Изобретение относится к области органической химии, в частности к новому оксимсодержащему полимеру, который может найти применение при синтезе полипептидов, содержащих С-концевые функциональные группы различной природы.

Синтетические полипептиды находят широкое применение в качестве основы при разработке различного рода лекарственных препаратов, вакцин и материалов медицинского назначения.

Предшествующий уровень техники

Одним из наиболее эффективных методов промышленного получения полипептидов является метод твердофазного синтеза [см., например, B.W. Erikson and R.B. Merrifield, Proteins, 3 255-527 (1976)]. В данном случае первый аминокислотный остаток присоединяют к нерастворимому полимерному носителю с последующим повторением стадий ацилирования и деблокирования до получения последовательности необходимой длины. Далее пептид отщепляют от полимерного носителя с одновременным удалением защитных групп под действием сильных кислот, очищают с помощью хроматографии и подвергают лиофильной сушке.

В литературе описано большое количество полимерных носителей, используемых при проведении синтеза твердофазным методом. Помимо природы полимерной матрицы и степени ее сшивки, существенным моментом является структура используемой линкерной группировки. Линкерная, то есть функциональная группа, позволяющая присоединить аминокислотный остаток к полимеру, определяет способ присоединения пептида к полимерному носителю, условия его отщепления и возможности получения конечного продукта в виде свободной кислоты, амида, замещенного амида, гидразида, эфира и т.д. Большое внимание уделяется также разработке эффективных методов циклизации пептидов на полимере, поскольку циклопептиды обладают большей устойчивостью к ферментативному расщеплению и, в ряде случаев, более высокой биологической активностью, чем линейные.

Таким образом, выбор полимерного носителя и особенно структуры линкерной группы определяют эффективность его использования для синтеза биологически активных полипептидов или реакционноспособных блоков для дальнейшего наращивания пептидной цепи. Особенный интерес представляет полимер Кайзера, который в качестве линкерной группы содержит оксим п-нитробензофенона [W.F. DeGrado and Е.Т. Kaiser, J. Org. Chem. 1980, 45, 1295 - 1300]: где M - полимерная матрица, в данном случае сшитый сополимер стирола с дивинилбензо лом .

Полимер Кайзера был с успехом использован для синтеза циклических пептидов и получения линейных полипептидов в форме амидов, эфиров и гидразидов. Однако у полимера Кайзера есть некоторые недостатки, а именно:

- в процессе синтеза исходного полимерного носителя используются токсичные реагенты, такие как нитробензол и дихлорэтан.

- в процессе пептидного синтеза полимер Кайзера недостаточно стабилен к действию трифторуксусной кислоты, используемой для удаления временной трет- бутилоксикарбонильной защитной группы; неполная устойчивость связи пептид- полимер в условиях деблокирования аминогруппы приводит к ограничению длины синтезируемых пептидов из-за их постепенного отщепления от полимерного носителя;

- в процессе синтеза полипептидов с использованием полимера Кайзера возможно отщепление пептида от полимерного носителя под действием оснований, в результате чего исключается возможность предварительной нейтрализации, и основание приходится добавлять на стадии образования пептидной связи, что ограничивает выбор используемых синтетических приемов.

- неустойчивость связи пептид - полимер к действию оснований делает невозможным его использование в синтезе с применением щелочнолабильных защитных групп таких, как 9-флуоренилметоксикарбонильная защита. Раскрытие изобретения

Объектом данного изобретения является новый оксимсодержащий (оксимный) полимер - полимерный носитель для синтеза линейных и циклических полипептидов, содержащих различные функциональные группы на С-конце пептидной цепи

Дополнительно ставится задача упрощения получения оксимного полимера при использовании легкодоступных исходных соединений и реагентов и отсутствии необходимости применения токсичных растворителей таких, как нитробензол и дихлорэтан.

Поставленные задачи решаются тем, что предлагается оксимный полимер, представляющий собой полимерную матрицу, модифицированную оксимом левулиновой кислоты общей формулы где М - полимерная матрица.

Для получения оксимного полимера нами используется левулиновая (4 - оксопентановая) кислота.

В качестве полимерной матрицы может использоваться сополимер стирола с дивинилбензолом; аналогичный полимер с привитым полиэтиленгликолем; полиэтилен, перекрестно сшитый полиэтиленгликолем; полимеры на основе акриламида и многие другие сополимеры. При этом, для использования в синтезе, полимерная матрица должна содержать аминогруппу.

Заявляемый оксимный полимер может быть получен в результате ацилирования аминогруппы аминометилированного сополимера стирола и дивинилбензола или других сополимеров, содержащих аминогруппу, действием левулиновой кислоты в присутствии конденсирующих агентов, таких как диизопропилкарбодиимид, дицикл огексилкарбодиимид, 2-(6-хлоро-1-Н- бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетрамети� �уроний гексафторфосфат (HCTU), N,N,N',N'- тетраметил-0-(1Н- бензотриазол-1-ил)уроний тетрафторборат (TBTU), N,N,N',N'- тетраметил-0-(1Н- бензотриазол-1-ил)уроний гексафторфосфат (HBTU) и других, используемых для твердофазного пептидного синтеза, с последующей обработкой солянокислым гидроксиламином в присутствии пиридина.

В примере 1 показан синтез оксимного полимера, путем модификации матрицы на основе сополимера стирола с дивинилбензолом. В примерах 2 - 4 показаны устойчивость заявляемого оксимного полимера к воздействию трифторуксусной кислоты и оснований, а также исследована возможность рацемизации при отщеплении пептида от полимерного носителя.

Пример 1. Синтез ]\-(левулиноил)оксим-а\шнометил полистирольного полимера

7 г аминометил-полистирольного полимера (IRIS Biotech GmbH; емкость 0.56 мМ/г) выдерживали в 50 мл хлористого метилена в течение 1 ч. Растворитель отфильтровывали и к полимеру добавляли 1.34 г (11.76 мМ, 3 экв) левулиновой кислоты, растворенной в 35 мл хлористого метилена, перемешивали в течение 10 мин и добавляли 1.82 мл (11.76 мМ, 3 экв) N,N’ -диизопропилкарбодиимида. Полимер перемешивали в течение 1 ч и оставляли на ночь при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровывали и полимер последовательно промывали (по 3 раза) хлористым метиленом, диметилформамидом и этанолом. Полноту реакции ацилирования контролировали при помощи теста Кайзера (нингидриновый тест [Kaiser Е., Colescott R.L., Bossinger C.D., Cook P.I., Anal. Biochem. 34: 595, 1970]).

К полученному на предыдущем этапе левулоил-аминометил- полистирольному полимеру добавляли 70 мл этанола, 7 г гидрохлорида гидроксиламина и 7 мл пиридина. Суспензию полимера кипятили с обратным холодильником в течение 6 ч и оставляли на ночь при комнатной температуре. Полимер отфильтровывали и последовательно промывали 2 раза этанолом, 2 раза 50% водным этанолом, 3 раза диметилформамидом, 2 раза этанолом и 2 раза диэтиловым эфиром. После высушивания в вакууме получено 7.5 г полимера.

Данные ИК спектроскопии, полученные с помощью ИК Фурье-спектрометра (Vertex 70; Bruker) свидетельствуют о наличии полосы поглощения при 1716 см ¹ (полоса колебания кетогруппы С=0) после присоединения к исходному полимеру левулиновой кислоты. Эта полоса исчезает после обработки гидроксиламином, приводящей к образованию оксима.

Определение емкости полимера (количества реакционноспособных групп на грамм полимера) с помощью загрузки 9-флуоренилметоксикарбонил-алан� �ном, деблокирования и спектрофотометрического определения количества образующегося дибензофульвена [Gude М., Ryf J., White P.D., Letters in Peptide Science, 9: 203, 2002] показывает, что модификация проходит практически на 100%.

Пример 2. Определение устойчивости оксимного полимера к действию трифторуксусной кислоты

К 200 мг оксимного полимера, предварительно промытого хлористым метиленом, добавляли раствор 9-флуоренилметоксикарбонил-алан� �на (0.174 г; 0.56 мМ) в 2 мл хлористого метилена и перемешивали в течение 10 мин. К реакционной смеси добавляли N,N’ -диизопропилкарбодиимид (0.87 мкл; 0.56 мМ) и оставляли на 8 ч. Растворитель отфильтровывали, и полимер промывали 2 раза диметилформамидом, 2 раза хлористым метиленом и 3 раза диэтиловым эфиром, после чего высушивали в вакуум-эксикаторе. Емкость загруженного полимера определяли по методике, приведенной в примере 1.

Загруженный полимер выдерживали в трифторуксусной кислоте в течение 3 ч, промывали 3 раза хлористым метиленом и 3 раза диэтиловым эфиром, после чего высушивали в вакуум-эксикаторе. Определение емкости полимера по методике, приведенной в примере 1 показывает, что она не изменяется в пределах погрешности эксперимента.

Пример 3. Определение устойчивости оксимного полимера к действию основания - 1,8-диазабицикло(5.4.0)ундец-7-ена Полимер, полученный по методике, приведенной в примере 2, обрабатывали 2% раствором 1,8-диазабицикло(5.4.0)ундец-7-ена в диметилформамиде (1x2 мин и 1x8 мин) и промывали 2 раза диметилформамидом, 2 раза изопропиловым спиртом и 3 раза диметилформамидом. К деблокированному полимеру добавляли раствор 9- флуоренилметоксикарбонил-фенил� �ланина (194 мг; 0.5 мМ) и этил циано(гидроксиимино)ацетата (71 мг; 0.5 мМ) в диметилформамиде. К реакционной смеси при перемешивании добавляли 1Ч,]ЧР-диизопропилкарбодиимид (0.77 мкл; 0.5 мМ) и оставляли на 8 ч. Растворитель отфильтровывали, и полимер промывали 3 раза диметилформамидом и 3 раза диэтиловым эфиром, после чего высушивали в вакуум-эксикаторе.

Определение емкости полимера по методике, приведенной в примере 1, показывает, что она не изменяется в пределах погрешности эксперимента.

Пример 4. Анализ возможности рацемизации в условиях отщепления пептида от полимерного носителя

Важным условием при проведении синтеза биологически активных полипептидов является сохранение оптической чистоты аминокислотных остатков (отсутствие рацемизации). Для определения отсутствия рацемизации в процессе отщепления пептида от оксимного полимера был использован высокочувствительный тест, предложенный Ф. Альберичио [Subiras-Funosas R., Prohens R., Barbas R., El-Faham A., Albericio F., Chem. Eur. J., 15: 9394, 2009]. Тест основан на проведении реакции конденсации между бензилоксикарбонил- фенилаланил-валином и амидом пролина с последующим разделением образующихся диастереомеров с помощью высокоэффективной обращенно-фазовой хроматографии (ОФ ВЭЖХ) Z-Phe-Val-OH + H-Pro-NH2 Z-Phe-Val-Pro-NFE _.

К 250 мг оксимного полимера, содержащего присоединенный бензилоксикарбонил-фенилаланил- валин, суспендированного в 2 мл тетрагидрофурана, добавляли 5 экв амида пролина и выдерживали в течение 8 ч. Растворитель упаривали и продукт анализировали с помощью ОФ ВЭЖХ с использованием реперных соединений: бензил оксикарбони л- Л-фенилаланил-Л- валил-Л-пролинамида и бензилоксикарбонил-Л-фенилалани л-Д-валил-Л- пролинамида. Результаты анализа свидетельствуют об отсутствии значимой примеси бензилоксикарбонил-Л-фенилалани л-Д-валил-Л-пролинамида, что позволяет сделать вывод о том, что в условиях отщеплении пептида от полимерного носителя с помощью аминолиза рацемизации не происходит.

Пример 5. Синтез модельных трипептидов BOC-Gly-Phe-Ala-OH и

BOC-Gly-Phe-Ala-OMe

Возможность применения заявляемого полимера для синтеза пептидов и их производных оценивали на примере получения трет-бутилоксикарбонил-глицил- фенилаланил-аланина (BOC-Gly-Phe-Ala-OH) в виде соединения со свободной карбоксильной группой и в виде соответствующего метилового эфира (BOC-Gly- Phe-Ala-OMe).

Для получения исходного пептидил полимера использовали стандартные методы твердофазного пептидного синтеза. Трет-бутилоксикарбонильную защиту удаляли действием 25%-ного раствора трифторуксусной кислоты в хлористом метилене, присоединение второго и третьего аминокислотного остатка проводили под действием 2-(6-хлоро- 1 -Н-бензотриазол- 1 -ил)- 1,1,3 ,3 -тетраметилуроний гексафторфосфата (HCTU) в диметилформамиде в присутствии диизопропилэтиламина.

Отщепление пептида от полимерного носителя проводили при использовании 140 мг пептидилполимера и 42 мкл 1,8-диазабицикло(5.4.0)ундец-7-ена в 2 мл смеси тетрагидрофуран/вода (95:5 при получении пептида со свободной карбоксильной группой) и 2 мл смеси тетрагидрофуран/метанол (95:5 при получении пептида метилового эфира).

Аналогичный (контрольный) синтез проводили на полимере Кайзера.

Для оценки чистоты полученного сырого продукта (неочищенного пептида) использовали метод высокоэффективной обращенно-фазовой хроматографии. Полученные результаты приведены в таблице ниже:

Содержание целевого продукта (%) Как видно из приведенных данных, заявляемый оксимсодержащий сополимер может быть синтезирован при использовании легкодоступных исходных соединений и реагентов, причем его синтез не требует применения токсичных растворителей таких, как нитробензол и дихлорэтан.

Высокая стабильность заявляемого оксимсодержащего полимера к действию трифторуксусной кислоты снимает ограничения при синтезе полипептидов с использованием кислотолабильной трет-бутилокискарбонильной (ВОС) защиты.

Устойчивость его к действию деблокирующих агентов таких, как 1,8- диазобицикло[5.4.0]ундек-7-ен (DBU) делает возможным использование щелочнолабильной 9-флуоренилметоксикарбонильной (Fmoc) защиты, по крайней мере, на некоторых стадиях синтеза.

При этом наблюдается отсутствие значимой рацемизации на стадии отщепления конечного продукта от полимерного носителя.

Все это позволяет успешно использовать заявляемый оксимный полимер при получении полипептидов и их производных, содержащих различные С-концевые функциональные группы.

Промышленная применимость

Заявляемый оксимсодержащий полимер может быть использован в технологическом процессе синтеза полипептидов, содержащих С-концевые функциональные группы различной природы, которые находят широкое применение в качестве основы при разработке различного рода лекарственных препаратов, вакцин и материалов медицинского назначения.