Merck Patent Gesellschaft

mit beschränkter Haftung

64271 D a r m s t a d t

Petrischale und Verfahren zur

mikrobiologischen Untersuchung von Flüssigkeiten mittels Membranfiltration

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Petrischale und Verfahren zur mikrobiologischen Untersuchung von Flüssigkeiten mittels Membranfiltration

Die Erfindung betrifft eine mit Medium gefüllte Petrischale, in die besonders einfach Filter eingebracht werden können sowie ein Verfahren zur mikrobiologischen Untersuchung von insbesondere Flüssigkeiten mittels Filtration und Inkubation der Filter in besagten Petrischalen.

Bakterien, Schimmel und Hefen können die Qualität und Haltbarkeit von Flüssigkeiten, wie z.B. Getränken, Wasser oder Kosmetika, negativ beeinträchtigen. Derartige Keime sind in den Rohmaterialien, in der Luft oder auch auf Oberflächen bei der Verarbeitung zu finden.

Daher wird typischerweise schon während der Produktion versucht, die Kontamination einerseits zu verhindern und andererseits mögliche

Kontaminationen durch regelmäßige Probenentnahme und Überprüfung an Schlüsselstellen aufzudecken. Ein systematisch ausgeführtes Programm von Probenentnahme und Analyse ermöglicht es dem Hersteller,

Kontaminationen an der Quelle zu entdecken und zu beheben, bevor sie sich zu einem größeren Problem entwickeln.

Zur mikrobiologischen Analyse von zu filtrierenden Flüssigkeiten werden typischerweise Filter eingesetzt, die von den zu untersuchenden

Flüssigkeiten durchströmt werden. Nach der Filtration wird der Filter entnommen und beispielsweise in Agarschalen eingelegt, auf denen der Filter in einem Brutschrank mehrere Tage bei erhöhter Temperatur lagert. Über den Agar erhalten die eventuell aus der Flüssigkeit gefilterten Keime Nährstoffe, die zum Wachstum anregen, so dass die Keime sich vermehren und bestimmt oder gezählt werden können.

Eine Hauptschwierigkeit dieses bekannten Verfahrens ist die Handhabung der zumeist extrem empfindlichen Filter. Typischerweise werden sie mit - 2 - einer Pinzette gegriffen und auf dem Medium der Petrischale positioniert. Dabei darf der Filter und das Medium der Petrischale während der

Handhabung nicht beschädigt oder deformiert werden. Ein weiteres Problem gerade für Labore, in denen eine Vielzahl von Proben parallel untersucht werden muss, ist der Platzbedarf der einzelnen

Petrischale. In der Regel werden Petrischalen verwendet, die einen wesentlich größeren Durchmesser aufweisen als der zu untersuchende Filter. Dies ist notwendig, da ansonsten der Filter nicht auf das weit unter dem Rand der Schale befindliche Medium platziert werden kann.

Beispielsweise werden für Filter mit einem Druchmesser von 47 mm

Petrischalen mit einem Durchmesser von 60 mm und mehr verwendet. Die Verwendung großer Petrischalen bedeutet einen größeren

Materialverbrauch für die Petrischale und das darin befindliche Medium und insbesondere einen größeren Platzbedarf in den Untersuchungslabors während der Inkubation der Schalen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, die Handhabung der Filter bei der Aufgabe auf die Petrischale zu vereinfachen und zudem eine möglichst platzsparende Schale zur Verfügung zu stellen.

Es wurde gefunden, dass das seit Jahrzehnten bekannte und mit vielen teilweise komplizierten Vorichtungen durchgeführte Verfahren dadurch erheblich erleichtert werden kann, dass eine nahezu vollständig oder bevorzugt eine bis zum Rand mit Medium gefüllte Petrischale verwendet wird. Auf diese Weise kann der Filter ohne Behinderung durch den Rand der Petrischale auf das Medium aufgelegt und positioniert werden. Die Handhabung erfolgt schneller und mit weniger Beschädigungen des Filters oder des Mediums. Weiterhin kann dadurch Platz und Medium gespart werden, weil der Durchmesser der Petrischale bis fast auf den

Durchmesser des Filters reduziert werden kann. - 3 -

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine Petrischale umfassend eine Schale, die zumindest bis 1 mm unter den Rand der Schale höchstens aber bis zum Rand der Schale mit Medium gefüllt ist und einen Deckel, der die Schale schließt.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Schale komplett, d.h. bis zum Rand, mit Medium gefüllt.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Medium ein Agar- Medium.

In einer anderen Ausführungsform sind die Schale und der Deckel rund.

In einer bevorzugten Ausführungsform hat der Deckel einen zumindest geringfügig grösseren Innendurchmesser als der Aussendurchmesser der Schale, so dass zum Schliessen der Schale der Deckel über die Schale stülpbar ist.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform liegt der Deckelboden nicht auf dem Rand der Schale auf. Dazu befinden sich bevorzugt an der Wand der Schale oder am Deckel eine oder mehrere Vorrichtungen, die bewirken, dass der Deckelboden nicht direkt auf dem Rand der Schale aufliegt.

In einer Ausführungsform wird das Aufliegen des Deckelbodens verhindert, indem auf dem Rand der Schale mindestens 3 Erhebungen aufgebracht sind, auf denen der Deckel aufliegt.

In einer anderen Ausführungsform sind an der Wand der Schale (innen oder bevorzugt außen) Halterungen, beispielsweise in Form eines Wulstes oder in Form von Verschlußvorrichtungen angebracht, auf denen der Rand des Deckels aufliegt. - 4 -

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zum

Nachweis von Keimen in Flüssigkeiten oder Gasen, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte

a) Filtration der Flüssigkeit oder des Gases durch einen Filter

b) Applikation des Filters auf das Medium einer erfindungsgemäßen

Petrischale

c) Verschließen der Petrischale mit dem Deckel

d) Inkubation der Petrischale aus Schritt c)

e) Auswertung des Keim-Wachstums

In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Flüssigkeit filtriert.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind Filter und Petrischale rund geformt.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der innere Durchmesser der Petrischale 2 bis 10 mm größer als der Durchmesser des Filters.

Bevorzugt hat der Filter eine Ausschlußgrenze zwischen 0.2 und 0.45 μιη.

Bevorzugt besteht der Filter vorwiegend aus Zelluloseactetat und/oder Zellulosenitrat.

Gegenstand er vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung einer erfindungsgemäßen Petrischale zum Nachweis von Keimen auf Filtern.

Dazu werden die Filter auf das Medium der Petrischale aufgelegt, inkubiert und anschließend die Keime ausgewertet.

Abbildung 1 zeigt zwei mögliche Ausführungsformen der Schale einer erfindungsgemäßen Petrischale. Der Deckel ist jeweils nicht gezeigt. - 5 -

Eine Petrischale ist erfindungsgemäß ein Behältnis zur Aufnahme von Nährmedien, wobei darunter beispielsweise Nährlösungen oder Nährböden zu verstehen sind, insbesondere zur Kultivierung von Mikroorganismen, Zellkulturen, Bakterien, etc. Das Behältnis umfasst eine Schale und einen die Schale verschliessenden Deckel. An dieser Stelle sei darauf

hingewiesen, dass der Deckel die Schale umgreifen oder in die Schale eingreifen kann. Folglich sind die Schale und der Deckel ganz allgemein als Teile zu verstehen, die zur Bildung eines mehr oder weniger

abgeschlossenen Raumes ineinander greifen. Zur Vereinfachung wird fortlaufend von Schale und Deckel gesprochen.

Die Schale und der Deckel umfassen jeweils einen bevorzugt in Form einer Kreisfläche ausgebildeten Boden (Schalenboden und Deckelboden) und eine vom Boden abragende, bevorzugt kreisringförmige Wand

(Schalenwand und Deckelwand). Dabei wird die obere Kante der Wand als Rand bezeichnet. Eine der Wände, vorzugsweise die Deckelwand, hat einen zumindest geringfügig grösseren Innendurchmesser als der

Aussendurchmesser der anderen Wand, vorzugsweise der Schalenwand, so dass zum Schliessen der Schale die eine Wand über die andere (oder umgekehrt) stülpbar ist.

Eine Petrischale ist also typischerweise eine flache, runde, meist

durchsichtige Glas- oder Kunststoffschale mit bevorzugt übergreifendem Deckel. Eine solche Schale kommt üblicherweise in der Biologie oder Chemie zum Einsatz. Sie dient zur Kultivierung von Mikroorganismen, auch Keime genannt, und wird zum Anlegen von Zellkulturen genutzt.

in Bezug auf das gattungsbildende Behältnis sei lediglich beispielhaft auf die DE 44 06 725 A1 verwiesen, aus der ein Behältnis im Sinne einer Petrischale bekannt ist. Ein Deckel dient zum Verschluss des Behältnisses. Regelmässig wird der Deckel über die Schale bzw. über die Schalenwand gestülpt.

Medien im Sinne der vorliegenden Erfindung sind feste Nährmedien oder Nährböden, auf denen unspezifisch verschiedene Keime oder spezifisch - 6 - bestimmte Keime wachsen können. Die Grundzusammensetzung eines Mediums besteht meist aus einem Hauptanteil Wasser, einer für den jeweiligen Keim verwertbaren Energiequelle, beispielsweise organische Verbindungen , sowie von ihm benötigte Nährstoffe (organische oder anorganische Kohlenstoff-, Stickstoff-, Schwefel- und Phosphat-Quellen sowie andere essentielle Nährstoffe). Die Nährstoffe sind in den

Nährmedien für Heterotrophe meistens Kohlenhydrate („Zucker"),

Proteinhydrolysate (Peptone) und gegebenenfalls Fettsäuren. Zusätzlich liefern anorganische Salze den Keimen lebenswichtige Ionen, wie z. B. Ammonium, Kalium, Natrium, Phosphat, Sulfat sowie Spurenelemente. Daneben können noch enthalten sein:

- Farbstoffe bzw. deren Vorstufen (Mikroskopiefarbstoffe, chromogene Substrate)

- Geliermittel (Verfestigungsmittel), wie Agar oder Gelatine,

- Hemmstoffe (zum Beispiel Antibiotika) und selektive Agentien, um das Wachstum unerwünschter Mikroorganismen zu verhindern (z. B.

Chloramphenicol für Hefen/Schimmel-Nährböden)

- Indikatoren, um Änderungen anzuzeigen, wie z. B. beim pH-Wert, aber auch um gewisse Stoffwechselprodukte oder Stoffwechselaktivitäten anzuzeigen

- Puffersubstanzen, um den pH-Wert zu stabilisieren

- Wachstumsfaktoren, wie Hormone, Vitamine und dergleichen.

Bevorzugt sind erfindungsgemäß Medien auf Agar-Basis, d.h. es sind Medien, die Agar enthalten.

Medien für den Nachweis von Keimen sind dem Fachmann bekannt. Beispiele für geeignete Medien finden sich beispielsweise in Microbiology Manual 2000, Merck KGaA, Deutschland.

Die folgende Tabelle nennt beispielhaft einige Medien und die mit ihnen nachzuweisenden Keime. - 7 -

Filter im Sinne der vorliegenden Erfindung sind alle Filter, die zum

Sammeln von Keimen, wie Schimmelpilzen, Hefen oder Bakterien, geeignet sind. Dies können Papierfilter oder Membranfilter z.B. aus Kunststoff sein. Geeignet sind beispielsweise Filter aus PVDF.

Besonders bevorzugt sind Filter auf Basis von Zellulose-Mischestern. Dies sind Filter, die zumindest Zelluloseacetat und/oder Zellulosenitrat enthalten. Die Porengröße der Filter richtet sich nach der Größe der zu isolierenden Keime. Typische Ausschlußgrößen sind 0.2 bis 0.45 pm. Das bedeutet, die Filter haben Porengrößen zwischen 0.2 bis 0.45 [im.

Typischerweise werden Filter mit Durchmessern zwischen 30 und 80 mm, bevorzugt zwischen 40 und 50 mm, verwendet.

Ein beispielhafter, für die Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren geeigneter Filter ist EZ-PAK ® Membrane, von Merck Millipore,

Deutschland. Dies ist ein Membran-Filter aus Basis von Zellulose-Estern mit einer Porengröße von 0.45 pm. - 8 -

Es wurde gefunden, dass eine erfindungsgemäße Petrischale, die zumindest bis 1 mm unter den Rand der Schale höchstens aber bis zum Rand der Schale mit Medium gefüllt ist, die Analyse von Filtern deutlich vereinfacht. Zum einen ist es wesentlich einfachen, die empfindlichen Filter auf das Medium der Schale zu positionieren. Zum anderen kann der Durchmesser der Schale an den des Filters angepasst werden. Gerade in Labors, in denen eine Vielzahl von Proben parallel untersucht werden muss, sollte der Platzverbrauch der einzelnen Petrischale möglichst klein sein. Die vorliegende Erfindung bietet nun die Möglichkeit, im Verhältnis zum Durchmesser des Filters kleinere Petrischalen einzusetzen, da das Auflegen des Filters auf eine bis zum Rand gefüllte Petrischale wesentlich einfacher ist als den Filter tief unten in die Schale hinein zu platzieren. Typischerweise ist die Schale bis mindestens 1 mm unter den Rand der Schale höchstens aber bis zum Rand der Schale mit Medium gefüllt.

Bevorzugt ist die Schale genau bis zum Rand, d.h. komplett mit Medium gefüllt. Die Höhe der Medienfüllung ergibt sich aus der Wandhöhe der Petrischale. Mit Wandhöhe ist dabei die Wandhöhe des Inneren der Petrischale gemeint. Diese weicht um die Dicke des Bodens der Petrischale von der äußeren Wandhöhe der Schale ab. Die innere Wandhöhe der Petrischale sollte mindestens 3 mm betragen, so dass sich eine Höhe des Mediums von mindestens 3 mm ergibt. Bevorzugt liegt die Höhe des Mediums zwischen 3 und 7 mm. Somit ergeben sich für die Petrischale bevorzugte Wandhöhen von 3 bis 8 mm. Durch die Wahl der Wandhöhe der

Petrischale kann Einfluß auf den Verbrauch an Medium genommen werden.

Bevorzugt ist das Medium ein Agar-Medium. - 9 -

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Schale und der Deckel rund und der Deckel hat einen zumindest geringfügig grösseren

Innendurchmesser als der Aussendurchmesser der Schale, so dass zum Schliessen der Schale der Deckel über die Schale stülpbar ist.

Um eine typischerweise gewünschte aerobe Inkubation zu ermöglichen sowie einen Kontakt zwischen Filter zund Deckel zu verhindern, sind Schale und Deckel bevorzugt so beschaffen, dass der Deckelboden nicht direkt auf dem Rand der Schale aufliegt. Dies kann auf verschiedene Weisen realisiert werden. Beispielsweise kann der Rand der Schale mindestens 3 Erhebungen aufweisen, auf denen der Deckel aufliegt.

Dadurch liegt der Deckel stabil auf, hat aber durch die Erhebungen einen Abstand zum eigentlichen Rand der Schale. Eine derartige

Ausführungsform ist in Abbildung 1A schematisch dargestellt. Die

Abbildung zeigt die runde Schale, auf deren Rand oben vier Erhebungen sind. Eine der vier Erhebungen ist in der Abbildung zum besseren

Verständnis mit der Zahl„1" markiert. Wird nun ein Deckel auf eine solche Schale aufgelegt, erzeugen die Erhebungen einen Abstand zwischen dem Deckelboden und dem Rand der Schale.

In einer weiteren Ausführungsform kann die Wand der Schale

Vorrichtungen wie einen inneren oder äußeren Wulst oder ein oder mehrere Halterungen aufweisen, auf denen der Rand des Deckels aufliegt. Ist die Höhe der Deckelwand nun höher als die Höhe der Wand der Schale über dem Wulst oder der Halterung, liegt der Boden des Deckels nicht auf dem Rand der Schale auf.

In einer Ausführungsform ist der Wulst als außenliegende kreisförmige Rille ausgebildet, in die der Deckel eingreift. Eine derartige Ausführungsform ist schematisch in Abbildung 1 B dargestellt. Die Abbildung zeigt einen Schnitt durch die Schale bestehend aus Wand (2) und Boden (3). Außen an der Wand (2) befindet sich ein Wulst (4), der ringförmig um die gesamte Wand - 10 - verläuft. In die dadurch entstehende Aussparung bzw. Rille (5) kann der Deckel eingreifen. Wird die Wand des Deckels nun entsprechend hoch gewählt, liegt der Deckelboden nicht auf dem Rand der Schale auf.

In einer anderen Ausführungsform ermöglichen außenliegende Halterungen nicht nur den Abstand zwischen Deckelboden und Schalenrand sondern bewirken zusätzlich noch eine Arretierung des Deckels. Dafür können die Halterungen beispielsweise als nach außen abragende Rastnasen,

Flansche, gewindeartige Teile, Kombinationen unterschiedlicher

Eingriffsmittel oder dergleichen ausgeführt sein. Derartige verschließbare Petrischalen sind beispielsweise bekannt aus WO 2008/141597.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zum

Nachweis von Keimen in Flüssigkeiten oder Gasen, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte

a) Filtration der Flüssigkeit oder des Gases durch einen Filter b) Aufbringen des Filters auf das Medium einer

erfindungsgemäaßen Petrischale

c) Verschließen der Petrischale mit dem Deckel

d) Inkubation der verschlossenen Petrischale aus Schritt c) e) Auswertung des Keimwachstums

Das generalle Verfahren zur Untersuchung flüssiger oder gasförmiger Proben durch Filtration und anschließende Inkubation des Filters in einer Petrischale ist dem Fachmann bekannt. Flüssigkeiten sind dabei

insbesondere Wasser, Getränke, flüssige Lebensmittel oder flüssige

Kosmetikartikel. Das am meisten untersuchte Gas ist Luft, z.B. in der Pharma oder Getränke und/oder Lebensmittelproduktion.

Typischerweise wird das Verfahren wie folgt durchgeführt.

1. Bereitstellung von Filter und Petrischale - 11 -

Erfindungsgemäß wird dabei eine Pertischale bereitsgestellt, die

mindestens bis 1 mm unter den Rand, höchstens bis zum Rand mit

Medium gefüllt ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind Filter und Petrischale rund geformt.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Durchmesser im Inneren der Petrischale 2 bis 10 mm, bevorzugt 1 bis 8 mm größer als der Durchmesser des Filters. Auf diese Weise kann eine Petrischale mit möglichst kleinem Durchmesser verwendet werden. Für Filter mit einem Durchmesser von 47 mm sind so beispielsweise Petrischalen mit einem Durchmesser von 55 mm geeignet.

Weitere notwendige und bevorzugte Eigenschaften von Petrischale und Filter wurden bereits oben offenbart. 2. Der Filter wird in einen Trichter oder eine andere Vorrichtung zum

Filtrieren von Flüssigkeiten oder Gasen eingebracht.

Derartige Vorrichtungen sind dem Fachmann bekannt. Beispiele für

Vorrichtungen zum Filtrieren von Flüssigkeiten finden sich in

WO2008113443 und den dort zitierten Dokumenten.

Typischerweise werden zwischen 50 und 500 ml, bevorzugt zwischen 100 und 250 ml der Flüssigkeit durch den Filter gegeben. Dabei bleiben die

Keime auf dem Filter hängen.

3. Entfernen des Filters aus der Filtrationsvorrichtung.

Optional kann der Filter vor der Entnahme aus der Filtrationsvorrichtung gespült werden, um mögliche störende Einflüsse der ursprünglichen

Flüssigkeit bei dem folgenden Nachweis der Keime auszuschließen.

4. Einbringen des Filters in die Petrischale

Der Filter wird typischerweise mit einer sterilen Pinzette auf das Medium der geöffneten Petrischale gegeben. Dann wird die Schale mit dem Deckel verschlossen. - 12 -

5. Die verschlossene Petrischale wird inkubiert

Dazu wird die Petrischale typischerweise in einen Inkubator gestellt.

Inkubationszeit und Inkubationstemperatur sind für verschiedene

Keimsorten unterschiedlich. Die Inkubationszeiten betragen typischerweise zwischen 12 und 48 Stunden. Die Temperaturen liegen typischerweise um 36°C. Für E. coli/Coliforme auf einem chromogenen Coliformen Agar liegen die Inkubationszeiten beispielsweise bevorzugt zwischen 18 und 24

Stunden bei ca. 36°C. Der Fachmann ist in der Lage, die Temperatur und die Inkubationszeiten auf die jeweils nachzuweisenden Keime anzupassen.

6. Auswertung des Keimwachstums

Nach erfolgter Inkubation können die Platten aus dem Inkubator entfernt und ausgewertet werden. Dies kann visuell erfolgen oder mit geeigneten Geräten. Methoden zur Auswertung sind dem Fachmann bekannt. Die

Auswertung des Keimwachstums kann durch Zählen der gebildeten Keim- Kolonien erfolgen und/oder durch Auswertung weiterer Merkmale.

Typischerweise erfolgt eine Auszählung der gebildeten Kolonien auf dem Agar. Werden beispielsweise 20 Kolonien auf dem Agar gefunden, geht man davon aus, dass 20 Keime aus der Probe gefiltert wurden. Je nach eingesetztem Probenvolumen kann man daraus die Keimzahl pro

Volumeneinheit berechnen. Die Auswertung weiterer Merkmale umfasst die Detektion einer Farbänderung, beispielsweise aufgrund einer Änderung des pH-Wertes oder der Verstoffwechselung eines chromogenen Substrates. Die Auswertung weiterer Merkmale kann aber auch die Isolierung eines oder mehrerer Keime und deren Identifizierung mit weiteren Tests wie z.B. PCR oder Antikörper-basierten Tests bedeuten.

Somit stellt die vorliegende Erfindung eine wesentliche Verbesserung der Bestimmung von Keimen in Flüssigkeiten oder Gasen mittels Filtration zur Verfügung. Durch durch die einfache Erhöhung des Medienfüllstands der - 13 -

Petrischalen wird die Handhabung deutlich vereinfacht. Zudem kann die Größe der Petrischalen im Verhältnis zum Filter verringert werden.

Die voranstehend erörterten Ausführungsbeispiele nebst Abbildungen dienen lediglich der beispielhaften Erörterung der beanspruchten Lehre, schränkt diese jedoch nicht auf die Ausführungsbeispiele ein. Auch ohne weitere Ausführungen wird davon ausgegangen, dass ein Fachmann die obige Beschreibung im weitesten Umfang nutzen kann. Die vollständige Offenbarung aller vor- und nachstehend aufgeführten Anmeldungen, Patente und Veröffentlichungen, insbesondere der korrespondierenden Anmeldung EP 14002840.8, eingereicht am 14. August 2014, ist durch Bezugnahme in diese Anmeldung eingeführt.