디늄) - _co -4 -비닐피리딘) 0.5 g을 10 mL의 증류수에 녹인 후 5 mL의 디메틸포름아마이드에 녹인 ［오스뮴 (III)(AW-디메틸- 2,2’- 바이이미다졸) ₂ (iV-부티닐- 메틸- 2, 2’-바이이미다졸)］ (핵사플루오로포스핀) ₃ 0.8 g을 넣는다. 반응혼합물에 구리 (I)촉매 (CuTc: Copper(I)仕 liophene carboxylate) 25 mg을 넣고 상온에서 12시간동안교반한다. 반응 종류후 반응혼합물은 에틸아세테이트 용액에 부어 침전물을 생성한다. 용매는 따라 버리고 생성된 고체는 아세토나이트릴 50 mL에 다시 녹이고 AG1X4클로라이드 레진과 물 (150 mL)을 넣어 24시간동안교반한다. 고분자 용액은 감압농축한후 (50 mL) 저분자량 (10,000 g/mol 이하)의 물질들을 제거하기 위해 투석

(dialysis)을 한다. 투석된 고분자 용액은동결 건조하여 최종산화-환원 중합체 1을 얻는다. (0.7 g) 실험예: 순환전압전류법을 이용한본 발명에 따른 전자전달 매개체용산화-환원 중합체［화학식 8］와 08복합체의 전기화학적 특성 확인 본 발명에 따른 08복합체를 포함하는산환-환원 중합체의 전자 전달 매개체로서의 성능을 확인하기 위하여, 다음과 같은 실험방법에 따라순환 전압 전류법을 이용한 전기화학적 특성을측정하였다. 2020/059997 1»（：1^1{2019/006000

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실험방법

① 하기 화학식 12 및 13의 오스뮴 복합체 2종 (03(111^111)3, 발명에 따른 화학식 8의 오스뮴-중합체 (어- | ₎₀ 1＞1161·)각각 20 1¾을 탈이온수와 0.1N1 염화나트륨 (30(1^111 ( 1011{16) 용액 5 에 녹였다.

② 용액 안의 산소를 제거하기 위해 10분 동안 아르곤으로 탈기하였다.

③ 산소가 탈기된 상기 용액에 작동 전극, 기준 전극, 대향 전극을 연결하고 아르곤하에서 전압의 변화에 따른 전기적 신호 변화를 측정하였다.

④ 이 실함결과를 각각도 2와표 1에 나타내었다.

[화학식 8]

2020/059997 1»(：1/10公019/006000

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[화학식 12]

실험재료/조건

작동전극 (working electrode): 유리탄소 전극 (dia: 3.0 mm)

기준전극 (Reference electrode): Ag/AgCl 전극

대향전극 (Counter electrode): 백금 로드 (Platinum rod)

시험 파라미터

-장비 : EmStat(P almS ens Co.)

-Technique: cyclic voltammetry

-Potential range: -1.0〜 1.0 V

-Scan rate: 10 mV/s

【표 1 ]

2020/059997 1»(：1^1{2019/006000

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도 2와 표 1에서 나타낸 것과 같이 오스뭄 트리스 （111）（ "-디메틸- 2,2’-바이이미다졸）, 오스뮴 （111）（尺 ：디메틸- 2,2’-바이이미다졸） ₂ （ -부티닐-八"- 메틸- 2,2’-바이이미다졸）과 함께 산화-환원 중합체 ［화학식 8］의 순환 전압 전류 곡선을 측정한 결과 3개의 화합물 모두 거의 동일한 위치에서 산화- 환원 전위가 나타났다. 따라서 본 발명에 따른 산화-환원 중합체의 전자전달 매개체로서의 성능은 단일 오스뮴 복합체와 동일함을 간접적으로 확인할 수 있었다.