La présente invention concerne de nouveaux composés de formule

leurs sels, leur préparation et leur utilisation.

Dans la formule (I), R représente un radical hydroxy, alkyloxy, phenylalkyloxy ou -NH-CH2-COOH, R' et R" sont identiques et représentent chacun un radical hydroxy ou méthoxy et R"' représente un atome d'hydrogène, de brome, de chlore ou d'iode ou un radical nitro.

Dans les définitions qui précédent et celles qui suivent, les radicaux et portions alkyle et alkyloxy contiennent 1 à 4 atomes de carbone en chaîne droite ou ramifiée, Arg signifie arginine, Lys signifie lysine, Pro signifie proline, Fmoc signifie 9-fluorénylméthoxycarbonyle, Pmc signifie 2,2,5,7,8-pentaméthylchroman-6-sulfonyle, Boc signifie tert-butoxycarbonyle.

Le composé de formule (I) pour lequel R, R' et R" repré.sentent un radical hydroxy et R"' représente un atome d'hydrogène peut être préparé par fermentation d'actinomycè- tes A9738 (CBS 162.94) et isolement du produit.

La fermentation s'effectue selon les procédés classiques de fermentation. De préfé¬ rence, on utilise comme milieu de culture un milieu comprenant de la peptone, un ex¬ trait de levure, un extrait de viande, du glucose, du carbonate de calcium, du chlorure de sodium et de l'agar. Cette fermentation est réalisée de préférence à une température

comprise entre 25 et 30°C. Le moût est ensuite extrait et la phase aqueuse ultrafiltrée et chromatographiée plusieurs fois.

Les composés de formule (I) pour lesquels R représente un radical alkyloxy ou phenylalkyloxy peuvent être préparés par estérification d'un composé de formule (I) correspondant pour lequel R représente un radical hydroxy.

Cette estérification s'effectue, de préférence, par action d'un alcool R-OH pour lequel R représente un radical alkyle ou phénylalkyle soit en présence de chlorure de thionyle selon la méthode décrite par M.E. JUNG et coll., Tetrahedron Letters, 30 (32), 4211- 4 (1989), soit en présence d'acide chlorhydrique gazeux ou d'acide sulfurique, à une température comprise entre 0 et 25°C, soit lorsque R représente un radical benzyloxy, en présence d'acide paratoluène sulfonique selon la méthode décrite par T.E. WALKER et coll., J. Org. Chem., 51, 1175-9 (1986). L'ester tert-butylique peut éga¬ lement être obtenu par action d'isobutène selon le procédé décrit dans le brevet US 3496219.

Les composés de formule (I) pour lesquels R représente un radical -NH-CH2-COOH peuvent être préparés par action d'un composé de formule (I) correspondant pour le¬ quel R représente un radical hydroxy sur la glycine.

π est particulièrement avantageux d'utiliser le composé de formule (I) sous forme acti¬ vée. Comme forme activée, on peut citer le produit de réaction du composé de for- mule (I) avec la N-hydroxysuccinimide, le N-hydroxybenzotriazole, l'hexafluoromé- thylphosphate de 2-[lH-benzotriazol-l-yl]-l,l,3,3-tétraméthyluronium qui peut être préparé au sein d'un solvant inerte tel qu'un amide comme le diméthylformamide, la N- méthylpyrrolidine-2-one, un solvant chloré tel que le chloroforme ou le chlorure de méthylène, un éther comme le tétrahydrofuranne ou un mélange de ces solvants, à une température comprise entre 15 et 60°C, en présence de tamis moléculaire 4Â ou d'un agent de condensation tel que le dcyclohexylcarixjdiimide ou encore un ester de pen- tafluorophényle qui peut être préparé selon la méthode décrite par L. KISFALUDY et coll., Synthesis, 325-327 (1983).

La condensation s'effectue généralement dans les mêmes conditions de température et de milieu réactionnel que celles décrites précédemment pour la préparation de la forme activée du composé de formule (I) éventuellement en présence de pyridine ou d'une

aminé telle que la dusopropyléthylamine. Ces réactions peuvent s'effectuer sans isoler le produit activé.

Les composés de formule (I) pour lesquels R' et R" représentent des radicaux méthoxy peuvent être préparés par action d'un composé de formule (I) correspondant pour le- quel R' et R" représentent des radicaux hydroxy sur le triméthylsilyldiazométhane. Lorsque R représente un radical hydroxy non protégé, on obtient un composé de for¬ mule (I) pour lequel R, R' et R" sont des radicaux méthoxy.

Cette réaction s'effectue au sein d'un alcool aliphatique inférieur (méthanol, éthanol par exemple), à une température voisine de 20°C.

Les composés de formule (I) pour lesquels R'" représente un radical nitro peuvent être préparés par nitration d'un composé de formule (I) correspondant pour lequel R'" re¬ présente un atome d'hydrogène.

Cette nitration s'effectue par toute méthode de nitration connue. De préférence, on fait réagir l'acide nitrique, au sein de l'acide acétique, à une température voisine de 20°C.

Les composés de formule (I) pour lesquels R"' représente un atome de chlore peuvent être préparés par chloration d'un composé de formule (I) correspondant pour lequel R'" représente un atome d'hydrogène.

Cette réaction s'effectue par toute méthode connue de chloration. De préférence, on fait réagir le 2,3,4,5,6,6-hexachloro-2,4-cyclohexadiène-l-one au sein d'un mélange di- méthylformamide-tétrachlorure de carbone, à une température voisine de 20°C selon la méthode décrite par M. LEMAIRE et coll., Janssen Chimica Acta, 5(1), 3-8 (1987).

Les composés de formule (I) pour lesquels R ¹ " représente un atome de brome peuvent être préparés par bromation d'un composé de formule (I) correspondant pour lequel R"' représente un atome d'hydrogène.

Cette réaction s'effectue par toute méthode connue de bromation. De préférence, on fait réagir le brome, en présence d'acétate de sodium, au sein de l'acide acétique, à une température voisine de 20°C.

Les composés de formule (I) pour lesquels R"' représente un atome d'iode peuvent être préparés par iodation d'un composé de formule (I) correspondant pour lequel R"' re¬ présente un atome d'hydrogène.

Cette réaction s'effectue par toute méthode connue de iodation. De préférence, on fait réagir un iodure de métal alcalin (iodure de sodium ou de potassium par exemple), en présence d'un réactif tel que le l,2,4,6-tétrachloro-3 ,6α-diphénylglycouril, au sein d'un alcool aliphatique inférieur tel que le méthanol, à une température voisine de 20°C.

Les composés de formule (I) pour lesquels R représente un radical hydroxy peuvent être éventuellement transformés en sels métalliques ou en sels d'addition avec les bases azotées selon des méthodes connues en soi. Ces sels peuvent être obtenus par action d'une base métallique (alcaline ou alcalinoterreuse par exemple), de l'ammoniac, d'une aminé ou d'un sel d'un acide organique sur un composé de formule (I), dans un sol¬ vant. Le sel formé est séparé par les méthodes habituelles.

Les composés de formule (I) peuvent être éventuellement transformés en sels d'addi¬ tion avec un acide minéral ou organique par action d'un tel acide au sein d'un solvant organique tel qu'un alcool, une cétone, un éther ou un solvant chloré.

Comme exemples de sels, peuvent être cités les sels d'addition avec les acides miné¬ raux ou organiques (tels que acétate, trifluoroacétate, propionate, succinate, benzoate, fumarate, maléate, oxalate, méthanesulfonate, iséthionate, théophyllinacétate, salicylate, méthylène-bis-β-oxynaphtoate, chlorhydrate, sulfate, nitrate et phosphate), les sels avec les métaux alcalins (sodium, potassium, lithium) ou avec les métaux alcalinoterreux (calcium, magnésium), le sel d'ammonium, les sels de bases azotées (éthanolamine, triméthylamine, méthylamine, pipéridine, benzylamine, N-benzyl-α- phénéthylamine, choline, arginine, leucine, lysine, N-méthyl glucamine).

Les composés de formule (I) sont particulièrement intéressants comme intermédiaires pour la préparation de composés actifs comme antagonistes de la neurotensine de for¬ mule :

dans laquelle R représente un radical hydroxy, alkyloxy, phenylalkyloxy ou -NH-CH2-COOH, Rj représente un atome d'hydrogène, un radical adamantylacétyle, adamantylcarbonyle, norbornylacétyle, norbornylphénoxycarbonyle, benzoyle, nicoti- noyle, 4-phénylbenzoyle, 4-tert-butylbenzoyle, 2-pyrrolidinecarbonyle ou un groupe protecteur d'une fonction aminé, R2 représente un résidu Arg ou Lys, R3 représente un résidu Arg ou Lys, R4 représente un résidu Pro, m, n et p, identiques ou différents, représentent un nombre égal à 0 ou 1, étant entendu que lorsque Rj représente un atome d'hydrogène la somme m+n+p est au moins égale à 1, R5 et R5 sont identiques et représentent un radical hydroxy ou méthoxy et R7 représente un atome d'hydro¬ gène, de chlore, de brome ou d'iode ou un radical nitro, ainsi que leurs équivalents dans lesquels les liaisons peptidiques (CO-NH) entre deux résidus d'acide aminé sont remplacées par des liaisons -CH2-NH- et/ou la liaison peptidique (CO-NH) entre les résidus d'acide aminé R2 et R3 est remplacée par une li-aison -CH=CH-.

Dans la formule (II), chaque résidu d'acide aminé peut être dans la configuration L ou D.

Comme groupe protecteur de la fonction aminé on peut citer les groupes 9-fluorénylméthoxycarbonyle, tert-butylcarbonye, acétyle, pivaloyle et benzyloxycarbonyle dont le phényle est éventuellement substitué par halogène, alkyle, alkyloxy ou nitro.

Les composés peptidiques de formule (H) pour lesquels la somme m+n+p est au moins égale à 1 peuvent être préparés par action d'un composé de formule (I) sur un dérivé de formule :

R ₁ -(R2)m-(R ₃ )n-(R ₄ )p-OH (m)

dans laquelle Rj représente un radical adamantylacétyle, adamantylcarbonyle, norbor- nylacétyle, norbornylphénoxycarbonyle, benzoyle, nicotinoyle, 4-phénylbenzoyle, 4-tert-butylbenzoyle, 2-pyrrolidinecarbonyle ou un groupe protecteur d'une fonction aminé, R2, R3, R4, n, m et p ont les mêmes significations que dans la formule (H), la somme m+n+p est au moins égale à 1, éventuellement suivie d'une déprotection de la fonction a iné terminale pour obtenir les composés pour lesquels Rj représente un atome d'hydrogène et/ou éventuellement lorsque R représente un radical alkyloxy ou phenylalkyloxy, d'une déprotection de la fonction carboxy pour obtenir les composés pour lesquels R représente un radical hydroxy.

Le couplage des dérivés de formules (I) et (III) s'effectue par toute méthode connue de l'homme du métier pour condenser un dérivé aminé et un peptide.

Il est particulièrement avantageux d'utiliser le dérivé de formule (III) sous forme acti¬ vée. Comme forme activée, on peut citer le produit de réaction du dérivé de formule (m) avec la N-hydroxysuœiιιimide, le N-hydroxybenzotriazole ou rhexafluorométhyl- phosphate de 2-[lH-benzotriazol-l-yl]-l,l,3,3-tétraméthyluronium qui peut être pré¬ paré au sein d'un solvant inerte tel qu'un amide comme le diméthylformamide, la N-méthylpyrrolidine-2-one, un solvant chloré tel que le chloroforme ou le chlorure de méthylène, un éther comme le tétrahydrofuranne ou un mélange de ces solvants, à une température comprise entre 15 et 60°C, en présence de tamis moléculaire 4À ou d'un agent de condensation tel que le ώcyclohexylcarbcdumide ou encore un ester de pen- tafluorophényle qui peut être préparé selon la méthode décrite par L. KISFALUDY et coll., Synthesis, 325-327 (1983).

La condensation du produit de formule (I) sur le produit activé de formule (III) s'ef¬ fectue généralement dans les mêmes conditions de température et de milieu réactionnel que celles décrites précédemment pour la préparation de la forme activée du dérivé de formule (lu) éventuellement en présence de pyridine ou d'une aminé telle que la dii- sopropyléthylamine. Ces réactions peuvent être faites sans isoler le produit activé.

Il peut être avantageux d'effectuer cette réaction en phase solide, sur une résine. Les résines préférées sont les résines 4-hydroxyméthylphénoxyméthyl-copolystyrène 1% divinylbenzène (HMP, Applied Biosystems, WANG, J. Amer. Chem. Soc., 95, 1328, (1973)), chlorotritylchlorure-copolymère polystyrène-1% divinylbenzène (Novabio- chem).

La déprotection éventuelle de la fonction aminé terminale peut être effectuée selon les techniques habituelles de déprotection des aminés telles que celles décrites par T.W. GREENE, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley, New York. On peut par exemple opérer au sein d'un solvant inerte tel que le diméthylformamide ou un sol- vant chloré tel que le dichlorométhane, en présence de pipéridine, à une température voisine de 20-25°C.

La déprotection éventuelle de la fonction carboxy peut être effectuée par toute mé¬ thode connue de l'homme du métier permettant de passer d'une fonction ester car- boxylique à une fonction carboxy. De préférence, on opère au sein d'un solvant inerte tel que le dioxanne, l'eau ou un mélange de ces solvants, en présence de lithine, à une température voisine de 0°C.

Les dérivés de formule (III) sont commercialisés ou peuvent être préparés par applica¬ tion ou adaptation des méthodes décrites par S. DOULUT et coll., Peptide Research, 5 (1), 30-38 (1992; J. COUDER et coll., Int. J. Peptide Res., 41, 181-184 (1993); V.K. SKUKLA et coll., Can. J. Physiol. Pharmacol., 71, 211-216 (1993); M.H. MICHAEL et coll., J. Chem. Soc. Perkin I, 307-314 (1982); T.E. CHRISTOS et coll., Bioorga ic Médicinal Chemistry Letters, 3 (6), 1035-1040 (1993), dans les brevets WO 93/00359 et WO 91/02750 et dans les exemples.

Les composés de formule (II) pour lesquels la somme m+n+p est au moins égale à 1, Rj représente un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur d'une fonction aminé peuvent également être préparés par action d'un dérivé de formule (I) correspondant sur successivement un dérivé (R4)p-OH et/ou (R3)n-OH et/ou (R2)m-OH dans les¬ quels R4, R3 et R2 ont les mêmes significations que dans la formule (I) dont les restes amino sont de préférence protégés suivie éventuellement d'une déprotection.

Cette réaction s'effectue dans les conditions décrites dans la littérature pour la chimie des peptides telles que celles décrites précédemment pour le couplage des dérivés de formule (I) et de formule (IH).

Les composés de formule (II) pour lesquels la somme m+n+p est égale à 0, Ri repré¬ sente un groupe protecteur de la fonction aminé peuvent être préparés par toute mé- thode connue de l'homme de l'art de protection d'une fonction aminé ne modifiant pas le reste de la molécule. En particulier, lorsque Rj représente un radical

9-fluorénylméthoxycarbonyle on fait réagir un composé de formule (I) «sur le carbonate de 9-fluorénylméthyle et de N-succinyle.

Cette réaction s'effectue généralement au sein d'un solvant inerte tel que le dioxanne, en présence d'une solution aqueuse de carbonate de sodium, à une température voisine de 20°C.

Lorsque Ri représente un radical tert-butoxycarbonyle, acétyle, pivaloyle ou benzyloxycarbonyle dont le phényle est éventuellement substitué par halogène, alkyle, alkyloxy ou nitro on fait réagir un composé de formule (I) sur un dérivé Rι~Cl dans lequel Ri représente un radical tert-butoxycarbonyle, acétyle, pivaloyle ou benzyloxycarbonyle dont le phényle est éventuellement substitué par halogène, alkyle, alkyloxy ou nitro.

Cette réaction s'effectue de préférence au sein d'un solvant inerte tel que le diméthyl- formamide, en présence d'une base telle qu'une trialkylamine (diisopropyléthylamine par exemple), à une température voisine de 20°C.

Les composés de formule (II) pour lesquels m+n+p est égal à zéro et représente un radical adamantylacétyle, adamantylcarbonyle, norbomylacétyle, norbomylphénoxy¬ carbonyle, benzoyle, nicotinoyle, 4-phénylbenzoyle, 4-tert-butylbenzoyle, 2-pyrrolidinecarbonyle peuvent être préparés par action d'un composé de formule (I) sur un chlorure Ri-Cl dans lequel Ri représente un radical adamantylacétyle, adamantylcarbonyle, norbomylacétyle, norbomylphénoxycarbonyle, benzoyle, nicotinoyle, 4-phénylbenzoyle, 4-tert-butylbenzoyle, 2-pyrrolidinecarbonyle.

Cette réaction s'effectue de préférence au sein d'un solvant inerte tel que le diméthyl- formamide, en présence d'une base telle qu'une trialkylamine (di-iscprOpyléthylamine par exemple), à une température voisine de 20°C.

Les composés de formule (II) peuvent être purifies par les méthodes connues habituel¬ les, par exemple par chromatographie ou extraction.

Il est entendu pour l'homme du métier que, pour la mise en oeuvre des procédés dé¬ crits précédemment, il peut être nécessaire d'introduire des groupes protecteurs des fonctions amino afin d'éviter des réactions secondaires tels que ceux décrits par T.W. GREENE, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley, New York.

Les composés de formule (II) pour lesquels R représente un radical hydroxy peuvent être éventuellement transformés en sels métalliques ou en sels d'addition avec les bases azotées selon des méthodes connues en soi. Ces sels peuvent être obtenus par action d'une base métallique (alcaline ou alcalinoterreuse par exemple), de l'ammoniac, d'une aminé ou d'un sel d'un acide organique sur un composé de formule (II), dans un solvant. Le sel formé est séparé par les méthodes habituelles.

Les composés de formule (II) peuvent être éventuellement transformés en sels d'addi¬ tion avec un acide minéral ou organique par action d'un tel acide au sein d'un solvant organique tel qu'un alcool, une cétone, un éther ou un solvant chloré.

Comme exemples de sels pharmaceutiquement acceptables, peuvent être cités les sels d'addition avec les acides minéraux ou organiques (tels que acétate, trifluoroacétate, propionate, succinate, benzoate, fumarate, maléate, oxalate, méthanesulfonate, iséthionate, théophyllinacétate, salicylate, mémylène-bis-β-oxynaphtoate, chlorhydrate, sulfate, nitrate et phosphate), les sels avec les métaux alcalins (sodium, potassium, lithium) ou avec les métaux alcalinoterreux (calcium, magnésium), le sel d'ammonium, les sels de bases azotées (éthanolamine, triméthylamine, méthylamine, pipéridine, benzylamine, N-benzyl-α-phénéthylamine, choline, arginine, leucine, lysine, N-méthyl glucamine).

Les composés de formule (II) présentent des propriétés pharmacologiques intéressan- tes. Ces composés sont des antagonistes de la neurotensine et sont donc utiles pour traiter ou prévenir des désordres associés à la neurotensine.

C'est ainsi que ces composés peuvent être utilisés pour le traitement ou la prévention des psychoses, des troubles anxieux, de la dépression, des troubles cognitifs, de la neurodégénération, des attaques de panique, de la maladie de Parkinson, de la maladie d'Alzheimer, de la schizophrénie, de l'autisme, de la diskynésie tardive, du syndrome du colon irritable, de la pancréatite aiguë, des ulcères, des désordres de la motilité in¬ testinale, de certaines tumeurs sensibles à la neurotensine, dans le sevrage aux traite¬ ments chroniques et abus d'alcool ou de médicaments, des phénomènes allergiques et inflammatoires, des troubles cardiovasculaires et respiratoires et de l'asthme.

L'affinité des composés de formule (II) vis-à-vis de la neurotensine a été mesurée par leur capacité à déplacer la liaison de la neurotensine tritiée de ses récepteurs présents dans une préparation membranaire brute de cortex cérébral de cobaye. Le test est basé

sur celui décrit par M. GOEDERT et coll., Brain Research, 304, 71-81 (1984) : des cobayes mâles Dunkin-Hartley (200-300 g) sont sacrifiés par décapitation et le cerveau rapidement prélevé. Toutes les étapes suivantes sont réalisées à 4°C. Le cortex céré¬ bral est disséqué, pesé et homogénéisé dans 5 ml de tampon Tris-HCl (50mM, pH 7,4) par gramme de tissu avec un polytron (force 6 pendant 15 secondes). L'homogénéisât est centrifugé à 48000 g pendant 15 minutes et le culot obtenu lavé deux fois dans le même tampon. Le culot final est homogénéisé dans 3 ml de tampon par gramme de tissu initial et gardé sous forme d'aliquots (environ 20 mg de protéines par ml) à -80°C jusqu'à utilisation. Le contenu protéique est mesuré selon la méthode de BRADFORD, Anal. Biochem., 72, 248-254 (1976). Le test de liaison est réalisé dans du tampon Tris-HCl 50mM pH7,4 contenant 0,4% d'albumine de sérum bovin et 0,1 mM de ba- citracine en présence de 0,15 mg de protéines par ml et 0,8nM de [3H]neurotensine pendant 15 minutes à 25°C. La liaison non spécifique est déterminée en présence de lμM de neurotensine 1-13. La réaction est arrêtée par filtration et la radioactivité re- tenue sur le filtre mesurée par scintillométrie. Les produits sont étudiés en gamme de concentrations afin de déterminer la concentration inhibitrice de 50% de la liaison spécifique. Les composés de formule (I) présentent dans ce test une CI50 inférieure à 15 μM.

Les composés de formule (II) présentent une faible toxicité compatible avec leur utili- sation comme principe actif de médicaments.

Les exemples suivants illustrent l'invention.

Un échantillon de la souche actinomycètes A9738 a été déposé et enregistré auprès du Centraalbureau voor Schimmel culturen (CBS) à Baarn 0?ays Bas) dans les conditions du traité de Budapest, le 22 mars 1994 sous le numéro CBS 162.94.

Pour les spectres de R.M.N., la nomenclature utilisée est celle de la Protein Data Bank, à l'exception des radicaux méthyle qui sont appelés M. Les résidus amino-aci- des des résidus macrocycliques des composés de formules (I) et (II) sont appelés X-TYR1 (amino-acide N terminal); X-ILE2; X-TYR3 et X-TYR4 (amino-acide C terminal). Les résidus amino-acides de la chaîne sont appelés R suivi du nom de l'amino-acide et de sa position dans la chaîne.

EXEMPLE 1

Préparation du composé de formule (I) pour lequel R, R' et R" représentent des radi¬ caux hydroxy et R'" représente un atome d'hydrogène:

Dans un erlenmeyer de 2 litres, un milieu de 250 ml contenant 5g/l de peptone, 5 g/ï d'extrait de levure, 15 g/1 de glucose, 5 g/1 d'extrait de viande, 3 g/1 de carbonate de calcium, 5 g/1 de chlorure de sodium et 1 g/1 d'agar est ensemencé par une gélose incli¬ née d'actinomycètes A9738 (CBS 162.94) sous forme de suspension de spores. Après agitation à 140 t/mn dans un agitateur thermostaté à 28°C pendant 72 heures, la totali¬ té de la culture est transférée stérilement dans un fermenteur primaire rempli de 60 li¬ tres du même milieu. Le fermenteur est agité à 300 t mn, aéré à 5 m^/h et thermostaté à 28°C pendant 44 heures. La totalité de la culture est alors transférée stérilement dans un fermenteur de production avec 450 litres de milieu stérilisé 40 minutes à 122°C (distillers 5 g/1, haricots 40 g/1, glucose 5 g/1, huile de soja 10 gΛ, chlorure de sodium 5 g/1 et chlorure de cobalt 20 mg/1) puis maintenue à une température de 28°C pendant 94 heures, sous agitation à 250 1 mn et aéré à raison de 15 n / . Le moût (487 litres, pH 7,8) est ensuite agité avec 5% de clarcel commercialisé par CECA puis filtré pour séparer le mycélium du filtrat. Le filtrat (300 litres) est extrait par 2 fois 100 litres d'acétate d'éthyle et la phase aqueuse (250 litres) est ultrafiltrée par une membrane d'ultrafiltration dont le seuil de coupure est de 20 kD juqu'à obtenir un volume de ré- tentat de 40 litres. L'ultrafiltrat (210 litres) est percolé sur une colonne en acier inoxy- dable (20x60 cm) contenant 30 litres de résine Duolite S861 commercialisé par Rhom et Haas avec un débit de 301 h. La colonne est rincée avec 80 litres d'eau puis la chromatographié est effectuée par un gradient par palier méthanol-eau avec un débit de 301/h et des fractions de 10 litres (50/50 en volumes pour les fractions 1 et 2, 60/40 en volumes pour les fractions 3 à 8, 80/20 en volumes pour les fractions 9 et 10 et 100 % de méthanol pour les fractions 11 et 12). Les fractions 3 à 6 sont rassemblées, le méthanol est élilminé sous pression réduite (3,4 kPa) puis la phase aqueuse est lyophilisée. On obtient ainsi 12,4 g d'une poudre jaune. Ce lycφhilisat est délité par 600 ml de méthanol refroidi à 4°C, l'insoluble est écarté et la solution est concentrée sous pression réduite (3,4 KPa) pour donner 4 g d'extrait sec. Cet extrait est solubilisé par 110 ml d'une solution méthanol-eau (1/10 en volumes) et chromatographié sur une colonne en acier inoxydable (5x60 cm) remplie de silice greffée C18 Matrex (20 μ, 60À) commercialisée par Amicon à l'aide d'un système GELSON. Les fractions de 50 ml sont collectées avec un collecteur de fractions Pharmacia et le débit est de 50 ml/minute. Le profil de gradient utilisé est le suivant : en 30 minutes, gradient linéaire de méthanol-eau 10/90 en volumes à 40/60 en volumes, palier de 30 minutes à

40/60 en volumes puis gradient linéaire de 40/60 en volumes à 100 % de méthanol en 40 minutes. Les fractions 21 à 29 sont rassemblées et concentrées sous pression ré¬ duite (3,4 kPa) à un volume de 10 ml. Cette solution est déposée au sommet d'une colonne en verre (5x30cm) remplie de polyamide SC6 Macherey Nagel. L'élution s'ef- fectue à l'eau. 50 fractions de volumes variables (20 à 70 ml) sont collectées. Après avoir écarté les fractions 1 à 12 (environ 1100 ml), les fractions 13 à 25 (600 ml) sont rassemblées et déposées sur une colonne en verre de 5 cm de diamètre et contenant 250 ml de DEAE Biogel A (Bio-Rad). L'élution s'effectue à l'eau. Les premiers 900 ml d'effluent et d'éluat sont écartés puis le produit recherché est élue à la suite avec 2 li- très d'eau. Ces 2 litres sont percolés sur un réservoir Analytichem international de 75 ml (2,5 cm de diamètre interne) contenant 40 ml de silice greffée Cl 8 Bondesil 40 μ commercialisée par Analytichem International. L'effluent est écarté et le produit est élue au méthanol. La solution méthanolique est concentrée sous pression réduite pour donner 60 mg de produit de formule (I) pour lequel R, R' et R" représentent des radicaux hydroxy et R"' représente un atome d'hydrogène pur sous forme d'une poudre légèrement jaune [spectre IR : bandes caractéristiques (cm"l) à 3395 (OH phénol), 3300 (NH), 2970 (CH3), 2935 (CH2), 2875 (CH3, CH2), 3125 à 2125 (OH acide), 1670 (C=O acide et amide), 1585 à 1500 (noyaux benzèniques), 1235 (CO éther aromatique et phénol), 865 et 835 (CH aromatiques; Spectre de masse (Finnegan TSQ46 en D/IC avec comme gaz réactant l'ammoniac) M/z=634 MNH4+, 617 MH+; Spectre R.M.N. (400 MHz, DMSO d6, δ en ppm) : X-TYR1 : NH2 large; HA 4,14; HB1, HB2 3,05, 3,20; HD1 7,10; HD26,80; HE1 6,81; X-ILE2 : NH 8,38; HA 4,20; HB 1,58; MG1 0,88; HG21, HG22 1,20, 1,51; MD 0,84; X-TYR3 : NH 8,48; HA 3,63; HB1, HB2 2,42, 2,88; HD1 6,60; HD2 5,59; X-TYR4 : NH 4,22; HA 4,26; HB1, HB23,02, 3,47; HD1 7,24, HD27,26, HE1 7,46; HE26,78].

EXEMPLE 2

Préparation du composé de formule (I) pour lequel R représente un radical méthoxy, R' et R" représentent des radicaux hydroxy et R"' représente un atome d'hydrogène.

On dissout 200 mg du composé de formule (I) pour lequel R, R' et R" représentent des radicaux hydroxy et R"' représente un atome d'hydrogène dans 20 ml de méthanol et ajoute 0,8 ml d'acide sulfurique concentré. La solution est agitée 18 heures à une température voisine de 20°C. On ajoute alors 10 g de Duolite S 861 (Rhom et Haas), dilue avec 200 ml d'eau et agite 30 minutes à une température voisine de 20°C. On

filtre et lave la résine sur verre fritte avec 60 ml d'eau. On extrait ensuite le composé par élution avec 100 ml de méthanol. Après évaporation sous pression réduite (3,4 kPa), le résidu est purifié par chromatographié sur 170 ml de résine carboxyméthyl-Triacryl (SEPRACOR), en éluant avec de l'eau, et en recueillant des fractions de 10 ml. Les fractions contenant le composé recherché sont jointes et évaporées à sec pour donner 40 mg de composé de formule (I) pour lequel R représente un radical méthoxy, R'" représente un atome d'hydrogène, R' et R" représentent des radicaux hydroxy, sous forme d'une poudre légèrement jaune [Spectre de masse sur Sciex API III en ionspray: M/z= 631 (MH ⁺ ); Spectre infra- rouge (FMIR, dans le méthanol): 3390, 3275, 2960, 2875, 1740, 1660, 1585+ 1500, 1510, 1215, 865+ 835 cm" ¹ ; Spectre RMN (400 MHz ; DMSO ; TEMP.=303 K; δ en ppm) : X-TYR1 : NH2 7,92; HA 4,78; HB1, HB2 3,01; 3,17; HD1 7,09; HD2 6,74; HE1 6,82; X-ILE 2 : NH 8,63; HA 4,19; HB 1,62; MG1 0,82; HG21, HG22 1,18, 1,48; MD 0,79; X-TYR 3 : NH 8,73; HA 3,58; HB1, HB2 2,42, 2,62; HD1 6,51; HD2 5,50; X-TYR 4 : NH 4,22; HA 4,45; HB1, HB2 3,21; 3,39; HD1 7,12, HD2 7,36; HE1 7,58; HE2 6,82; OCH ₃ 3,81].

EXEMPLE 3

Préparation du composé de formule (I) pour lequel R, R' et R" représentent des radi¬ caux hydroxy et R"' représente un atome d'iode.

740 mg du composé de formule (I), pour lequel R, R' et R" représentent des radicaux hydroxy et R"' représente un atome d'hydrogène sont dissous dans 60 ml de méthanol et additionnés de 180 mg d'iodure de sodium, puis de 133 mg de l,2,4,6-tétrachloro-3 α,6α-diphénylglycouril. La solution est agitée 45 minutes, à une température voisine de 20°C. Les solvants sont alors évaporés sous pression réduite (2 kPa) et le brut réactionnel est fixé sur 10 g de gel de silice. On dépose ce mélange sur une colonne de 4 cm de diamètre contenant 150 g de gel de silice et élue avec le mélange acétate d'éthyle-acide acétique-eau (103-12-10 en volumes), en recueillant des fractions de 100 ml. Les fractions comprises entre 900 et 2400 ml sont jointes et concentrées à sec pour donner 734 mg d'un solide de couleur ocre. Ce solide est repris dans 20 ml d'eau et 100 ml d'acétate d'éthyle, tiédi à une température voisine de 40°C, puis refroidi à une température voisine de 20°C, avant d'être filtré, lavé avec 3 ml d'eau, puis avec trois fois 20 ml d'acétate d'éthyle. On le sèche sous pression réduite (30 Pa) à 40°C, pour obtenir 387,7 mg de composé de formule (I) pour lequel R, R' et R" représentent

14

des radicaux hydroxy et R'" représente un atome d'iode sous forme d'un solide de couleur beige fondant à une température supérieure à 260°C [Spectre de masse sur Autospec VG FISONS, en LIMS (Liquid Secondary Ion Mass Spectroscopy), matrice de glycérol-thioglycérol: M/z = 743 (MH)+; Spectre RMN (600 MHZ, DMSO, TEMP 303 K; déplacements chimiques en ppm) : X-TYR1 : HA 3,98; HB1.HB2 3,16, 2,80; HD1.HD2 7,34, 6,67; X-ILE2 : NH 8,51; HA 4,18; HB 1,62; MG1 0,84; HG21.HG22 1,49, 1,16; MD 0,82; X-TYR3 : NH 8,61; HA 3,64; HB1.HB2 2,66, 2,40; HD1.HD2 6,52, 5,29; X-TYR4: NH 4,19; HA 4,27; HB1,HB2 3,39, 3,02; HD1.HD2 7,40, 7,22; HE1, HE27,10, 6,70].

EXEMPLE 4

Préparation du composé de formule (I) pour lequel R, R' et R" représentent des radi¬ caux méthoxy et R'" représente un atome d'hydrogène.

Sous atmosphère inerte, à une solution de 1,4 g du composé de formule (I) pour lequel R, R ¹ et R" représentent des radicaux hydroxy, R"' représente un atome d'hydrogène et Rl-fl^ ^VG^p représente Fmoc- dissous dans 30 ml de méthanol, on addi¬ tionne en une heure 20 ml d'une solution 2M de triméthylsilyldiazométhane dans ïïiexane et agite 18 heures à une température voisine de 20°C. On additionne à nou¬ veau 10 ml d'une solution 2M de triméthylsilyldiazométhane dans ïïiexane et agite 24 heures à une température voisine de 20°C. On additionne 0,5 ml d'acide acétique, et évapore les solvants sous pression réduite (2 kPa). Le résidu obtenu est purifié par chromatographié sur une colonne de 4 cm de diamètre contenant 250 g de gel de si¬ lice, en éluant successivement avec 750 ml de dichlorométhane, 3000 ml du mélange dichlorométhane-méthanol (98/2 en volumes), puis du mélange dichlorométhane-mé- thanol (95/5 en volumes), en recueillant des fractions de 100 ml. Les fractions compri- ses entre 2500 et 4400 ml sont jointes et évaporées pour donner 932 mg d'un solide blanc. On peut continuer à purifier le produit, en le dissolvant dans 10 ml de dichlo¬ rométhane, en diluant avec 50 ml d'éthanol; la solution est ensuite concentrée sous pression réduite à une température voisine de 20°C, jusqu'à début de précipitation, et laissée au repos 16 heures à une température voisine de +5°C. On obtient ainsi 441 mg du composé de formule (II) pour lequel R, R' et R" représentent des radicaux méthoxy, R"' représente un atome d'hydrogène et Ri-(R2)m"^3)n"(R4)p représente Fmoc, sous forme d'une poudre blanche fondant à 145°C, en se décomposant [Spectre de masse sur Autospec VG FISONS, en LIMS (Liquid Secondary Ion Mass

Spectroscopy), matrice de glycérol+thioglycérol: M/z = 881 (MH) ⁺ ]. A 187 mg du composé précédemment obtenu dissous dans 20 ml de dichlorométhane, on ajoute 0,1 ml de pipéridine et agite à une température voisine de 20°C pendant 42 heures. Les solvants sont évaporés sous pression réduite (2 kPa); le résidu est trituré dans 10 ml de diéthyléther, à une température voisine de 35°C, refroidi à une température voisine de 20°C, filtré et lavé trois fois avec 5 ml de diéthyléther pour donner 140 mg de poudre blanche qui est reprise dans 5 ml d'eau et extraite cinq fois avec 20 ml d'acétate d'éthyle. Les solvants sont évaporés sous pression réduite (2 kPa). La purification est poursuivie p.ar reprise dans 1 ml de dichlorométhane dilué avec 10 ml de diéthyléther. On obtient ainsi 80 mg du composé de formule (I) pour lequel R, R' et R" représentent des radicaux méthoxy et R'" représente un atome d'hydrogène sous la forme d'une poudre légèrement jaune, fondant à 240°C, en se décomposât [Spectre de masse, sur Autospec VG FISONS, en LIMS (Liquid Secondary Ion Mass Spectroscopy), matrice de glycérol+thioglycérol: M/z = 659 (MH) ⁺ ].

EXEMPLES DE PREPARATION DES COMPOSES DE FORMULE (II) :

Exemple A

On solubilise 61 mg du dérivé de formule (I) pour lequel R, R' et R" représentent des radicaux hydroxy et R"' représente un atome d'hydrogène, 64 mg de Fmoc-Arg-Pro-OH et 13 mg de N-hydroxybenzotriazole dans 1 ml de diméthylfor- mamide contenant du tamis moléculaire 4 Â. Après 15 heures, on ajoute 10 μl de p - ridine et 21 mg de dicyclohexylcarbodiimide et on laisse réagir 72 heures à 40°C. On ajoute ensuite 15 ml d'eau et le précipité ainsi formé est collecté sur verre fritte n° 4. Le solide est délité par 10 ml de méthanol puis filtré. Le filtrat est étendu à 15 ml puis additionné d'eau (85 ml). La solution est soumise à une chromatographié liquide haute performance avec une colonne de silice greffée octadécyle (250x10 mm) au débit de 3,5 ml/minute. L'élution est effectuée à l'aide d'un gradient linéaire d'eau 0,07 % d'acide trifluoroacétique à acétonitrile-eau (70/30 en volumes) 0,07 % acide trifluoro- acétique. Des fractions de 1,7 ml sont collectées. Celles contenant le produit recherché sont rassemblées et évaporées sous pression réduite. On isole ainsi 0,6 mg du composé de formule (II) pour lequel R représente un radical hydroxy, Rl-(R2)m"G 3)n"G 4)p représente Fmoc-.Arg-Pro-, R5 et Rg représentent des radicaux hydroxy et R7 repré¬ sente un atome d'hydrogène sous forme d'une poudre beige [Spectre de masse sur perkin Elmer «API m en ionspray : M/z 1092 MH ⁺ 1114 MNa ⁺ ; Spectre de R.M.N.

(400MHz, DMSO, δ en PPM) : R-FMOC1 : HAÏ, HA2 4,22; HB 4,30; aromatiques 7,70; 7,31; 7,40; 7,89; R-ARG2 : NH 7,90; HA 4,20; HB1, HB2 1,45, 1,22; HG1, HG2 1,45; HD1, HD2 2,97; guanidine large; R-PRO3 - HA 4,42, HB1, HB2 1,83, 1,88; HG1, HG2 1,88, 1,88; HD1, HD2 3,60, 3,40; X-TYR1 : NH 6,98; HA 4,69; HB1, HB2 2,92; HD1 6,90; HD2 6,70; HE1 6,68; X-ILE2 : NH 8,27; HA 4,05; HB 1,60; MG1 0,82; HG21, HG22 1,15, 1,55; MD 0,83; X-TYR3 : NH 8,65; HA 3,58; HB1, HB2 2,88, 2,40; HD1 6,57; HD2 5,47; X-TYR4 : NH 4,27; HA 4,18, HB1, HB22,48, 2,52; HD1 7,16; HD27,31; HE1 7,51; HE2 6,78].

Le peptide Fmoc-Arg-Pro-OH peut être synthétisé en phase solide, en utilisant une «stratégie de synthèse Fmoc sur un appareil Applied Biosystems 431A en utilisant les cycles "standard Fmoc" fournis par le constructeur avec la N-méthylpyrrolidine-2-one comme solvant. La déprotection des fonctions alpha-amine est réalisée par une solu¬ tion de pipéridine à 20% dans la N-méthylpyrrolidine-2-one pendant 20 minutes à cha¬ que étape de synthèse. Le peptide est synthétisé sur 0,25 mmol de résine WANG (J. Am. Chem. Soc, 95, 1328 (1973)) 4-hydoxyméthylphénoxyméthyl-copolystyrène 1% divinylbenzène (HMP, Applied Biosystems). On forme l'anhydride symétrique de la Fmoc-Pro-OH (lmmol) par réaction pendant 20 minutes avec 0,5 mmol de dicyclohe-^lcarbodiimide dans 1,3 ml de N-méthylpyrrolidine-2-one et 1,8 ml de dichlorométhane. Après 13 minutes de réaction, 0,36 ml de diméthylaminopyridine à 0,1 M dans le diméthylformamide sont ajoutés. Après élimination par filtration de la dicyclohexylurée formée, l'anhydride symétrique est mis en réaction pendant 30 minutes avec la résine. La fonction aminé de la praline est déprotégée par réaction pendant 20 minutes avec une solution à 20% de pipéridine dans la N-méthylpyrrolidine-2-one. L'ester N-hydroxybenzotriazolyle de la Fmoc-- rg(Pmc)-OH est formé par réaction de 1 mmole de Fmoc-Arg(Pmc)-OH dans 4,1 ml de N-méthylpyrrolidine-2-one en présence de 1 mmol de N-hydroxybenzotriazole et 1 mmol de dicyclohexylcarbodiimide pendant 20 minutes. Après élimination de la dicyclohexylurée formée, l'ester est mis en réaction pendant 30 minutes avec la résine. On obtient ainsi une résine sur laquelle est greffé le groupe Fmoc-Arg(Pmc)-Pro. Le peptide est clivé de la résine par traitement pendant 1 heure et 30 minutes dans 10 ml d'acide trifluoracétique, 0,75 g de phénol, 0,25 ml d'éthanedi- thiol, 0,5 ml de thioanisole et 0,5 ml d'eau pour 100 mg de peptidyl-résine. Après éli¬ mination de la résine par filtration, la phase liquide est concentrée à l'évaporateur ro¬ tatif pendant 30 minutes sous pression réduite (4 kPa). Le peptide est ensuite précipité par addition d'éther tert-butylméthylique et d'éther de pétrole (4/1 en volumes) et ré-

cupéré par centrifugation. Le peptide est repris par un volume minimal d'acide trifluo- roacétique, précipité par addition d'un mélange d'éther tert-butylméthylique et d'éther de pétrole (4/1 en volumes) et récupéré par centrifugation, cette opération est répétée deux fois. Le peptide est ensuite lavé par 30 ml d'un mélange d'éther tert-butylméthylique et d'éther de pétrole (4/1 en volumes), récupéré par centrifugation et séché sous vide (4 kPa). Le peptide est utilisé tel quel pour les étapes suivantes de la synthèse.

Exemple B

Une solution de 60 mg de Fmoc-Arg-Arg-Pro-OH, 16 mg de N-hydroxysuccinimide et 20 mg de dicyclohexylca-±KDdiimide dans 1,5 ml de diméthylformamide est chauffée pendant 15 heures à 50°C. On ajoute ensuite 50 mg du dérivé de formule (I) pour le¬ quel R, R' et R" représentent des radicaux hydroxy et R'" représente un atome d'hy¬ drogène et une goutte de pyridine et laisse réagir 72 heures à une température de 50°C. Le mélange réactionnel est déposé en tête d'une colonne de silice (2,6x6cm) équilibrée dans du dichlorométhane. Après un lavage au dichlorométhane (45 ml) la colonne est percolée avec un mélange acétate d'éthyle-acide acétique-eau (60/12/10 en volumes). Des fractions de 4,5 ml sont collectées. Les fractions contenant le produit recherché sont rassemblées et évaporées à sec sous pression réduite (3,4 kPa) pour donner 10 mg d'une poudre beige. Cette poudre est soumise à une chromatographié li- quide haute performance avec une colonne de silice greffée octadécyle (250x10 mm) au débit de 3,5 ml/minute. L'élution est effectuée à l'aide d'un gradient linéaire d'eau 0,07 % d'acide trifluoroacétique à acétonitrile-eau (70/30 en volumes) 0,07 % acide trifluoroacétique. Des fractions de 1,7 ml sont collectées. Celles contenant le produit recherché sont rassemblées et évaporées sous pression réduite pour donner 5 mg du composé de formule (II) pour lequel R représente un radical hydroxy, Rl-(R2) _m -(R3)n"^4)p représente Fmoc-.Arg-Arg-Pro-, R5 et Rβ représentent des radicaux hydroxy et R7 représente un atome d'hydrogène sous forme d'une poudre lé¬ gèrement beige [Spectre de masse sur Perkin Elmer API III en ionspray : M/z : 1248 MH+, 624,8 (M+2H)++; Spectre de R.M.N. (400MHz, DMSO, δ en ppm : R-Fmocl : HAÏ, HA2 4,28, 4,32; HB 4,32; aromatiques 7,68; 7,32; 7,42; 7,88; R-ARG2 : NH 7,30; HA 4,08; HB1, HB2 1,65, 1,50; HG1, HG2 1,50; HD1, HD2 3,15; guanidine 7,35, 6,90; R-ARG3 : NH 7,98; HA 4,48; HB1, HB2 1,50; HG1, HG2 1,50; HD1, HD2 3,10; guanidine 7,22, 6,90; R-PRO4 : HA 4,38; HB1, HB2 1,85, 1,95; HG1, HG2 1,85, 1,95; HD1, HD2 3,45, 3,61; X-TYR1 : NH 6,90; HA 4,92;

HB1, HB2 2,98; HD1 6,90; HD2 6,90; HE1 6,80; X-ILE2 : NH 8,12; HA 4,13; HB 1,63; MG1 0,85; HG21, HG22 1,22, 1,51; MD 0,83; X-TYR3 : NH 8,48; HA 3,62; HB1, HB2 2,65, 2,70; HD1 6,58; HD2 5,52; X-TYR4 - NH 4,22; HA 4,32; HB1, HB23,20, 3,35; HD1 7,28; HD27,30; HE1 7,51; HE26,78].

La synthèse du peptide Fmoc-Arg-Arg-Pro-OH est conduite comme décrit pour le peptide Fmoc-.A-rg-Pro-OH dans l'exemple A. Une résine sur laquelle on a greffé au préalable un groupe Fmoc-Arg(Pmc)-Pro comme décrit à l'exemple A est déprotégée de son groupement protecteur Fmoc par de la pipéridine à 20 % dans la N-méthylpyrrolidine-2-one pendant seulement 3 minutes pour limiter la formation d'un dérivé dicétopipérazinique correspondant. La résine est lavée extensivement par de la N-méthylpyrrolidine-2-one. Parallèlement l'ester N-hydroxybenzotriazolyle de la Fmoc-Arg(Pmc)-OH est formé par réaction de 1 mmol de Fmoc-.Arg(Pmc)-OH dans 2,1 ml de N-méthylpyrrolidine-2-one, 1 ml de N-hydroxybenzotriazole 1M dans la N-méthylpyrrolidine-2-one et 1 ml de dicyclohexylcartiodiimide 1M dans la N-méthylpyrrolidine-2-one pendant 20 minutes. Après élimination de la dicyclohexylurée formée, cet ester est mis en réaction pendant 30 minutes avec la résine greffée. On obtient ainsi une résine sur laquelle est greffé le groupe Fmoc-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-Pro. Le peptide Fmoc-Arg-Arg-Pro-OH est clivé de la résine et purifié de la même manière que Fmoc-Arg-Pro-OH.

Exemple C

On dissout 7 mg du produit de l'exemple B dans 180 μl de diméthylformamide et on ajoute 20 μl de pipéridine. La solution se trouble rapidement et un précipité apparaît. Le précipité est collecté par centrifugation et lavé par deux fois 200 μl d'acétonitrile. On obtient ainsi 1 mg du composé de formule (II) pour lequel R représente un radical hydroxy, Rl-(R2)m"^3)n"^4)p représente H-Arg-Arg-Pro-, R5 et Rβ représentent des radicaux hydroxy et R7 représente un atome d'hydrogène sous forme de sel de pi¬ péridine [Spectre de masse sur Perkin Elmer API El en ionspray : M/z 1026 MH ⁺ ].

Exemple D

A une solution de 62 mg de composé de formule (I) pour lequel R, R' et R" représen- tent des radicaux hydroxy et R ¹ " représente un atome d'hydrogène et de 52,5 μl de dii- sopropyléthylamine dans 3 ml de diméthylformamide, on ajoute 50,3 mg de N-Fmoc-

I _^ prolinate de pentafluorophényle et agite 18 heures à une température voisine de

25°C. On dilue alors avec 25 ml d'acétate d'éthyle et 25 ml d'eau, puis acidifie avec une solution aqueuse d'acide chlorhydrique IN. Après décantation, la phase organique est lavée par 3 fois 25 ml d'eau et séchée sur sulfate de magnésium. Après filtration, lavage et évaporation du filtrat (2 kPa), on obtient 80 mg de solide. Ce solide est pu- rifié par chromatographié liquide haute performance sur une colonne LiChroprep diol (MERCK) de 2,5 cm de diamètre et 31 cm de longueur, en éluant à un débit de 10 ml par minute, d'abord avec 200 ml du mélange dichlorométhane-éthanol (95/5 en volu¬ mes), puis 200 ml du mélange dichlorométhane-éthanol (93/7 en volumes). Les frac¬ tions contenant le composé attendu sont réunies et évaporées à sec (2 kPa), pour donner 25 mg du composé de formule (II), pour lequel R représente un radical hy¬ droxy, représente Fmoc-Pro-, R5 et R représentent des radi¬ caux hydroxy et R7 représente un atome d'hydrogène sous forme d'un solide blanc [Spectre de masse (Autospec VG FISONS en LSIMS) : M/z = 936 (M + H)+. M/z = 714 (M - Fmoc + 2H)+; Spectre infrarouge (KBr): 3390, 2965, 2930, 2875, 3100 à 2250, 1680, 1585, 1450, 1505, 835, 760, 740 cm" ¹ ; Spectre de RMN (600 MHz; DMSO; TEMP.=350K, δ en ppm : R-Fmocl : HAÏ, HA2 4,20, 4,32; HB 4,32; aromatiques 7,83; 7,28; 7,48; 7,88; R-PRO2 : HA 4,22; HB1, HB2 1,74, 2,08; HG1, HG2 1,78, 1,95; HD1, HD2 3,28, 3,35; X-TYR1 : NH 7,62; HA 4,71; HB1, HB2 2,91; 3,06; HD1 6,89; HD2 6.84; HE1 6.68; X-ILE2 - NH 7,95; HA 4,15; HB 1,62; MG1 0,82; HG21, HG22 1,12, 1,47; MD 0,79; X-TYR3 : NH 8,24; HA 3,62; HB1, HB2 2,46; 2,70; HD1 6,62; HD2 5,52; X-TYR4 : NH 4,22; HA 4,26; HB1, HB2 3,10, 3,38; HD1 7,18; HD27,25; HE1 7,45; HE26,78].

Exemple E

9 mg du composé de l'exemple D sont dissous dans 0,5 ml du mélange dichloromé- thane-pipéridine (90/10 en volumes). Après 96 heures à une température voisine de 25°C, les solvants sont évaporés sous pression réduite (2 kPa). Le résidu est repris dans 0,5 ml d'eau, puis lavé par deux fois 1 ml d'éther diéthylique. La phase aqueuse est amenée à un pH voisin de 4 avec de l'acide acétique. La suspension obtenue est alors chromatographiée sur une colonne préparative de chromatographié liquide haute performance de silice greffée octadécyle Bio-Rad 100 Â de 25 cm de longueur et de 1 cm de diamètre avec un débit de 6 ml par minute. L'élution est effectuée à l'aide d'un gradient linéaire d'eau-acide trifluoroacétique (100/0,07 en volumes) à eau-acétoni- trile-acide trifluoroacétique (63/37/0,07 en volumes), en 33 minutes. Des fractions de 3 ml sont recueillies. Les fractions contenant le produit recherché sont jointes, congé-

lées à -80°C et lyophilisées (1 Pa) pour donner 0,6 mg de composé de formule (H) pour lequel Ri-(R2)m"^3)n"^4)p représente H-Pro-, R, R5 et R5 représentent des radicaux hydroxy et R7 représente un atome d'hydrogène sous forme d'un solide blanc [Spectre de masse (Fïnnegan TSQ46 en désorpsion par ionisation chimique avec comme gaz réactant l'ammoniac): M/z= 714 (MH ⁺ ); Spectre RMN (600 MHz DMSO ; TEMP.≈303 K; Ô en ppm) : R-PRO1 : HA 4,10; HB1, HB2 1.77, 2,12: HG1, HG2 1,73; HD1, HD2 3,20; X-TYR1 : NH 8,13; HA 4,78; HB1, HB2 2,94 3,03; HD1 6,78; HD2 6,78; HE1 6.71; X-ILE2 : NH 8,31; HA 4,10; HB 1,62; MG1 0,82; HG21, HG22 1,12; 1,47; MD 0,79; X-TYR3 : NH 8,66; HA 3,59; HB1, HB2 2,42; 2,69; HD1 6,58; HD2 5,49; X-TYR4 : NH 4,14; HA 4,31; HB1, HB2 3,10; 3,38; HD1 7,18; HD27,32; HE1 7,52; HE2 6,80].

Exemple F

20 mg de composé de formule (I) pour lequel R représente un radical méthoxy, R' et R" représentent des radicaux hydroxy et R ¹ " représente un atome d'hydrogène sont ajoutés à un mélange de 23,2 mg de trifluoroacétate de (Boc)2Lys-Ψ [CH2NH]-Lys(Boc)-Pro-OH, 11,4 mg d'hexafiuorométhylphosphate de 2-[lH-benzotriazol-l-yl]-l,l,3,3-tétraméthyluronium et 16 μl de dϋsopropyléthyla- mine dans 3 ml de diméthylformamide, à une température voisine de 20°C. Le mé¬ lange est agité pendant 6 heures et 30 minutes à cette même température. Les solvants sont évaporés sous pression réduite (15 Pa). Le résidu est repris dans 5 ml de dichlo- roéthane et lavé par deux fois 1 ml d'eau, deux fois 1 ml d'une solution 0,1 M de mo¬ nophosphate de sodium, deux fois 1 ml d'une solution 0,25 M d'hydrogénocarbonate de sodium et par deux fois 1 ml d'eau. La phase organique est concentrée sous pres¬ sion réduite (5,3 kPa). Le résidu est repris dans 2 ml d'acide trifluoroacétique aqueux (95/5 en volumes) à une température voisine de 20°C pendant 1 heure et 30 minutes. Après concentration à un volume d'environ 0,2 ml (5,3 kPa), le produit est précipité par addition de méthyl-tert-butyléther et collecté par centrifugation. On obtient ainsi 2,2 mg de composé de formule (II) pour lequel Rl-(R2)m"^3)n ^_ ^4)p représente H-Lys-Ψ[CH2NH]-Lys-Pro-, R représente un radical méthoxy, R5 et Rg représentent des radicaux hydroxy et R7 représente un atome d'hydrogène de couleur jaune clair. Spectre de masse sur Sciex -API III en ionspray: M/z= 970 (MH ⁺ ).

Le composé (Boc)2Lys-Ψ[CH2NH]-Lys(Boc)-Pro-OH peut être préparé selon la méthode de S DOULUT et coll., Peptide Research, 5 (1), 30-38 (1992), en faisant

réagir le (Boc^Lysinal sur H-Lys(Boc)-Pro-OBg puis en saponifiant l'ester teπninal (OBg ester = N-benzhydrylglycolamide ester : Tetrahedron, 44, 5101-5108 (1988)).

Exemple G

37 mg de composé décrit à l'exemple F sont dissous dans 0,6 ml de dioxanne, 0,3 ml d'eau et 0,3 ml de solution de lithine 1M, à une température voisine de 0°C. Après 70 minutes d'agitation à une température voisine de 0°C, on dilue avec 10 ml d'acide acétique aqueux (10/90 en volumes), et on injecte le brut sur une colonne préparative de chromatographié liquide haute performance de silice greffée octadécyle Bio-Rad RSL 100 Â de 30 cm de longueur et de 1 cm de diamètre. L'élution est effectuée à l'aide d'un gradient linéaire d'eau-acide trifluoroacétique (100/0,07 en volumes) à eau- acétonitrile-acide trifluoroacétique (65/35/0,07 en volumes), en 30 minutes. Les frac¬ tions contenant le produit recherché sont jointes, congelées à -80°C et lyophilisées (1 Pa) pour donner 4,4 mg du composé de formule (II) pour lequel Ri-( 2)m"^3^n" (R ₄ )p représente H-Lys-Ψ[CH2NH]-Lys-Pro-, R, R5 et Rg représentent des radicaux hydroxy et R7 représente un atome d'hydrogène sous forme de poudre blanche [Spectre de masse sur Sciex API III en ionspray: M/z = 956 (MH ⁺ )].

Exemple H

La synthe.se en phase solide est effectuée au moyen du matériel de la société Shandon (groupe Life Science International) à l'exception du rotateur pour tubes à hémolyse. La résine est confinée dans des seringues d'extraction en phase solide de 3 ml en poly- éthylène haute densité (PE-HD) munies de filtres en téflon. Ces seringues sont mon¬ tées sur une vanne deux voies en téflon et fermées par un bouchon à ailettes à usage unique en PE-HD. L'agitation des seringues est réalisée sur un rotateur pour tubes à hémolyse. Les opérations de lavage et de filtration sont conduites sur une station de travail d'extraction en phase solide (enceinte à vide munie d'embouts luer, Shandon).

La synthèse est réalisée sur 50 μmol de résine en chimie Fmoc. Les couplages des aci¬ des aminés sont réalisés en traitant pendant 1 heure la résine p.ar 250 μmol de l'acide aminé convenablement protégé en présence de 250 μmol de 2-(lH-benzotriazole-l- yl)-l,l,3,3-tétraméthyluronium hexafluorophosphate, 250 μmol de N-hydroxyben- zotriazole et 750 μmol de dϋsopropyléthylamine dans 1,2 ml d'un mélange N-mémylpyrrolidme-2-one-diméthylformamide (1/1 en volumes). La déprotection du groupement Fmoc est réalisée par 3 traitements successifs de la résine pendant

1 minute, 1 minute et 20 minutes respectivement, avec 2 ml d'une «solution de pipéri¬ dine à 20% en volumes dans la N-méthylpyrrolidine-2-one.

On soumet successivement 50 μmol de résine Fmoc-Gly- [résine de Wang] (Wang et coll., J. Amer. Chem. Soc., 95, 1328, (1973)) aux traitements suivants : - Déprotection du groupement Fmoc,

- Lavage par 5 fois 2 ml de N-méthylpyrrolidine-2-one,

- Couplage de 2 équivalents du composé de formule (I) pour lequel R, R' et R" représentent chacun un radical hydroxy et R'" représente un atome d'hydrogène dont l'amino est protégé par Fmoc, - Lavage par 5 fois 2 ml de N-méthylpyrrolidine-2-one,

- Déprotection du groupement Fmoc,

- Lavage par 5 fois 2 ml de N-méthylpyrrolidine-2-one,

- Couplage de 5 équivalents de Fmoc-proline,

- Lavage par 5 fois 2 ml de N-méthylpyrrolidine-2-one, - Déprotection du groupement Fmoc,

- Lavage par 5 fois 2 ml de N-méthylpyrrolidine-2-one,

- Couplage de 5 équivalents de Fmoc-arginine(Pmc),

- Lavage par 5 fois 2 ml de N-méthylpyrrolidine-2-one,

- Déprotection du groupement Fmoc, - Lavage par 5 fois 2 ml de N-méthylpyrrolidine-2-one,

- Couplage de 5 équivalents de Fmc>c-argin _-- ne(Pmc),

- Lavage par 5 fois 2 ml de N-méthylpyrrolidine-2-one, le peptide est ensuite clivé par réaction dans 10 ml d'un mélange acide trifluoroacéti- que-phénol-éthanedithiol-thioanisole-eau (40/3/1/2/2 en volumes) pendant 90 minutes. La résine est éliminée par filtration. Le filtrat est concentré sous pression réduite au moyen d'un évaporateur rotatif équipé d'une pompe à membrane et d'un piège à car- boglace pendant 1 heure, la température du bain étant maintenue à 45°C. Le volume final du concentrât est d'environ 1 ml. Le produit est précipité par addition de 15 ml de méthyl-tert-butyléther et recueilli par centrifugation. Le culot est solubilisé dans 1 ml d'acide trifluoroacétique, précipité par addition de 15 ml de méthyl-tert-butyléther puis lavé par 15 ml d'un mélange méthyl-tert-butyléther-éther de pétrole (2/1 en volumes) en présence de 0,2 ml d'acide trifluoroacétique. Le produit est séché sous pression ré¬ duite (3,5 kPa), puis purifié par chromatographié liquide à haute performance sur une colonne Ci8 100  (250 x 10 mm, Bio-Rad), en éluant avec un gradient de 20 à 40% d'acétonitrile contenant 0,07% en volumes d'acide trifluoroacétique dans l'eau conte-

nant 0,07% en volumes d'acide trifluoroacétique à un débit de 6 ml/minute, en 30 minutes, puis lyophilisé. On obtient ainsi 3,4 mg de ditrifluoroacétate du composé de formule (II) pour lequel R représente un radical -NH-CH2-COOH, Rl-(R2) -(R3)n-(R4)p représente Fmoc-.Arg-Arg-Pro-, R5 et Rg représentent des radicaux hydroxy et R7 représente un atome d'hydrogène sous la forme d'une poudre blanche [Spectre de masse sur Sciex API m en ESMS (Electrospray Mass Spectrometry) : M/z = 1306 (MH)+, M z = 653 (M+2H) ²⁺ ].

Exemple I

On traite 180 mg (170 μmol) de Boc-Arg(benzyloxycarbonyle)2- Arg(benzyloxycarbonyle)2-Pro-OH par 31 mg (150 μmol) de dicyclohexylcarbodii- mide et 23 mg (170 μmol) de N-hydroxybenzotriazole dans 3 ml de diméthylforma¬ mide pendant 4 heures à une température voisine de 20°C. La dicyclohexylurée formée est ensuite filtrée sur un filtre Millex HV 0,45 μm (Millipore) et le filtrat est ajouté à une solution contenant 100 mg (162 μmol) du composé de formule (I) pour lequel R"' représentent des atomes d'hydrogène, R, R' et R" représentent des radicaux hydroxy et 0,025 ml (143 μmol) de diisopropyléthylamine dans 2,5 ml de diméΛylformamide. La réaction est conduite pendant 24 heures à une température voisine de 20°C. Le solvant est éliminé grâce à un évaporateur centrifuge Speed Vac (Savant) équipé d'une pompe à palettes pendant 18 heures à une température voisine de 20°C. Le résidu est solubilisé dans 20 ml de dichlorométhane et la solution extraite successivement par 2 fois 4 ml d'eau distillée, 2 fois 4 ml d'une solution de dihydrogénophosphate de so¬ dium 0,1 M dans l'eau distillée et 2 fois 4 ml d'eau distillée. On obtient ainsi le compo¬ sé de formule (II) pour lequel représente Boc-- g(benzyloxycarbonyle)2-Arg(benzyloxycarbonyle)2-Pro-, R, R5 et R repré- sentent des radicaux hydroxy et R7 représente un atome d'hydrogène en solution dans le dichlorométhane. Cette solution est divisée en trois parts égales qui sont séchées. Une de ces parties est solubilisée dans 2 ml d'un mélange dichlorométhane-méthanol (1/1 en volumes). A cette solution on ajoute 100 mg de palladium sur charbon à 10% et 100 mg de formiate d'ammonium. La réaction est conduite pendant 100 minutes avec agitation périodique au vortex. Le milieu réactionnel est ensuite filtré sur un filtre Millex HV 0,45 μm (Millipore) et le filtre lavé par 5 ml de méthanol. Le solvant est évaporé sous pression réduite (2,6 kPa, 45°C, 30 minutes). Le produit est enfin purifié par chromatographié liquide à haute performance sur une colonne Ci8 100 Â (250x10 mm, Bio-Rad), en éluant avec un gradient de 15 à 40% d'acétonitrile

contenant 0,07% d'acide trifluoroacétique (en volumes) dans l'eau contenant 0,07% d'acide trifluoroacétique (en volumes) à un débit de 6 ml/minute en 30 minutes, puis lyophilisé. On obtient ainsi 15,2 mg du composé de formule (I) pour lequel Ri-( 2)m~ (R3)n"CR4)ρ représente Boc-Arg-Arg-Pro-, R, R5 et R5 représentent des radicaux hydroxy et R7 représente un atome d'hydrogène sous la forme d'une poudre blanche [Spectre de masse sur Sciex API III en ESMS (Electrospray Mass Spectrometry) : M/z = 1126 (MH)+, M/z = 563 (M+2H) ²⁺ ].

Le peptide Boc-Arg(benzyloxycarbonyle)2-Arg(benzyloxycarbonyle)2-Pro-OH peut être préparé de la manière suivante : le composé Boc-Arg(benzyloxycarbonyle)2-OH est mis à réagir avec le prolinate de méthyle en présence de 2-(lH-benzotriazole-l-yl)- 1,1,3,3-tétraméthyluronium hexafluorophosphate dans l'acétonitrile ou le diméthylfor¬ mamide en utilisant la diisopropyléthylamine comme base pour obtenir un pH supé¬ rieur à 8, le groupement Boc est ensuite clivé par l'acide trifluoroacétique à 40% dans le dichlorométhane. Le composé Boc-Arg(benzyloxycarbonyle)2-OH est mis à réagir avec ce produit, en présence de 2-(lH-benzotriazole-l-yl)-l,l,3,3-tétraméthyluronium hexafluorophosphate dans l'acétonitrile ou le diméthylformamide en utilisant la dϋso¬ propyléthylamine comme base pour obtenir un pH supérieur à 8. L'ester obtenu peut ensuite être saponifié par la lithine, à une température voisine de + 4°C.

Exemple J

Une des 3 parties du composé de formule (II) pour lequel Ri-(R2)m ^_ ^3)n ^_ ^4)p re¬ présente Bcκ,-Arg(ber-zyloxycarbonyle)2-Arg(benzyloxycarbonyle)2-Pro -, R, R5 et Rg représentent des radicaux hydroxy et R7 représente un atome d'hydrogène obtenue à l'exemple I est traitée pendant 90 minutes par 5 ml d'un mélange acide trifluoroacéti- que-eau distillée (95/5 en volumes). Le milieu est ensuite amené à sec à l'évaporateur rotatif (2,6 kPa; 45°C; 45 minutes) et 15 ml d'eau distillée sont ensuite ajoutés au mi¬ lieu. La suspension obtenue est congelée à -80°C puis lyophilisée (96 heures). Le pro¬ duit est solubilisé dans 1 ml de diméthylformamide contenant 0,0625 ml de diisopropy¬ léthylamine (0,36 mmol). On ajoute ensuite 50 μl (50 μmol) d'une solution de chlorure d'acide 1-adamantylacétique (obtenue par réaction de 38,8 mg (200 μmol) d'acide 1-adamantylacétique avec 17,2 μl (200 μmol) de chlorure d'oxalyle dans 200 μl de di¬ chlorométhane en présence d'une goutte de diméthylformamide, pendant 15 minutes à une température voisine de 20°C) à la solution de peptide et la réaction est conduite à une température voisine de 20°C, pendant 1 heure. Le solvant est ensuite éliminé grâce

25

à un évaporateur centrifuge Speed Vac (Savant) équipé d'une pompe à palettes pen¬ dant 18 heures à une température voisine de 20°C. Le résidu est solubilisé dans 2 ml d'un mélange dichlorométhane-méthanol (1/1 en volumes) puis additionné de 100 mg de palladium sur charbon à 10% et 100 mg de formiate d'ammonium. La réaction est conduite pendant 150 minutes avec agitation périodique au vortex. Le milieu réaction¬ nel est filtré sur un filtre Millex HV 0,45 μm (Millipore) et le filtre lavé par 5 ml de méthanol. Le solvant est ensuite évaporé sous pression réduite (2,6 kPa, 45°C, 30 minutes). Le produit est enfin purifié par chromatographié liquide à haute perfor¬ mance sur une colonne Cl8 100 À (250 x 10 mm, Bio-Rad), en éluant avec un gradient de 15 à 40% d'acétonitrile contenant 0,07% d'acide trifluoroacétique (en vo¬ lumes) dans l'eau contenant 0,07% d'acide trifluoroacétique (en volumes), à un débit de 6 ml/minute en 30 minutes, puis lyophilisé. On obtient ainsi 2,9 mg de ditrifluoroacétate du composé de formule (II) pour lequel l-( 2)m"^3)n"^4)p représente 1-adamantylacétyl-Arg-Arg-Pro-, R, R5 et Rg représentent des radicaux hydroxy et R7 représente un atome d'hydrogène, sous la forme d'une poudre blanche [Spectre de masse, sur Sciex API III en ESMS (Electrospray Mass Spectrometry) : M z = 601,6 (M+2H)2+].

Exemple K

Une des 3 parties du composé de formule (II) pour lequel pour lequel Ri-(R2)πr (R3)n ^_ ( ^R 4)ρ représente Boc-Arg(benzyloxycarbonyle)2-Arg(benzyloxycarbonyle)2- Pro-, R, R5 et Rg représentent des radicaux hydroxy et R7 représente un atome d'hydrogène obtenue à l'exemple I est traitée pendant 90 minutes par 5 ml d'un mélange acide trifluoroacétique-eau distillée (95/5 en volumes). Le millieu est ensuite amené à sec à l'évaporateur rotatif (2,6 kPa, 45°C, 45 minutes). On ajoute 15 ml d'eau distillée au résidu et la suspension est congelée à -80°C puis lyophilisée (96 heures). Le produit obtenu est solubilisé dans 1 ml de diméthylformamide contenant 62,5 μl de diisopropyléthylamine (0,36 mmol). On ajoute ensuite 9,9 mg (50 μmol) de chlorure d'acide 1-adamantylcarboxylique à la solution de peptide et la réaction est conduite à une température voisine de 20°C pendant 1 heure. Le solvant est ensuite éliminé grâce à un évaporateur centrifuge Speed Vac (Savant) équipé d'une pompe à palettes pendant 18 heures à une température voisine de 20°C. Le résidu est solubilisé dans 2 ml d'un mélange dichlorométhane-méthanol (1/1 en volumes) puis additionné de 100 mg de palladium sur charbon à 10% et 100 mg de formiate d'ammonium. La réaction est conduite pendant 150 minutes avec agitation périodique au vortex. Le

milieu réactionnel est ensuite filtré sur un filtre Millex HV 0,45 μm (Millipore) et le filtre lavé par 5 ml de méthanol. Le solvant est évaporé sous pression réduite. Le produit est enfin purifié par chromatographié liquide à haute performance sur une colonne Cl8 100 Â (250 x 10 mm, Bio-Rad) en éluant avec un gradient de 18 à 43% d'acétonitrile contenant 0,07% d'acide trifluoroacétique (en volumes) dans l'eau contenant 0,07% d'acide trifluoroacétique (en volumes), à un débit de 6 ml minute en 30 minutes puis lyophilisé. On obtient ainsi 3,1 mg de ditrifluoroacétate du composé de formule (π) pour lequel représente 1-adamantylcarbonyl- Arg-Arg-Pro-, R, R5 et Rβ représentent des radicaux hydroxy et R7 représente un atome d'hydrogène sous la forme d'une poudre blanche [Spectre de masse, sur Sciex API lu en ESMS (Electrospray Mass Spectrometry) : M/z = 594,5 (M+2H) ²⁺ ].

Exemple L

On traite 100 mg (85 μmol) de Fmoc-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-Pro-OH par 17,4 mg de dicyclohe-tylcartjcdumide (85 μmol) et 12,2 mg de N-hydroxybenzotriazole (90 μmol) dans 1,5 ml de diméthylformamide pendant 4 heures à une température voisine de 20°C. La dicyclohexylurée formée est ensuite filtrée sur un filtre Millex HV 0,45 μm (Millipore) et le filtre est lavé par 0,5 ml de diméthylformamide. On ajoute ensuite 0,45 ml du filtrat obtenu (correspondant à 19 μmol de Fmoc-Arg(Pmc)-.Arg0?mc)- Pro-OH) à 0,25 ml d'une solution contenant 16,7 mg (22,5 μmol) du composé de for- mule (Et) pour lequel R, R5 et Rβ représentent des radicaux hydroxy et R7 représente un atome d'iode et 4 μl (23 μmol) de diisopropyléthylamine dans le diméthylforma¬ mide. La réaction est conduite pendant 3 heures à une température voisine de 20°C. Le solvant est éliminé grâce à un évaporateur centrifuge Speed Vac (Savant) équipé d'une pompe à palettes pendant 18 heures à une température voisine de 20°C. Le ré- sidu est ensuite repris par 5 ml d'un mélange acide trifluoroacétique-phénol-éthanedi- thiol-thioanisole-eau (40/3/1/2/2 en volumes) et laissé à réagir pendant 90 minutes, à une température voisine de 20°C, sous agitation. Le mélange est ensuite concentré sur un évaporateur centrifuge RC10-10 (Jouan) équipé d'une pompe à palettes pendant 45 minutes (température de la chambre d'évaporation 50°C, piégeage des vapeurs à -90°C). Le concentrât obtenu (environ 1 ml) est additionné de 15 ml d'un mélange éther tert-butylméthylique-éther de pétrole (1/1 en volumes) pour précipiter le peptide. Le précipité est collecté par centrifugation et solubilisé par 1 ml d'acide trifluoroacéti¬ que. L'opération de précipitation est répétée 1 fois. Le peptide est séché sous pression réduite (3,5 kPa). Le produit est enfin purifié par chromatographié liquide à haute per-

formance sur une colonne Ci8 100 Â (250 x 10 mm, Bio-Rad), en éluant avec un gra¬ dient de 22 à 47% d'acétonitrile contenant 0,07% d'acide trifluoroacétique (en volu¬ mes) dans l'eau contenant 0,07% d'acide trifluoroacétique (en volumes) à un débit de 6 ml/minute en 30 minutes puis lyophilisé. On obtient ainsi 10 mg de ditrifluoroacétate du composé de formule (H) pour lequel Ri-(R2)m"( ^R 3) "^4)p représente Fmoc-Arg- Arg-Pro-, R, R5 et R représentent des radicaux hydroxy et R7 représente un atome d'iode sous la forme d'une poudre blanche [Spectre de masse, sur Sciex API UJ en ESMS (Electrospray Mass Spectrometry) : M/z = 1374, (M+H)+, M/z = 687 (M+2H) ²⁺ ].

Le composé Fmoc-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-Pro-OH peut être préparé de la manière sui¬ vante : on obtient une résine Fmoc-Pro-chlorotrityl en traitant 0,3 mmol de résine chlorotritylchlorure-copolymère polystyrène 1% divinylbenzène (Novabiochem) par 1 mmol de Fmoc-proline dans 3,5 ml d'un mélange dichlorométhane-dϋsopropyléthy- lamine (6/1 en volumes) pendant 30 minutes à une température voisine de 20°C. On ajoute ensuite 2 ml de méthanol et on laisse la réaction se poursuivre pendant 30 minu¬ tes à une température voisine de 20°C. La résine est ensuite lavée successivement par 3 fois 5 ml de méthanol et 3 fois 5 ml de dichlorométhane et séchée.

Le peptide Fmoc-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-Pro-OH est assemblé sur un appareil Applied Biosystems 431A en utilisant les cycles "standard Fmoc", fournis par le constructeur, en utilisant la N-méthylpyrrolidine-2-one comme solvant. La déprotection des fonctio¬ ns alpha-amines est réalisée par de la pipéridine à 20% dans la N-méthylpyrrolidine-2- one pendant 20 minutes à chaque étape de la synthèse. La résine Fmoc-Pro-chlorotrityl est déposée dans le réacteur de l'appareil. Après déprotection de la fonction alpha- amine de la proline, l'ester N-hydroxybenzotriazolyle de la Fmoc-Arg(Pmc) est formé par réaction de 1 mmol de Fmoc--Arg0?mc)-OH dans 2,1 ml de N-méthylpyrrolidine-2- one, 1 ml de N-hydroxybenzotriazole 1M dans la N-méthylpyrrolidine-2-one et 1 ml de dcyclohexylcarbcdiimide 1M dans la N-méthylpyrrolidine-2-one pendant 20 minu¬ tes. Après élimination de la dicyclohexylurée formée, l'ester est mis en réaction pen¬ dant 30 minutes avec la résine. La fonction alpha-amino de l'arginine est ensuite dépro- tégée et l'ester N-hydroxybenzotriazolyle de la Fmoc-ArgG?mc)-OH est couplé à la résine comme décrit précédemment. Le peptide Fmoc-Arg(Pmc)-Arg0?mc)-Pro-OH est détaché de la résine en traitant celle-ci pendant 15 minutes par 10 ml d'un mélange acide acétique-trifluoroéthanol-dichlorométhane (1/2/7 en volumes) à une température voisine de 20°C. La résine est ensuite lavée successivement par 10 ml de dichloromé-

thane et 10 ml d'acétonitrile. Les phases organiques sont jointes et les solvants sont éliminés à l'évaporateur rotatif (2,6 kPA, 1 heure, 45°C). Le résidu est repris par 1 ml d'acétonitrile et additionné de 30 ml d'eau distillée. La suspension obtenue est congelée à -80°C et lyophilisée. On obtient ainsi 102 mg de Fmoc-- rg(Pmc)-Arg(Pmc)-Pro-OH

Exemple M

3,06 g du composé de formule (I) pour lequel R, R' et R" représentent des radicaux hydroxy et R"' représente un atome d'hydrogène sont dissous dans 80 ml d'une solu¬ tion aqueuse de carbonate de sodium à 5%, auxquels on ajoute 1,8 g de carbonate de 9-fluorénylméthyle et de N-succinyle puis 40 ml de dioxanne. La réaction se poursuit pendant 5 heures à une température voisine de 20°C. Le mélange réactionnel est ex¬ trait par 2 fois 100 ml d'acétate d'éthyle; les phases organiques sont éliminées puis la phase aqueuse est acidifiée à pH entre 1 et 2 par une solution d'acide chlorhydrique concentré. On extrait par 3 fois 100 ml d'acétate d'éthyle et les phases organiques sont combinées, séchées par du sulfate de sodium, filtrées sur gel de silice puis évaporées sous pression réduite (2 kPa). Le précipité est délité par 300 ml d'un mélange méthyl- tert-butyléther-chlorure de méthylène (1/1 en volumes) puis séché sous pression ré¬ duite pour donner 3,3 g du composé de formule (II) pour lequel Rl-(R2)m"^3^n" (R4)p représente Fmoc, R, R5 et Rβ représentent des radicaux hydroxy et R7 repré¬ sente un atome d'hydrogène sous la forme d'une poudre blanche [Spectre de masse sur Sciex API m en ESMS (Electrospray Mass Spectrometry) : M/z = 861, (M+Na) ⁺ . M/z = 839 (M+H)+; Spectre infrarouge (FMIR dans le méthanol) : 3395, 3335, 2970, 2940, 2880, 3125 à 2125, 1700, 1665, 1590, 1500, 1450, 1225; Spectre de RMN (400MHz; DMSO; TEMP.≈ 297K, δ en ppm) : R-Fmoc-1 : HA1.HA24,23; HB 4,48; HG1, HG2 7,70; HDl, HD2 7,37; HEl, HE2: 7,45; HZ1, HZ2 7,92; X-TYR1 : NH 5,73; HA 4,52; HBl, HB2 2,93, 3,03; HDl 6,70; HD2 6,72 HEl 6,70; X-ILE 2 : NH 8,36; HA 4,12; HB 1,62; MG1 0,83; HG21, HG22 1,18, 1,49; MD 0,83; X-TYR3 : NH 8,67; HA 3,58; HBl, HB2 2,45; 2,79; HDl 6,57; HD2 5,51; X-TYR4 : NH 4,17; HA 4,28; HBl, HB23,18, 3,43; HDl 7,19; HD27,31; HEl 7,52; HE26,80].

Exemple N

On traite 100 mg de Fmoc-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-Pro-OH (85 μmol) par 17,4 mg de dicyclohexylcarbc iimide (85 μmol) et 12,2 mg de N-hydroxybenzotriazole (90 μmol) dans 1,5 ml de diméthylformamide pendant 4 heures à une température voisine de 20°C. La dicyclohexylurée formée est ensuite filtrée sur un filtre Millex HV 0,45 μm

(Millipore) et le filtre est lavé par 0,5 ml de diméthylformamide. On ajoute ensuite 0,972 ml du filtrat obtenu (correspondant à 41 μmol de Fmoc-Arg(Pmc)-ArgO?mc)- Pro-OH) à 0,5 ml d'une solution contenant 32 mg (48,6 μmol) du compo.se de formule (I) pour lequel R, R' et R" représentent des radicaux méthoxy et R"' représente un atome d'hydrogène et 7 μl (40 μmol) de diisopropyléthylamine. La réaction est con¬ duite pendant 3 heures à une température voisine de 20°C. Le solvant est ensuite éli¬ miné grâce à un évaporateur centrifuge Speed Vac (Savant) équipé d'une pompe à pa¬ lettes pendant 18 heures à une température voisine de 20°C. Le résidu est ensuite re¬ pris par 10 ml d'un mélange acide trifluoroacétique-phénol-éthanedithiol-thioanisole- eau (40/3/1/2/2 en volumes) et laissé à réagir pendant 90 minutes à une température voisine de 20°C sous agitation.. Le mélange est ensuite concentré sur un évaporateur centrifuge RC10-10 (Jouan) équipé d'une pompe à palettes pendant 45 minutes (température de la chambre d'évaporation 50°C, piégeage des vapeurs à -90°C). Le concentrât obtenu (environ 2 ml ) est additionné de 30 ml d'un mélange éther tert- butylméthylique-éther de pétrole (1/1 en volumes) pour précipiter le peptide. Ce pep¬ tide est collecté par centrifugation. Il est solubilisé par 2 ml d'acide trifluoroacétique et l'opération de précipitation est répétée 1 fois. Le peptide est séché sous pression ré¬ duite (3,5 kPa). Le produit est enfin purifié par chromatographié liquide à haute per¬ formance sur une colonne Ci8 100 Λ (250 x 10 mm, Bio-Rad), élue par un gradient de 22 à 47% d'acétonitrile contenant 0,07% d'acide trifluoroacétique (en volumes) dans l'eau contenant 0,07% d'acide trifluoroacétique (en volumes), à un débit de 6 ml/minute, en 30 minutes, puis lyophilisé. On obtient ainsi 23,6 mg de ditrifluoroacé- tate du composé de formule (II) pour lequel représente Fmoc- Arg-Arg-Pro-, R, R5 et Rβ représentent des radicaux méthoxy et R7 représente un atome d'hydrogène sous la forme d'une poudre blanche [Spectre de masse, sur Sciex API m en ESMS (Electrospray Mass Spectrometry) : M/z = 1290 (M+H) ⁺ , M/z = 646 (M+2H) ²⁺ L