COMPOSICIóN FARMACéUTICA QUE COMPRENDE LA PROTEíNA NMB0873.

Campo de Ia técnica La presente invención está relacionada con Ia rama de Ia medicina, particularmente con el desarrollo de una composición farmacéutica, de aplicación preventiva o terapéutica, que permite un aumento en Ia calidad de Ia respuesta inmune contra antígenos vacunales característicos de enfermedades de origen diverso.

Estado de Ia técnica anterior

Neisseria meningitidis, un diplococo Gram negativo cuyo único hospedero es el hombre, es el agente causal de Ia enfermedad meningocóccica. Usualmente esta bacteria se encuentra en Ia nasofaringe de personas que son portadores asintomáticos, siendo esta Ia vía más común para su aislamiento microbiológico. En el mundo los niños menores de 2 años de edad son Ia población más susceptible a contraer Ia meningitis meningocóccica, sin embargo, los adolescentes jóvenes y Ia población de adultos mayores también pueden ser afectados. La enfermedad meningocóccica sin tratamiento es fatal en Ia mayoría de los individuos afectados, y Ia vacunación podría prevenir esta situación evitando incluso Ia colonización bacteriana.

Diversas estrategias se han desarrollado con el objetivo de obtener un preparado vacunal que satisfaga los requisitos necesarios para proteger a Ia población contra esta enfermedad. Para ello se han tenido en cuenta los antígenos capsulares cuya especificidad inmunológica ha permitido Ia clasificación de este microorganismo en serogrupos. En Ia actualidad se han definido cinco de estos serogrupos como los responsables de Ia mayoría de los casos de enfermedad meningocóccica en el mundo. El serogrupo A es el principal responsable de las epidemias en áfrica subsahariana. Los serogrupos B y C están asociados a Ia mayor parte de los casos que ocurren en los países desarrollados. Los serogrupos Y y W135 están presentes en Ia mayoría de los casos remanentes de Ia enfermedad y de infección prevalente en algunas regiones de los Estados Unidos, con un marcado incremento en los últimos años. De ahí que los polisacáridos capsulares hayan sido objeto de estudio y evaluación como candidatos vacunales. Una vacuna tetravalente, basada en polisacáridos, que confiere protección contra los serogrupos A, C, Y, y W-135 ha

sido licenciada en los Estados Unidos. Los anticuerpos que son generados tras Ia vacunación son serogrupo- específico (Rosenstein N. et al. (2001 ). Meningococcal disease. N. Engl. J. Med 344: 1378-1388). El serogrupo B, a diferencia del resto, continúa siendo una importante causa de enfermedad meningocóccica endémica y epidémica, en gran parte debido a Ia no existencia de vacunas efectivas contra el mismo. Se ha visto que el polisacárido del serogrupo B posee una baja inmunogenicidad, además del riesgo potencial que existe de que vacunas basadas en este compuesto puedan desarrollar inmunotolerancia y/o inducir autoinmunidad dada su homología estructural con cadenas oligosacarídicas presentes en estructuras fetales humanas (Finne J. et al. (1987). An IgG monoclonal antibody to group B meningococci cross-reacts with developmentally regulated polysialic acid units of glycoproteins in neural and extraneural tisúes. J. Immunol 138: 4402-4407). Por este motivo, el desarrollo de vacunas contra el serogrupo B se ha concentrado en el uso de antígenos subcapsulares.

Vacunas de vesículas y proteínas de membrana externa

En Ia década de los años 70 Ia producción de vacunas de proteínas de membrana externa (PME), estuvo basada en Ia eliminación del lipopolisacárido (LPS) de las preparaciones proteicas mediante Ia utilización de detergentes (Frasch CE and Robbins JD. (1978). Protection against group B meningococcal disease. III. Immunogenicity of serotype 2 vaccines and specificity of protection in a guinea pig model. J Exp Med 147(3): 629-44). Después, las PME fueron precipitadas para producir agregados resuspendidos en cloruro de sodio. A pesar de los buenos resultados obtenidos en estudios realizados en animales, estas vacunas no indujeron anticuerpos bactericidas ni en adultos ni en niños (Zollinger WD, et al. (1978). Safety and immunogenicity of a Neisseria meningitidis type 2 protein vaccine in animáis and humans. J. Infecí Dis 137(6):728-39), resultado que fue atribuido a Ia desnaturalización de las proteínas presentes en Ia preparación, como resultado de Ia precipitación. Los próximos pasos en Ia búsqueda de un nuevo candidato fueron: diseñar una vacuna que presenta las proteínas en su conformación nativa formando VME (Zollinger WD, et al. (1979). Complex of meningococcal group B polysaccharide and type 2 outer membrane protein immunogenic in man. J. Clin. Invest. 63(5): 836-48; Wang LY and Frasch CE. (1984). Development of a Neisseria

meningitidis group B serotype 2b protein vaccine and evaluation in a mouse model. Infecí Immun. 46(2):408-14136).

Las vacunas compuestas por vesículas de membrana externa fueron significativamente más inmunogénicas por vía parenteral que los agregados de PME, y esta inmunogenicidad fue explicada inicialmente por una mayor adsorción al adyuvante hidróxido de aluminio (Wang LY and Frasch CE. (1984). Neisseria meningitidis group B serotype 2b protein vaccine and evaluation in a mouse model. Infecí Immun. 46(2): 408-14136). Varios estudios de eficacia se han llevado a cabo utilizando vacunas basadas en VME, en diferentes formulaciones. Las dos vacunas más ampliamente estudiadas fueron desarrolladas en los años 80, en respuesta a brotes de Ia enfermedad meningocóccica en Cuba (Sierra GV eí al. (1991 ). Vaccine against group B Neisseria meningiíidis: protection trial and mass vaccination resuits in Cuba. NIPH Ann Dis. 14(2): 195-210) y Noruega (Bjune G, eí al. (1991). Effect of outer membrane vesicle vaccine against group B meningococcal disease in Norway. Lanceí 338(8775):1093-6), respectivamente. La vacuna producida por el Instituto Finlay en Cuba (comercialmente denominada VA-MENGOC-BC ^® ) es producida a partir de Ia cepa B:4,7:P1.19,15 y está compuesta por una preparación de VME de dicha cepa y polisacárido capsular aislado del serogrupo C, adsorbidas a hidróxido de aluminio (Sierra GV et al. 1991. Vaccine against group B Neisseria meningifidis: protection trial and mass vaccination resuits in Cuba. NIPH Ann Dis. 14(2):195-210). Esta vacuna contribuyó a un rápido descenso de Ia epidemia en Cuba (Rodríguez AP, eí al. (1999). The epidemiological impact of antimeningococcal B vaccination in Cuba. Mem Inst Oswaldo Cruz. 94(4):433-40). La vacuna producida por el Instituto Nacional de Salud Pública de Noruega (NIPH) fue inicialmente utilizada durante un período hiperendémico de Ia enfermedad causada por una cepa perteneciente al clon ET-5 (B:15:P1.7,16). Esta vacuna monovalente también fue producida a partir de VME purificadas y adsorbidas a hidróxido de aluminio (Bjune G, eí al. (1991 ). Effect of outer membrane vesicle vaccine against group B meningococcal disease in Norway. Lancei. 338(8775): 1093-6).

Las vacunas de VME parecen ser efectivas en Ia presentación de las PME, dispuestas en su conformación natural, para permitir Ia generación de anticuerpos bactericidas, al menos en adolescentes y adultos. Las respuestas de anticuerpos

generadas incrementaron Ia opsonofagocitosis del meningococo. La formulación precisa de las vacunas (por ejemplo: contenido de PME ₁ contenido de LPS y Ia presencia o ausencia del adyuvante) tiene un significativo impacto en Ia inmunogenicidad, existiendo grandes diferencias de un productor a otro según Ia cepa y/o Ia metodología empleada (Lehmann AK, et al. (1991 ). Immunization against serogroup B meningococci. Opsonin response in vaccinees as measured by chemiluminescence. APMIS. 99(8):769-72; Gómez JA, et al. (1998). Effect of adjuvants in the isotypes and bactericidal activity of antibodies against the transferrin-binding proteins of Neisseria meningitidis. Vaccineλ Q (17): 1633-9 ; Steeghs L, et al. (1999). Immunogenicity of Outer Membrane Proteins in a Lipopolysaccharide-Deficient Mutant of Neisseria meningitidis: Influence of Adjuvants on the Immune Response. Infecí Immun. 67(10):4988-93). Sin embargo, el perfil antigénico de los aislamientos obtenidos de pacientes cambia rápidamente y una vacuna abarca sólo un limitado número de cepas, por tanto puede ser inefectiva en unos años, si las cepas que Ia componen no se corresponden con Ia epidemia local existente.

Hasta el momento, las vacunas de VME han sido más utilizadas que cualquier otra vacuna del serogrupo B y son útiles en el contexto de los brotes de Ia enfermedad causada por un solo tipo de cepa. Los inmunógenos responsables de Ia reactividad cruzada inducida por este tipo de preparados no han sido completamente caracterizados, y muchos antígenos presentes en estos preparados restan por ser identificados. Estudios realizados con los sueros provenientes de ensayos clínicos del Instituto Finlay y el NIPH, sugieren que los anticuerpos contra Ia proteína de clase 1 (P1 , también llamada PorA) y Opc (otra PME mayoritaria) (Wedege E, et al. (1998). Immune Responses against Major Outer Membrane Antigens of Neisseria meningitidis in Vaccinees and Controls Who Contracted Meningococcal Disease during the Norwegian Serogroup B Protection Trial. Infecí Immun. 66(7): 3223-31 ), son importantes mediadores de Ia actividad bactericida del suero (fundamentalmente P1 ) y en ambas proteínas se observó una marcada variabilidad de cepa a cepa.

La proteína P1 es un antígeno con un significativo nivel de variabilidad, el cual parece experimentar variación continua entre y durante los brotes (Jelfs J, eí al. (2000). Sequence Variation in the porA Gene of a Clone of Neisseria meningitidis during Epidemic Spread. Clin Diagn Lab Immunol. 7(3):390-5). Hacia este antígeno

van dirigidos predominantemente los anticuerpos bactericidas después de Ia vacunación y después de Ia enfermedad. Sin embargo su variabilidad hace cuestionable que Ia protección producto de Ia inmunización con vacunas de VME de una sola cepa (monovalentes) sea de amplio espectro. Para resolver este problema, se desarrolló una vacuna de VME en Holanda (RIVM) que contenía P1 de seis aislamientos patogénicos diferentes (van der Ley P and Poolman JT. (1992). Construction of a multivalent meningococcal vaccine strain based on the class 1 outer membrane protein. Infecí Immun. 60(8):3156-61 ; Claassen I ₁ et al. (1996). Production, characterization and control of a Neisseria meningitidis hexavalent class 1 outer membrane protein containing vesicle vaccine. Vaccine 14 (10):1001-8). En este caso las vesículas fueron extraídas de dos variantes de Ia cepa H44/76, genéticamente manipulada para expresar tres proteínas P1 independientes. La búsqueda de un antígeno universal Aunque las PME pueden inducir una respuesta inmune funcional contra el serogrupo B, ninguna de las vacunas confiere una protección universal, debido a Ia gran heterogeneidad de las regiones expuestas en Ia superficie de las PME. La discreta reactividad cruzada inducida por las vacunas de VME ha incentivado Ia búsqueda de un antígeno de membrana extema (o de un grupo de antígenos), que induzca anticuerpos funcionales y esté presente en todas las cepas del meningococo. Estos antígenos deben ser Ia base para una vacuna antimeningocóccica realmente universal, Ia cual eliminará el potencial problema de Ia modificación capsular en las cepas patogénicas, después de Ia vacunación con polisacárido. Debido a Ia variabilidad de Ia proteína inmunodominante P1 , su uso en una vacuna universal está limitado y por tanto otras PME mayoritarias fueron consideradas candidatos para una vacuna y muchas de ellas se encuentran en desarrollo. Algunas de las que han sido incluidas son: proteínas reguladas por hierro (TbpA y B, FbpA y FetA), NspA y proteínas de clase 5 (Opc). TbpB forma parte del complejo de unión de transferrina, junto con TbpA. Recientes trabajos sugieren que Ia TbpA tiene una función más importante en Ia unión al hierro (Pintor M, et al. (1998). Analysis of TbpA and TbpB functionality in defective mutants of Neisseria meningitidis. J Med Microbiol 47(9): 757-60) y es un inmunogéno más efectivo que Ia TbpB. La proteína NspA, una PME minoritaria, altamente conservada, ha sido descubierta a través de una técnica novedosa, Ia que consiste en emplear combinaciones de

PME provenientes de diferentes cepas para inmunizar ratones (Martin D, et al. (1997). Highly Conserved Neisseha meningitidis Surface Protein Confers Protection against Experimental Infection. J Exp Med 185 (7): 1173-83). Para producir hibridomas se utilizaron células B de ratones inmunizados, y los mAbs se examinaron para detectar Ia reactividad cruzada contra múltiples cepas del meningococo. Como resultado se encontró un anticuerpo monoclonal con reactividad cruzada que reconoció una PME de 22 kDa y fue designada como NspA. La inmunización de ratones con NspA indujo respuesta de anticuerpos bactericidas contra cepas de los grupos A hasta C. Esta proteína también protege contra Ia infección meningocóccica letal (Martin D, et al. (1997). Highly Conserved Neissería meningitidis Surface Protein Confers Protection against Experimental Infection. J Exp Med 185 (7): 1173-83). La comparación de secuencias de NspA genéticamente divergentes, demostró que Ia proteína está altamente conservada (97% homología) (Cadieux N, et al. (1999). Bactericidal and Cross-Protective Activities of a Monoclonal Antibody Directed against Neisseria meningitidis NspA Outer Membrane Protein. Infect Immun 67 (9): 4955-9).

La presencia de NspA se detectó por ELISA en un 99.2% de las cepas evaluadas pertenecientes a los serogrupos desde Ia A hasta Ia C, utilizando anticuerpos monoclonales (Martin D ₁ et al. (1997). Highly Conserved Neisseria meningitidis Surface Protein Confers Protection against Experimental Infection. J Exp Med 185 (7): 1173-83). Se ha comprobado que estos anticuerpos monoclonales presentan actividad bactericida contra numerosas cepas del meningococo y son capaces de reducir Ia bacteriemia provocada por este microorganismo en un modelo murino (Cadieux N, et al. (1999). Bactericidal and Cross-Protective Activities of a Monoclonal Antibody Directed against Neissería meningitidis NspA Outer Membrane Protein. Infect Immun 67 (9): 4955-9). Aunque estos resultados sugieren que Ia NspA es un prometedor candidato vacunal capaz de conferir protección contra varios serogrupos, un suero policlonal de ratón contra Ia proteína recombinante no se asoció a Ia superficie en un 35% de las cepas de meningococo del serogrupo B, a pesar de Ia presencia del gen nspA en estos organismos (Moe GR et al. (1999). Differences in Surface Expression of NspA among Neisseria meningitidis Group B Strains. Infect Immun 67 (11 ): 5664-75).

Secuenciación del genoma de Neissería meningitidis y su impacto en el desarrollo de vacunas.

La secuenciación del genoma de MC58, una cepa de meningococo del serogrupo B (Tettelin H, et al. (2000). Complete Genome Sequence of Neisseria meningitidis Serogroup B Strain MC58. Science 287 (5459): 1809-15172), y de Z2491 , una cepa de serogrupo A (Parkhill J, eí al. (2000). Complete DNA sequence of a serogroup A strain of Neisseria meningitidis Z2491. Nature 404 (6777):502-6173), fueron publicadas durante el año 2000. La disponibilidad de las secuencias de ADN ha tenido una gran influencia en Ia investigación de una vacuna antimeningocóccica. Mientras Ia secuenciación del genoma de MC58 continuaba su desarrollo, Pizza y colaboradores comenzaron identificando los marcos abiertos de lectura (ORFs) que según las predicciones codificaban para las proteínas expuestas en Ia superficie, las unidas a membrana y las que se exportan. Este grupo de investigadores identificó 570 ORFs, amplificados a través de Ia reacción en cadena de la polimerasa y los clonó en Escherichia coli, para permitir Ia expresión de proteínas de fusión con cola de histidina o glutatión S-transferasa (Pizza M, et al. (2000). Identification of Vaccine Candidates Against Serogroup B Meningococcus by Whole-Genome Sequencing. Science 287 (5459): 1816-20). El 61 % (350) de los ORFs seleccionados fueron expresados exitosamente. En Ia mayoría de los casos, aquellos que no lograron expresarse tenían más de un dominio hidrofóbico de transmembrana. Las proteínas recombinantes fueron purificadas y se utilizaron para inmunizar ratones. Los sueros obtenidos fueron evaluados por ELISA, citometría de flujo y se les determinó Ia actividad bactericida contra 2 cepas. Posteriormente se seleccionaron 7 proteínas que en los 3 ensayos resultaron positivas. Las formulaciones vacunales empleando algunas de estas proteínas combinadas con adyuvantes, indujeron títulos significativos de anticuerpos bactericidas contra Ia cepa homologa (MC58), pero ninguno de ellos fue tan alto como los inducidos por una vacuna de VME de esta misma cepa (Giuliani MM, et al. 2000. Proceedings 12th IPNC. p. 22). Por otro lado, existen evidencias de que combinaciones de estas proteínas resultan más inmunogénicas que cada proteína por separado (Santini L. eí al. (2000). Proceedings 12th IPNC. p. 25). Los numerosos ORFs excluidos en ese trabajo, por Ia falta de Ia expresión proteica o por modificaciones de las propiedades inmunológicas, necesitan una investigación más profunda.

Los componentes de una vacuna deben seleccionarse en base a Ia contribución de los antígenos en Ia patogénesis de N. meningitidis. Los antígenos por sí solos

pueden ser efectivos candidatos vacunales, o alternativamente, los mutantes atenuados pueden ser considerados integrantes de una vacuna. Un importante problema de Ia prevención y/o Ia terapia de Ia enfermedad meningocóccica es que ninguna de las vacunas disponibles hasta Ia fecha confiere una protección universal, debido a Ia gran heterogeneidad de los antígenos del meningococo que se han empleado como vacuna.

Explicación de Ia invención

Esta invención contribuye a resolver el problema antes mencionado al proporcionar composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína cuya secuencia está altamente conservada, incluso entre diferentes géneros de microorganismos patógenos. El objetivo técnico que se persigue con esta invención es precisamente el desarrollo de composiciones capaces de elevar y/o ampliar Ia respuesta inmune sistémica y mucosal del hospedero contra varios patógenos, o contra un espectro amplio de variedades del mismo. Se reportan, por primera vez, composiciones farmacéuticas, de carácter terapéutico o preventivo, que comprenden Ia proteína NMB0873.

Más particularmente, Ia invención se refiere a composiciones farmacéuticas para prevenir o tratar cualquier infección provocada por una bacteria del género Neissería, que comprenden dicha proteína. En una realización particular de Ia invención, las composiciones farmacéuticas que comprenden dicho antígeno son útiles para Ia prevención o el tratamiento de enfermedades causadas por N. meningitidis y N. gonorrhoeae. Particularmente, es objeto de Ia presente invención una composición farmacéutica donde Ia proteína NMB0873 está presente en un rango entre 0.5-100 μg/dosis, en un excipiente farmacéuticamente aceptable. Dicha composición comprende, opcionalmente, un adyuvante vacunal, capaz de potenciar Ia respuesta inmune contra el principio activo, Ia proteína NMB0873. En otra materialización de Ia invención, las composiciones farmacéuticas que comprenden Ia proteína NMB0873, contienen también uno o varios antígenos de naturaleza sintética, recombinante o natural. En una realización preferida, las composiciones farmacéuticas combinadas contienen antígenos polisacarídicos, incluyendo los polisacáridos bacterianos. Más particularmente, Ia invención se refiere a los polisacáridos capsulares de N. meningitidis. La composición farmacéutica de Ia presente invención puede contener conjugados proteína-

polisacárido, cuyo componente polisacarídico se corresponda con un polisacárido bacteriano.

En otra realización preferida, Ia composición farmacéutica que comprende

NMB0873, contiene además antígenos de naturaleza peptídica, con el fin de ampliar el espectro de protección de dicha composición.

Esta invención revela una composición farmacéutica que se caracteriza por ser una vacuna capaz de generar en el organismo receptor una respuesta protectora contra infecciones causadas por bacterias del género Neisseria. Más particularmente, Ia composición farmacéutica de Ia presente invención es una vacuna capaz de generar en el organismo receptor una respuesta protectora contra infecciones causadas por Neisseria meningitidis o Neisseria gonorrhoeae. Las composiciones de Ia presente invención son administradas por ruta parenteral, o por ruta mucosal, incluyendo Ia administración por vía oral. En otra materialización de Ia invención, Ia proteína NMB0873 puede ser empleada combinada o fusionada con otros antígenos. En esas composiciones Ia proteína actúa como inmunopotenciadora o portadora de péptidos, polisacáridos u otros antígenos de menor inmunogenicidad, con el fin de potenciar Ia respuesta inmune contra los mismos. Ei Ejemplo 12 ilustra que Ia proteína mencionada anteriormente es capaz de elevar significativamente los niveles de anticuerpos contra un péptido derivado de un antígeno viral, una vez que han sido conjugadas ambas moléculas. También es parte de Ia presente invención, que los determinantes protectores para un antígeno proteico dado sean insertados dentro de Ia secuencia de Ia proteína NMB0873, con el fin de inducir una repuesta inmune imcrementada contra los mismos, dando lugar a proteínas híbridas que formen parte de una composición farmacéutica.

En otra realización preferida, las composiciones farmacéuticas de Ia presente invención pueden contener fragmentos de Ia proteína NMB0873, que sean capaces de generar en el hospedero una respuesta protectora contra el meningococo u otra bacteria del género Neisseria, en presencia de excipientes farmacéuticamente aceptables. En una realización particular de Ia invención, las composiciones farmacéuticas contienen mimotopos o péptidos miméticos de Ia proteína NMB0873, en forma sintética u obtenidos mediante tecnología del ADN recombinante. El término "mimotopo" significa cualquier péptido que sea capaz de generar

anticuerpos que se combinen con Ia proteína NMB0873, y por esa vía sean capaces de producir una respuesta protectora contra Neisseha.

También es parte de Ia presente invención, un método para el diagnóstico de Ia infección causada por bacterias del género Neisseria que comprende Ia detección de Ia proteína NMB0873, o sus fragmentos, o del gen codificante para Ia proteína NMB0873, identificado como Seq. ID. No 3, de forma independiente o en conjunto con otros componentes, dentro de una muestra biológica obtenida de un individuo.

Breve descripción de las figuras Figura 1. Vector pM238 empleado en el clonaje y Ia expresión de Ia proteína NMB0873.

Figura 2. Construcción final obtenida del clonaje de Ia secuencia nucleotídica correspondiente al gen NMB0873 en el vector pM238. Figura 3. Análisis mediante SDS-PAGE de las fracciones obtenidas en Ia ruptura celular; carril 1 : patrón de peso molecular (PM); carril 2: Control de expresión de Ia proteína NMB0873 (Mi); carril 3: Sobrenadante de ruptura (SR); carril 4: Precipitado de ruptura (PR); carril 5: Control no relacionado de Ia expresión (NR).

Figura 4. Análisis de Ia pureza de las diferentes fracciones del proceso de purificación de Ia proteína recombinante NMB0873, mediante SDS-PAGE: Carril 1 : Sobrenadante de solubilización (S6M); carril 2, fracción no adsorbida (pass); carril 3: fracción eluida con un tampón que contiene 10 mM Imidazol (1OmM); carril 4: fracción eluida con un tampón que contiene 100 mM Imidazol (10OmM); carril 5: fracción eluida con tampón que contiene 300 mM Imidazol (30OmM); carril 6: fracción eluida con tampón que contiene 1 M Imidazol (1M) ; carril 7: Patrón de peso molecular. Figura 5. Niveles de anticuerpos (IgG) contra Ia proteína recombinante NMB0873, obtenidos al inmunizar ratones con el mismo antígeno adyuvado con hidróxido de Aluminio (Alum); Adyuvante de Freund (Freund), o mezclada con el polisacárido del serogrupo C (PoIiC) de N. meningitidis, por vía subcutánea. Se representan los resultados obtenidos en un ensayo tipo ELISA, que fueron expresados como el inverso del título, calculado como Ia dilución de Ia muestra (sueros individuales) donde se triplica Ia densidad óptica de Ia muestra de suero preinmune. Figura 6. Reconocimiento de determinantes antigénicos presentes en las PME de N. meningitidis, cepa H44/76 (serogrupo B) y cepa de serogrupo A, utilizando sueros de ratones inmunizados con Ia proteína recombinante NMB0873 adyuvada con

hidróxido de Aluminio (Alum); Adyuvante de Freund (Freund), o mezclada con el polisacárido del serogrupo C (PoIiC), por vía subcutánea. Los resultados fueron expresados como el inverso del título, calculado como Ia dilución del suero (mezcla de sueros por grupo) donde se duplica Ia densidad óptica del suero preinmune. Figura 7. Resultados de Ia búsqueda de similitud entre el gen que codifica para Ia proteína NMB0873 ("query") y las secuencias anotadas de los genomas de diferentes serogrupos de N. meningitidis ("Sbjct") empleando el programa BLAST. Figura 8. Reconocimiento de antígenos presentes en 3 cepas de N. meningitidis, por sueros producidos después de Ia inmunización con Ia proteína recombinante NMB0873 adyuvada con hidróxido de Aluminio (Alum); Adyuvante de Freund (Freund), o mezclada con el polisacárido del serogrupo C (PoIiC) por vía subcutánea: B385 (serogrupo B); H44/76 (serogrupo B, B:15:P1.7,16); y Nme C (serogrupo C, C:2a:P1.5). Los resultados fueron expresados como el inverso del título, calculado como Ia dilución del suero (mezcla de sueros por grupo) donde se duplica Ia densidad óptica del suero preinmune.

Figura 9. Experimento de protección pasiva contra infección meningocóccica en el modelo de rata infante, utilizando los sueros obtenidos inmunizando con Ia proteína recombinante NMB0873 adyuvada con hidróxido de Aluminio; Freund y mezclada con el polisacárido C (PoIiC) de N. meningitidis. Para Ia infección se utilizó Ia cepa Z4181.C-: mezcla de sueros de animales no tratados, C+: suero de ratón inmunizado con vesículas de membrana externa de N. meningitidis de Ia cepa Z4181. El símbolo ^* * representa una diferencia estadísticamente significativa respecto al grupo control negativo (C-), en cuanto a los niveles de bacteremia expresados como unidades formadoras de colonias por mililitro (ufc/ml). Figura 10. Reconocimiento de Ia proteína recombinante NMB0873 y de un panel de antígenos no relacionados, por los mAbs generados (mAbs B10/22, H3/86 y D6/30). Antígenos: P1 , proteína de clase 1 de N. meningitidis cepa B:4:P1.15; P64k, proteína P64k de N. meningitidis; TT, toxoide tetánico; HBsAg, antígeno de superficie del virus de Ia Hepatitis B. Los resultados se representan como Ia absorbancia (492nm) en un ensayo tipo ELISA.

Figura 11. Reconocimiento de Ia proteína recombinante NMB0873 por sueros de pacientes convalecientes de Ia enfermedad meningocóccica. Como control negativo se emplearon sueros de donantes sanos. Los resultados se representan como Ia absorbancia (492nm) en un ensayo tipo ELISA.

Figura 12. Títulos de anticuerpos anti-péptido JY1 correspondientes a los sueros de los animales inmunizados con el péptido libre (JY1 ), Ia proteína recombinante (NMB0873) y el conjugado JY1-NMB0873.

Figura 13. Niveles de anticuerpos (IgA) contra Ia proteína recombinante NMB0873 presentes en muestras de lavados pulmonares de ratones inmunizados por vía intranasal con Ia proteína mezclada con polisacárido C de N. meningitidis (NMB0873+PsC) o con Ia proteína incorporada en liposomas (NMB0873_Lip).

Exposición detallada de modos de realización / Ejemplos de realización

Ejemplo 1. Detección de Ia proteína NMB0873 en preparaciones de vesículas de membrana externa de Neisseria meningitidis, serogrupo B.

Con el objetivo de estudiar las proteínas presentes en preparaciones de vesículas de membrana externa de N. meningitidis serogrupo B (cepa CU385, clasificación B:4:P1.19,15), se realizó una electroforesis bidimensional según Io descrito en Ia literatura (Sabounchi-Schutt F, et al. (2000). An immobiline DryStrip application method enabling high-capacity two-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis 21 : 3649-3656. A continuación se realizó una digestión enzimática de las proteínas extraídas del gel empleando Ia enzima tripsina (Promega, Madison, Wl, E.U). Los péptidos generados durante Ia digestión fueron extraídos de Ia solución empleando microcolumnas (ZipTips, Miliipore, MA, E.U). Previo al análisis por espectrometría de masas los péptidos fueron eluídos de las microcolumnas con solución de acetonitrilo al 60% y 1 % de ácido fórmico e inmediatamente Ia mezcla se cargó en nanoagujas (Protana, Dinamarca). Las mediciones se realizaron en un espectrómetro de masas híbrido con cuadrupolo y tiempo de vuelo (QTof-2™, Manchester, Reino Unido), equipado con una fuente de ionización (nanoESI). Los espectros de masas fueron adquiridos en un rango de m/z desde 400 hasta 2000 en 0.98 segundos y utilizando 0.02 segundos entre cada uno de los barridos. La adquisición y procesamiento de los datos fue realizada a través del programa MassLynx (versión 3.5, Micromass).

La identificación de proteínas basada en los espectros ESI-MS se realizó empleando el programa ProFound (Zhang W and Chait BT. (2000). ProFound: an expert system for protein identification using mass spectrometric peptide mapping ¡nformation. Anal Chem 72:2482-2489; http://prowl.rockefeller.edu/cgi-

bin/ProFound). La búsqueda se subscribió a las secuencias de genes y proteínas de bacterias contenidas en las bases de datos SwissProt (http://www.ebi.ac.uk/swissprot/) y NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), considerando Ia oxidación de metioninas, Ia desamidación y Ia carboxiamidometilación de cisternas como posibles modificaciones presentes.

La identificación de las proteínas basada en los espectros MS/MS se realizó a través del programa MASCOT (Perkins DN, eí al. (1999). Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophomsis 20:3551-3567. http://www.matrixscience.com/). Entre los parámetros de búsqueda se incluyó Ia modificación de cisteínas así como las posibles oxidaciones y desamidaciones.

A partir del análisis de los datos obtenidos de Ia identificación de las proteínas presentes en preparaciones de VME se seleccionó para evaluar como antígeno vacunal a Ia proteína NMB0873 de Ia cual fue identificado 1 péptido mediante espectrometría de masas.

Ejemplo 2. Análisis de homología de Ia proteína NMB0873 con productos génicos reportados en bases de datos.

Para el análisis de homología de Ia proteína NMB0873, se realizó una búsqueda de similitud de secuencias en Ia base de datos del NCBI empleando el programa BLAST ( Altschul SF, eí al. 1990. Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215:403-410, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Los resultados de este procedimiento señalaron como homólogos, además de a las correspondientes proteínas de otros serogrupos de Neisseria, a varios productos génicos de otros microorganismos, entre los cuales se encuentra Ia proteína LoIB de Escherichia coli, Ia cual ha sido bien caracterizada como integrante esencial de Ia maquinaria de exportación lipoproteica en esta bacteria (Matsuyama, S., N. Yokota, and H. Tokuda. 1997. A novel outer membrane lipoprotein, LoIB (HemM), involved In the LoIA (p20)- dependent localization of lipoproteins to the outer membrane of Escherichia coli. EMBO J. 16:6947-6955.; Yokota, N., T. Kuroda, S. Matsuyama, and H. Tokuda. 1999. Characterization of the LoIA-LoIB system as the general lipoprotein localization mechanism of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 274:30995-30999.; K. Tanaka, S. Matsuyama, and H. Tokuda. 2001. Deletion of lolB, Encoding an Outer Membrane Lipoprotein, Is Lethal for Escherichia coli and Causes Accumulation of

Lipoprotein Localization Intermediates in the Perípíasm. J. Biol. VoI. 183, No. 22, p.

6538-6542).

La conservación de esta proteína en el genoma de varios géneros microbianos, ha dado lugar a que se reúnan como grupo de proteínas ortólogas en un dominio conservado reportado en Ia NCBI (qnllCDDl5593 pfam03550, LoIB, Outer membrane lipoprotein LoIB), Io cual indica un común ancestro filogenético para todas ellas.

El análisis de Ia vecindad del gen que codifica para Ia proteína NMB0873 empleando Ia base de datos MBGD (Uchiyama, I. 2003. MBGD: microbial genome datábase for comparative análisis. Nucleic Acids Res. 31 , 58-62), reveló una significativa similitud en Ia organización génica con los genes de los microorganismos antes mencionados, Io que unido a los datos anteriores, nos conduce a confirmarlos como homólogos en los respectivos genomas. Basándonos en los datos anteriores, identificamos al producto del gen nmbO873 como Ia proteína LoIB de Neisseria meningitidis.

Ejemplo 3. Clonaje y expresión en Escheríchia coli del gen nmbO873, codificante para Ia proteína NMB0873 de Neisseria meningitidis.

Para realizar el clonaje y Ia expresión del gen nmbO873 se utilizó el vector pM238. Dicho vector permite realizar el clonaje empleando diferentes enzimas de restricción, y obtener elevados niveles de expresión de proteínas heterólogas en forma de cuerpos de inclusión en el citoplasma de E. coli.

El vector pM238 (Figura 1 ) cuenta con los siguientes elementos principales: promotor triptófano, secuencia correspondiente al segmento estabilizador N-terminal del antígeno P64k de N. meningitidis cepa CU385 (codificante para 47 a. a), secuencia que codifica para una cola de histidina C-terminal, secuencia correspondiente al terminador de Ia transcripción del bacteriófago T4 y secuencia correspondiente al gen que confiere resistencia a ampicillina como marcador de selección. Además, este vector permite Ia selección de los recombinantes mediante Ia coloración azul o blanca de las colonias, producto de Ia presencia del gen /acZ subunidad alfa.

A partir de Ia secuencia nucleotídica correspondiente al gen que codifica para Ia proteína NMB0873 se procedió a diseñar un par de oligonucleótidos (0873U y 0873L) para amplificar el segmento de dicho gen sin Ia secuencia que codifica para el péptido señal, utilizando el ADN genómico de Ia cepa B:4:P1.19,15.

Xba\ 0873U: 5 ^' CGTTTTCT AG ATCTCGCGC AATTACCTC ^' 3

(No. Identificación de secuencia: 1 )

0873L: 5 ^* TATCCCGGGATCCACCATATCTCGTG 3 ^'

BamH\ (No. Identificación de secuencia: 2)

Para Ia predicción del péptido señal se utilizaron los métodos descritos en el SignalP World Wide Web server (http://www.cbs. dtu.dk/services/SignalP-2.0). A continuación de Ia amplificación del gen de Ia proteína NMB0873 mediante Ia reacción en cadena de Ia polimerasa (RCP) (Randall K ₁ et al. 1988. Science 42394:487-491) utilizando los oligonucleótidos 0873U y 0873L, se digirió dicho producto de RCP empleando las enzimas Xba\ y BamH\, y se clonó en el vector pM-238 digerido previamente de Ia misma forma. La construcción final obtenida se muestra en Ia Figura 2, Ia proteína NMB0873 se obtiene fusionada con el segmento N-terminal de Ia P64k. La secuenciación del segmento del gen nmbO873 clonado se realizó empleando el secuenciador automático ALFexpressIl (Termo Sequenase™ Cy™ 5 Dye Terminador Kit, Amersham Biosciences) y los oligonucleotidos 1573 (No. Identificación de secuencia: 8) y 6795 (No. Identificación de secuencia: 9), que hibridan en Ia secuencia correspondiente al segmento estabilizador de Ia P64k y en el terminador de Ia transcripción del bacteriófago T4, respectivamente. El plasmidio obtenido se nombró pM238-NMB0873 para su posterior utilización. Para Ia expresión del gen nmbO873 se transformó por el método químico Ia cepa de E. coli GC 366 con el plasmidio pM238-NMB0873 (Figura 2). El experimento de expresión se realizó en medio mínimo salino M9 (Miller JH. 1972. Experiments ¡n Molecular Genetics, CoId Spring Harbor Laboratory Press, NEW York, USA) suplementado con glicerol al 1 %, hidrolizado de caseína al 1 %, CaCI ₂ 0.1 mM, MgSO ₄ 1mM y ampicillina 50 ug/mL. Los cultivos se incubaron durante 12 h a 37 ⁰ C a 250 r.p.m. Al cabo de este tiempo se centrifugaron y se realizó Ia ruptura del precipitado celular mediante disrupción ultrasónica (IKA LABORTECHNIK). Fracciones de sobrenadante y precipitado obtenidas fueron analizadas mediante electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) (Laemmli UK. 1970.

Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage 14. Nature 277:680) y tinción con Azul Brillante de Coomassie R-250; analizándose el porciento de expresión mediante densitometría del gel (LKB Bromma 2202 Ultrascan láser densitometer; Amersham Pharmacia Biotech, Reino Unido). La proteína NMB0873 se obtuvo en el precipitado de ruptura, representando un 60% del total de las proteínas presentes en esta fracción (Figura 3). Muestras del precipitado celular se solubilizaron con tampón Tris HCL (Tris HCL 20 mM pH=8.0). Cuando se utilizó el tampón antes descrito que contiene disuelto urea 6M, se solubiliza Ia proteína NMB0873 presente en el precipitado de ruptura. El sobrenadante después de Ia solubilización se sometió a una cromatografía de afinidad por quelatos metálicos para realizar Ia purificación de Ia proteína de interés y se obtuvo una muestra donde Ia especie molecular que migra en Ia talla esperada corresponde con un 85%. En Ia Figura 4 puede apreciarse el patrón electroforético de algunas muestras tomadas en el proceso de purificación. Por último se realizó una diálisis y se procedió a su evaluación en animales de laboratorio.

Ejemplo 4. Evaluación de Ia respuesta inmune inducida por Ia proteína NMB0873 administrada por vía subcutánea.

Para evaluar Ia inmunogenicidad de Ia proteína NMB0873, se diseñó un esquema de inmunización en ratones, en el que se administró Ia proteína adyuvada con hidróxido de aluminio, adyuvante de Freund o combinada con el polisacárido del serogrupo C de N. meningitidis. Con estas preparaciones se inmunizaron ratones

Balb/c hembras, de 8 a 10 semanas de edad, los cuales fueron divididos en 3 grupos de 10 ratones cada uno. Se realizaron 3 inmunizaciones por vía subcutánea, separadas por un intervalo de 7 días. En Ia Tabla 1 se describe Ia composición administrada a cada grupo:

Tablai . Grupos de ratones Balb/C utilizados para Ia inmunización.

Los títulos de anticuerpos (IgG) contra Ia proteína recombinante y contra antígenos presentes en Ia bacteria se determinaron mediante un ensayo tipo ELISA, en sueros obtenidos después de Ia tercera dosis. En Ia Figura 5 se muestran los títulos de anticuerpos de cada uno de los animales contra Ia proteína recombinante. Desde Ia segunda inoculación se detectan anticuerpos capaces de reconocer el antígeno administrado (datos no mostrados), aunque fueron superiores luego de Ia última inoculación. También se realizó Ia identificación inmunológica por Western blotting, detectándose el reconocimiento de Ia banda correspondiente a Ia proteína detectándose el reconocimiento de Ia banda correspondiente a Ia proteína (Datos no mostrados). Los sueros obtenidos después de inmunizar con Ia proteína recombinante reconocieron determinantes antigénicos presentes en un preparado de proteínas de membrana externa (PME) de Ia cepa H44/76 (serogrupo B) y Serogrupo A. Estos resultados son expuestos en Ia Figura 6.

Ejemplo 5. Caracterización de Ia secuencia del gen codificante para Ia proteína NMB0873 en distintas cepas de N. meningitídis y en N. gonorrhoeae.

Para analizar Ia conservación de Ia secuencia del gen codificante para Ia proteína NMB0873 en el género Neisseria se realizó una búsqueda de similitud con los genomas de Neisseria meningitídis (serogrupos A y B) y N. gonorrhoeae anotados en Ia base de datos del NCBI (NC 003116.1 , NC 003112.1 , NC 002946) empleando el programa BLAST (Altschul SF, et al. 1990. Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215:403-410. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). La Figura 7 muestra los resultados de Ia comparación de secuencias para aquellas secuencias que producen un alineamiento significativo en cada uno de los genomas analizados. Dichas secuencias presentan un 100% de identidad en el serogrupos B, un 95% de identidad en el serogrupo A, y un 96% en el caso de N. gonorrhoeae, con Ia secuencia del gen codificante para Ia proteína NMB0873 obtenida (No. Identificación de secuencia: 3). Adicionalmente se determinó Ia secuencia nucleotídica del gen en cuestión para 3 aislamientos cubanos (No. Identificación de secuencia: 5-7) pertenecientes al serogrupo B (B:4:P1.19,15) y se realizó un alineamiento de secuencia empleando el programa ClustalX (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/). Los resultados del alineamiento evidencian que existe una gran conservación en Ia secuencia nucleotídica del gen nmbO873 entre las distintas cepas analizadas y en el género Neisseria, de manera general.

El empleo de Ia proteína NMB0873 como candidato vacunal, tomando en cuenta el alto grado de similitud existente entre las secuencias anteriormente citadas, permitiría generar una respuesta inmune efectiva y de amplio espectro de protección (producto de Ia reactividad cruzada), contra Ia enfermedad meningoccócica.

Ejemplo 6. Caracterización de Ia respuesta inmune de amplio espectro de acción inducida por Ia inmunización de ratones Balb/c con Ia proteína NMB0873.

Con el objetivo de evaluar si Ia inmunización con Ia proteína NMB0873 induce una respuesta de amplia reactividad con diversas cepas de Neisseria, se realizó un ensayo tipo ELISA en el que las placas de poliestireno se recubrieron con células completas de 5 cepas de Neisseria pertenecientes a diferentes serogrupos, serotipos y serosubtipos. Las placas se incubaron con Ia mezcla de los sueros obtenidos contra Ia proteína NMB0873 en las tres composiciones, según se describe en el Ejemplo 4.

En Ia Figura 8 se muestra el reconocimiento de antígenos presentes en cepas de los serogrupos B y C de N. meningitidis, por los sueros obtenidos después de Ia inmunización con Ia proteína recombinante NMB0873 adyuvada con Adyuvante de Freund. Los sueros generados después de Ia inoculación de Ia proteína en las otras dos composiciones tuvieron un comportamiento similar.

Ejemplo 7. Protección inducida por los sueros murinos generados contra Ia proteína NMB0873 en el modelo de rata infante.

Para determinar Ia actividad funcional de los antisueros obtenidos, se realizó un ensayo de protección pasiva en el modelo de infección meningocóccica en ratas infantes. En dicho ensayo se emplearon 30 ratas de 5 - 6 días de nacidas, divididas en grupos de 6 animales cada uno.

Se determinó si los sueros que se administraron por Ia ruta intraperitoneal protegían a las ratas de Ia infección meningocóccica causada por Ia cepa CU385 (B:4:P1.19,15), inoculada por Ia misma ruta una hora después. Los sueros de cada grupo de ratones inmunizados se mezclaron y se diluyeron 1 :10 en PBS estéril, antes de ser inoculados en ratas infantes. Cuatro horas después del reto, los animales se sacrificaron y se hizo un conteo de las bacterias viables en su sangre.

Para la interpretación de los resultados se realizó un Análisis de Varianza (Anova) seguido de un análisis de comparación múltiple de Dunnet, donde se comparan los grupos en estudio con el control negativo (mezcla de sueros de animales no tratados). Como se observa en Ia Figura 9, el grupo que recibió los anticuerpos de los ratones que fueron inmunizados con Ia proteína NMB0873 con adyuvante de Freund mostró diferencias significativas respecto al control negativo, o sea los anticuerpos fueron protectores en el modelo de rata infante.

Un ensayo similar fue realizado infectando las ratas infantes con Ia cepa Z4181 (Serogrupo C), detectándose, al igual que en el experimento anterior, que los anticuerpos de ratones inmunizados con Ia proteína empleando tres adyuvantes diferentes protegieron a las ratas de Ia infección meningocóccica en el modelo utilizado (datos no mostrados). Además se realizaron otros ensayos infectando a las ratas con las cepas H44/48 y 120/90, aisladas de pacientes en Cuba, cuya clasificación serológica es homologa a Ia de Ia cepa CU385. También se realizó un experimento de reto con Ia cepa H44/76 (B:15:P1.7,16) del serogrupo B. En todos los casos, los anticuerpos de ratones inmunizados con Ia proteína NMB0873 protegieron a las ratas infantes contra Ia infección meningocóccica.

Ejemplo 8. Inmunogenicidad de Ia proteína NMB0873 en un modelo animal de inmunización neonatal.

Con el objetivo de evaluar si Ia proteína NMB0873 era capaz de producir anticuerpos tras Ia vacunación en Ia etapa neonatal, se desarrolló un experimento de inmunización en ratones OF1 neonatos. La inmunización de ratones de 7 días de nacidos es considerado como un modelo que reproduce las características de Ia respuesta inmune humoral en Ia etapa neonatal humana, para muchos antígenos. Por ello, se inmunizaron 3 grupos de ratones (6 ratones/grupo), a los 7, 10 y 14 días después del nacimiento. Los ratones del primer grupo, en cada dosis recibieron 10 μg de Ia proteína NMB0873 adyuvada con hidróxido de aluminio (400 μg/dosis). Los ratones del segundo grupo, en cada dosis recibieron 10 μg de Ia proteína NMB0873 adyuvada con fosfato de aluminio (400 μg/dosis), mientras que los ratones del tercer grupo sólo recibieron 400 μg/dosis de hidróxido de aluminio sin antígeno. A los 21 días de edad se obtuvieron muestras de sangre de los ratones y el suero se analizó por ELISA, para determinar los niveles de anticuerpos contra Ia

proteína NMB0873. A continuación se muestran los títulos de anticuerpos anti- NMB0873 detectados en los tres grupos de ratones.

Tabla 2. Títulos de anticuerpos anti-NMB0873 detectados en los tres grupos de ratones OF1 inmunizados en Ia etapa neonatal.

*: MGT, media geométrica de los títulos de anticuerpos IgG anti~NMB0873 detectados en los ratones a los 21 días de nacidos.

Como se observa en Ia Tabla 2, ambas formulaciones que contienen Ia proteína NMB0873 junto a adyuvantes vacunales aceptados para el uso en humanos produjeron niveles de anticuerpos significativos para un modelo animal con una marcada inmadurez en el sistema inmune, Io cual sugiere que este antígeno vacunal puede resultar inmunogénico tras su administración en neonatos humanos, y conferir inmunidad contra el meningococo en esa edad temprana de Ia vida.

Ejemplo 9. Generación de anticuerpos monoclonales contra Ia proteína NMB0873, capaces de mediar actividad bactericida contra Neissería meningitidis. Con el objetivo de generar anticuerpos monoclonales (mAbs) específicos contra Ia proteína NMB0873, y estudiar su capacidad funcional de mediar actividad bactericida contra cepas homologas y heterólogas de N. meningitidis, se empleó en un esquema de inmunización una preparación de Ia proteína NMB0873 con un porciento de pureza del 85%. El esquema de inmunización se realizó en ratones Balb/c (H-2 ^d , sexo femenino, 5-6 semanas) y contó con un total de 4 dosis distribuidas de Ia siguiente manera: los días 0, 15 y 30 del esquema se inocularon 10 μg del antígeno NMB0873 por ratón (volumen total 100 μl), administrados por vía subcutánea, emulsificada Ia primera dosis con Adyuvante Completo de Freund, y las restantes dosis con Adyuvante Incompleto de Freund; el día 50, se administraron

10 μg del antígeno por ratón en solución tampón fosfato (NaCI 140 mM, KCI 270 mM, KH ₂ PO ₄ 1.5 mM, Na ₂ HPO ₄ x 2H ₂ O 6.5 mM, pH 7.2), por vía ¡ntraperitoneal. Las extracciones se realizaron los días 0 y 45 del esquema. Los esplenocitos del animal de mejor título, evaluados mediante un ELISA indirecto empleando Ia proteína NMB0873 en el recubrimiento, se fundieron con las células de mieloma X63 Ag8 653 y los hibridomas resultantes se aislaron y pesquisaron según métodos establecidos (Gavilondo JV. (1995). Anticuerpos Monoclonales: Teoría y Práctica, Elfos Scientiae, La Habana, Cuba). La reactividad de los anticuerpos secretados por los hibridomas obtenidos contra la proteína NMB0873, así como su reactividad contra un grupo de antígenos no relacionados, se evaluó mediante un ELISA indirecto empleando en ei recubrimiento 5 μg/ml de cada uno de los antígenos, e igual concentración de los mAbs a ensayar. La Figura 10 muestra los resultados obtenidos en este experimento, en total se obtuvieron 3 clones positivos (mAbs B10/22, H3/86 y D6/30) que reconocen específicamente Ia proteína NMB0873, y no a Ia secuencia aminoacídica correspondiente al segmento N-term de Ia P64k, tampoco al resto del panel de antígenos no relacionados ensayados. Para determinar Ia capacidad de los mAbs generados contra Ia proteína NMB0873 de mediar actividad bactericida contra cepas homologas y heterólogas de N. meningitidis se realizó un ensayo bactericida. El título de anticuerpos bactericidas fue expresado como el recíproco de Ia mayor dilución de anticuerpos evaluada, capaz de matar el 50% ó más de las bacterias; dos de los mAbs generados (3H2/64 y 7D2/15) tuvieron títulos bactericidas superiores a 1 :128 contra Ia cepa homologa B:4:P1.19,15 y uno (H8/92) superior a 1 :80. Además tuvieron títulos superiores a 1 :64 contra las cepas heterólogas cuyas clasificaciones son B:15:P1.7,16 y C:2a:P1.5, respectivamente.

Ejemplo 10. Caracterización de las regiones blanco de Ia respuesta inmune murina contra Ia proteína NMB0873.

Con el objetivo de identificar las regiones dentro de Ia proteína, que son más reconocidas por los antisueros murinos generados contra el antígeno recombinante se realizó un ensayo de tipo SPOTScan. Una serie de péptidos sobrelapados que cubren Ia secuencia de Ia proteína se sintetizaron sobre un soporte de celulosa y Ia membrana se incubó con una mezcla de sueros diluida 1 :100. La reacción antígeno-

anticuerpo se detectó mediante Ia incubación con un conjugado anti- lnmunoglobulina G murina- fosfatasa alcalina, seguido de Ia adición de una solución que contenía el sustrato Bromo-Cloro-Indolil-Fosfato.

Se observaron varias regiones antigénicas comunes presentes en Ia proteína, con independencia de Ia preparación que se empleó en Ia inmunización. No obstante, se apreció que en los grupos inmunizados con proteína adyuvada con Adyuvante de Freund se obtuvo un patrón de reconocimiento mucho más amplio.

Ejemplo 11. Reconocimiento de Ia proteína NMB0873 por sueros humanos. Una batería de sueros humanos, provenientes de individuos convalecientes se empleó en este estudio, que se realizó en un ensayo tipo ELISA. Las placas se recubrieron con Ia proteína NMB0873 obtenida mediante electroforesis preparativa (5 μg/ml). Después de bloquear las placas con leche descremada en polvo al 3% en PBS con Tween-20, los sueros se diluyeron (1 :50) en Ia misma solución y se incubaron en las placas. El inmunoensayo prosiguió como ha sido ampliamente reportado. Como control negativo se emplearon sueros de donantes sanos. También se empleó como control no relacionado una mezcla de sueros de vacunados con vacuna recombinante contra Ia Hepatitis B (datos no mostrados). La Figura 11 muestra los resultados obtenidos con 5 sueros de convalecientes en este ensayo. Como se aprecia, los sueros humanos reconocieron Ia proteína Io que indica que Ia misma se expresa durante Ia infección meningocóccica y que es inmunogénica.

Ejemplo 12. Proteína NMB0873 como portadora de un péptido. Para demostrar Ia capacidad portadora de Ia proteína recombinante NMB0873, se conjugó a Ia misma un péptido sintético de 15 residuos aminoacídicos, derivado de Ia región V3 de Ia proteína gp120 del VIH-1 , aislamiento JY1. La conjugación se realizó por el método del glutaraldehído. El péptido JY1 libre, Ia proteína recombinante NMB0873 y el conjugado JY1-NMB0873, se administró a ratones adultos en un esquema de 3 dosis, donde los inmunógenos se emulsificaron con Adyuvante de Freund. Dos semanas después de Ia tercera dosis se obtuvieron muestras del suero de los animales inmunizados, los que se analizaron por ELISA para determinar los niveles de anticuerpos anti-péptido. Para ello las placas se recubrieron con el péptido libre (20μg/ml) y el inmunoensayo prosiguió como se ha

descrito previamente. Los resultados del experimento (Figura 12) evidencian Ia capacidad portadora de Ia proteína NMB0873, capaz de potenciar significativamente Ia respuesta de anticuerpos contra el péptido JY1 , tras su conjugación al mismo.

Ejemplo 13. Evaluación de Ia respuesta inmune inducida por Ia proteína NMB0873, por vía mucosal.

Para evaluar Ia inmunogenicidad de Ia proteína NMB0873 por vía mucosal, se diseñó un esquema de inmunización en ratones, en el cual se administró Ia proteína encapsulada en liposomas o mezclada con polisacárido C de N. meningitidis. Los liposomas se obtuvieron por el método de deshidratación-rehidratación como ha sido descrito previamente (Carménate T, et al. (2001 ). Recombinant Opc protein from Neissería meningitidis reconstituted into liposomes elicits opsonic antibodies following immunization. Biotechnol. Appl. Biochem. 34: 63-69). Con ambas preparaciones se inmunizaron ratones Balb/c hembras, de 8 a 10 semanas de edad, los cuales recibieron 3 dosis de 50 μg de Ia proteína, por vía intranasal, separadas por un intervalo de 15 días. Para realizar un análisis de Ia respuesta a nivel mucosal se detectaron anticuerpos IgA presentes en muestras de lavados pulmonares de los ratones inmunizados. En Ia Figura 13 se muestran los niveles de anticuerpos IgA detectados en los dos grupos analizados.