DOMAINE TECHNIQUE AUQUEL SE RAPPORTE L'INVENTION

La présente invention se rapporte au domaine des probiotiques. En particulier la présente invention porte sur des microcapsules de pectine comprenant des probiotiques sous forme de biofilm, son procédé de fabrication et ses utilisations.

ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE

Le tractus gastro-intestinal de l'Homme compte 10 ¹⁴ micro-organismes en cohabitation dont la plupart se situent au niveau du côlon avec une concentration autour de 10 ¹¹ -10 ¹² bactéries/mL. Grâce aux techniques moléculaires et de culture en constante évolution, à ce jour plus de 1000 espèces bactériennes ont été identifiées comme résidentes du tractus gastro-intestinal humain et un individu serait l'hôte d'au moins 160 espèces bactériennes différentes. Cette population au niveau des intestins appelée microbiote intestinal joue un rôle important dans la physiologie de l'hôte (digestion et assimilation des nutriments, protection contre la colonisation de pathogènes et modulation des réponses immunitaires). Une dysbiose du microbiote intestinal correspondant à un déséquilibre dans sa composition a pu être associée à de nombreuses pathologies humaines, comme l'obésité, la maladie de Crohn, ou encore la colite ulcéreuse. L'ingestion de probiotiques peut modifier la composition du microbiote intestinal et ainsi permettre de rétablir son équilibre.

Les microorganismes les plus utilisés en tant que probiotiques sont des bactéries appartenant aux genres Lactobacillus et Bifidobacterium, hôtes naturels du microbiote intestinal de l'homme. L'efficacité des probiotiques est spécifique à la souche, et chaque souche peut contribuer à la santé de l'hôte grâce à des mécanismes différents. Parmi ces mécanismes, la modulation des fonctions immunitaires au niveau intestinal est recherchée pour les probiotiques par rapport à leur capacité anti-inflammatoire.

Cependant, après ingestion, les probiotiques sont confrontés à un certain nombre de stress environnementaux avant d'arriver sur leur site d'action, tels que l'acidité gastrique, la présence d'enzymes hydrolytiques ou encore les sels biliaires produits par l'intestin grêle.

Or, pour être efficaces sur la flore intestinale, les probiotiques doivent y parvenir en nombre suffisant. Ils doivent donc notamment être capables de résister à l'acidité gastrique et à celle du suc pancréatique lors de leur passage dans l'estomac pour être libérés vivants dans les intestins. En effet, environ 90 % des probiotiques ingérés sont détruits face à ces conditions de stress physicochimique (pH acide et force ionique élevée).

Pour compenser la mortalité bactérienne et permettre aux bactéries de mieux résister aux stress rencontrés dans le tractus gastro-intestinal, une première solution apportée par l'état de la technique consiste à formuler les probiotiques avec une charge bactérienne importante. En effet, la quantité de probiotiques vivants lors de l'ingestion doit être suffisante pour qu'ils puissent persister dans le tractus gastro-intestinal.

Cependant, cette première solution n'est pas satisfaisante dans la mesure où de nombreux probiotiques ne résistent pas au stress rencontré dans le tractus gastro-intestinal avant d'arriver sur leur site d'action. En outre, le coût de production lié à cette approche est assez onéreux et se répercute sur le prix final des probiotiques.

Une deuxième solution consiste à encapsuler les bactéries probiotiques dans une matrice, généralement en alginate, et/ou d'adapter les bactéries probiotiques aux conditions de stress rencontré dans le tractus gastro-intestinal avant d'éventuellement les encapsuler.

La publication de Cheow et al., 2013, BioMacromolecules, décrit par exemple des microcapsules d'alginate ou de carraghénane revêtues de chitosan comprenant des probiotiques (Lactobacillus rhamnosus GG) qui ont été incubés in situ de sorte à former un biofilm. Cette publication montre que l'encapsulation de probiotiques sous forme de biofilm permet d'améliorer la viabilité des probiotiques lorsqu'ils sont soumis au stress dû à la lyophilisation ou à un séjour prolongé à la chaleur (60 à 70°C). Toutefois, il a été démontré que les microcapsules d'alginate ou de carraghénane comprenant des probiotiques sous forme de biofilm ne permettent pas d'améliorer leur viabilité dans un liquide gastrique simulé par rapport à des microcapsules comprenant des probiotiques planctoniques. Cette publication conclut que les capsules d'alginate recouvertes de chitosan représentent le système de diffusion des probiotiques le plus approprié dû à leur profil de relargage et à leur viabilité lors de leur stockage. Elle indique également qu'il existe un besoin dans l'état de la technique pour fournir de nouvelles capsules qui incorporent des matériaux protecteurs additionnels afin de protéger les probiotiques aux expositions thermiques et acides.

La publication de Cheow et al., 2014, Carbohydrate Polymers, qui est une continuité de la publication mentionnée ci-dessus, décrit des microcapsules d'alginate/farine de graines de caroube et/ou d'alginate/gomme de xanthane comprenant un biofilm de Lactobacillus rhamnosus GG formé in situ. Ces microcapsules présentent une meilleure résistance au stress et notamment au milieu acide que les microcapsules décrites précédemment.

Cependant, ces microcapsules, bien que satisfaisantes, peuvent être améliorées pour permettre par exemple, une adhésion optimale des probiotiques au niveau des intestins.

On connaît également de l'état de la technique, la publication de Nabil Aoudi, et Aurélie Rieu, et al. 2014, Cellular Microbiology, qui divulgue notamment que des bactéries, dont Lactobacillus casei, sous forme de biofilm, présentent des propriétés anti- inflammatoires au niveau des intestins supérieurs à ces mêmes bactéries cultivées sous forme planctonique.

Ainsi, les conditions de culture des probiotiques et les procédés de formulation des microcapsules/capsules restent à définir et à optimiser afin notamment d'améliorer la survie des bactéries probiotiques, ainsi que leur fonctionnalité dans l'intestin.

Il est donc souhaitable de disposer d'une nouvelle formulation qui permette de fournir des bactéries probiotiques présentant un niveau de survie aux différents niveaux du tractus gastro-intestinal qui soit satisfaisant, à savoir qui permette de produire les bactéries probiotiques sous une forme viable et active de sorte à pouvoir agir au niveau de l'intestin.

II est également utile de disposer d'une nouvelle formulation qui puisse être simple à réaliser, économique et réalisable à l'échelle industrielle.

Le but de la présente invention est ainsi de proposer une nouvelle microcapsule évitant au moins en partie les inconvénients précités et permettant notamment d'améliorer la survie des bactéries probiotiques au niveau du tractus gastro-intestinal, tout en étant simple à mettre en œuvre.

En particulier, un but de l'invention est de fournir des microcapsules permettant d'améliorer la survie des bactéries probiotiques au niveau de l'estomac, de les vectoriser jusque dans le côlon et de les libérer dans un état physiologique propice à leur implantation et à leur activité probiotique.

OBJET DE L'INVENTION

Ainsi, la présente invention concerne des microcapsules destinées à protéger des probiotiques (bactéries ou levures par exemple), comprenant une enveloppe et un cœur dans lequel sont dispersés lesdits probiotiques sous forme de biofilms répartis en amas distincts, caractérisés en ce que ladite enveloppe et ledit cœur sont composés de pectine.

Selon l'invention, « les probiotiques » sont définis comme étant des microorganismes vivants (levures ou bactéries) exerçant une action bénéfique sur la santé de l'hôte qui les ingère en améliorant l'équilibre de la flore intestinale, au-delà des effets nutritionnels traditionnels. Cette définition a été approuvée par l'Organisation des Nations Unies pour l'Alimentation et l'Agriculture (ONUAA) et l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS).

Selon divers modes de réalisation de l'invention, les caractéristiques suivantes peuvent être utilisées seules ou selon toutes les combinaisons techniquement possibles: - les biofilms issus des probiotiques sont formés in situ ;

- la concentration en probiotiques au sein de microcapsules varie de 8 à 1 1 log UFC/g, de préférence varie de 9,5 à 10,5 log UFC/g, et typiquement est de 10 log UFC/g ;

- ladite enveloppe et le cœur composant les microcapsules sont en pectine amidée et méthylée présentant :

- un degré d'amidation (DA) allant de 5 à 30 %, de préférence de 20 à 30 % et ;

- un degré d'estérification (DE) allant de 5 à 50 %, de préférence de 20 à 30 % ;

- les probiotiques sont choisis parmi : une bactérie probiotique, telle que Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus, Propionibacterium, Bacillus et Streptococcus, etc. ou une levure, telle qu'une levure du genre Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces. boulardi, etc., ou un de leurs mélanges ;

- ledit cœur comprend une autre substance active non probiotique (à savoir différente d'une bactérie probiotique ou d'une levure), telle qu'un polyphénol, une vitamine, un prébiotique, tel que l'inuline, les fructo-oligosaccharides (FOS), etc., ou un de leurs mélanges ;

- les microcapsules se présentent sous forme déshydratée (par exemple lyophilisée) ou congelée, de sorte à optimiser leur conservation.

La présente invention porte également sur une formulation probiotique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins les microcapsules telles que décrites ci- dessus.

Un autre objet de la présente invention porte sur un procédé de fabrication de microcapsules telles que décrites ci-dessus, comprenant les étapes suivantes :

(i) la préparation d'un mélange homogène composé d'au moins: une solution ou une émulsion huile/eau de pectine contenant une suspension de probiotiques ;

(ii) l'encapsulation de gouttelettes de ce mélange homogène dans une solution de réticulation, de sorte à former des microcapsules comprenant : une enveloppe en pectine et un cœur formant un réseau en pectine, dans lequel les probiotiques sont immobilisées ;

(iii) la mise en culture des microcapsules obtenues à l'issue de l'étape (ii) dans un milieu de culture, de sorte à former in situ au sein des microcapsules des biofilms répartis en amas distincts à partir des probiotiques immobilisés ;

(iv) éventuellement, la déshydratation (comme la lyophilisation) ou la congélation des microcapsules obtenues à l'issue de l'étape (iii).

Selon divers modes de réalisation de l'invention, les caractéristiques suivantes peuvent être utilisées seules ou selon toutes les combinaisons techniquement possibles:

- le mélange homogène de l'étape (i) comprend une teneur en pectine, en masse, par rapport au volume total de la solution, allant de 2 % (m/v) à 10 % (m/v), de préférence de 3 % (m/v) à 8 % (m/v) et typiquement de 3,5 % (m/v) à 5 % (m/v) ;

- le mélange de l'étape (i) comprend une concentration en probiotiques allant de 10 ⁵ UFC/mL à 10 ⁹ UFC/ml_, de préférence de 10 ⁶ UFC/mL à 10 ⁸ UFC/ml_ et typiquement de l'ordre de 10 ⁷ UFC/mL ;

- l'étape d'encapsulation (ii) comprend une première sous-étape d'injection (iia) par des moyens permettant le goutte à goutte du mélange de l'étape (i) dans la solution de réticulation mise sous agitation, de sorte à ce que chaque goutte forme une microcapsule lorsqu'elle entre en contact avec la solution de réticulation ;

- l'étape d'encapsulation (ii) comprend une deuxième sous-étape dite de réticulation des microcapsules (iib) comprenant la mise en maturation des microcapsules obtenues lors de la sous-étape d'injection (iia) pendant une durée d'au moins 3 minutes, de préférence allant de 5 à 60 minutes, et en particulier allant de 10 à 25 minutes ;

- la solution de réticulation est composée de cation divalent, tel que Ca ²⁺ , Zn ²⁺ , Ba ²⁺ , Fe ²⁺ sous forme de chlorure, sulfure, acétate, ou un de leurs mélanges, et est en particulier Ca ²⁺ sous forme de chlorure ;

- lors de l'étape (i), une autre substance active non probiotique, telle que du polyphénol, des vitamines, des minéraux, un prébiotique, etc. est ajoutée au mélange homogène.

La présente invention concerne également à l'utilisation des microcapsules telles que décrites ci-dessus, ou de la formulation probiotique susmentionnée comprenant lesdites microcapsules, ou des microcapsules obtenues selon le procédé susmentionné, pour protéger les probiotiques lors du passage dans l'estomac et à les délivrer sous une forme active au niveau de l'intestin chez un animal.

« Par animal » selon l'invention, on entend les mammifères, les oiseaux, les poissons, les insectes, etc., ainsi que l'être humain.

La présente invention a également pour objet des microcapsules décrites ci- dessus, ou de la formulation probiotique susmentionnée ou des microcapsules obtenues selon le procédé décrit ci-dessus, pour son utilisation comme médicament.

L'invention se rapporte également à des microcapsules décrites ci-dessus, ou de la formulation probiotique susmentionnée ou des microcapsules obtenues selon le procédé décrit ci-dessus pour une utilisation chez l'animal afin :

- d'empêcher et inhiber la prolifération d'agent pathogène ; ou

- de moduler la réponse immunitaire ; ou

- d'influencer la production de facteurs de virulence des agents pathogènes au sein de l'organisme hôte ; ou

- de traiter une dysbiose du microbiote intestinal.

Pour le reste de la description, à moins qu'il n'en soit spécifié autrement, l'indication d'un intervalle de valeurs « de X à Y » ou « entre X et Y », dans la présente invention, s'entend comme incluant les valeurs X et Y.

DESCRIPTION DES FIGURES

La description qui va suivre en regard des dessins annexés, donnés à titre d'exemples non limitatifs, fera bien comprendre en quoi consiste l'invention et comment elle peut être réalisée.

Sur les dessins annexés : la figure 1 est (a) une observation en microscopie confocale d'un biofilm de l'exemple 1 de Lcasei ATCC334 sur un film de pectine plat selon une cinétique de formation d'un biofilm à t = 24 h ; et (b) est une représentation en 3D de ce biofilm de 24 h (marquage Syto9/IP) ; et

- la figure 2 est une observation en microscopie confocale : (a) d'une vue d'ensemble (échelle 730 μηη) représentant 12 microcapsules de pectine selon l'exemple 1 de l'invention qui ont été incubées dans un milieu de culture MRS, dans laquelle on distingue, à l'intérieur de chaque microcapsule, les divers amas distincts de biofilm comprenant les probiotiques L. casei ATCC334, (b) d'une vue agrandie (échelle 150 μηι) des microcapsules de la figure 2 (a) dans laquelle on peut voir 4 microcapsules à l'intérieur desquelles sont disposés les amas distincts de biofilm compris dans le réseau de pectine ; et (c) d'une vue encore plus agrandie (échelle 5 μηη ) de l'intérieur d'une microcapsule de la figure 2(b) et représentant deux amas de biofilm ;

- la figure 3 est une observation en cryo-microscopie électronique à balayage : (a) d'une vue d'ensemble (échelle 2.0 mm) de plusieurs microcapsules de pectine selon l'exemple 1 de l'invention qui ont été incubées dans un milieu de culture MRS ; (b) d'une vue agrandie (échelle 100 μηι) de l'intérieur d'une microcapsule de la figure 3 (a) dans laquelle on distingue des amas distincts de biofilm (comprenant les bactéries L. casei ATCC334) réparties dans le réseau de pectine ; (c) d'une vue agrandie (échelle 40,0 μηι) de la figure 3 (b) dans laquelle on distingue davantage les amas de biofilm (deux sur la figure) comprenant les bactéries, (d) et (e) d'une vue encore plus agrandie (échelle 10.0 μηη) de l'intérieur d'un amas de biofilm de la figure 3 (c) dans laquelle on distingue les probiotiques qui ont sécrété une matrice formant un biofilm sous forme d'amas, le biofilm adhérant au paroi du réseau de pectine ;

- .la figure 4 est un graphique représentant la perte de poids de souris au cours du temps avec un traitement DSS (du jour 5 au jour 1 1 ): la condition « eau physiologique + DSS » correspond aux souris ayant reçu le traitement DSS et gavées à l'eau physiologique ; la condition « formulation + DSS » correspond aux souris ayant reçu le traitement DSS et gavées avec une formulation comprenant les microcapsules selon l'invention (microparticules de pectine contenant des biofilms de probiotiques de L. casei) ;

- la figure 5 et la figure 6 sont des graphiques représentant la quantification au cours du temps des bactéries du genre Lactobacillus spp (figure 5) et L. casei (figure 6) dans les fèces du groupe de souris ayant reçu la formulation selon ladite invention telle que mentionné à la figure 4 (microparticules de pectine contenant des biofilms de probiotiques de L. casei).

DESCRIPTION DÉTAILLÉE D'UN EXEMPLE DE RÉALISATION

La description qui va suivre fera bien comprendre en quoi consiste l'invention et comment elle peut être réalisée.

La Demanderesse s'est attachée au développement de nouvelles microcapsules comprenant des probiotiques aptes à résister à l'acidité gastrique et à celle du suc pancréatique lors de leur passage dans l'estomac afin de libérer les probiotiques viables dans les intestins où elles ont notamment une action bénéfique sur la santé de l'hôte qui les ingère.

La Demanderesse a découvert, de manière inattendue, que des microcapsules comprenant une enveloppe en pectine et un cœur formant un réseau de pectine, dans lequel des probiotiques sous forme de biofilm sont immobilisés, permettent d'obtenir cet effet technique.

En effet, la Demanderesse a montré que de telles microcapsules en pectine permettaient d'augmenter la survie des bactéries ou des levures probiotiques aux différents niveaux du tractus gastro-intestinal et de les libérer sous forme viable et active au niveau de l'intestin de l'hôte. Les microcapsules selon l'invention, après ingestion, permettent donc de résister à l'acidité gastrique, à celle du suc pancréatique, ainsi qu'aux enzymes hydrolytiques et de s'implanter, en outre dans l'intestin.

Ainsi, la Demanderesse a mis au point une nouvelle formulation de microcapsules simple à mettre en œuvre, qui ne nécessite pas de matériaux protecteurs additionnels afin de résister au stress gastrique comme cela est suggéré dans la publication de Cheow et al., 2013.

En effet, de façon surprenante, le simple emploi de pectine parmi tous les polysaccharides existants permet de former des microcapsules présentant une enveloppe en pectine et un cœur composé d'un réseau de pectine présentant une résistance similaire, voire améliorée au stress gastrique par rapport aux microcapsules de l'art antérieur pour lesquels il est nécessaire d'appliquer au moins deux couches de polysaccharide (alginate/chitosan) afin de protéger les bactéries ou les levures probiotiques.

L'emploi de pectine n'est en outre pas suggéré dans l'art antérieur dans la mesure où le réseau tridimensionnel formé par la pectine en présence des ions calcium est relativement hétérogène par rapport au réseau d'alginate. Ceci est dû à la présence de groupement ester et amide et la présence de zones ramifiées dans la pectine (Assifaoui et al. Soft Matter 2015). Cependant, de manière surprenante, cette hétérogénéité de structure serait responsable du développement des bactéries et des levures probiotiques en biofilms. Ainsi, contrairement à l'alginate, qui présente une structure linéaire, le réseau de gel de pectine particulier permet, de façon inattendue, de permettre une meilleure croissance des bactéries et des levures probiotiques à l'intérieur de ce réseau.

Ainsi, la présente invention a tout d'abord trait à des microcapsules destinées à protéger des probiotiques, comprenant une enveloppe et un cœur dans lequel sont dispersés lesdits probiotiques sous forme de biofilms répartis en amas distincts, caractérisées en ce que ladite enveloppe et ledit cœur sont composés de pectine.

« Par biofilm », on entend des communautés structurées de bactéries ou de levures enfermées dans une matrice polymère auto-produite qui est adhérente à une surface vivante ou inerte (Costerton et al., 1999).

En particulier, les biofilms issus des probiotiques sont formés in situ.

Il a en effet été démontré par les inventeurs que les probiotiques et en particulier les bactéries probiotiques du genre Lactobacillus, cultivées en biofilm, sont plus résistantes à des stress mimant les conditions rencontrées dans le tractus-gastro-intestinal et présentent en outre, une activité anti-inflammatoire accrue.

Ainsi, la mise sous forme de biofilm des bactéries et des levures probiotiques alliée à l'emploi de pectine, permet de former des microcapsules présentant une bonne résistance aux stress environnementaux rencontrés entre l'ingestion et le site d'action (côlon). Le biofilm est d'ailleurs conservé jusqu'au lieu de délivrance des bactéries. En effet, les microcapsules selon l'invention sont capables de relâcher au niveau du côlon les bactéries avec un phénotype biofilm, c'est à dire présentant, d'une part, des propriétés d'adhésion bien supérieures aux cellules planctoniques et d'autre part, une activité probiotiques (immunomodulation) augmentée. En effet, l'enzyme qui dégrade la pectine est naturellement présente au niveau du côlon. Il s'agit donc d'une délivrance ciblée des bactéries dans un compartiment choisi de l'intestin, le côlon. Une fois naturellement libérés de l'enveloppe et de la matrice en pectine, les probiotiques sous forme de biofilm pourront se fixer au niveau des villosités intestinales du côlon et exercer leurs effets bénéfiques sur la santé de leur hôte.

Généralement, les bactéries et les levures probiotiques convenant à la présente invention sont ainsi aptes à former un biofilm et peuvent être choisies parmi : Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus, Propionibacterium, Bacillus et Streptococcus ou un de leurs mélanges.

Par exemple, les bactéries probiotiques peuvent être choisies parmi : L acidophilus, L. crispatus, L. gasseri, L. delbrueckii, L. salivarius, L. casei, L. paracasei, L. plantarum, L. rhamnosus, L. reuteri, L. brevis, L. buchneri, L. fermentum, B. adolescentis, B. angulation, B. bifidum, B. brève, B. catenulatum, B. infantis, B. lactis, B. longum, B. pseudocatenulatum, S. thermophiles, ou un de leurs mélanges, de préférence les bactéries probiotiques sont L. casei et L. rhamnosus, ou un de leurs mélanges.

Les levures probiotiques convenant pour la présente invention peuvent être choisies parmi : Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, etc. ou un de leurs mélanges.

Avantageusement, la concentration en probiotiques au sein de microcapsules est très élevée. Elle varie par exemple de 8 à 1 1 log UFC/g, de préférence de 9,5 à 10,5 log UFC/g, et est typiquement est de 10 log UFC/g. De plus, selon l'invention, d'autres substances actives non probiotiques, à savoir différentes d'une bactérie ou d'une levure, peuvent être comprises dans le cœur des microcapsules. Elles sont en particulier piégées dans le réseau de pectine.

Ces autres substances actives peuvent être choisies notamment parmi : un polyphénol, une vitamine (la thiamine (B1 ), la riboflavine (B2), la niacine (B3), l'acide pantothénique (B5), la pyridoxine (B6), l'acide folique (B9) et la cyanocobalamine (B12), un minéral (magnésium, calcium, fer, etc.), un prébiotique, tel que l'inuline, FOS, etc., ou un de leurs mélanges.

L'ajout de ces autres substances comme le polyphénol peut permettre par exemple de potentialiser l'effet des biofilms.

En effet, parmi les composés alimentaires, les polyphénols d'origine végétale sont des molécules très réactives qui, selon des études in vitro et in vivo réalisées chez la souris, peuvent avoir un impact fort sur la signalisation des cellules intestinales, mais également sur les bactéries du microbiote intestinal.

A titre d'exemple, il a été démontré pour plusieurs polyphénols qu'ils pouvaient induire une augmentation de l'adhésion et de la prolifération des bactéries probiotiques comme Lactobacillus rhamnosus sur les entérocytes (Parkar et al., 2008, The potential influence of fruit polyphénols on colonie microflora and human gut health, International Journal of Food Microbiology (124), p. 295-298). De plus, les bactéries intestinales sont connues pour transformer les polyphénols en métabolites pouvant avoir des activités importantes sur la modulation de l'homéostasie intestinale (van Duynhoven et al., 201 1 , Metabolic fate of polyphénols in the human superorganism, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (108), p. 4531 -4538).

Il semblerait également que la biodisponibilité des minéraux, notamment celle du calcium, du fer, du zinc, du manganèse, du cuivre et du phosphore, soit augmentée dans les produits laitiers fermentés par rapport à celle du lait. Par conséquent, les microcapsules selon l'invention contiennent avantageusement une quantité élevée de vitamines et de minéraux qui seront facilement assimilables par l'organisme.

Selon l'invention, les « prébiotiques » sont des oligosaccharides ou des polysaccharides à courte chaîne constitués approximativement de deux à vingt unités de sucre. Ils échappent à la digestion dans l'intestin grêle et sont des substrats potentiels pour l'hydrolyse et la fermentation par les bactéries intestinales.

Il est connu que les prébiotiques permettent d'augmenter l'absorption de minéraux (en particulier du calcium et du magnésium) dans le côlon, de diminuer des pertes des tissus osseux, ainsi que d'avoir un effet sur les fonctions immunitaires. Par exemple, l'administration d'inuline, d'oligofructose et de trans-galactooligosaccharides conduit à une augmentation sélective de la concentration fécale des populations de bifidobactéries. Tels que mentionnés ci-dessus, l'enveloppe et le cœur des microcapsules selon l'invention sont en pectine.

En particulier, les microcapsules selon l'invention comprennent ou peuvent être constituées d'une enveloppe et d'un cœur dans lequel sont dispersés lesdits probiotiques sous forme de biofilms répartis en amas distincts, caractérisées en ce que ladite enveloppe et ledit cœur sont composés de pectine. Selon ce mode, les microcapsules sont uniquement composées de pectine afin de former l'enveloppe et le cœur, c'est-à-dire que les microcapsules ne comprennent pas d'autres polysaccharides afin de former leur cœur et leur enveloppe.

En outre, en général, les microcapsules selon l'invention ne comprennent pas d'enrobage, à savoir elles ne sont pas recouvertes par un autre matériau protecteur, tel qu'un polysaccharide, comme le chitosan.

Selon l'invention, la pectine est un polysaccharide d'origine végétale caractérisé par un squelette d'acide α-D-galacturonique et de faibles quantités de α-L-rhamnose plus ou moins ramifiés. En particulier, elle comprend un enchaînement de deux structures majoritaires: une chaîne principale homogalacturonique (ou "zone lisse", dénommée HG) et une chaîne rhamnogalacturonique (ou "zone hérissée", dénommée RG).

Les homogalacturonanes sont la principale chaîne qui compose les pectines (représentant en règle générale plus de 60% des pectines). Ce sont des polymères d'acide a-D-galacturonique liés en (1→4). La longueur de ces chaînes peut aller de 70 à 100 résidus d'acide galacturonique dans le citron, la betterave sucrière ou dans la pomme, c'est-à-dire présentant des masses molaires de l'ordre 12 à 20 kilodalton (kDa).

La fonction carboxylique des acides α-D-galacturoniques peut être sous forme acide, ou ionisée par différents cations dont le calcium, ou estérifiée par du méthanol. Par ailleurs les acides galacturoniques peuvent être acétylés en 0-2 et /ou O- 3. En fonction de ces estérifications, les pectines sont caractérisées par un degré de méthylation (DM) et un degré d'acétylation (DAc) qui correspondent au rapport des acides galacturoniques estérifiés (respectivement méthylés ou acétylés) sur les acides galacturoniques totaux.

D'un point de vue fonctionnel, trois catégories de pectines se distinguent:

- si le degré de méthylation est inférieur à 5% (DM<5), il s'agit d'acides pectiques ;

- si le degré de méthylation est inférieur à 50% (DM<50), il s'agit de pectines faiblement méthylées ;

- si le degré de méthylation est supérieur à 50% (DM>50), il s'agit de pectines hautement méthylées (HM).

Le degré d'estérification des pectines a un impact sur la flexibilité de la molécule : plus le degré d'estérification est faible, plus la pectine est rigide. Il a également un fort impact sur leurs propriétés de gélification.

En général, ladite enveloppe et le cœur composant les microcapsules sont en pectine faiblement méthylée qui présente un degré d'estérification (DE = DM) allant de 10 à 50 %, de préférence de 20 à 30 % et typiquement de l'ordre de 28 %.

La fonction acide carboxylique des acides α-D-galacturoniques peut, au cours d'un traitement industriel de déméthylation en milieu ammoniacal, être amidée. Dans ce cas, la pectine se trouve amidée et présente un degré d'amidation DA.

De préférence, ladite enveloppe et le cœur composant les microcapsules sont en pectine amidée présentant un degré d'amidation (DA) allant de 3 à 30 %, de préférence de 20 à 30 % et typiquement de l'ordre de 24 %.

Les degrés d'amidation (DA) et d'estérification (DE) sont déterminés par la méthode de titration (Food Chemical Codex, 1981 ) (Food Chemical Codex. (1981 ). (3rd éd.). Washington, DC: National Academy of Sciences.

Avantageusement, les microcapsules selon l'invention présentent un diamètre moyen allant de 100 μηη à 5000 μηι, de préférence allant de 250 μηη à 1000 μηη et en particulier allant de 400 μηη à 800 μηι.

Selon une caractéristique de l'invention, les microcapsules se présentent sous forme déshydratée (par exemple lyophilisée), ou congelée, de sorte à optimiser leur conservation.

Puis, la présente invention a également trait à une formulation probiotique notamment pour animal, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins les microcapsules telles que décrites ci-dessus.

En particulier, la formulation probiotique peut se présenter sous diverses formes galéniques permettant de préférence une prise orale, telles qu'une gélule, une capsule molle, un comprimé, une boisson, une ampoule, de la poudre ou toute autre forme galénique pouvant être ingérée par un hôte ou permettant la préparation de boissons ou plats nutritionnels.

A titre d'exemple, les boissons ou plats nutritionnels peuvent être du lait fermenté, un produit laitier glacé, une barre céréalière, une boisson non alcoolisée, des compléments alimentaires, un supplément nutritionnel, des croquettes et friandises pour animaux domestiques, etc.

Telle que susmentionnée, la présente invention porte également sur un procédé de fabrication de microcapsules telles que décrites ci-dessus, comprenant les étapes suivantes :

(i) la préparation d'un mélange homogène comprenant une solution ou une émulsion huile/eau de pectine, de préférence stérilisée, contenant une suspension de probiotiques ;

(ii) l'encapsulation de gouttelettes de ce mélange dans une solution de réticulation, de sorte à former des microcapsules comprenant : une enveloppe en pectine et un cœur formant un réseau en pectine, dans lequel les probiotiques sont immobilisés ;

(iii) la mise en culture des microcapsules obtenues à l'issue de l'étape (ii) dans un milieu de culture, de sorte à former in situ au sein des microcapsules des biofilms répartis en amas distincts à partir des probiotiques immobilisés ;

(iv) éventuellement, la déshydratation (comme la lyophilisation) ou la congélation des microcapsules obtenues à l'issue de l'étape (iii).

Les étapes (i) à (iv) vont être décrites ci-dessous.

Tout d'abord, on prépare, d'une part, une solution ou une émulsion huile/eau de pectine et, d'autre part, une suspension de probiotiques ; puis on mélange les deux préparations jusqu'à homogénéisation et obtention du mélange homogène.

Bien sûr, toutes les caractéristiques décrites ci-dessus pour les microcapsules selon l'invention s'appliquent également pour le procédé de l'invention et inversement.

Notamment, la pectine comprise dans le mélange homogène est de préférence faiblement méthylée et présente en particulier un degré d'estérification (DE = DM) allant de 10 à 50 %, de préférence de 20 à 30 % et typiquement de l'ordre de 28 %. La pectine peut être également amidée et présente un degré d'amidation (DA) allant de 3 à 30 %, de préférence de 20 à 30 % et typiquement de l'ordre de 24 %.

Selon une première caractéristique du procédé, le mélange homogène comprend une teneur en pectine, en masse, par rapport au volume total du mélange, allant de 2 % (m/v) à 10 % (m/v), de préférence de 3 % (m/v) à 8 % (m/v) et typiquement de 3,5 % (m/v) à 5 % (m/v).

Selon une deuxième caractéristique du procédé, le mélange homogène de l'étape (i) comprend une concentration en probiotiques allant de 10 ⁵ UFC/mL à 10 ⁹ UFC/mL, de préférence de 10 ⁶ UFC/mL à 10 ⁸ UFC/mL et typiquement de l'ordre de 10 ⁷ UFC/mL.

Il est possible de rajouter au mélange homogène de l'étape (i), une autre substance active non probiotique, telle que du polyphénol, des vitamines, des minéraux, un prébiotique, ou un de leurs mélanges. En général, cette autre substance active représente en masse, par rapport à la masse totale du mélange homogène de 0,1 à 30 %, de préférence de 0,1 à 20 % et typiquement de 5 % à 15 %.

Puis, on procède à l'étape d'encapsulation (ii).

Généralement, cette étape d'encapsulation (ii) comprend une première sous- étape d'injection (iia) par des moyens permettant le goutte à goutte du mélange homogène de l'étape (i) dans la solution de réticulation mise sous agitation, de sorte à ce que chaque goutte forme une microcapsule lorsqu'elle entre en contact avec la solution de réticulation.

A titre d'exemple, cette étape d'injection (iia) peut être réalisée au moyen d'une douchette. Dans ce cas, la découpe des gouttes se fait par gravité et permet notamment d'obtenir des microcapsules présentant un diamètre moyen allant de 1000 à 5000 μηη.

Cette étape (iia) peut également être réalisée au moyen d'un encapsulateur.

Dans ce cas, la découpe des gouttes peut être, selon un mode de réalisation, être effectuée par application d'un champ électrique. Le champ électrique appliqué allant de 0,1 kv à 10kv, de préférence allant de 2 kv à 10kv et typiquement de 5 kv à 8 kv. Cette technique permet en général d'obtenir des microcapsules présentant un diamètre moyen allant de 400 à 1000 μηι.

Selon un autre mode de réalisation, la découpe des gouttes peut être effectuée par vibration. Cette technique permet en général d'obtenir des microcapsules présentant un diamètre moyen allant de 100 à 1000 μηη.

Quel que soit le moyen permettant le goutte à goutte, le débit du goutte à goutte varie généralement de 20 [ Us à 300 μ-Js, de préférence varie de 40 [ Us à 100 [ Us et typiquement varie de 40 [ Us à 80 [ Us ; tandis que la hauteur d'injection du mélange homogène de l'étape (i) dans la solution de réticulation varie de 1 cm à 15 cm, de préférence varie de 2 cm à 10 cm et typiquement varie de 2 cm à 6 cm.

De préférence, la solution de réticulation est composée de cation divalent, tel que Ca ²⁺ , Zn ²⁺ , Ba ²⁺ , Fe ²⁺ , par exemple sous forme de chlorure, de sulfure, d'acétate, ou est composée d'un de leurs mélanges. Typiquement, la solution de réticulation est composée d'ions Ca ²⁺ sous forme de chlorure.

En particulier, la concentration en ions divalents de la solution de réticulation varie de 25 à 750 mM, de préférence de 200 à 750 mM, et en particulier de 500 à 750 mM.

Suite à cette première sous-étape (iia), l'étape d'encapsulation (ii) comprend en particulier une deuxième sous-étape dite de réticulation des microcapsules (iib). Cette deuxième sous-étape comprend la mise en maturation des microcapsules obtenues lors de la sous-étape d'injection (iia) pendant une durée d'au moins 8 minutes, de préférence allant de 0 à 60 minutes, et en particulier allant de 10 à 25 minutes.

Avantageusement, cette sous-étape de réticulation (iib) s'effectue à une température inférieure à 40°C, de préférence inférieure à 30°C et en particulier allant de 4°C à 25°C.

Suite à cette étape d'encapsulation, les microcapsules comprennent ainsi une enveloppe en pectine et un cœur formé d'un réseau en pectine et dans lequel les probiotiques sont immobilisés.

Avantageusement, les microcapsules obtenues selon le procédé de l'invention présentent un diamètre moyen allant de 100 μηη à 5000 μηη, de préférence allant de 250 μηη à 1000 μηη et en particulier allant de 400 μηη à 800 μηι.

Ensuite, préalablement à l'étape (iii) de mise en culture, les microcapsules obtenues à l'issue de l'étape (ii) sont de préférence récupérées, généralement par sédimentation gravitationnelle, puis rincées, généralement à l'eau distillée. Puis, on effectue l'étape de mise en culture des microcapsules (iii) dans un milieu de culture, de sorte à former in situ au sein des microcapsules des biofilms répartis en amas distincts à partir des probiotiques immobilisés.

A titre d'exemple, le milieu de culture lors de cette étape de mise en culture (iii) est choisi parmi : MRS (deMan, Rogosa, Sharpe), AOAC (Association of Officiai Analytical Chemists), LB (Lysogeny Broth), TSB (Tryptic Soy Broth), TPY (Tryptone Phytone Yeast), BSM (Bifidus Sélective Médium), Enterococcosel Broth (Bile Esculin Azide Broth), Nutrient Broth n°4, CA SO Broth (Casein peptone Soybean), AC Broth (AH Culture Broth), Reinforced Clostridial Médium, BHI (Brain Heart Infusion), Bifidobacterium Broth, Tomato Juice Broth, ou un de leurs mélanges, et est de préférence choisi parmi : MRS (deMan, Rogosa, Sharpe), AOAC ((Association of Officiai Analytical Chemists).

Préférentiellement, le pH du milieu de culture varie de 3 à 8, de préférence de 4 à 7 et typiquement de 5 à 7.

La température du milieu de culture varie par exemple de 20 à 40°C, de préférence de 25°C à 37°C et généralement de 25 à 30°C.

Cette étape s'effectue en général pendant une durée supérieure ou égale à 12 heures, de préférence allant de 12 à 72 heures et généralement de 20 à 48 heures.

Enfin, on procède éventuellement à la congélation ou à la déshydratation des microcapsules obtenues à l'issue de l'étape (iii).

Une des méthodes de déshydratation est la lyophilisation. Cette étape de lyophilisation comprend par exemple la mise en congélation des microcapsules jusqu'à environ - 80°C, par exemple dans des vials de 10 mL, soit environ 1 g d'échantillons par vial, avec une rampe de 8°C/min. Avant la congélation, des cryo-protectants (type glycérol, sucres, anti-oxydants...) peuvent être ajoutés avec les microcapsules dans les vials. Les échantillons sont ensuite lyophilisés par exemple 20 Heures à - 55°C avec une pression de 0,05 mbar, en appliquant 5 paliers (-40, 10, 0, 20 et 30°C). Après la lyophilisation, les échantillons sont stockés par exemple à température ambiante.

De préférence, l'étape de congélation s'effectue par la mise en congélation des microcapsules, par exemple dans des vials de 10 mL, soit environ 1 g d'échantillons par vial. Avant la congélation, des cryo-protectants (type glycérol, sucres, anti-oxydants...) peuvent être ajoutés avec les microcapsules dans les vials. Les températures de congélation sont comprises par exemple entre -20°C et -80°C, et la descente en température s'effectue par exemple avec une rampe de 8°C/min.

Puis, la présente invention est relative à l'utilisation des microcapsules telles que décrites ci-dessus, ou de la formulation probiotique susmentionnée comprenant lesdites microcapsules, ou des microcapsules obtenues selon le procédé susmentionné, pour protéger les probiotiques lors du passage dans l'estomac et à les délivrer sous une forme active au niveau de l'intestin chez un animal. Enfin, la présente invention porte sur des microcapsules décrites ci-dessus, ou de la formulation probiotique susmentionnée ou des microcapsules obtenues selon le procédé décrit ci-dessus, pour son utilisation comme médicament.

Bien sûr, toutes les caractéristiques décrites ci-dessus pour les microcapsules selon l'invention ou pour le procédé selon l'invention s'appliquent également pour le médicament susmentionné.

L'invention se rapporte également à des microcapsules décrites ci-dessus, ou de la formulation probiotique susmentionnée ou des microcapsules obtenues selon le procédé décrit ci-dessus, pour une utilisation chez l'animal afin :

- d'empêcher et inhiber la prolifération d'agent pathogène ; ou

- de moduler la réponse immunitaire ; ou

- d'influencer la production de facteurs de virulence des agents pathogènes au sein de l'organisme hôte ; ou

- de traiter une dysbiose du microbiote intestinal.

Bien sûr, toutes les caractéristiques décrites ci-dessus pour les microcapsules selon l'invention ou pour le procédé selon l'invention s'appliquent également pour les utilisations susmentionnées.

EXEMPLES EXEMPLE 1 : PRÉPARATION DE MICROCAPSULES DE PECTINE ET D'UN FILM PLAT DE PECTINE

Pour cet essai, deux types de formulations ont été développés :

(a) -une sous forme de microcapsules de pectine selon l'invention ;

(b) -une sous forme de film plat afin de mieux caractériser les interactions entre le biofilm bactérien et le gel de pectine.

MATIERES PREMIERES

TABLEAU 1

^* Ces bactéries proviennent d'une culture revivifiée à 1% pendant 24 h dans un milieu de culture MRS à pH 5,8 à partir d'une culture de sortie de cryotube de 24 h dans du MRS pH 5,8. B) PROTOCOLES DE FABRICATION DE MICROCAPSULES DE PECTINE (a)

-i) préparation d'un mélange homogène

Tout d'abord, de la pectine en poudre, stérile, est mise en solution à 4% (m/v) dans de l'eau ultra pure autoclavée, sous atmosphère stérile ; puis 10 ⁷ UFC/mL de bactéries sont ajoutées. Le tout est mis sous agitation magnétique de sorte à obtenir un mélange homogène.

- ii) l'encapsulation de gouttelettes

Un encapsulateur de type Nisco Var 1 a été utilisé (paramètres : 8 kV ; embout 0,7 mm) avec un pousse seringue (paramètres : débit 98,4 μί/h ; volume 0,20 mL). Le mélange homogène obtenu ci-dessus est introduit dans une seringue de 20 mL avant d'être injecté dans l'encapsulateur à l'aide du pousse seringue. Le champ électrique de 8 kV va forcer la formation de microgouttes qui vont tomber dans un bain de réticulation de CaCI ₂ agité, chacune de ces gouttes formera une microcapsule. Le diamètre moyen des microcapsules humides ainsi élaborées est de l'ordre de 1000 μηη.

Ensuite, la gélification s'opère sous atmosphère stérile pendant 20 minutes par contact de la solution de pectine avec la solution stérile de CaCI ₂ à 0,75 M.

Finalement, le gel est lavé trois fois dans de l'eau ultra pure autoclavée afin d'enlever l'excédent de CaCI ₂ .

A l'issue de cette étape, on obtient des microcapsules comprenant : une enveloppe en pectine et un cœur formant un réseau en pectine, dans lequel les probiotiques sont immobilisés.

- iii) mise en culture des microcapsules

Les microcapsules de pectine contenant les bactéries immobilisées (1 lot de bille = 4 mL de pectine) sont incubées à différents temps (24 h - 48 h - 72 h) à 28°C dans 20 mL de milieu de culture, de sorte à former in situ au sein des microcapsules des biofilms répartis en amas distincts à partir des probiotiques immobilisés.

Deux milieux de culture différents sont utilisés pour permettre la croissance des bactéries en biofilm à l'intérieur des microcapsules de pectine, le milieu MRS pH=5,8 (Conda) ou le milieu AOAC pH 6,8 (Difco).

Après incubation, les microcapsules de pectine contenant les biofilms bactériens sont lavées trois fois dans de l'eau ultra pure (15 mL).

-iv) dénombrement des bactéries dans le gel de pectine

On effectue la libération des bactéries des gels de pectine. Pour cela, les gels de pectine (1 lot de microcapsules de 4 mL de pectine) sont désagrégés à l'aide d'une solution tampon (50 mL) de citrate de sodium à 0,1 M, ce qui permet de libérer et de suspendre en solution les bactéries. Les bactéries re-suspendues sont alors dénombrées selon deux méthodes : la méthode des Unités Formant Colonies ou la cytométrie en flux. ^* Méthode des Unités Formant Colonies

La solution de bactéries re-suspendues est diluée en cascade de 10 ^"1 à 10 ^"5 avec de l'eau physiologique et 3 gouttes de 10 μί sont déposées aux dilutions 10 ^"5 à 10° sur un milieu MRS gélosé à pH 5,8. La boite de Pétri est ensuite incubée 48 h à 28°C. Cette méthode permet de mesurer la cultivabilité bactérienne.

^* Cytométrie en flux

La solution de bactéries re-suspendues est tout d'abord lavée : centrifugation de 1 mL à 10 000 g et récupération des cellules bactériennes dans 1 mL de PBS 1X filtré. Ensuite cette suspension bactérienne est diluée pour être comprise entre 10 ⁵ /10 ⁶ bactéries/mL. Finalement, les bactéries sont marquées au cFDA (carboxy-Fluorescein DiAcetate) ainsi qu'à ΙΊΡ (lodure de Propidium). Les solutions bactériennes marquées sont alors analysées par cytométrie en flux (BD Acuri, C6). Le marquage cFDA permet de mesurer la viabilité bactérienne alors que le marquage à ΙΊΡ permet de mesurer l'intégrité membranaire.

C) PROTOCOLES DE FABRICATION D'UN BIOFILM SUR UN FILM DE PECTINE PLAT (b)

-i) Pour élaborer des films plats, le protocole consiste à introduire une solution de pectine à 4% (m/v) dans une boite de Pétri avant de la recouvrir avec une membrane de dialyse (Thermofisher, Snakeskin Dialysis Tubing, 10 kDa). En particulier, la solution de pectine est obtenue par mise en solution de pectine en poudre, stérile dans de l'eau ultra pure autoclavée et ce sous atmosphère stérile de sorte à obtenir une teneur en pectine de à 4% (m/v).

-ii) Cette boite est ensuite introduite à l'envers (membrane vers le bas) pendant 20 minutes dans un bain de CaCI ₂ . Les ions calcium vont diffuser via la membrane de dialyse dans la solution de pectine pour permettre la gélification de la pectine. Le gel est alors séché pour former un film.

-iii) Pour permettre la croissance en biofilm des bactéries probiotiques à la surface du film de pectine, celui-ci est introduit pendant différents temps (24 h ou 48 h) à 28°C dans du milieu de culture (milieu MRS ou milieu AOAC) ensemencé avec 10 ⁷ UFC/mL de bactéries. Après ces temps d'incubation, les films sont lavés trois fois avec de l'eau ultra pure.

-iv) Dénombrement des bactéries libérées des gels de pectine : les mêmes protocoles que ceux décrits au paragraphe B).- iv ont été appliqués. D) RESULTATS

Les résultats des dénombrements obtenus sont présentés dans le tableau 2 ci- dessous et sont exprimés en Log (UFC) pour 1 lot de microcapsules, qui correspond à la même quantité de pectine que 1 film plat (soit 4 mL de pectine à 4% (m/v)). Les gels sont dits « humides » lorsqu'ils ne subissent pas de séchage après gélification et que leur teneur en eau est grande.

"renouvellement milieu à 24 h

TABLEAU 2

Deux méthodes ont été comparées pour dénombrer les bactéries dans les gels de pectine : la méthode des UFC et la cytométrie en flux. Ces deux méthodes ont présenté des résultats étroitement similaires, qui montrent une bonne corrélation entre cultivabilité et viabilité des bactéries dans les gels de pectine.

Cet essai met en évidence que les films plats de pectine permettent la croissance en biofilm de la bactérie probiotique testée L. casei. Notamment, comme la montre la figure 1 , un biofilm uniforme sur la surface du film de pectine a été observé par microscopie confocale.

Par ailleurs, une croissance en biofilm de L. casei a aussi été observée à l'intérieur des microcapsules de pectine à partir des bactéries immobilisées dans le réseau de la pectine (augmentation moyenne de la population initiale de 2 Log).

Par microscopie confocale comme cela est représenté sur la figure 2, il apparaît que les probiotiques se sont développés en microcolonies sphériques (biofilms) réparties de façon homogène et distinct au sein des microparticules de pectine mises en culture dans le milieu MRS. De plus, par cryo-microscopie électronique à balayage et comme cela est représenté en figure 3a) à figure 3e), il apparaît également que les probiotiques L. casei se sont développés en microcolonies sphériques (amas de biofilm) au sein de « niches » formées par le réseau de pectine au sein de chaque microcapsule. Les probiotiques semblent adhérer sur ce dit-réseau et former une véritable structure tridimensionnelle sous forme de microcolonies (figures 3 (d) et 3(e)). Une matrice sécrétée par les bactéries probiotiques substance exopolymérique) et les liant les unes aux autres est également visible sur les figures 3(d) et 3(e).

En outre, la Demanderesse a testé également dans les mêmes conditions expérimentales et avec succès une autre souche Lactobacillus rhamnosus GG dans le milieu de culture MRS pendant 24 heures. En effet, des biofilms se sont formés sur un film plat de pectine, ainsi qu'à l'intérieur des microcapsules de pectine.

EXEMPLE 2 : LYOPHILISATION DES MICROCAPSULES DE L'EXEMPLE 1

Des tests de séchage ont été menés en utilisant la lyophilisation, une méthode très utilisée dans l'industrie des probiotiques et des ferments, mais cependant qui a des taux de mortalité élevés.

Le protocole de lyophilisation est le suivant :

- la mise en congélation des microcapsules de - 20°C à - 80°C dans des vials de 10 mL, soit environ 1 g d'échantillons par vial, avec une rampe de 8°C/min ;

les échantillons sont ensuite lyophilisés 20 heures à - 55°C avec une pression de 0,05 mbar, en appliquant 5 paliers (-40, 10, 0, 20 et 30°C) ;

- après la lyophilisation, les échantillons sont stockés à température ambiante.

Afin de vérifier la survie des bactéries dans les gels de pectine après lyophilisation, un protocole pour re-suspendre mais aussi pour revivifier les bactéries a été mis en place : un lot de microcapsules de pectine lyophilisées (soit 163 mg de microcapsules +/- 1 1 mg) est dissout dans 50 mL d'une solution tampon de citrate de sodium 0,1 M + MRS pH 5,8 dilué au 1/4 et est incubé 2 h à 28°C.

Les dénombrements ont été effectués sur milieu de culture gélosé et en cytométrie en flux.

Les résultats des dénombrements obtenus sont présentés dans le tableau 3 ci- dessous :

TABLEAU 3

Après lyophilisation, la mortalité la plus élevée a été observée pour les bactéries planctoniques, soit une perte de - 3,02 Log d'UFC. Pour les bactéries immobilisées dans les microcapsules de pectine ou pour les bactéries cultivées en biofilm à l'intérieur des microcapsules de pectine dans du milieu de culture MRS, la mortalité bactérienne après lyophilisation est similaire à savoir respectivement 1 ,12 Log d'UFC et 1 ,54 Log d'UFC. La survie la plus élevée a été observée pour les bactéries en biofilm cultivées en milieu AOAC dans les microcapsules de pectine, soit 0,4 Log d'UFC de perte.

Cependant les résultats présentés ici sont comparables à ceux retrouvés dans la littérature. Pour les gels humides, il n'est pas pertinent de comparer des valeurs de biomasse en UFC/g car selon le protocole de gélification et les polyosides utilisés, les gels obtenus peuvent avoir des teneurs en eau différentes ce qui va rentrer en compte dans le poids des gels. De la même manière, en fonction de la méthode de séchage, les teneurs en eau vont rentrer en compte dans le poids des gels (les teneurs en eau après séchage ne sont généralement pas indiquées). En moyenne dans la littérature, des quantités de bactéries encapsulées dans des polyosides aux alentours de 10 Log d'UFC/g sont retrouvées avec des méthodes de séchages optimisant la survie des bactéries. Par exemple, pour l'encapsulation de Lactobacillus rhamnosus GG en biofilm dans des microcapsules d'alginate / caroube, la biomasse obtenue est de 9,7 Log d'UFC/ g (Cheow, Kiew, et Hadinoto 2014) et 9,38 Log d'UFC / g pour Bifidobacterium bifidum dans des microsphères d'alginate (Châvarri et al. 2010).

Les résultats sans optimisation de la survie des bactéries après la lyophilisation pour la condition « biofilm 24 h en AOAC » sont de 10,24 Log d'UFC/g et 9,86 pour la condition « biofilm 24 h en MRS ».

EXEMPLE 3 : ESSAI DE RÉSISTANCE AU STRESS ACIDE DES MICROCAPSULES DE L'EXEMPLE 1 EN COMPARAISON AVEC DES BACTERIES PROBIOTIQUES PLANCTONIQUES

Une solution mimant le stress rencontré dans l'estomac a été utilisée (solution gastrique). Cette solution est composée de NaCI (0,2% m/v) et le pH est ajusté à pH= 2 avec de l'acide chlorhydrique 1 N (d'après Cook et al ; 201 1 ).

A t = 0, des bactéries planctoniques ou des microcapsules (0,8 g) ont été introduites en quantité connue, soit 8,5 Log d'UFC, dans 5 mL de solution gastrique à 37 °C. Après 2 heures d'incubation, les bactéries planctoniques, les bactéries en biofilm dans les microcapsules de pectine et les bactéries re-larguées dans le milieu ont été dénombrées sur gélose MRS selon la méthode des UFC (décrite précédemment). Au préalable, les microcapsules ont été récupérées et désagrégées dans 10 mL de citrate de sodium (0,1 M) afin de suspendre en solution les bactéries.

Avec ce protocole, les bactéries sont soumises à un stress important, qui provoque chez les bactéries planctonique une mortalité importante, de l'ordre de 4,6 Log d'UFC de perte. Contrairement à cela, les bactéries probiotiques en biofilm dans les microcapsules de pectine selon l'invention ont une mortalité relativement faible par rapport aux bactéries planctoniques à savoir en moyenne 1 ,15 Log d'UFC de perte.

TABLEAU 4

EXEMPLE 4 : ESSAI DES PROPRIÉTÉS D'ADHÉSION DES MICROCAPSULES DE L'EXEMPLE 1 EN COMPARAISON AVEC DES BACTERIES PROBIOTIQUES PLANCTONIQUES Essai 1

L'adhésion de bactéries Lactobacillus casei a été étudiée in vitro dans un modèle de cellules épithéliales intestinales de la lignée Caco-2. Les cellules sont cultivées en microplaque (24 puits) à la concentration de 10 ⁵ cellules par puit et entretenues pendant 15 jours pour obtenir un tapis de cellules différenciées (avec une bordure en brosse).

Les bactéries Lactobacillus casei sous forme de biofilm libérées des microcapsules de pectine selon l'invention sont mises en contact avec les cellules épithéliales pendant 1 h 30 à 37°C, à une concentration connue (100 fois plus de bactéries que de cellules épithéliales (MOI 100), ou 10 fois plus de bactéries que de cellules épithéliales (MOI 10)). Après ce temps d'incubation, les cellules épithéliales sont lavées et les bactéries ayant adhérées aux cellules épithéliales sont dénombrées sur des géloses de MRS.

Le même essai est réalisé avec des bactéries probiotiques de Lactobacillus casei sous forme planctonique. Ces bactéries proviennent d'une culture revivifiée à 1 % pendant 24 h dans un milieu de culture MRS à pH 5,8 à partir d'une culture de sortie de cryotube de 24 h dans du MRS pH 5,8. Ces bactéries sont mises en contact avec des cellules épithéliales comme décrit précédemment.

Le taux d'adhésion des bactéries planctoniques Lactobacillus casei est similaire à celui déjà décrit dans la littérature à savoir 0,68% à MOI 100.

Les bactéries en biofilm libérées des microcapsules de pectine et cultivées en milieu MRS ou AOAC ont présenté un taux d'adhésion similaire, soit 0,7%. Par contre, de manière surprenante lorsque ces deux formulations ont été lyophilisées, le taux d'adhésion a considérablement augmenté, à savoir à 20%. Les bactéries en biofilm dans les microcapsules de pectine ont donc présenté une capacité d'adhésion similaire à des bactéries sous forme planctonique. La lyophilisation des bactéries en biofilm dans les microcapsules de pectine a augmenté leur taux d'adhésion, des premiers résultats semblent indiquer que la pectine jouerait un rôle en favorisant l'adhésion à la muqueuse intestinale.

TABLEAU 5

^■ s Essai 2

Dans cet essai, le même protocole que pour l'essai 1 a été utilisé, à la différence de l'ajout de pectine en solution à l'étape de mise en contact des cellules épithéliales.

TABLEAU 6

^* selon la méthode de lyophilisation décrite à l'exemple 2

Cet essai démontre ainsi que les bactéries planctoniques présentent une capacité d'adhésion aux cellules épithéliales augmentées par la pectine. En effet les bactéries planctoniques sans pectine ont un taux d'adhésion moyen de 3.32 % et en contact avec la pectine (4 mg) ce taux passe à 44,22 %. EXEMPLE 5 : ESSAI IN VIVO AVEC DU DSS (DEXTRAN SODIUM SULFATE)

^■ Protocole expérimental L'essai expérimental s'est déroulé sur 16 jours.

Des souris C57BL mâles de chez Charles River Laboratories ont été réparties en deux groupes :

un groupe « eau physiologique + DSS » dont les souris ont été gavées quotidiennement avec de l'eau physiologique ;

- un groupe « formulation selon l'invention + DSS » dont les souris ont été gavées quotidiennement avec la formulation selon ladite invention contenant l'espèce probiotique Lactobacillus casei, à une dose de 10 ⁹ UFC/sou ris/jour et préparée selon conformément à la formulation (a) de l'exemple 1 susmentionné.

Pour ces deux groupes, les souris ont reçu un traitement DSS (Dextran Sodium Sulfate) à 2% (w/v) dans l'eau de boisson du jour 5 au jour 1 1 de l'expérimentation. Le DSS a provoqué une inflammation au niveau des intestins des souris.

Tous les deux jours, les souris de chaque groupe ont été pesées afin d'observer l'évolution du poids des souris en fonction du temps (Figure 4).

Par ailleurs, tous les deux jours, les fèces des souris ont été récupérées afin de quantifier les bactéries du genre Lactobacillus d'une part (Figure 5) et l'espèce L. casei d'autre part (Figure 6). Pour cela, 140 mg de fèces de chaque groupe de souris ont été dilués dans l'eau physiologique, et désintégrés en agitant avec des billes de verre, donnant une solution liquide (en triplicata). Enfin, cette solution contenant les bactéries a été dénombrée selon la méthode des unités formant colonies : la solution de bactéries re- suspendues a été diluée en cascade au i o ^eme avec de l'eau physiologique et les dilutions ont été étalées sur un milieu MRS gélosé à pH 6 contenant 20 mg/mL de vancomycine (milieu permettant la croissance des bactéries du genre Lactobacillus) et sur un milieu M- RTLV gélosé à pH 6 (milieu permettant la croissance des bactéries de l'espèce L. casei). Les géloses ont ensuite été incubées 48 h à 37°C. Cette méthode permet de mesurer la cultivabilité bactérienne. Résultat

Il ressort tout d'abord de cet essai que les souris ayant reçu les microparticules de pectine comprenant les bactéries probiotiques sous forme de biofilm selon l'invention présentent un état de santé amélioré par rapport aux autres souris ayant reçu de l'eau physiologique. En effet, le DSS a provoqué dans les différents groupes de souris testés une inflammation au niveau intestinal (diarrhées, perte de poids, etc.). Toutefois, la perte de poids a été moindre dans le groupe ayant reçu la formulation selon l'invention comme cela est illustré en Figure 4.

Ensuite, comme cela est illustré sur les figures 5 et 6, cet essai a démontré que les bactéries présentent dans le biofilm contenu dans les microcapsules de pectine selon l'invention sont bien relarguées au niveau intestinal et en particulier au niveau du côlon (présence des bactéries probiotiques dans les fèces (8 log UFC/gr).

Ainsi, ces résultats démontrent que les microcapsules selon l'invention permet la vectorisation et le relarguage des probiotiques sous forme viable et permet de conserver la fonctionnalité des bactéries probiotiques.