Campo de la técnica

La presente invención se relaciona con la rama de la medicina, en particular con un péptido modificado tipo APL (del inglés Altered Peptide Ligand, abreviado APL), derivado de la HSP60 y su empleo para garantizar la homeostasis lipídica, prevenir el estrés oxidativo celular, y evitar la amiloidosis producida por modificaciones inadecuadas de la apolipoproteína A-l (Apo-AI) y la transtirretina (TTR). El péptido también es útil para el tratamiento de pacientes con afectaciones en el transporte y procesamiento inadecuado de lípidos.

Estado de la técnica anterior

Se ha descrito que los lípidos son fundamentales en el funcionamiento adecuado del organismo humano y tienen un papel esencial en la obtención y almacenamiento de energía. Además, son componentes fundamentales de las membranas lipídicas de vahas hormonas y de las sales biliares. Los desbalances en la concentración de los lípidos, ya sea por exceso o por defecto, están relacionados directamente con el desarrollo de enfermedades cardiovasculares, como la enfermedad coronaria, cerebrovascular o las dislipidemias (Krahmer, N. et al. (2013) EMBO Mol. Med. 5, 973-983).

Los lípidos son biomoléculas hidrofóbicas, y en su mayoría insolubles en sangre, por lo que su transporte es conducido por las lipoproteínas. Las lipoproteínas se clasifican en dependencia de su tamaño y su densidad. Las lipoproteínas son estructuras esféricas hidrofóbicas, que poseen proteínas en su superficie (apoproteínas o apolipoproteínas), capaces de unir las enzimas encargadas del procesamiento de los lípidos (Rosenson, R.S. et al. (2016). Nat. Rev. Cardiol. 13, 48-60).

Las lipoproteínas de alta densidad (HDL) transportan el exceso de colesterol de los tejidos extra-hepáticos hacia el hígado, en el cual es metabolizado. Las HDL están relacionadas con la disminución de riesgo cardiovascular, y las lipoproteínas de baja densidad (LDL) y las de muy baja densidad (VLDL), lo incrementan. Existe una correlación inversa entre la concentración de colesterol asociado a HDL y el riesgo de ateroesclerosis (Lee, M., P. T. et al. (2003). J. Lipid Res. 44: 539-546).

Las HDL son las lipoproteínas de mayor densidad porque tienen una concentración mayor de proteínas que de lípidos. Estas lipoproteínas están compuestas de colesterol, triglicéridos y numerosas apolipoproteínas: Apo-AI, Apo-AII, Apo-AIV, Apo- AV, Apo-C1 , Apo-CII, Apo-CIII y Apo-E. La Apo-AI es el componente proteico principal de las HDL y es la apolipoproteína primordial encargada de mantener la estructura de las HDL (Jonas, A., K. E. Kezdy, y J. H. Wald. (1989). J. Biol. Chem. 264: 4818-4824). La Apo-AI activa a la enzima lecitina-colesterol-acil-transferasa, que cataliza la transformación del colesterol a su forma de éster, por lo cual aumenta la capacidad de las HDL para transportar lípidos hacia el hígado (Gordon, T. et al. (1977). Am. J. Med. 62, 707-714). La concentración en sangre de la Apo-AI aumenta durante determinadas condiciones fisiológicas como el embarazo, las hepatopatías, el uso de estrógenos y disminuyen durante la sepsis y aterosclerosis. Las concentraciones altas de la Apo-AI y bajas de Apo-B (principal componente proteico de las lipoproteínas de baja densidad) se correlacionan significativamente con una reducción del riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares. Las HDL tienen propiedades anti-aterogénicas y anti-inflamatorias, ya que transportan el colesterol acumulado en las placas de ateromas hacia el hígado, con lo cual contribuyen a la reducción de dichas placas (T.M. Forte, et al. (2002) J Lipid Res, 43: 477-485).

Los mecanismos de formación de las placas ateroscleróticas no se comprenden en su totalidad, pero las lipoproteínas LDL y HDL tienen un rol fundamental en dichos mecanismos. Hasta el momento no se ha encontrado un tratamiento efectivo para evitar la formación de ateromas y evitar los daños consiguientes al organismo humano. Por lo tanto, obtener tratamientos que garanticen una homeostasis lipídica y procesamiento adecuado de las lipoproteínas es crucial.

Por otra parte, se ha descrito que la TTR forma parte de las HDL, a través de la unión a la Apo-AI (Liz, M. A., C. M. Gomes, M. J. Saraiva, y M. M. Sousa. (2007) J. Lipid Res. 48: 2385-2395). La TTR es una proteína tetraméhca presente en el plasma, es sintetizada fundamentalmente en el hígado, y se encarga del transporte de tiroxina y de la proteína ligada al retinol. Esta proteína puede disgregarse en monómeros y dímeros, que pueden acoplase en fibras y depositarse en los tejidos. La edad y mutaciones puntuales (se han descritos más de cien) pueden aumentar la predisposición a la agregación. Se han descrito dos formas de amiloidosis por TTR: la forma natural (wt ATTR, abreviado del inglés wild type transthyretin cardiac amiloidosis, conocida como amiloidosis sistémica senil) y la forma hereditaria (h- ATTR, abreviado del inglés hereditary transthyretin cardiac amiloidosis). En la forma natural, la síntesis de la TTR es normal, mientras que en la hereditaria la presencia de una mutación puntual hace que la TTR tenga afectada su conformación, desde su síntesis en los hepatocitos (Kittleson MM, Maurer MS, Ambardekar AA, et al. (2020) Circulation; 142:e7-22).

Entre las enfermedades causadas por amiloidosis por TTR está la cardiomiopatía amiloidea, la cual se refiere a la afección cardíaca como consecuencia del depósito extracelular de fibrillas anormales insolubles. La prevalencia de esta enfermedad se estima entre el 13%, en los adultos mayores internados por fracción de eyección preservada, y el 16% de las estenosis aórticas severas que requiere intervención (Coelho T, Maurer MS, Suhr OB. (2013) Curr Med Res Opin; 29:63-76).

Además, las modificaciones postraduccionales de la TTR que afectan su conformación tetramérica, y la presencia de sus oligómeros, se relacionan fuertemente con la enfermedad de Parkinson (Ando Y, Nakamura M y Araki S. (2005) Arch Neurol 62: 1057-1062) y con las patologías asociadas al estrés oxidativo (Sharma M, Khan S, Rahman S y Singh LR (2019) Front. Physiol. 10:5. doi: 10.3389/fphys.2019.00005).

Se ha descrito que una fracción de TTR plasmática circula en las HDL a través de la unión a la Apo-AI, y se ha demostrado que la TTR es capaz de escindir el carboxilo terminal de la Apo-AI libre de lípidos. La escisión de la Apo-AI por TTR induce la formación de fibrillas de amiloide de Apo-AI. Además, provoca que las partículas de HDL modificadas tengan una capacidad reducida para promover el recambio adecuado de colesterol. Por otra parte, la Apo-AI escindida por TTR tiene una alta preferencia a formar partículas agregadas, por lo que afecta el recambio de las HDL, y favorece el desarrollo de la aterosclerosis, al reducir el metabolismo del colesterol y aumentar el potencial amiloidogénico de la Apo-AI (Liz, M. A., C. M. Gomes, M. J. Saraiva, y M. M. Sousa. (2007) J. Lipid Res. 48: 2385-2395).

La búsqueda de tratamientos que estabilicen las HDL es crucial para garantizar un adecuado intercambio lipídico, en especial del colesterol, y evitar la formación o reducir las placas de ateromas que promueven la aterosclerosis. Al mismo tiempo, tratamientos que estabilicen la conformación de la TTR, que eviten sus modificaciones y su agregación, serían efectivos al prevenir la amiloidosis mediada por TTR y la enfermedad de Parkinson.

Explicación de la invención

La presente invención resuelve el problema mencionado anteriormente, al proveer un péptido cuya secuencia se identifica como SEQ ID NO: 1 , para su uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad que cursa con una afectación en la Apo-AI o en la TTR. El péptido modificado identificado como SEQ ID NO: 1 es capaz de estabilizar la estructura supramolecular de las HDL, a través de la unión a la Apo-AI. De esta forma, facilita un metabolismo adecuado de los lípidos y la reducción de las placas de ateromas, asociadas con la aterosclerosis. Como se muestra en la invención, sorprendentemente, las únicas proteínas que interactúan con este péptido en el plasma humano son la Apo-AI y la TTR. Esta interacción permite la estabilidad tanto de la Apo-AI como de la TTR.

En el contexto de la invención “una enfermedad que cursa con una afectación en la Apo-AI o en la TTR” se define como aquella enfermedad en la cual existe un aumento o disminución de la concentración plasmática de la Apo-AI o de la TTR, o en la que ocurren modificaciones en las interacciones de estas proteínas en las partículas de HDL, o aquellas enfermedades donde se afectan las estructuras de la Apo-AI y la TTR, y por ende sus funciones biológicas.

Previamente, se describió que el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 induce mecanismos reguladores de la respuesta inmunitaria en diferentes sistemas experimentales. Dicho péptido incrementó la frecuencia de las células T reguladoras (Treg) en ensayos ex vivo con células mononucleares de sangre periférica de pacientes con artritis reumatoide (AR), pero no en donantes sanos; estas células tienen actividad supresora (Barberá A, Lorenzo N, van Kooten P, et al. (2016) Cell Stress and Chaperones.; 21 :735-744). Asimismo, dicho péptido indujo un aumento significativo de la población de células Treg en ratones BALB/c. Además, este péptido inhibió eficientemente la AR en dos modelos animales (Lorenzo N, Altruda F, Silengo L y Dominguez MC. (2017) Clin Exp Med; 17:209-216). El tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 a pacientes con AR, demostró ser seguro y tuvo un buen efecto terapéutico (Dinorah Prada, Jorge Gómez, Norailys Lorenzo, Oreste Corrales, et al. (2018) Journal of Clinical Trials; 8:2167-0870; Cabrales-Rico, A., Ramos, Y., Besada, V., Del Carmen, D. M., Lorenzo, N. etal. (2017) J Pharm Biomed Anal 143: 130-140).

Estos resultados se revelaron en las solicitudes de patente internacional No. PCT/CU2005/000008 y PCT/CU2009/000009. Estos reivindican el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 y su uso para el tratamiento de la AR y de la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa y la diabetes mellitus tipo I, respectivamente. Posteriormente, la solicitud de patente internacional No. PCT/CU2018/050007 reivindicó una composición farmacéutica muy estable que contiene el péptido de SEQ ID NO: 1 , para el tratamiento de las enfermedades caracterizadas por un aumento de la citrulinación y del número de neutrófilos. En particular, dicha invención se relaciona con el tratamiento de la AR, la espondilitis anquilosante, la artritis idiopática juvenil, la fibrosis hepática y pulmonar y la enfermedad de Alzheimer.

Por otra parte, el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 se ha utilizado en el tratamiento de pacientes con hiperinflamación, como es el caso de pacientes con COVID-19; y se demostró que reduce la inflamación en dichos pacientes (Hernandez- Cedeño M et al. (2021). Cell Stress and Chaperones 26: 515-525; Domínguez Horta MC, et al. (2022). Anales de la Academia de Ciencias de Cuba; 12(1): e1072. http://www.revistaccuba.cu/index.php/revacc/article/view/107 2. Este hecho primero se reveló en la solicitud de patente internacional No. PCT/CU2021/050001 , la que revindica el uso de dicho péptido para el tratamiento de la hiperinflamación.

En la presente invención se demuestra, por primera vez, la capacidad del péptido de SEQ ID NO: 1 de unir fuertemente a las proteínas Apo-AI y TTR, lo cual contribuye a garantizar una homeostasis lipídica estable y a reducir los procesos de amiloidosis mediados por dichas proteínas. Además, en esta invención se demuestra el beneficio que recibieron los pacientes tratados con el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 , que habían alcanzado un estado de gravedad debido a enfermedades relacionadas con el metabolismo de los lípidos.

En una materialización de la invención, la enfermedad que cursa con una afectación en la Apo-AI o en la TTR se caracteriza por una afectación en la homeostasis lipídica o en la estabilidad de la TTR. En una realización particular, dicha enfermedad se selecciona del grupo compuesto por ateroesclerosis, cardiopatía isquémica, diabetes tipo II, dislipidemia secundaria y síndrome metabólico. En otra realización particular, dicha enfermedad es la amiloidosis por TTR o la enfermedad de Parkinson.

El péptido identificado como SEQ ID NO: 1 reduce el estrés oxidativo y mejora significativamente el estado de pacientes que se encuentran clínicamente graves debido a enfermedades cardiovasculares, como las cardiopatías isquémicas, y la hipertensión. El tratamiento con dicho péptido a pacientes con cardiopatías isquémicas y diabetes tipo II fue muy seguro, ya que no causó efectos adversos.

Se conoce que el mismo péptido es útil para el tratamiento de los pacientes con diabetes tipo I. Sin embargo, dicho uso está basado en la regulación de la respuesta inmunológica descontrolada que persiste en los pacientes con diabetes tipo I. La diabetes tipo II no es considerada una enfermedad autoinmune. Sorprendentemente, el tratamiento con dicho péptido a pacientes con diabetes tipo II descompensada permitió una recuperación muy rápida de los mismos, en comparación con los pacientes que recibieron el tratamiento estándar solamente. En la presente invención se demuestra, inesperadamente, que se produce un efecto muy beneficioso en los pacientes con diabetes tipo II, donde el tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 contribuye a la homeostasis lipídica y su efecto en el metabolismo intermediario.

La invención también provee un método de tratamiento de una enfermedad que cursa con una afectación en la Apo-AI o en la TTR en un individuo que lo necesita. Dicho método de tratamiento se caracteriza porque se administra una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO: 1. En una materialización de la invención la enfermedad se selecciona del grupo compuesto por ateroesclerosis, cardiopatía isquémica, diabetes tipo II, dislipidemia secundaria y síndrome metabólico. En otra materialización, la enfermedad es la amiloidosis por TTR o la enfermedad de Parkinson.

En una realización de la invención, en el método de tratamiento dicha composición farmacéutica se administra por ruta sistémica. En una realización preferida, la composición se administra por ruta subcutánea o intravenosa. En una materialización de la invención, dicha composición farmacéutica se administra de manera simultánea con la terapia estándar, en el curso de un mismo tratamiento.

Breve descripción de las figuras:

Figura 1. Electroforesis SDS-PAGE que muestra las proteínas en el plasma humano que se unen de forma específica al péptido identificado como SEQ ID NO: 1 . Carril 1 : patrón de peso molecular. Carril 2: proteínas que se unen a la matriz-sin péptido (control). Carril 3: proteínas que se unen de forma específica al péptido identificado como SEQ ID NO: 1 unido a la matriz.

Figura 2. Espectro de masas (EM) de la banda identificada como Apo-AI en la SDS- PAGE. Los recuadros indican los péptidos que fueron identificados con el programa MASCOT en la base de datos UniProtKB como constituyentes de la Apo-AI. Figura 3. EM de la banda identificada como TTR en la SDS-PAGE. Los puntos indican los péptidos que fueron identificados con el programa MASCOT en la base de datos UniProtKB como constituyentes de la TTR.

Figura 4. Western Blot que muestra las proteínas que se unen de forma específica al péptido identificado como SEQ ID NO: 1 en el plasma humano. Carril 1 : patrón de peso molecular. Carril 2: plasma que no se incubó con el péptido. Carril 3: plasma que se incubó con el péptido.

Figura 5. A, superposición de la estructura de los diez modelos del complejo péptido- proteína de mayor puntuación predicho por el método CABS-dock. B, modelo de la estructura del complejo del péptido identificado como SEQ ID NO: 1 unido a la proteína TTR por el sitio “hid”. C, representación del péptido unido a proteína TTR, representando la superficie de la proteína de acuerdo al carácter hidropático. D, figura similar a la C, pero sin representar el carácter electrostático de la superficie de la proteína. E, vista de las interacciones observadas en el entorno del residuo Leu18 del péptido.

Figura 6. Mapa de contacto entre los residuos del péptido identificado como SEQ ID NO: 1 (eje vertical) y la proteína TTR (eje horizontal), según la predicción de estructura 3D del complejo. Los cuadros significan que los residuos correspondientes contienen átomos localizados a una distancia igual o inferior a 4,5 Á. El tipo de residuo se muestra en código de tres letras, junto al identificador de cadena (cadenas B y D corresponden a la proteína TTR y la cadena E al péptido identificado como SEQ ID NO: 1) y al número de residuo de la secuencia de aminoácidos.

Figura 7. Niveles de colesterol en pacientes con cardiopatía isquémica e hipertensión arterial tratados con el péptido identificado como SEQ ID NO: 1. Tiempo 0: niveles de colesterol antes de iniciar el tratamiento con el péptido; día 7: niveles de colesterol siete días después de iniciado el tratamiento con el péptido.

Figura 8. Niveles de colesterol en los pacientes diabéticos tipo II, cinco de los cuales recibieron tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 , en comparación con cinco pacientes no tratados con dicho péptido. La línea discontinua marca el límite normal de los niveles de colesterol en sangre (5,20 mmol/L). Tiempo 0: niveles de colesterol antes de iniciar el tratamiento con el péptido, día 8: niveles de colesterol ocho días después de iniciado el tratamiento con el péptido.

Exposición detallada de modos de realización / Ejemplos de realización. Ejemplo 1. Identificación de apolipoproteína A (Apo-AI) como proteína que une el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 en el plasma humano.

Con el objetivo de investigar la capacidad del péptido identificado como SEQ ID NO: 1 de unir proteínas plasmáticas, se realizó una cromatografía de afinidad, a través de una resina cromatográfica a la cual se le unió el péptido sintético identificado como SEQ ID NO: 1. Primeramente, se extrajo sangre de un donante sano, de sexo femenino, de 24 años, sin ninguna afectación patológica y con un perfil lipídico normal. La sangre se diluyó 1 :2 con PBS 1X y se añadió a 3 mL de Ficoll-Paque™, se centrifugó durante 30 min a 1200 rpm. Se recolectó el plasma, el cual fue incubado con 100 L de la matriz de cromatografía. Esta matriz es una resina en forma de perlas, denominada ChemMatñx™ (Quebec, Canadá), a la cual previamente se le acopló el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 (a esta unión se le denomina en lo adelante matñz-péptido).

Antes de la incubación, la matñz-péptido fue tratada con una solución de metanol al 70% y medio de cultivo RPMI. La incubación de la matñz-péptido con el plasma se realizó durante 3 horas. Posteriormente, se realizó la elución con una solución que contenía: glicerol 20%; TRIS-HCI 62,5 mM; bromofenol azul 2,5%; SDS 2 % y p- mercaptoetanol al 5 %; y se recolectó la fracción de elución. La misma se calentó a 95°C por 5 min, y se analizó por electroforesis SDS-PAGE (gel al 15%). Como control del experimento, se realizó el procedimiento descrito anteriormente con la matriz ChemMatñx™ sin acoplarle el péptido identificado como SEQ ID NO: 1. El gel se tiñó con una solución de azul de Coomassie, esta tinción es compatible para la identificación de proteínas por espectrometría de masas.

Por su parte, la Figura 1 muestra el resultado del análisis por electroforesis SDS- PAGE, de las fracciones colectadas después de la elución. El gel se sometió a tinción de plata. Como se aprecia claramente, se identificaron dos proteínas del plasma que se unen al péptido identificado como SEQ ID NO: 1 , las cuales se denominaron como proteína X1 y X2.

Para la identificación de la proteína X1 observada en la SDS-PAGE, se recortó la banda correspondiente a esta, y se añadió 1 mL de una solución que contenía bicarbonato de amonio (BCA) 250 mM, acetonitrilo (ACN) 30%, ditiotreitol (DTT) 1% en agua. La muestra se agitó durante 15 minutos. Posteriormente, se eliminó esta solución y se añadió 1 mL de una solución que contenía BCA 250 mM; ACN 30%; acñlamida 2,5% en agua. La muestra se agitó durante 15 minutos. Inmediatamente, se eliminó esta solución, y se añadió 1 mL de una solución que contenía BCA 250 mM y ACN 30% en agua. La muestra se agitó durante 15 minutos. A continuación, se realizaron tres lavados con agua durante 10 min en agitación y la banda se recortó en cubos de 1 mm ³ . Se añadieron 400 pL de ACN puro, se homogenize utilizando un vortex, y se eliminó el sobrenadante. Luego, se secó la muestra en Speed Vac por 5 min, y el gel se hidrató con una solución de BCA 50 mM que contenía tripsina, a una concentración de 12,5 ng/mL. La incubación con la tripsina se realizó por 16 h a 37°C. Seguidamente, el gel se rehidrató con agua por 30 min a 37°C.

Consecutivamente, la muestra se desaló en una microcolumna ZipTip C18™ (Millipore, EEUU) y se eluyó en 3,5 pL de ACN al 60% en agua que contenía ácido fórmico 1%. La muestra se aplicó, en un capilar de borosilicato recubierto de un material conductor (Thermo Scientific, EEUU), y se analizó por nanoESI-MS. Los espectros de masas ESI-MS se obtuvieron en un espectrómetro de configuración híbrida ortogonal QTOF-2 (Micromass, Reino Unido) con fuente de ionización por electronebulización Z-spray en modo positivo (nanoESI+). El analizador se calibró con una mezcla de sales de yoduros de sodio y cesio (Sigma, EEUU) como referencia en un rango amplio de masas (50-2000 Th). Los espectros ESI-MS fueron obtenidos al aplicar un voltaje de 1200 volts y 30 volts en el capilar y en el cono de entrada del espectrómetro de masas, respectivamente. El programa de adquisición y procesamiento de los espectros de masas empleado fue el MassLynx versión 4.1 (Micromass, Reino Unido). Los espectros ESI-MS/MS fueron obtenidos al aplicar una energía de colisión en el rango de 20-40 eV, para inducir fragmentaciones que contuvieran información suficiente para la elucidación estructural de los péptidos analizados. El gas de colisión empleado fue el argón (Gases Industriales, Cuba).

El espectro ESI-MS de la digestión tríptica de la proteína correspondiente a la banda identificada como X1 mostró los iones multicargados (2+) correspondientes a cinco péptidos (m/z 620,43; 626,81 ; 700,85; 806,90 y 967,47; respectivamente), que fueron seleccionados para fragmentar y obtener su espectro ESI-MS/MS. Dichas especies corresponden a los fragmentos peptídicos ³⁷ DLATVYVDVLK ⁴⁸ , ⁵³ DYVSQFEGSALGK ⁶⁶ , ⁷² LLDNWDSVTSTFSK ⁸⁶ , ⁸⁹ EQLGPVTQEFWDNLEK ¹⁰⁴ y ¹²³ VQPYLDDFQK ¹³³ , respectivamente, de la proteína Apo-AI, identificada mediante el programa MASCOT realizando la búsqueda en la base de datos UniProtKB (Figura 2). Ejemplo 2. Identificación de transtirretina como proteína que une el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 en el plasma humano.

Para la identificación de la proteína X2 observada en la SDS-PAGE, se procedió como en el Ejemplo 1. El espectro ESI-MS de la proteína analizada correspondiente a la banda superior, mostró los iones multicargados (3+) correspondientes a dos péptidos (m/z 819,07 y 817,45; respectivamente) que fueron seleccionados para fragmentar mediante CID (abreviado del inglés Collision-Induced Dissociation) y se obtuvo su espectro ESI-MS/MS, el que se representa en la Figura 3. Dichas especies corresponden a los fragmentos peptídicos ³⁶ KTSESGELHGLTTEEEFVEGIYKV ⁵⁹ y ⁶⁸ KALGISPFHEHAEWFTANDSGPRR ⁹² , respectivamente, de la proteína TTR, identificada mediante el programa MASCOT. Esto se constató al realizar la búsqueda en la base de datos UniProtKB.

Ejemplo 3. Reconocimiento inmunológico del péptido identificado como SEQ ID NO: 1 unido a la apolipoproteína-AI o a la transtirretina.

Para confirmar que el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 se une a las proteínas Apo-AI y TTR presentes en el plasma, se realizó un experimento de inmunoidentificación tipo Western blot, con anticuerpos policlonales contra dicho péptido. Se utilizó como anticuerpo primario el suero de un conejo previamente inmunizado con el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 , conjugado a la proteína KLH (anticuerpo vs péptido). Durante la caracterización biológica del suero policlonal empleado, se comprobó que no reconoce a la Apo-AI ni a la TTR. Primeramente, se realizó una electroforesis SDS-PAGE (gel al 12,5%), donde se aplicó en dos carriles el plasma de un donante sano y en otro un patrón de peso molecular. Posteriormente, se realizó la transferencia de las proteínas presentes en el gel a una membrana de nitrocelulosa, la cual se tiñó con solución de Rojo Ponceau, y se marcaron las bandas correspondientes a los patrones de peso molecular. Se recortó la membrana, según los carriles donde se aplicó el plasma. Los fragmentos de membrana fueron tratados con una solución de albúmina de suero bovino al 1% que contenía Tween 20 al 0,05%; durante toda la noche a 4°C.

Seguidamente, uno de los fragmentos de membrana fue incubado con una solución del péptido identificado como SEQ ID NO: 1 , a una concentración de 200 pg/mL en PBS 1X más Tween 20 (0,05%). Esta incubación se efectuó durante tres horas a 37°C, los restantes fragmentos de membrana fueron tratados de igual forma, pero sin añadir péptido a la solución. Posteriormente, los fragmentos de membrana se sometieron a lavados con la solución compuesta por PBS 1X más Tween 20 (0,05%). A continuación, los fragmentos de membrana se incubaron con el suero policlonal vs péptido, como anticuerpo primario. El suero policlonal se diluyó 1/2500 en la solución de lavado, la incubación se realizó durante dos horas a 37°C. Transcurrido ese tiempo, se repitieron los lavados y se añadió el anticuerpo secundario (Sigma, EEUU). Este último consiste en una mezcla de inmunoglobulinas tipo G que reconocen la región constante de los anticuerpos de conejo, conjugadas a peroxidasa de rábano. La incubación con el anticuerpo secundario se efectuó durante una hora a 37°C. Seguidamente, se efectuaron los lavados, y el revelado se efectuó con peróxido de hidrógeno al 0,01 % y 3,3'-diaminobenc¡d¡na (1 mg/mL).

Los resultados se muestran en la Figura 4. Se observa como a la altura de las bandas correspondientes a la Apo-AI y la TTR hay reconocimiento inmunológico por el anticuerpo vs péptido. Este experimento confirma los resultados mostrados en los ejemplos 1 y 2, y por tanto se ratifica que el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 interactúa con estas dos proteínas presentes en el plasma humano.

Ejemplo 4. Modelación de la estructura del complejo formado entre el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 y la proteína Transtirretina.

La TTR monomérica adopta un plegamiento de tipo beta sándwich formado por dos hojas beta antiparalelas. La proteína TTR nativa se caracteriza por adoptar una estructura cuaternaria tetraméhca, la cual se establece por medio de la asociación de dos dímeros de la proteína. El dímero de TTR se configura inicialmente mediante la interacción de las hebras de uno de los extremos de las hojas beta de la proteína monomérica, formándose como resultado dos hojas beta antiparalelas extendidas. La superficie convexa de una de las hojas de cada dímero interactúa cara a cara con la hoja extendida análoga del otro dímero, obteniéndose el tetrámero. En el espacio ubicado entre dichas hojas se crea una cavidad o canal que acomoda el ligando natural (T4), así como otras moléculas pequeñas tipo drogas (Cothna et al. (2021). European Journal of Medicinal Chemistry. Vol 226, p 113847). La interacción inter- dímeros es relativamente poco estable, y la disociación del tetrámero está relacionada con un número de patologías asociadas a la proteína TTR, tales como la amiloidosis por TTR (Ando Y, Nakamura M y Araki S. (2005) Arch Neurol 62: 1057-1062). El sitio de unión descrito en el espacio localizado entre los dímeros es la diana de medicamentos estudiados y/o desarrollados contra vahas de dichas enfermedades. Para la modelación de la estructura del complejo formado entre el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 y la proteína TTR, se empleó el método de acoplamiento flexible péptido-proteína CABS-dock (Kurcinski M etal. (2020). Protein Science, 29: 211-222). Se utilizó la estructura cristalográfica - de 1.6 Á de resolución - de la proteína TTR (fichero 3CFM del Banco de Datos de Proteínas PDB), correspondiente a la proteína TTR (sin ligando) y cuya secuencia es la salvaje. El fichero contiene un dímero de la proteína TTR en la unidad asimétrica, por lo que el tetrámero fue obtenido aplicando las operaciones de simetría de BIOMOLECULE, descrita en el fichero tipo pdb. Las dos cadenas simétricas a las cadenas A y B - las originales del fichero pdb - fueron denominadas C y D, respectivamente.

El protocolo de acoplamiento empleado es “ciego”, o sea considera que todos los parches de la superficie de la proteína constituyen sitios potenciales de unión. La Figura 5A muestra superpuestos los diez mejores modelos propuestos por el algoritmo de CABS-dock. Con flechas se señala la localización del péptido identificado como SEQ ID NO: 1 , unido a la proteína en los modelos obtenidos. Todos los modelos indican que el sitio de unión más probable está localizado en una de dos hendiduras del tetrámero: a) la hendidura formada entre los monómeros del dímero (hendidura inter-monómero: “him”) la cual está delineada por la hoja beta extendida de cara expuesta cóncava o b) la hendidura formada en el espacio entre dímeros (hendidura inter-dímeros: “hid”), delineada por las hojas beta antiparalelas convexas. Las hendiduras “hid” forman la boca del canal o sitio de unión del ligando natural T4 de la proteína TTR. Este resultado sugiere que estos parches de la superficie poseen propiedades estereoquímicas favorables respecto al resto de la superficie de la proteína, de tal manera que constituyen “atractores” potenciales de interacciones del péptido identificado como SEQ ID NO: 1. Los dos sitios “him” son idénticos entre sí (al igual que los dos sitios “hid”), ya que están relacionados por el operador de simetría C2. Los resultados indican que el 60% de los modelos localizan al péptido identificado como SEQ ID NO: 1 unido al sitio “hid” y el restante 40% en el sitio “him”.

La Figura 5B muestra un modelo del péptido identificado como SEQ ID NO: 1 unido al sitio “hid”. En dicho modelo, el segmento de carácter más hidrófobo del péptido identificado como SEQ ID NO: 1 (residuos Leu15-Ala20) se proyecta hacia el interior de la boca del canal, a través de interacciones con residuos de carácter hidrófobos de la proteína TTR, lo cual aporta favorablemente a la energía de interacción (y la afinidad de la unión), por medio del “efecto hidrofóbico”. Como se observa en la Figura 5C, la región más profunda del sitio “hid” en contacto con el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 es de carácter hidrófobo. La complementariedad electrostática entre el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 y la proteína también es razonable, como se observa en la Figura 5D. El residuo del péptido identificado como SEQ ID NO: 1 que se proyecta más hacia el interior de la hendidura es la Leu18. En la Figura 5E se aprecia que este residuo leucina del péptido tiene contactos atómicos cercanos con los residuos Leu17, Leu103 y Ala108 de la proteína. Se observan las interacciones hidrofóbicas características de la unión del péptido de SEQ ID NO: 1 a la proteína.

Por otra parte, en la Figura 6 se observa como el segmento Ile11-Ala20 del péptido, que contiene la mayor cantidad de residuos hidrófobos, es el segmento que realiza la mayor cantidad de contactos con la proteína TTR. Se refuerza la importancia del efecto hidrofóbico respecto a su aporte energético, fundamental en interacciones péptido-proteína.

Desde el punto de vista funcional, la unión del péptido al sitio “hid” contribuye a la estabilización estructural del tetrámero y de esta forma puede conducir a la inhibición y/o modulación de los efectos negativos de enfermedades asociadas a la desestabilización de la estructura cuaternaria nativa de la proteína TTR. Por otra parte, el modelo es consistente con un rol central del residuo Leu18 en la interacción, el cual es resultado de la sustitución del residuo Asp18 presente en la secuencia nativa del epítopo T de la proteína HSP60 (Barberá A, Lorenzo N, van Kooten P, et al. (2016) Cell Stress and Chaperones.; 21 :735-744). Las interacciones del residuo Leu18 descritas aquí podrían constituir las bases estructurales de la actividad biológica específica del péptido identificado como SEQ ID NO: 1 , no observadas en el péptido nativo.

Ejemplo 5. Tratamiento con la composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 a pacientes con cardiopatía isquémica. Los pacientes con niveles bajos de HDL e hipertensos desarrollan con mucha frecuencia cardiopatías isquémicas, asociadas con la formación de placas de ateroma que caracterizan a la enfermedad llamada aterosclerosis. Estas cardiopatías a menudo conducen a los pacientes a un estado de gravedad y el tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 puede contribuir a la recuperación de los mismos. Se ejemplifica con los resultados de seis pacientes, estos presentaron cardiopatía isquémica, asociado a hipertensión, que les produjo un estado de gravedad. Fueron atendidos en la Unidad de Cuidados Intermedios (UCI) del hospital “Luis Díaz Soto” de La Habana. Estos pacientes se trataron con una composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 , de manera tal que se administró una dosis de péptido de 1 mg cada 12 horas, por vía intravenosa, durante siete días. Además, recibieron la terapia estándar necesaria para estos casos.

La Figura 7 muestra los niveles de colesterol en estos seis pacientes con cardiopatía isquémica e hipertensión arterial tratados con el péptido. Como se puede observar, los niveles de colesterol en sangre disminuyeron a los siete días de tratamiento. Dichos pacientes se recuperaron, y fueron dados de alta hospitalaria. Estos resultados indican que el tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 puede estabilizar a las HDL y favorecer un recambio adecuado del colesterol, con lo cual se pueden disminuir las placas de ateroma, mejorar la ateroesclerosis y evitar las complicaciones asociadas. El tratamiento con dicho péptido fue muy seguro, se comprobó mediante el seguimiento de parámetros de la bioquímica sanguínea y hemograma diferencial. No se observaron efectos adversos en los pacientes tratados, de acuerdo a la evaluación clínica y de imágenes.

En contraste, cinco pacientes con características similares, que no recibieron tratamiento con el péptido en el mismo periodo de tiempo, tuvieron una estadía más prolongada en la UCI, y los niveles de colesterol en estos superaron los 5 mmol/L al final del tratamiento.

Ejemplo 6. Tratamiento con la composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 a pacientes con diabetes tipo II.

Los pacientes obesos e hipertensos desarrollan con mucha frecuencia diabetes tipo II, asociado con desbalances en el metabolismo lipídico. Estas afectaciones pueden conducirlos a un estado de gravedad, y el tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 puede contribuir a la recuperación de los mismos.

Se ejemplifica con diez pacientes que presentaron una descompensación diabética y alcanzaron un estado de gravedad, que hizo que fueran atendidos en la UCI del hospital “Luis Díaz Soto” de La Habana. Cinco de estos pacientes fueron tratados con una composición farmacéutica que comprende el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 , de manera tal que se administró una dosis de péptido de 1 mg cada 12 horas, por vía intravenosa, durante ocho días. Además, recibieron la terapia estándar necesaria para estos casos.

La Figura 8 muestra los niveles de colesterol en los pacientes con diabetes tipo II que fueron tratados con el péptido, en comparación con los pacientes que recibieron el tratamiento estándar para estos casos, pero sin incluir el péptido. Como se puede observar los niveles de colesterol se mantienen constantes en los pacientes tratados con el péptido, en comparación con los pacientes no tratados con el péptido, en los cuales los niveles del colesterol superan los valores normales al final del periodo de evaluación, de 8 días. Estos resultados indican que el tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 puede estabilizar a las HDL, y favorecer un recambio adecuado del colesterol, lo cual contribuye a la estabilidad del metabolismo glucémico. El tratamiento con dicho péptido fue seguro, se comprobó mediante el seguimiento de parámetros de la bioquímica sanguínea y hemograma diferencial. No se observaron efectos adversos en los pacientes tratados, de acuerdo a la evaluación clínica y de imágenes.