CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención está relacionada con inmunoterapias, y más particularmente está relacionada con una composición de péptidos con efectos inmunomoduladores.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La inmunoterapia implica la estimulación, mejora, supresión o desensibilización de la respuesta inmunológica para tratar padecimientos con un componente inflamatorio. Entre los inmunoterapéuticos, destacan los dializados de extractos leucocitarios humanos (hDLE) que están compuestos por una mezcla de péptidos de bajo peso molecular con propiedades inmunomoduladoras. Desde su primera descripción, realizada en 1949 por Henry Sherwood Lawrence, se han usado dializados de extractos leucocitarios como auxiliares terapéuticos para tratar enfermedades relacionadas con la desregulación del sistema inmunológico. Sin embargo, los efectos biológicos de estos extractos celulares han sido controversia les debido a la ausencia de información sobre la identidad y variabilidad del contenido que presentan entre ellos, debido principalmente a la carencia de información fidedigna sobre su fuente de origen y del método de fabricación de los mismos, lo que imposibilita dilucidar su mecanismo de acción

Se ha descrito un extracto dializable de leucocitos que comprende una mezcla compleja de péptidos de bajo peso molecular (<10 kDa) obtenido por diálisis/filtración de Usados leucocitarios humanos, y su ingrediente activo es una mezcla compleja de péptidos reproducible entre lotes conforme al método descrito en el documento de patente W02013089550. Este producto derivado de la sangre humana, es el principio activo de formas farmacéutias orales o inyectables y se utiliza en el tratamiento de enfermedades con un componente inflamatorio (Medina-Rivero, E., et al., Batch -to-batch reproducibility of Transieron. J Pharm Biomed Anal, 2014. 88: p. 289-94; y Estrada-Parra, S., et al., Comparative study of transfer factor and acyclovir in the treatment of herpes zoster. Int. J. Immunopharmacol, 1998. 20(10): p. 521-535.).

La información preclínica y clínica que se ha generado, indica que el extracto dializable de leucocitos referido modula la producción de citocinas proinfla matorias (Salinas-Jazmín, N., et al., Herpes murine model as a biological assay to test dialyzable leukocyte extracts activity. J Immunol Res, 2015. 146305: p. 1 - 9; y Santacruz-Valdez, C., et al., Dialyzable leukocyte extracts (transfer factor) as adjuvant therapy for fungal keratitis. Am J case rep, 2010. 11: p. 97 - 101.). Además, mejora la resolución de enfermedades infecciosas al aumentar el número de células productoras de IFN-gama en la queratitis micótica ocular (Santacruz-Valdez, C., et al., Diaiyzabie leukocyte extracts (transfer factor) as adjuvant therapy for funga! keratitis. Am J case rep, 2010. 11: p. 97 - 101.) y mejora la supervivencia de los pacientes pediátricos con sepsis al disminuir la concentacion sérica de la proteína C reactiva (CRP), aumenta el número total de linfocitos y disminuye el numero total de neutrófilos (Castrejón-Vázquez, MI., et al., Diaiyzabie Leukocyte Extract (Transieron ™) Administration in Sepsis: Experience from a Single Referral Pediatric Intensive Care Unit. Biomed Res Int, 2019. 8980506: 2 - 10.). Adicionalmente, este extracto dializable de leucocitos aumenta los niveles de IFN-gama en suero y favorece el curso clínico en pacientes con infección por herpes zoster cuando se administra por vía subcutánea (Estrada-Parra, S., et al., Comparative study of transfer factor and acyclovir in the treatment of herpes zoster. Int. J. Immunopharmacol, 1998. 20(10): p. 521-535). Se han desarrollado varios modelos para dilucidar los mecanismo por las que este extracto dializable de leucocitos por vía oral provoca su efecto terapéutico. En cuanto a los modelos in vitro, este extracto dializable de leucocitos adicionado al medio de cultivo aumenta la expresión de los niveles de CD80/CD86 e IL-6 en células THP-1 estimuladas con LPS (Jiménez-Uribe, A., et al. CD80 Expression Correlates with IL-6 Production in THP-l-Like Macrophages Costimulated with LPS and Dialyzable Leukocyte Extract (Transferon®). J Immunol Res, 2019. 2198508: p. 1 - 9), mientras que induce la diferenciación de células NK CD56+CD16+CDllc+ productoras de IFN- gama de células progenitoras CD34+ obtenidas del cordón umbilical humano (Ramirez-Ramirez, D., et al. Early Differentiation of Human CDllc(+)NK Cells with yd T Cell Activation Properties Is Promoted by Diaiyzabie Leukocyte Extracts. J Immunol Res, 2016. 4097642: p l - 12). En este mismo sentido en modelos tumorales, este extracto dializable de leucocitos administrado por vía oral (1 - 25 pg/kg) reduce el crecimiento tumoral y la metástasis en un modelo murino de cáncer de próstata (Hernández-Esquivel, M., et al. The diaiyzabie leukocyte extract Transferon™ inhibits tumor growth and brain metastasis in a murine mode! of prostate cáncer. Biomed Pharmacother, 2018. 101 p: 938 - 944), mientras que en el modelo murino de infección por Virus Herpes Simplex tipo 1 (HSV-1) disminuye los niveles sanguíneos de TNF-alfa e IL-6, y aumenta los niveles de IFN-gama y el porcentaje de supervivencia cuando se administra por vía orofaríngea (Salinas-Jazmín, N., et al., Herpes murine mode! as a biological assay to test diaiyzabie leukocyte extracts activity. J Immunol Res, 2015. 146305: p. 1 - 9). Sin embargo, la información disponible de estos modelos no es suficiente para explicar cómo una mezcla de peptídos puede modular al sistema inmunológico cuando se administra por vía oral o parenteral. En por ello, que es fundamental identificar los componentes peptídicos más abundantes del extracto dializable de leucocitos referido, para comprender las bases de las propiedades inmunomoduladoras de este hemoderivado.

Hasta este momento sólo se conoce un informe sobre la identificación de secuencias de péptidos en extractos dializables derivados de células de mamíferos (ratones y bovinos), el cual data del año 2000 (Kirkpatrick, C.H., Transfer factors: identification of conserved sequences in transfer factor molecules. Mol Med, 2000. 6(4): p. 332-41). En este trabajo, se obtuvo la secuencia de péptidos no humanos conservados mediante la secuenciación por degradación de Edman. Sin embargo, esas secuencias de péptidos no se han encontrado en ninguna base pública de información, a pesar de que actualmente se conoce el proteoma humano, murino y bovino, mamíferos de los cuales se obtuvieron los péptidos analizados en dicha referencia. Aunque la degradación de Edman sigue siendo una técnica de secuenciación muy utilizada, su eficacia se limita a muestras con péptidos de alta pureza. Por lo tanto, esta técnica no es adecuada para el análisis de mezclas complejas como el extracto dializable de leucocitos descrito porque estos productos están compuestos por una miríada de péptidos con una baja concentración. Para la identificación y cuantificación de un gran número de péptidos en muestras complejas se utilizan diferentes métodos basados en espectroscopia de masas (estudios peptidómicos). Por otro lado, el documento de patente US 2007/0207162 describe composiciones de Ubiquitina o fragmentos de dicha proteína para suprimir el sistema inmunológico o tratar sepsis en un mamífero. No obstante, dicho documento se limita a describir el uso de Ubiquitina o un fragmento de dicha proteína para suprimir el sistema inmunológico cuando este está exacerbado, más no para su estimulación cuando éste está deprimido. Además, el documento de patente US 2007/0207162 no describe composiciones de Ubiquitina en combinación con fragmentos de dicha proteína, y menos aún con fragmentos de otras proteínas humanas para la regulación integral (estimuladora y supresora) del sistema inmunológico.

Por consecuencia de lo anterior, se ha buscado suprimir los inconvenientes que presentan los hDLE utilizados en la actualidad para inmunoterapia, desarrollando una composición de péptidos con efectos inmunomoduladores que no presente variabilidad en el contenido de péptidos de acuerdo con su origen celular y método de fabricación.

OBJETOS DE LA INVENCIÓN

Teniendo en cuenta los defectos de la técnica anterior, es un objeto de la presente invención proporcionar una composición de péptidos con efectos inmunomoduladores que no presente variabilidad en el contenido de péptidos de acuerdo con su origen celular y método de fabricación y que sea útil para la regulación integral del sistema inmunológico.

Estos y otros objetos se logran mediante una composición de péptidos con efectos inmunomoduladores de conformidad con la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN.

Para ello, se ha inventado una composición de péptidos con efectos inmunomoduladores que comprende el monómero completo de Ubiquitina humana (Ub), y una variante del monómeno de Ubiquitina humana que carece de dos glicinas terminales (Ub(-GG)).

En una modalidad preferida de la presente invención, la composición de péptidos con efectos inmunomoduladores comprende adicionalmente por lo menos un fragmento peptídico de las siguientes proteínas humanas: Anquirina-1, Proteína 4.1, Subunidad Alfa de Hemoglobina, Subunidad Beta de Hemoglobina, Subunidad Delta de Hemoglobina, Proteína C3 del complemento, Calpastatina, Alfa-Sinucleína, Cadena Alfa del Fibrinógeno, Actina Citoplasmática 1, Timosina Beta-4, Timosina Beta-10, o Zixina.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Los aspectos novedosos que se consideran característicos de la presente invención se establecerán con particularidad en las reivindicaciones anexas. Sin embargo, algunas modalidades, características y algunos objetos y ventajas de ésta, se comprenderán mejor en la descripción detallada, cuando se lea en relación con los dibujos anexos, en los cuales:

La Figura 1 muestra el porcentaje de la contribución de los fragmentos de las proteínas al espectro de masa total de un extracto dializable de leucocitos. La Figura 2 muestra el análisis del porcentaje y de la cobertura de las proteínas que aportan péptidos a un extracto dializable de leucocitos.

La Figura 3 muestra el análisis de la abundancia de péptidos en un extracto dializable de leucocitos, la cual es reproducidles en 10 lotes.

La Figura 4 muestra la identificación del monómero completo de Ubiquitina humana (Ub) en un extracto dializable de leucocitos empleando como referencia un estándar de comercial de Ub monomérica.

La Figura 5 muestra la verificación de la presencia del monómero completo de Ubiquitina humana (Ub) y una variante del monómeno de Ubiquitina humana que carece de dos glicinas terminales (Ub(-GG)) en un extracto dializable de leucocitos empleando como referencia un estándar de Ub.

La Figura 6 muestra un análisis por MS de muestras reducidas de un extracto dializable de leucocitos donde las señales de TIC y m/z son atribuidles a Ub y Ub(-GG) y no a agregados moleculares.

La Figura 7 muestra que la presencia de Ub y Ub(-GG) es consistente en los lotes del extracto dializable de leucocitos.

La Figura 8 muestra la identificación de Ub y Ub(-GG) utilizando anticuerpos policlonales.

La Figura 9 muestra la comparación estructural de Ub y Ub(-GG) y la cuantificación de Ub total en un extracto dializable de leucocitos.

La Figura 10 muestra el efecto protector de un extracto dializable de leucocitos y Ub en el modelo murino de infección por HSV-1.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Se ha encontrado que una composición de péptidos es útil para ser usada en inmunoterapia para la estimulación, mejora, supresión o desensibilización de la respuesta inmunológica para tratar padecimientos con un componente inflamatorio.

Así pues, en un aspecto de la invención, se describe una composición de péptidos con efectos inmunomoduladores que comprende el monómero completo de Ubiquitina humana (Ub) y una variante del monómeno de Ubiquitina humana que carece de dos glicinas terminales (Ub(-GG)).

El monómero completo de Ub preferiblemente tiene una masa molecular de alrededor de 8.56 kDa. Asimismo, la variante del monómeno de Ub(-GG) preferiblemente tiene una masa molecular de alrededor de 8.45 kDa. El monómero de Ub es una proteína globular sérica natural de pequeño tamaño (76 aminoácidos) que carece de modificaciones postrad ucciona les y posee una alta estabilidad térmica, estructural y proteolítica.

El monómero completo de Ub preferiblemente se selecciona de UBC_HUMAN (Número de acceso P0CG48 de UniProtKB) o de UBB_HUMAN (Número de acceso P0CG47 de UniProtKB). Más preferiblemente el monómero completo de Ub se selecciona de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1.

Asimismo, la variante del monómeno de Ub(-GG) preferiblemente se selecciona del fragmento J3QRK5_HUMAN (Número de acceso UPI000268AF41 de UniProtKB) o de las variantes ribosomales RS27A_HUMAN (Número de acceso P62979 de UniProtKB) y RL40_HUMAN (Número de acceso P62987 de UniProtKB). Más preferiblemente la variante del monómeno de Ub(-GG) se selecciona de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2.

De forma preferida, la composición de péptidos con efectos inmunomoduladores comprende de 0.168 a 0.268% (m/m) del monómero completo de Ub y de la variante del monómeno de Ub(-GG). El resto de la composición de péptidos está formada por fragmentos péptídicos minoritarios. Más preferiblemente, el contenido promedio de la variante del monómeno de Ub(-GG) en la composición de péptidos con efectos inmunomoduladores está en una relación 2:1 respecto del contenido promedio del monómero completo de Ub.

En una modalidad preferida de la presente invención, la composición de péptidos con efectos inmunomoduladores comprende adicionalmente por lo menos un fragmento peptídico de las siguientes proteínas humanas: Anquirina-1, Proteína 4.1, Subunidad Alfa de Hemoglobina, Subunidad Beta de Hemoglobina, Subunidad Delta de Hemoglobina, Proteína C3 del complemento, Calpastatina, Alfa-Sinucleína, Cadena Alfa del Fibrinógeno, Actina Citoplasmática 1, Timosina Beta-4, Timosina Beta-10, o Zixina.

Para fines de la presente invención, los términos "fragmento péptidico" o "fragmento" significa un segmento continuo de una proteína, el cual tiene una masa molecular menor a 10 kDa.

De forma preferida, la composición de péptidos con efectos inmunomoduladores comprende de 0.644 a 0.924% (m/m) de por lo menos un fragmento de Anquirina-1. Asimismo, de forma preferida, la composición de péptidos con efectos inmunomoduladores comprende de 0.397 a 0.637% (m/m) de por lo menos un fragmento de Proteína 4.1. Asimismo, de forma preferida, la composición de péptidos con efectos inmunomoduladores comprende de 0.351 a 0.571% (m/m) de por lo menos un fragmento de Subunidad Alfa de Hemoglobina. Asimismo, de forma preferida, la composición de péptidos con efectos inmunomoduladores comprende de 0.367 a 0.547% (m/m) de por lo menos un fragmento de Subunidad Beta de Hemoglobina y/o de la Subunidad Delta de Hemoglobina. Asimismo, de forma preferida, la composición de péptidos con efectos inmunomoduladores comprende de 0.303 a 0.583% (m/m) de por lo menos un fragmento de la proteína C3 del Complemento. Asimismo, de forma preferida, la composición de péptidos con efectos inmunomoduladores comprende de 0.319 a 0.519% (m/m) de por lo menos un fragmento de Calpastatina. Asimismo, de forma preferida, la composición de péptidos con efectos inmunomoduladores comprende de 0.198 a 0.298% (m/m) de por lo menos un fragmento de Alfa-Sinucleína. Asimismo, de forma preferida, la composición de péptidos con efectos inmunomoduladores comprende de 0.151 a 0.311% (m/m) de por lo menos un fragmento de Cadena Alfa de Fibrinógeno. Asimismo, de forma preferida, la composición de péptidos con efectos inmunomoduladores comprende de 0.163 a 0.283% (m/m) de por lo menos un fragmento de Actina Citoplasmática 1. Asimismo, de forma preferida, la composición de péptidos con efectos inmunomoduladores comprende de 0.12 a 0.2% (m/m) de por lo menos un fragmento de Timosina Beta- 4 y/o Timosina Beta-10. Asimismo, de forma preferida, la composición de péptidos con efectos inmunomoduladores comprende de 0.108 a 0.208% (m/m) de por lo menos un fragmento de Zixina. En una modalidad preferida de la presente invención, cada fragmento peptídico se selecciona de la proteína humana Anquirina-1, la cual a su vez preferiblemente se selecciona de ANK1_HUMAN (Número de acceso P16157 de UniProtKB) o de Q6PK32_HUMAN (Número de acceso Q6PK32 de UniProtKB). Más preferiblemente, cada fragmento peptídico corresponde a un fragmento de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4.

En otra modalidad preferida de la presente invención, cada fragmento peptídico se selecciona de la proteína humana Proteína 4.1 preferiblemente se selecciona de 41_HUMAN (Número de acceso P11171 de UniProtKB). Más preferiblemente, cada fragmento peptídico corresponde a un fragmento de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5.

En otra modalidad preferida de la presente invención, cada fragmento peptídico se selecciona de la proteína humana Subunidad Alfa de Hemoglobina preferiblemente se selecciona de HBA_HUMAN (Número de acceso P69905 de UniProtKB) o de G3V1N2_HUMAN (Número de acceso G3V1N2 de Uniprot). Más preferiblemente, cada fragmento peptídico corresponde a un fragmento de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:7.

En otra modalidad preferida de la presente invención, cada fragmento peptídico se selecciona de la proteína humana Subunidad Beta de Hemoglobina preferiblemente se selecciona de HBB_HUMAN (Número de acceso P68871 de UniProtKB). Más preferiblemente, cada fragmento peptídico corresponde a un fragmento de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:8.

En otra modalidad preferida de la presente invención, cada fragmento peptídico se selecciona de la proteína humana Subunidad Delta de Hemoglobina preferiblemente se selecciona de E9PEW8_HUMAN (Número de acceso E9PEW8 de UniProtKB). Más preferiblemente, cada fragmento peptídico corresponde a un fragmento de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:9.

En otra modalidad preferida de la presente invención, cada fragmento peptídico se selecciona de la proteína humana C3 del Complemento preferiblemente se selecciona de CO3_HUMAN (Número de acceso P01024 de UniProtKB). Más preferiblemente, cada fragmento peptídico corresponde a un fragmento de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 10.

En otra modalidad preferida de la presente invención, cada fragmento peptídico se selecciona de la proteína humana Calpastatina preferiblemente se selecciona de ICAL_HUMAN (Número de acceso P20810 de UniProtKB) o de A0A0A0MR45_HUMAN (Número de acceso A0A0A0MR45 de UniProtKB), o de D6RC54_HUMAN (Número de acceso D6RC54 de UniProtKB). Más preferiblemente, cada fragmento peptídico corresponde a un fragmento de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:12 o SEQ ID NO:13.

En otra modalidad preferida de la presente invención, cada fragmento peptídico se selecciona de la proteína humana Alfa-Sinucleína preferiblemente se selecciona de SYUA_HUMAN (Número de acceso P37840 de UniProtKB) o de H6UYS7_HUMAN (Número de acceso H6UYS7 de UniProtKB). Más preferiblemente, cada fragmento peptídico corresponde a un fragmento de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:15.

En otra modalidad preferida de la presente invención, cada fragmento peptídico se selecciona de la proteína humana Cadena Alfa de Fibrinógeno preferiblemente se selecciona de FIBA_HUMAN (Número de acceso P02671 de UniProtKB). Más preferiblemente, cada fragmento peptídico corresponde a un fragmento de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 16.

En otra modalidad preferida de la presente invención, cada fragmento peptídico se selecciona de la proteína humana Actina Citoplasmática 1 preferiblemente se selecciona de ACTB_HUMAN (Número de acceso P60709 de UniProtKB), de I3L3R2_HUMAN (Número de acceso I3L3R2 de UniProtKB), o de POTEE_HUMAN (Número de acceso Q6S8J3 de UniProtKB). Más preferiblemente, cada fragmento peptídico corresponde a un fragmento de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:18 o SEQ ID NO: 19.

En otra modalidad preferida de la presente invención, cada fragmento peptídico se selecciona de la proteína humana Timosina Beta-4 preferiblemente se selecciona de TYB4_HUMAN (Número de acceso P62328 de UniProtKB). Más preferiblemente, cada fragmento peptídico corresponde a un fragmento de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:20.

En otra modalidad preferida de la presente invención, cada fragmento peptídico se selecciona de la proteína humana Timosina Beta-10 preferiblemente se selecciona de TYB10_HUMAN (Número de acceso P63313 de UniProtKB). Más preferiblemente, cada fragmento peptídico corresponde a un fragmento de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:21.

En otra modalidad preferida de la presente invención, cada fragmento peptídico se selecciona de la proteína humana Zixina preferiblemente se selecciona de ZYX_HUMAN (Número de acceso Q15942 de UniProtKB). Más preferiblemente, cada fragmento peptídico corresponde a un fragmento de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:22.

La composición de péptidos con efectos inmunomoduladores puede administrarse en combinación con otros agentes farmacéuticos y/o inmunogénicos y/o inmunoestimuladores y/o inmunoterapéuticos, y puede combinarse con un vehículo fisiológicamente o farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, la composición de péptidos con efectos inmunomoduladores se puede administrar junto citocinas, adyuvantes o anticuerpos.

Las cantidades inmunológicamente eficaces y el método de administración de la composición de péptidos con efectos inmunomoduladores pueden variar según el individuo, qué afección se va a tratar y otros factores evidentes para un experto en la técnica. Los factores por considerar incluyen sin limitarse a: la vía de administración, el número de dosis, si la composición de péptidos con efectos inmunomoduladores se administrará junto con otros agentes farmacéuticos y/o inmunogénicos y/o inmunoestimuladores o un vehículo fisiológicamente o farmacéuticamente aceptable del mismo. Dichos factores son conocidos en la técnica y está dentro de los conocimientos de los expertos en la técnica hacer tales determinaciones. Un intervalo de dosificación adecuado es aquel que proporciona la modulación deseada de la respuesta inmunológica. Los rangos de dosificación útiles de la composición de péptidos con efectos inmunomoduladores, pueden ser, por ejemplo, de aproximadamente cualquiera de los siguientes: 0.1 a 100 pg/kg, 0.1 a 50 pg/kg, 0.1 a 25 pg/kg , 0.1 a 10 pg/kg, 1 a 500 pg/kg, 100 a 400 pg/kg, 200 a 300 pg/kg, 1 a 100 pg/kg, 100 a 200 pg/kg, 300 a 400 pg/kg, 400 a 500 pg/kg. Alternativamente, las dosis pueden ser aproximadamente cualquiera de las siguientes: 0.1 pg, 0.25 pg, 0.5 pg, 1.0 pg, 2.0 pg, 5.0 pg, 10 pg, 25 pg, 50 pg, 75 pg, 100 pg. Por consiguiente, los rangos de dosis pueden ser aquellos con un límite inferior de cualquiera de los siguientes: 0.1 pg, 0.25 pg, 0.5 pg y 1.0 pg; y con un límite superior de aproximadamente cualquiera de los siguientes: 25 pg, 50 pg y 100 pg. La cantidad absoluta administrada a cada paciente depende de propiedades farmacológicas como la biodisponibilidad, la tasa de aclaramiento y la vía de administración.

La cantidad eficaz y el método de administración de la composición de péptidos con efectos inmunomoduladores pueden variar según el paciente individual y la etapa de la enfermedad y otros factores evidentes para un experto en la técnica. La(s) ruta(s) de administración útiles en una aplicación particular son evidentes para un experto en la técnica. Las vías de administración incluyen, pero no se limitan a, tópica, dérmica, transdérmica, transmucosa, epidérmica, parenteral, gastrointestinal, oral, orofaringea, nasofaríngea y pulmonar, incluyendo transbronquial y transalveolar. Un intervalo de dosificación adecuado es aquel que proporciona suficiente composición de péptidos con efectos inmunomoduladores para lograr un efecto preventivo o terapéutico. La cantidad absoluta administrada a cada paciente depende de propiedades farmacológicas como la biodisponibilidad, la tasa de aclaramiento y la vía de administración.

La presente invención será mejor entendida a partir de los siguientes ejemplos, los cuales se presentan únicamente con fines ilustrativos para permitir la comprensión cabal de las modalidades preferidas de la presente invención, sin que por ello se implique que no existen otras modalidades no ¡lustradas que puedan llevarse a la práctica con base en la descripción detallada arriba realizada.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Obtención de un extracto dializable de leucocitos y secuenciación de novo por espectrometría de masas.

Se realizó un ensayo para identificar los componentes peptídicos de un extracto dializable de leucocitos a través de técnicas de espectrometría de masas.

Todos los lotes del extracto dializable de leucocitos fueron fabricados por Pharma-FT Laboratory (Ciudad de México, México) utilizando un método estandarizado descrito previamente (Medina-Rivero, E., et al., Physicochemical Characteristics of Transieron Batches. Biomed Res Int, 2016. 2016: p. 7935181.). En resumen, se recibieron "concentrados leuco-plaquetarios y eritrocitos" provenientes de bancos de sangre humana certificados y el contenido celular se rompió aplicando ciclos de congelación-descongelación. El lisado celular se dializó a través de una membrana de 12 kDa y el permeado se filtró mediante un cartucho de 10 kDa. La solución obtenida se diluyó a 0.4 mg/mL usando agua para inyección. Los lotes transferidos se sometieron a un análisis de control de calidad, que incluyó esterilidad, identidad, pH, contenido de endotoxinas, densidad relativa, contenido de proteína total, identidad y potencia. Todos los lotes del extracto dializable de leucocitos se mantuvieron a -18 °C hasta su uso.

El extracto dializable de leucocitos fue secuenciado de novo para identificar las proteínas que proporcionan su contenido de péptidos. Diez lotes del extracto dializable de leucocitos (14G18, 14G19, 15A03, 15A04, 15C10, 15D11, 15D12, 15E14, 15F17 y 15G18) fueron secuenciados utilizando métodos estandarizados. En este sentido, las muestras del extracto dializable de leucocitos se liofilizaron y se purificaron 2 mg del extracto dializable de leucocitos usando el ProteoExtract® Protein Precipitation Kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras se reconstituyeron en aproximadamente 100 pL de urea 6.0 M, se redujeron con 1-4 ditiotreitol a 5 mM y 37 °C durante 30 min, y se alquilaron con yodoacetamida 15 mM a temperatura ambiente durante 10 min. La yodoacetamida se inactivo añadiendo un exceso del agente reductor. Se añadió tripsina/Lys-C en una proporción de 1:25 (enzima: péptido) y se incubó a 37 °C durante 4 h. Luego, se agregaron 550 pL de una solución tampón de bicarbonato de amonio 50 mM y la digestión continuó durante la noche. Las muestras se desalaron usando Macro Spin Columns® de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras se recuperaron en una solución de agua: acetonitrilo + ácido fórmico (20%: 80% + 0.5%).

Las muestras se analizaron mediante espectrometría de masas en tándem (MS/MS) acoplada a la cromatografía de líquidos (LC-MS/MS) en un espectrómetro de masas Thermo Scientific Q Exactive + Orbitrap acoplado con una fuente de Proxeonnanospray Proxeon Easy-nLC II HPLC (Thermo Scientific®). Los péptidos se separaron usando una columna de fase inversa Magic C18 200Á 3U de 75 pm x 150 mm y un gradiente de 120 min con un flujo de 300 nL/min. Los datos se obtuvieron de 350- 1600 m/z donde los iones superiores se sometieron a disociación de colisión de alta energía (HCD), y se usó una energía de colisión normalizada del 27% para la fragmentación. Los espectros de masas en tándem se extrajeron mediante la desconvolución del estado de carga de Proteome Discoverer® versión 1.2 y no se realizaron desisótopos. Todas las muestras de MS/MS se analizaron usando X! Tandem (The GMP group; https://www.thegpm.org/), que se creó para buscar en la base de datos de refseq humanos de NCBI y contaminantes comunes no humanos y un número igual de secuencias inversas asumiendo la digestión de tripsina. La búsqueda permitió una tolerancia de masa de iones de fragmentos y de iones parentales de 20 ppm y 10 ppm, respectivamente. Se utilizó Scaffold v4.7.5 (Proteome Software Inc.) para la validación de datos. Se aceptó la identificación de péptidos si alcanzaron un umbral del 97% utilizando el algoritmo LFDR de Sacaffold, y se aceptó la identificación de proteínas si contenían al menos dos péptidos en este umbral. Las proteínas que comparten una evidencia significativa de péptidos se agruparon en grupos. También se empleó scaffold para identificar los péptidos más abundantes del extracto dializable de leucocitos, que se basó en la intensidad de la señal y la probabilidad de identificación (>95%).

En este análisis, se encontró que cada muestra del extracto dializable de leucocitos está compuesta por alrededor de 20,000 péptidos derivados de 593 proteínas humanas. En este sentido, los clusters de proteínas se ordenaron de mayor a menor intensidad espectrométrica, y se seleccionaron aquellas que i) aparecieron consistentemente entre los diez lotes analizados (reproducibilidad), ¡i) se identificaron con una probabilidad superior al 95%, y iii) cuya espectrometría la intensidad estuvo por encima de la relación señal/ruido, que se definió como el punto donde se detectaron secuencias de queratina, un contaminante ambiental común en este tipo de análisis. Se determinó que los péptidos del extracto dializable de leucocitos más abundantes, según la intensidad de su espectro de masas, provienen de 22 proteínas humanas, 18 de ellas agrupadas (Tabla 1). En general, estos péptidos representan el 4,319% (SD <1,03) del contenido total de péptidos del extracto dializable de leucocitos, siendo los péptidos de anquirina (ANK-1) los que más contribuyen (Figura 1).

Tabla 1

La contribución de cada proteína al espectro de masas del un extracto dializable de leucocitos depende de: i) el número de péptidos proporcionados a la mezcla y ¡i) la intensidad espectral de cada péptido. Por lo tanto, la abundancia relativa por proteína en el extracto dializable de leucocitos se calculó cualitativamente basándose en el porcentaje de cobertura y el número de aciertos promedio de sus péptidos. El mapa de cobertura se observa en la Figura 2A, mientras que el porcentaje de cobertura se observa en la Figura 2B. Además, se obtuvo el número medio de aciertos por péptido como indicador de abundancia relativa. A este respecto, se seleccionaron los péptidos que aparecieron en al menos ocho de los 10 lotes secuenciados. Se identificaron 136 péptidos relevantes, y su número medio de aciertos se agruparon en una región de aciertos alta (> 80 aciertos) o intermedia (40 - 80) (Figura 3).

Ejemplo 2. Análisis de masa intacta, identificación del monómero completo de Ub y la variante del monómeno de Ub(-GG) y cuantificación de Ub total.

Se llevó a cabo un análisis de masa intacta para identificar los péptidos del extracto dializable de leucocitos con una actividad biológica relevante.

La masa intacta de los péptidos del extracto dializable de leucocitos se determinó mediante espectrometría de masas (MS) utilizando la secuencia completa de las proteínas identificadas en la secuenciación de novo del Ejemplo 1. Se liofilizaron ocho lotes del extracto dializable de leucocitos (16E16, 16E15, 16F17, 16F18, 16J27, 16J28, 16J29, 16H15 y 16H26) y se reconstituyeron en agua MS a 2 mg/ml. Además, una muestra del lote 18A01 se redujo y se acetiló como se describió previamente. Se inyectó un volumen de 10 pL de muestras del extracto dializable de leucocitos y Ub humana recombinante (1 pg/ml) en un Vion® ESI-IMS-Q-ToF acoplado a un sistema Acquity® UPLC Clase I y se separó con un CSH C18 de 1.7 pm (2.1 mm x 150 mm) para la identificación y cuantificación de Ub y una columna BioSuite® de 3.0 pm C18 (2.1 x 150 mm) para la verificación de la identidad de Ub a 60 °C. Las muestras se eluyeron a 0.2 mL/min usando agua + ácido fórmico (0.1%) (Fase A) y acetonitrilo + ácido fórmico (0.1%) (Fase B) como sigue: 100% de 0 a 10 min de fase A, y un gradiente de 100 a 50% de 10 a 85 min de fase A. IMS-QTof se operó en polaridad positiva y sensibilidad MSE/modo de 50 a 2000 m/z. Las energías de colisión fueron 5,00 eV (baja), 10,00 eV (alta) y 35,00 eV (final de rampa de alta energía de colisión). Los parámetros de ionización por electropulverización (ESI) se establecieron en: temperatura de la fuente de 150 °C, temperatura de desolvatación de 450 °C, gas de cono de 0 L/h, gas de desolvatación de 1000 L/h y voltaje capilar de 2,75 kV. Se infundió una solución de leucina encefalina de 50 pg/pl (Waters, 556,2766 m/z) durante el análisis de MS a 5 pl/min para la corrección de masa. Los datos se adquirieron y procesaron utilizando el software Vion® en el que se cargó la secuencia completa de las proteínas identificadas en la secuenciación de novo, y se buscaron todos los posibles péptidos derivados de la digestión específica de LysC/tripsina con una tolerancia de 25 ppm; no se consideraron modificaciones químicas o postraduccionales.

Para identificar los péptidos del extracto dializable de leucocitos con una actividad biológica relevante se determinó el componente más abundante, la señal más alta del Conteo de Iones Totales (TIC) se observó alrededor de 57 min (Figura 4A) utilizando una columna CSH C18 de 1,7 pm. Usando el algoritmo MaxEntl se combinó la señal de 57 min, y el m/z obtenido y su masa desconvolucionada (Figura 4B y 4C, respectivamente) fueron muy similares a la masa teórica del monómero completo de Ub (8564.84 Da). En el mismo pico cromatográfico se observó una segunda señal peptídica con una masa similar al monómero completo de Ub (8449,0 kDa). La presencia del monómero completo de Ub en el extracto dializable de leucocitos se verificó analizando un patrón del monómero completo de Ub y el extracto dializable de leucocitos uno al lado del otro usando una columna C18 BioSuite® de 3.0 p; ambas muestras exhibieron el mismo perfil de TIC en el tiempo de elución del monómero completo de Ub, es decir, de 50 min - 69 min (Figura 5A). La combinación del perfil TIC del extracto dializable de leucocitos de 50 a 69 min evidenció dos conjuntos de señales, como se observó anteriormente usando la columna CSH C18 de partículas de pequeño tamaño, uno de ellos era similar al estándar del monómero completo de Ub (Figura 5B). Después de la deconvolución mediante un algoritmo MaxEntl, estos conjuntos de señales m/z del extracto dializable de leucocitos se asignaron al monómero completo de Ub (8564,50 Da) de acuerdo con la masa intacta del estándar, y el segundo conjunto, el más intenso, a una variante del monómeno de Ubiquitina humana que carece de dos glicinas terminales (Ub(-GG)) (8450,5 kDa) según la secuencia predicha por el software UNIPROT y el cálculo de masa teórica de Ub(-GG) utilizando la herramienta ExPASy (8450,74 Da) (Figura 5C). Se analizó una muestra del extracto dializable de leucocitos reducida con ditiotreitol (DTT) en las mismas condiciones analíticas para confirmar que las señales m/z atribuidles a Ub y Ub(-GG) en lugar de agregados de péptidos. La muestra reducida también mostró los patrones m/z Ub y Ub(-GG). Esto se muestra en la figura 6.

Además, los perfiles TIC y m/z de Ub y Ub (-GG) (de la Figura 6) fueron reproducidles en análisis de espectrometría de masas del extracto dializable de leucocitos de 8 lotes (en la Figura 7).

La identidad de Ub y Ub(-GG) en el extracto dializable de leucocitos también se determinó usando anticuerpos policlonales. Un anticuerpo policlonal (Mellado-Sanchez, G., et al., Development of Functional Antibodies Directed to Human Dialyzable Leukocyte Extract (Transferon(R)). J Immunol Res, 2019. 2019: p. 2754920.), reconocido Ub monomérico humano recombinante, así como un anticuerpo policlonal anti-Ub comercial (Figura 8A). Además, se incubó una muestra del extracto dializable de leucocitos (2 mg/mL) con un anticuerpo anti-Ub policlonal comercial a 4 °C durante la noche y se filtró a través de una membrana de 100 kDa. El análisis de la masa intacta mostró que el anticuerpo anti-Ub retuvo tanto Ub como Ub(-GG) durante la filtración (Figura 8B). Este resultado también confirmó que los dos conjuntos de señales m/z que co-eluyen a los 55 minutos en el perfil TIC del extracto dializable de leucocitos corresponden a Ub y Ub(-GG), dos entidades peptídicas estructural y fisicoquímicamente similares. La similitud estructural entre Ub y Ub(-GG) también se evaluó mediante modelado por homología utilizando la herramienta SWISS-MODEL. Los modelos obtenidos para Ub y Ub(- GG) y sus valores de puntaje Z fueron similares (0.55 versus 0.59) (Figura 9A).

El total de Ub [Ub + Ub(-GG)] se cuantificó en ocho lotes del extracto dializable de leucocitos (18A01, 18A02, 18A03, 18A04, 18B05, 18E13, 18E14 y 18E16). Se liofilizó un vial de 5 mi (0,4 mg/ml del extracto dializable de leucocitos, equivalente a una dosis), se reconstituyó en agua (2 mg/ml) y se cuantificó por MS utilizando una curva Ub monomérica humana estándar; los resultados se calcularon en pg/dosis, lo que equivale a pg/5 mL. La cuantificación mostró que el contenido promedio del péptido Ub(-GG) casi duplica el del Ub monomérico (0.637 pg/dosis versus 0.366 pg/dosis) en el extracto dializable de leucocitos y que el contenido promedio de Ub total es 1003 pg/dosis (Figura 9B) .

Ejemplo 3. Detección del monómero completo de Ub por medio de ELISA.

La presencia de ubiquitina monomérica (Ub) en el extracto dializable de leucocitos se confirmó indirectamente mediante ELISA indirecto empleando anticuerpos policlonales como en el ejemplo anterior y el kit OptEIA® de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las placas de ELISA Maxisorp® se recubrieron con 50 pL de Ub humana recombinante (10 pg/mL) en solución tampón de carbonato de pH 9,5 (BD Biosciences®) a 4 °C durante la noche. La detección de Ub se logró utilizando el anticuerpo policlonal (dilución 1:250) o un anticuerpo policlonal anti-Ub comercial (dilución 1:300; Boston Biochem Inc.), ambos desarrollados en conejo. Los anticuerpos primarios se detectaron usando un anticuerpo anti-IgG de conejo acoplado a peroxidasa de rábano picante (dilución 1:2500; Sigma- Aldrich). Los datos se analizaron a 450 nm/570 nm en un espectrofotómetro Epoch® (BioTek®; VT, EE.UU.) después de realizar la reacción colorimétrica con una 3,3', 5,5' tetrametilbencidina (TMB) (BD Biosciencs). Los datos se procesaron utilizando el software Gen5 (BioTek®). Ejemplo 4. Modelo murino de infección por HSV-1.

La relevancia del contenido de Ub en un extracto dializable de leucocitos (EDL) se evaluó utilizando un modelo murino de infección por HSV-1, como se ha descrito previamente (Salinas-Jazmín, N., et al., Herpes murine model as a biological assay to test diaiyzabie leukocyte extracts activity. J Immunol Res, 2015. 2015: p. 146305); investigadores capacitados realizaron en ciego todos los procedimientos. Para ello, se consideró a Ub y Ub(-GG) la misma molécula (Ub total) considerando que son fisicoquímicos y estructuralmente similares y que la falta de Gly terminal no afecta la actividad biológica de Ub extracelular.

En el modelo murino de infección por HSV-1, los ratones BALB/c se infectan con HSV-1, el tratamiento farmacológico es administrado por vía orofaringea a los 2, 4, 6, 8 y 10 días después de la infección, y permanecen bajo observación durante diez días adicionales para evaluar el porcentaje de supervivencia. Los tratamientos administrados fueron el EDL (0.50 pg/200 pL); el EDL añadido con Ub monomérico (0.50 pg/200 pL + 0.75 pg/200 pL, respectivamente); el EDL sin Ub (« 0.50 pg/200 pL), que se eliminó con un anticuerpo anti-Ub policlonal comercial (Figura 8B); y Ub (0.75 pg/200 pL) (Figura 10). En este ensayo, se observó que el grupo tratado con EDL+ Ub mostró un aumento en el porcentaje de supervivencia en comparación con el grupo tratado con EDL solo (77.7% versus 66.6%), mientras que el porcentaje de supervivencia disminuyó en el grupo tratado con EDL empobrecido en Ub en comparación con el grupo EDL (55.5% versus 66.6%). Curiosamente, el grupo tratado con Ub solo mostró una supervivencia del 100%, al igual que el grupo de control negativo (sin infección / sin tratamiento). La concentración de Ub utilizada para este ensayo se determinó en un ensayo anterior en el que se observó que concentraciones equivalentes a menos del 50% de EDL no indujeron cambios significativos en la supervivencia en comparación con el control de la infección (datos no mostrados). En conjunto, estos resultados indican que Ub monomérico es un componente activo principal de la mezcla de péptidos de EDL.

El contenido de Ub total de EDL sin Ub se eliminó usando un anticuerpo policlonal anti- Ub (Boston Biochem Inc.) y se usó como control negativo en el ensayo ¡n vivo. Las muestras transferidas (lote 19J20) se liofilizaron y reconstituyeron en agua para inyección a 2 mg/ml. Se incubó un volumen de 200 pl con 2 pl de anticuerpo policlonal anti-Ub (Boston Biochem Inc.) a 4 °C durante la noche. Luego, la muestra se filtró por centrifugación a través de una membrana de 50 kDa; el permeado y las fracciones retenidas se analizaron mediante el método MS intacto para confirmar la eliminación de Ub. El permeado se esterilizó mediante filtración utilizando una membrana de 0.22 pm (Millipore) y se almacenó a 4 °C hasta su uso.

En el modelo de infección por HSV-I, la administración de Ub (0.087 nM) y péptidos con una masa molecular menor a 10 KDa fueron capaces de inducir un efecto protector. Sorprendentemente, cuando se modificó la concentración de Ub en EDL usando anticuerpos comerciales contra Ub o agregando Ub humano monomérico recombinante, la capacidad protectora de EDL disminuyó o aumentó, respectivamente, lo que indica que Ub es uno de los componentes activos de EDL. De conformidad con lo anteriormente descrito, se podrá observar que la composición de peptidos con efectos inmunomoduladores, ha sido ideada para no presentar variabilidad a diferencia de otros extractos leucocitarios que varían en su contenido de peptidos de acuerdo con su origen celular y método de fabricación y para la regulación integral del sistema inmunológico, y será evidente para cualquier experto en la materia que las modalidades de la composición para inmunoterapia según se describió anteriormente e ¡lustró en los dibujos que se acompañan, son únicamente ilustrativas más no limitativas de la presente invención, ya que son posibles numerosos cambios de consideración en sus detalles sin apartarse del alcance de la invención. Por ejemplo, es posible la combinación de la composición de peptidos con efectos inmunomoduladores con otros agentes farmacéuticos y/o inmunogénicos y/o inmunoestimuladores y/o inmunoterapéuticos, y puede combinarse con un vehículo fisiológicamente o farmacéuticamente aceptable para su administración.

Por lo tanto, la presente invención no deberá considerarse como restringida excepto por lo que exija la técnica anterior y por el alcance de las reivindicaciones anexas.