技术领域

本发明属于应用环境微生物和农业领域， 涉及一种加氧酶基因 cace^及其编码的蛋白质和 应用。 背景技术

除草剂的使用在减轻农业劳动强度、保证农业 正常生产的同时，其残留也带来了严重的作 物药害问题，据统计我国每年农田受除草剂药 害面积达到 3000万亩，其中严重药害面积达到 500 万亩， 每年造成几十亿元的损失， 而抗除草剂转基因是解决除草剂药害的最佳途 径。 氯代乙酰 胺类除草剂是一类高效、 高选择性的触杀性除草剂， 对禾本科杂草具有非常显著的杀除效果。 氯代酰胺类除草剂是目前国际上大量使用的除 草剂之一， 至 2007年，年产量与使用面积仅次于 有机磷除草剂， 居世界第二位， 其主要代表品种甲草胺、 乙草胺和丁草胺， 其中以乙草胺的使 用量最大。随着农业劳动力的减少和农业耕种 方式的改变， 该类除草剂的需求和使用量还将持 续增加。

氯代乙酰胺类除草剂化学性质较稳定，在土壤 残留期长， 并且该类除草剂及其代谢产物会 从土壤迁移进入地下水，造成生活水源污染。 研究表明该类除草剂有些品种具有致畸变和致 突 变性， 甲草胺、 乙草胺和丁草胺被美国环保局定为 B-2类致癌物， 异丙甲草胺被定为 C类致癌 物 （USEAP, 1994)， 因此， 环境及农产品中氯代乙酰胺类除草剂残留严重 危害人类健康。

氯代乙酰胺类除草剂对鱼类有很强的毒性， 比对哺乳动物的毒性大 500-10000倍， 因此该 类除草剂进入水体将会对渔业资源带来严重的 危害。乙草胺和丁草胺对土壤微生物数量及土 壤 中细菌、 放线菌、 真菌生长速率均有抑制作用， 并显著降低土壤微生物多样性。

此外， 氯代乙酰胺类除草剂如乙草胺和丁草胺对农作 物具有较严重的药害，特别是在有机 质含量较低的砂型土壤、或用药量过大、 或施药后遇持续低温高湿天气时， 会严重影响作物的 生长，近年来我国因乙草胺和丁草胺因使用不 当带来的作物药害时有发生，对农业造成严重 的 损失。 因此，土壤和水体环境中氯代乙酞胺类除草剂 残留污染严重危害人类健康、破坏生态环境 及对作物具有严重药害。 获得氯代乙酰胺类除草剂的降解菌株和降解基 因在治理除草剂残留， 消除其药害技术研发中具有以下作用和功能， （一） 通过现代生物技术将降解基因导入作物构 建相应的能降解氯代乙酰胺类除草剂抗性转基 因作物， （二） 用于土壤、 水体中除草剂氯代乙 酰胺类除草剂残留中间产物的消除， （三） 用于有用化工产品及药物合成的生物转化。 因此降 解基因在消除该类除草剂药害及生物转化领域 中具有非常重要的理论和应用价值。 发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提 供一个新的降解甲草胺、 乙草胺和丁草胺等 多种氯乙酰胺除草剂的加氧酶基因 cace

本发明的另一目的是提供该基因编码蛋白质。

本发明的又一目的是提供该基因及其编码的蛋 白质的应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一个降解氯乙酰胺除草剂的加氧酶基因 caceft 其核苷酸序列为 SEQ ID NO. 1。

本专利所用的出发菌株为一株能够降解氯乙酰 胺除草剂的细菌菌株 sp. DC-2 (保藏于中中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 CCTCCNO: M 2012190 ) 。 通过多次传 代获得了一个该菌株的突变株 DC-2 MUT (保藏日期 2013. 4. 28，保藏号为： CCTCCNO: M 2013164)。 菌株 DC-2 MUT ( CCTCCNO: M 2013164)失去了降解甲草胺、 乙草胺和丁草胺等氯乙酰胺除草剂 的能力。 菌株 DC-2降解乙草胺的第一步反应是在一个加氧酶� �催化下生成生成 2 - 氯 -N- ( 2- 乙基 -6-甲基苯基） 乙酰胺。

降解氯乙酰胺除草剂的加氧酶基因 勺获得是采用生现代生物信息学手段获得（技 术 路线见图 1 )。 即通过比较野生株 DC-2和突变株 DC-2 MUT的基因组信息， 寻找在野生株 DC-2基因 组存在， 但在突变株 DC-2 MUT中缺失的加氧酶基因。 首先提取野生株 DC-2和突变株 DC-2 MUT 的总 DNA， 把总 DNA进行基因组测序， 组装， KEGG数据库比对。 测序结果表明， 野生株 DC-2基因 组大小为 6， 334， 837bp， 481个 scaffold; 突变株 DC-2 MUT基因组大小为 6， 325， 634bp， 892个 scaffold。

经过对野生株 DC-2 ( CCTCCNO: M 2012190 ) 和突变株 DC-2 MUT ( CCTCCNO: M 2013164) 比对， 发现在野生菌株总基因组中一个 Rieske (2Fe-2S) domain-containing 蛋白类型的加氧 酶基因在突变株 DC-2 MUT中丢失了， 该蛋白和 RW1 中的一个加氧酶 vani l late monooxygenase同源性 43%。 将包含该基因的 1. 2K片段通过 PCR从野生菌株中扩增出来酶连在 pBBRlMCS-5构建重组载体， 通过转化的方法导入到£ coli DH5 α , 获得了重组菌株^: coli DH5 a -CaceO, 通过三亲结合将包含该加氧酶基因的重组载体 互补到突变株 DC_2 MUT获得重组 菌株 DC-2 MUT-Cace0(技术流程见图 2)。检测了重组菌株^: coli DH5 a -CaceO和 DC-2 MUT-CaceO 对甲草胺、 乙草胺和丁草胺的降解情况， 结果表明获得该加氧酶基因的重组菌株 coli DH5 ct -CaceO和 DC-2 MUT-CaceO均获得了降解甲草胺、 乙草胺和丁草胺的能力， 表明该基因确 实为降解氯代乙酰胺除草剂的目标基因， 将该基因命名为 cace 气质联用检测了 coli DH5 a -CaceO对乙草胺的降解代谢产物， 结果表明^: coli DH5 a -CaceO水解乙草胺生成 2 - 氯 -N- ( 2-乙基 -6-甲基苯基） 乙酰胺 （见图 3)。

所述的加氧酶基因 cac 编码的蛋白质 CaceO, 其氨基酸序列为 SEQ ID NO. 2。

含有所述的加氧酶基因 cac 的重组表达载体 _P BBRlMCS5-cace0。

含有所述的重组表达载体 pBBRlMCS5_cace0的基因工程菌株 E. coli DH5 a -Cace0。 所述的加氧酶基因 cace^在降解和转化氯乙酰胺除草剂中的应用。 其中所述的氯乙酰胺 除草剂优选甲草胺、 乙草胺或丁草胺中的一种或多种。

所述的含有加氧酶基因 caceO的重组表达载体在降解和转化氯乙酰胺除� ��剂中的应用。 其中所述的氯乙酰胺除草剂优选甲草胺、 乙草胺或丁草胺中的一种或多种。

所述加氧酶基因 cace^在构建抗氯乙酰胺除草剂的转基因作物中� ��应用。 其中所述的氯 乙酰胺除草剂优选甲草胺、 乙草胺或丁草胺中的一种或多种。

所述加氧酶 CaceO在降解氯乙酰胺除草剂中的应用。 其中所述的氯乙酰胺除草剂优选甲 草胺、 乙草胺或丁草胺中的一种或多种。

所述加氧酶 CaceO在去除土壤、 水体中氯乙酰胺除草剂残留中的应用。 其中所述的氯乙 酰胺除草剂优选甲草胺、 乙草胺或丁草胺中的一种或多种。 本发明的有益效果如下：

本发明出发菌株为一株鞘酯菌 i Sphingobi DC-2 ( CCTCCNO: M 2012190 ) , 菌株 DC-2能够降解乙草胺生成 2-乙基 -6-甲基苯胺； 降解甲草胺和丁草胺生成 2 ，6二乙基苯胺。 在 此基础上， 从菌株 DC-2中克隆到降解甲草胺、 乙草胺和丁草胺的加氧酶基因 cace 在 GenBank 比对结果表明该基因为一个新的基因， 全长 （从起始密码子到终止密码子） 为 1047 bp , 编码 348个氨基酸。 该基因能够降解氯乙酰胺除草剂， 可在构建抗氯乙酰胺除草剂的转基因作物中 应用。该基因的编码蛋白可在降解氯乙酰胺除 草剂或除土壤、水体中氯乙酰胺除草剂残留中 应 用。 附图说明 图 1降解氯代乙酰胺类除草剂的加氧酶 因克隆技术路线图。

图 2加氧酶基因 力能验证技术路线图。

图 3 A图为乙草胺标准品液相检测图谱；

B图为重组菌株 E. coli DH5 a -CaceO降解乙草胺的液相检测图谱；

C图为 B图中产物的质谱图。

D图为甲草胺标准品液相检测图谱

E图为重组菌株 E. coli DH5 a -CaceO降解甲草胺的液相检测图谱；

F图为 E图中产物的质谱图。

G图为丁草胺标准品液相检测图谱

H图为重组菌株 E. coli DH5 a -CaceO降解丁草胺的液相检测图谱；

I图为 H图中产物的质谱图。 生物材料保藏信息

氯代乙酰胺类除草剂降解菌 DC-2,分类命名为 quisquiliarum DC_2， 保存在 中国典型培养物保藏中心 （CCTCC) , 地址为中国武汉， 武汉大学， 保藏编号为 CCTCC NO: M 2012190, 保藏日期为 2012年 5月 30日。

突变株 DC-2 MUT , 分类命名为 ^wV^ sp. DC-2， 保存在中国典型培养物保藏中心 ( CCTCC), 地址为中国武汉， 武汉大学， 保藏编号为 CCTCC NO: M 2013164, 保藏日期为 2013 年 4月 28日。 具体实施方式

实施例 1. 乙草胺降解基因的克隆（策略图见图 1 )

1. 1突变株 DC-2 MUT的获得

常温下乙草胺的水溶性 225mg/kg， 所以含有 400mg/kg乙草胺的 LB平板产生浑浊， 降野 生菌株 DC-2 ( CCTCC NO: M 2012190 ) 划线在 LB平板 （含有 400mg/kg乙草胺） 上 30°C培养 时会有透明圈的出现， 以此肉眼简单的来判断乙草胺的降解。然而经 过多次传代， 发现一个菌 落其周边没有产生透明圈。 挑选此菌落至 100ml LB液体培养基中， 待菌株培养至对数后期， 6 000离心蒸熘水洗涤 2遍， 重悬至 20ml (含 100mg/kg乙草胺） 无机盐验证效果。 结果表明 其丢失了降解乙草胺的功能， 命名此菌株 DC-2 MUT ( CCTCC NO: M 2013164)。 1.2细菌基因组总 DNA的提取

菌株 \)C-2 Sphin _g obiums . ) (CCTCCNO: M 2012190)及 DC-2 MUT (CCTCC NO: M 2013164) 大量培养后， 采用高盐结合 CTAB法提取高纯度、 大片段的 DC-2的基因组总 DNA， 溶于 TE缓 冲液 （pH8.0)中， 置于 -20°C保藏， 具体方法参考 F ·奥斯伯等编的 《精编分子生物学实验指 南》。

1.3 DNA样品寄送与检测

细菌基因组测序要求样品 0D值在 1.8-2.0之间， 浓度越高越好， 浓度不低于 30 ng/μΐ, 达到精细图至少需要样品量 30微克。 将准备好的足量的 DNA样品在干冰保温下寄送至美吉生 物科技。

样品检测采用： 1. 浓度检测， 琼脂糖凝胶电泳定量； 2. 0D260:280和 0D260/230检测方 法： NanoDrop。

1.4 菌株基因组测序

DNA样品检测合格后建库， 测序， 并对数据进行基本分析 (包括碱基识别、 过滤接头序列、 去污染）。 然后进行后续生物信息分析， 主要包括基因组序列组装、 基因组成分分析、 基因功 能注释以及比较基因组分析等。

1.5 测序片段组装与分析

运用 SOAPdenovo组装软件对 reads数据进行组装，得到 scaffold序列并作相关基本数据 统计。

1.6 基因预测与功能注释

采用 Glimmer3.0基因预测软件对组装结果进行基因 ώ？ ο ο预测， 并对预测的基因与数据 库比对并进行功能注释。

基因注释主要基于蛋白序列比对。将基因的序 列与各数据库进行比对，得到对应的功能注 释信息。 由于每一条序列可能会有许多比对结果， 这里为了保证其生物意义， 我们保留一条比 对效果最好的结果， 作为此条基因的注释。 所有的注释均使用 BLAST软件结合各个数据库的特 点完成。 BLAST的版本为： blastall 2.2.21, 供注释的蛋白库为： KEGG、 GO等。

1.7 菌株 DC-2基因组和 DC-2 MUT 基因组的比较

基因组测序结果， 野生株DC-2基因组大小为6，334，837bp， 481个 scaffold, 大于 1000bp 的 scaffold有 388个， 通过 ώ? Ο Ο预测共 6612个 0RF； 突变株 DC_2 MUT基因组大小为 6， 325, 634bp, 892个 scaffold,大于 lOOObp的 scaffold有 704个，通过 ώ? Ο Ο预测共 6779个 0RF。 采用 0MIGA3.0将菌株 DC-2 MUT的 892个 scaffold与野生菌株 DC_2基因组一一比较， 结果发 现， 野生菌株 DC-2基因组中有 50个片段大约 20KB序列在 DC-2 而 T 中没有找到。 20KB的序列中 有可能含有传代过程中丢失的功能片段。 然后对 20KB的序列进行 0RF预测， 蛋白的翻译， 重点 寻找 Rieske (2Fe-2S) domain-containing 蛋白类型的加氧酶， 把这些加氧酶放在 NCBI网上 Blast, 比对结果发现其中一个 Rieske (2Fe-2S) domain-containing蛋白类型的加氧酶和 Sphingomoans RW1 vanillate monooxygenase同源性 43%， 命名此蛋白为 CaceO, 氨基酸序歹 |J如 SEQIDN0.2所示， 相应的基因为 caceO, 核苷酸序列如 SEQ ID N0.1所示。

1.8设计引物对含 cace片段 PCR扩增验证

根据含 cace片段设计引物对野生菌株 DC-2菌落及突变菌株 DC-2 MUT菌落进行 PCR扩增， 结 果只有野生菌株 DC-2中能扩增到相应的片段。

1.9 野生菌株 DC-2 PCR产物测序

将 1.7中的 PCR产物 TA克隆到 pMD-18 T simple载体上送至南京金丝瑞生物科技公司测序 。 结果与预测的片段 100%同源。

实施例 2 加氧酶基因 caceCtC力能验证技术路线图 （策略图见图 2)

2.1菌株 DC-2基因组 DNA提取

同 1· 1

2.2包含 因的 1.2K核酸片段 PCR扩增

以正向引物： 5- CGGGATCCCGGCCAGTTCCGCCGCCCCAAAATCCA ( SEQ ID N0.3 ) 下划线为 EcoR I 酶切位点和反向引物： A2： 5- CGGAATTCCGCTACCCCGCCGACACAGCGACGACC (SEQIDN0.4) 下划线 BamH I酶切位点为引物， 用 PCR从 ^ /¾ ^ ™ DC-2 (CCTCCNO: M 2012190) 基因组 DNA中扩 增 1· 2K-cace0 _o

扩增体系：

Prime STAR TacM (5U/ 1) 0.5 μ 1

5 X PrimeSTAR Buffer (Mg ²⁺ Plus) 25 μ 1

dNTP Mixture (各 2.5mM) 5 μ 1

模板 DNA 10 ng

正向引物 （20μΜ) 1μ 1

反向引物 （20μΜ) 1μ 1

灭菌蒸熘水 至 50 μ 1 PCR扩增程序：

a. 98 °C 变性 lmin;

b. 98 °C 变性 15s， 53°C退火 15s， 72°C延伸 70 s， 进行 30个循环；

c. 72°C延伸 10 min， 冷却到室温。

2. 3 PCR产物用 BamH I和^ 酶切。

酶切体系：

Nde I 1 μ 1

EcoRI 1 μ 1

DNA μ g

灭菌的蒸熘水 加至 20 μ 1

在 37°C水浴中， 反应 10h以上。 酶切产物进行 0. 75%的琼脂糖凝胶电泳切胶回收。

2. 4 pBBRlMCS-5 (购自上海北诺生物科技有限公司） 用 BamH I和 EcoRI双酶切 （参考 2. 3)。 2. 5 转化

2. 3中的回收片段和 2. 4中酶切好的 pBBRlMCS-5进行酶连。 酶连好 pBBRlMCS5_cace0重 组质粒转化到 E. coli DH5 α (购自 TransGen Biotech) 获得重组 E. coli DH5 a -CaceO, 挑取 阳性克隆子。 E. coli DH5 a -CaceO在辅助菌 E. coli HB101 (pRK600 ) (购自 Novegen公司） 的辅助下， 将 pBBRlMCS5-ca _C e0互补到突变株 DC-2 MUT (降解乙草胺性状丢失）中， 结合子涂 布在含有 100mg/kg Str 和 50mg/kg Gm的 LB平板上， 长出的单菌经过提取质粒验证， 获得阳 性克隆子 DC-2 MUT-Cace0。

2. 6基因工程菌株降解效果的验证及产物的鉴定

将 E. coli DH5 a -CaceO和 DC_2 MUT- CaceO接种到含有 50mg/kg Gm的 100 LB液体中生 长至对数中后期， 离心收集菌体， 用灭过菌的蒸熘水离心洗涤菌体 2遍。然后菌体分别添加在 含 100mg * L— ¹ 甲草胺、 乙草胺和丁草胺的基础盐培养基中， 使基础盐培养基 0D ₆ 。。=2， 37°C， 180 r · min ¹ 摇床培养 48h。 基础盐培养基配方为： 5. 0g * L— ¹ 葡萄糖， 1· 0 g · L— ¹ 譚 0 ₃ ， 1. 0 g · L— ¹ NaCl, 1. 5g · L- ¹ K ₂ HP0 ₄ ， 0· 5 g · L- ¹ KH ₂ P0 ₄ ， 0. 02 g · L- ¹ MgS0 ₄ · 7H ₂ 0， 100 mg · L— ¹ 维生素 B12, 调节 pH 到 7. 0。

采用高效液相色谱测定降解效果， 方法如下： 首先往上述基础盐培养基中分别加入等体积 的二氯甲垸进行全量提取， 剧烈振荡后静置分层， 然后取 lml下层二氯甲垸挥发完全后， 加入 lmL 甲醇溶解 (色谱纯)， 用滤膜 (孔径 0.22μιη)过滤。 液相色谱条件： 流动相为甲醇： 水（80: 20, V/V) , Zorbax C218 0DS Spherex 反相柱（5 μ πι， 4. 6mm X 250mm, Agi lent, USA) ， 柱温 为室温， 紫外检测器， 测定波长 230nm， 进样量 20 μ L， 流速为 0.8mL · min-1。 结果见图 3。 余下的滤液取 10 L采用气质联用检测的提取液中的成分， 检测方法： 柱型： BD-5MS石 英毛细管柱（15mX0.25mmX0.25 m); 样品进样量： 2 μ L; 分流比： 30; 载气： 氦气； 载气流 速 lml/min; 进样口温度为 230°C， 柱温为 200°C。 一级质谱条件： 离子检测方式为多反应离 子检测； 离子极性为负离子； 离子化方式为电喷雾离子化； 毛细管电压为 4000 伏； 干燥气温 度： 33CTC; 干燥气流速： 10.0L/min， 雾化气压力： 35psi， 碰撞电压： 135 伏； 质量扫描范 围（m/z): 300-500。 二级子离子质谱条件： 碰撞电压： 90 伏； 质量扫描范围 （m/z): 30-400。

结果显示， 基因工程菌株催化乙草胺水解生成 2 - 氯 -N- (2-乙基 -6-甲基苯基） 乙酰胺， 水解甲草胺和丁草胺生成 2 - 氯 -N- (2， 6-二乙基苯基） 乙酰胺。