[발명의 명칭】

인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 [기술분야]

본 발명은 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 상기 조성물의 약학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 치료 또는 예방 방법에 관한 것으로서， 더욱 자세하게는 SPOCK2 단백질， SPOCK2 단백질을 코딩하는 유전자， 상기 유전자를 포함하는 백터 및 상기 백터를 포함하는 세포로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물 및 이의 이용방법에 관한 것이다.

【배경기술】

감염성 질병은 박테리아, 바이러스, 곰광이 등과 같은 미세한 크기의 유기체에 의한 감염으로 나타나며, 직접 또는 간접적인 전염성을 가진다. 세계 보건기구에서는 감염성 질병을 주요 사망원인 10위 중 하나로 분류하며 특히 저소득 국가에서 그 비율이 높게 나타난다. 인플루엔자 바이러스는 호흡기를 통해 감염되며 전세계적으로 매년 5-10%성인과 20-30%의 소아가 감염 된다고 보고된다. 인플루엔자 바이러스 감염으로 인한 증상은 단순한 고열， 기침, 복통, 근육통에서부터 심각한 경우 죽음에 이르게 하며 매년 25만명에서

50만명이 감염으로 인해 사망한다. 인플루엔자 바이러스는 8개의 분절된 단일가닥 RNA를 게놈으로 가지며, 인벨롭 단백질들이 이를 감싸고 있는 구조로 이루어져있다. 인플루엔자 바이러스의 감염은 바이러스 표면에 발현하는 헤마글루티닌 (hemagglutinin, HA) 단백질과 숙주 표면에 발현하는 시알릭산 수용체의 결합에 의해 개시된다. 세포 내로 들어간 후, 숙주 세포 단백질들을 이용하여 복제하고 조합되어 세포 외부로 방출됨으로써 증식한다. 이 때, 인플루엔자 바이러스의 주요 구조 단백질인 NP단백질이 전사, 복제에 관여한다고 보고되고 있다. 바이러스 RNA를 감싸고 있는 NP단백질은 핵전좌 서열을 포함하고 있어 바이라스 RNA를 핵 내로 전달할 뿐만 아니라 전사 복제된 RNA를 안정화하는 역할을 한다고 알려져 있다.

현재 통용되고 있는 인플루엔자 바이러스 치료제들은 주로 바이러스 단백질을 타깃으로 바이러스의 생활환 (침입, 복제, 방출)을 억제하는 효능을 가진다. 바이러스의 뉴라미니데이즈 (neuraminidase, NA)는 시알리다아제의 효소활성을 가지는 당단백질로서 인플루엔자 바이러스의 대표적인 치료제인 타미플루는 NA 단백질을 표적으로 바이러스의 방출을 억제하여 바이러스의 증식을 억제한다. 바이러스의 NA단백질은 숙주 세포 표면의 시알릭산 수용체에 결합하여 세포 내로의 침입에 관여한다. 숙주 세포의 시알리다아제 또는 Neu5Ac를 표적으로 HA의 기^을 억 ^" 제하여 바이러스의 부착 및 침입을 제어하는 억제제들이 개발 또는 연구되고 있다.

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】

본 발명은 SPOCK2 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는， 바이러스성 감염 질환의 예방 또는 치료용 DNA 백신 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 유효성분으로서, SPOCK2 단백질을 유효성분으로 포함하는， 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 DNA 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 세포에서 SPOCK2 단백질이 과발현되도록 SPOCK2 단백질을 코딩하는 유전자를 코돈을 변형시키는 단계; 및 상기 변형된 유전자를 백터에 도입하는 단계를 포함하는， 예방 또는 치료용 DNA 백신 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물의 약학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 인플루엔자 바이러스 질환 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다. 【기술적 해결방법】

본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위하여, SPOCK2 단백질 또는 이의 당화가 바이러스, 특히 인플루엔자 A 바이러스의 증식 및 이에 의한 감염 조절에 증요한 역할을 한다는 것을 확인하여, SPOCK2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 바이러스성 감염 질환의 예방 또는 치료용 DNA 백신 조성물을 개발하였다.

본 발명의 일 예는 SPOCK2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 바이러스성 감염 질환의 예방 또는 치료용 DNA 백신 조성물이다. 본 발명의 또 다른 일 예는 유효성분으로서, SPOCK2 단백질을 유효성분으로 포함하는, 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 DNA 백신 조성물이다.

본 발명의 또 다른 일 예는, 세포에서 SPOCK2 단백질이 과발현되도록 SPOCK2 단백질을 코딩하는 유전자 코돈을 변형시키는 단계; 및 상기 변형된 유전자를 백터에 도입하는 단계를 포함하는, 바이러스성 감염 질환의 예방 또는 치료용 DNA 백신 조성물의 제조방법이다.

본 발명의 또 다른 일 예는 상기 조성물의 약학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 바이러스 질환 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바이러스성 감염 질환의 예방 또는 치료용 DNA 백신 조성물에 의하면 바이러스의 증식을 억제하며， 바이러스 예방 또는 감염 치료에 사용될 수 있다. 상기 인플루엔자 바이러스 증식 억제는 바이러스의 세포 내 침입 억제, 바이러스의 뉴클레오프로테인 단백질 (nucleoprotein, NP)의 발현 저해 및 바이러스의 헤마글루티닌 단백질 (hemagglutinin, HA)의 발현을 저해하는 것으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에 의해 달성될 수 있다.

이하， 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 예는 SPOCK2 단백질을 코딩하는 유전자 또는 SPOCK2 단백질를 포함하는, 바이러스성 감염 질환의 예방 또는 치료용 DNA 백신 조성물에 관한 것이다. 또한, 상기 유전자는 SPOCK2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 형태， 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 백터 및 상기 백터를 포함하는 세포로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 형태로 제공될 수 있다.

SPOCK2 단백질는 422개 아미노산으로 구성된 당 단백질이다. 분비 단백질에서 공통적으로 나타나는 신호 펩타이드가 N말단에 존재하고， FS 도메인, 칼슘과 결합하는 EC 도메인, Glu 도메인으로 이루어져 있다. 세포 내 생성된 SPOCK2 단백질은 세포 내 소기관인 ER, Golgi를 통해 당화 과정을 거치게 되며, 최종적으로 세포 밖으로 분비되어 주로 세포 외 막질에 위치하는 것으로 알려져 있다. 종래에 SPOCK2는폐나 뇌의 발달 과정에서 발현이 높아지며, 이들의 발달과 유지를 조절하는 역할을 한다고 보고되었으며, 결장, 전립선, 유방암 등에서 과도한 메틸레이션이 되어있다는 것이 밝혀 지면서 암을 진단하는데 있어 바이오 마커로 이용되어 왔다.

바람직하게는 상기 SPOCK2는 당화될 수 밌으며 225번 아스파라진 잔기에 N-linked glycosylation site와 383 및 388번 세린 잔기에 glycosaminoglycan attachment sites를 포함하는 것이다. 상기 SPOCK2는 상기 225번， 383번 및 388번으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 아미노산 위치에서 당화가 이루어질 수 있으며, 예를 들면 당화된 SPOCK2의 분자량은 바람직하게는 55 내지 170kDa, 더욱 바람직하게는 55 내지 100kD 인 것일 수 있다.

예를 들면， SPOCK2 단백질의 225번 아스파라진 잔기를 아스파르산 (aspartic acid) 잔기로 치환하여 당화를 억제시켰을 때 SPOCK2 단백질에 의한 인플루엔자 바이러스의 증식 억제 효과가 사라지고, 세포 밖으로 방출된 인플루엔자 바이러스의 양 또한 증가한다. 이는 SPOCK2 단백질의 당화 현상이 바이러스 증식 억제 효능에 관여한다는 것을 의미한다.

상기 SPOCK2 단백질을 코딩하는 유전자는 세포에서 SPOCK2 단백질이 과발현되도록 코돈이 변형된 것을 특징으로 할 수 있으며, 특히 당화 (glycosylation) 가능한 SPOCK2 단백질의 _' 변이체를 포함한다. 이는 SPOCK2 단백질의 당화가 바이러스 감염 및 증식 조절에 중요한 역할을 하는 것에 기인한 것이다. 바람직하게는 상기 SP0CK2 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 SP0CK2 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 상기 유전자는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.

상기 SPOCK2 단백질을 과발현시키면 인플루엔자 바이러스의 증식이 억제되며， 구체적으로 바이러스가 세포 내 침입을 억제할 수 있고， 바이러스 증식이 억제되었음을 바이러스의 뉴클레오프로테인 단백질 (nucleoprotein, NP) 또는 해마글루티닌 단백질 (hemagglutinin, HA)의 발현 저해를 통해 확인하였다.

상기 SPOCK2 단백질을 코딩하는 유전자는 백터에 포함된 형태로 제공될 수 있으며, 바람직하게는 상기 백터는 바이러스성 또는 비바이러스성 백터일 수 있다. 특히 상기 바이러스성 백터는 아데노바이러스， 아데노 -부속 바이러스, 헬퍼-의존형 아데노바이러스 및 레트로바이러스 백터로 이루어진 군에서 선택된 1 이상일 수 있다. 구체적으로 상기 백터는 도 1의 개열 지도를 갖는 것일 수 있다. 또한 비바이러스성 백터는 풀라스미드, 리포좀 등 일 수 있다.

상기 SPOCK2 단백질을 코딩하는 유전자는 상기 유전자가 포함된 백터에 의해 형질 전환된 세포의 형태로 제공할 수 있다

상기 조성물은 바이러스 증식을 억제하여 바이러스성 감염 질환을 예방 또는 치료하는 것일 수 있다. 바이러스의 증식 억제 방법은 바이러스의 생활환을 억제하는 방법에만 제한되지 않으며, 바람직하게는 상기 바이러스 증식 억제는 바이러스가 세포 내 침입 억제; 바이러스의 뉴클레오프로테인 단백질 (nucleoprotein, NP)의 발현 저해; 및 바이러스의 해마글루티닌 단백질 (hemagglutinin, HA)의 발현을 저해하는 것으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상인 것일 수 있다.

상기 바이러스 증식 억제 방법은 생체 내 (in vivo) 또는 생체 외 (in vitro)에서 수행되는 것일 수 있다.

본 발명의 상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스이며， 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스일 수 있다. 상기 바이러스 감염 질환은 바이러스 감염에 의해 발병할 수 있는 질환을 의미한다. 바람직하게는 인플루엔자 바이러스에 의한 독감, 라이증후군, 폐 질환 _: 및 혈세포 질환으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상일 수 있으며， 상기 독감은 고열, 기침， 복통을 동반하고, 상기 라이증후군은 간기능장애를 유발하며， 상기 폐 질환은 천식과 유사한 증상을 나타내며， 혈세포 질환은 호흡곤란을 일으키는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 예는, 상기 DNA 백신 조성물을 포함하는, 포유류 동물의 바이러스 감염 예방 또는 치료용 제제를 포함할 수 있다.

상기 제제는 면역 보조제를 더욱 포함할 수 있으며, 면역을 유도할 수 있으며 안전한 것으로서 당 업계에서 잘 알려진 면역보조제라면 어떤 것도 바람직하게 사용할 수 있다.

상기 제제는 각각 통상의 방법에 따라 경구형 제형, 또는 비경구 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 제제는 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제 등의 보조제를 추가로 함유하는 것일 수 있다.

본 발명의 제제를 인간에게 적용하는 구체 예에 있어서, 본 발명의 제제는 단독으로 투여될 수 있으나, 일반적으로 투여 방식과 표준 약제학적 관행 (standard phamaceutical practice)을 고려하여 선택된 약제학적 담체와 흔합되어 투여될 수 있다.

본 발명의 제제의 투여 용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태， 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다. 예컨대， 유효성분 (i.e., SPOCK2 단백질, 이의 코딩 폴리뉴클레오타이드 또는 이들의 흔합물) 함량을 기준으로 1일 투여량이 0.001 내지 10000 mg/kg 일 수 있다. 상기한 투여량은 평균적인 경우를 예시한 것으로서 개인적인 차이에 따라 그 투여량이 높가나 낮을 수 있다. 본 발명의 약제적 제제의 1일 투여량이 상기 투여 용량 미만이면 유의성 있는 효과를 얻을 수 없으며, 그 이상을 초과하는 경우 비경제적일 뿐만 아니라 상용량의 범위를 벗어나므로 바람직하지 않은 부작용이 나타날 우려가 발생할 수 있으므로， 상기 범위로 하는 것이 좋다ᅳ

본 발명의 또 다른 일 예는， 상기 조성물의 약학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 예는 세포에서 SPOCK2 단백질이 과발현되도록 SPOCK2 단백질을 코딩하는 유전자를 코돈을 변형시키는 단계; 및 상기 변형된 유전자를 백터에 도입하는 단계를 포함하는， 인플루엔자 바이러스 DNA 백신 제조방법을 제공한다. 상기 DNA 백신 조성물에 관한 사항은 그 제조방법 및 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료 방법에 적용될 수 있다. 【발명의 효과】

본 발명의 약학 조성물은 유효성분으로서 SPOCK2 단백질 및 상기 단백질 또는 단백질 단편을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1 이상이 바이러스의 증식을 억제하는 바， 바이러스, 특히 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스 (Influenza A virus, IAV) 감염에 대한 예방 및 /또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

【도면의 간단한 설명】

도 1은 SPOCK2을 포함하는 백터의 개열 지도를 나타낸 도면이다. 도 2은 SPOCK2를 과발현하는 A549 세포주를 인플루엔자 A 바이러스로 감염시킨 후에 , SPOCK2 발현 여부에 따른 GFP 신호를 유동세포계수법으로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.

도 3는 SPOCK2를 과발현하는 A549 세포주에 인플루엔자 바이러스를 감염시킨 후에， 세포 내 인플루엔자 바이러스 유전자 (HA) 발현을 Real Time-qPCR을 이용하여 측정한 결과와 SPOCK2-V5과발현 정도를 나타내는 도면이다. ^" 도 4은 SPOCK2를 과발현하는 A549 세포주에 인플루엔자 바이러스를 감염시킨 후에 용해 버퍼를 처리하여 얻어진 용해물의 바이러스 단백질 (NP)의 발현 정도를 웨스턴 블랏으로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.

도 5는 SPOCK2를 과발현하는 A549 세포주에 인플루엔자 바이러스를 감염시킨 후에 SPOCK2의 과발현에 따른 인플루엔자 A 바이러스의 칩입 상태 및 부착 상태에서의 바이러스 위치를 형광 현미경으로 확인한 결과를 나타내는 도면이다.

도 6은 실시예 5에 따라 SPOCK2 과발현에 의한 RNA 의존 RNA 중합효소 활성을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.

도 7은 실시예 6에 따라 SPOCK2-V5 과발현된 경우 방출된 바이러스 양을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.

도 8은 실시에 8에 따라 바이러스 감염에 따른 SPOCK2의 세포 내 위치를 형광 현미경으로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.

【발명의 실시를 위한 최선의 형태】

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 실시예 1. SPOCK2를과발현하는세포주의 제조

1-1 : 발현 플라스미드 제조ᅳ

SPOCK2 단백질 (서열번호 1)을 암호화하는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열 및 상기 단백질의 225번 서열의 아스파라진이 아스팔틱산으로 치환된 단백질 (서열번호 2)을 암호화하는 서열번호

4의 뉴클레오티드 서열을 PCR로 증폭하여 pDEST-51백터에 클로닝하여 SPOCK2 단백질을 발현하는 플라스미드를 제작하였다. 상기 플라스미드의 개열지도를 도 1에 나타내었다. 상기 서열번호 1의 SPOCK2 단백질 및 SPOCK2 N225D 단백질의 아미노산 및 핵산 서열번호을 하기 표 1에 기재하였다. 【표 1]

1-2: 플라스미드를 세포주에 도입

상기 항목 1-1에서 제조된 플라스미드 (SPOCK2-V5)를 리포좀 주입법으로 A549 세포에 도입한 후, 10% 소태아혈청 (fetal bovine serum; 이하 FBS, Hyclone) 을 포함한 DMEM미디어 (Welgene) 에서 48시간 배양하였다. 48시간 후, A549 세포를 용해버퍼 (25mM Tris-HCl(pH7.4), 150mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.5% deocycholic acid, 0.1% SDS)를 이용해 용해 후， 세포 내 과발현된 SPOCK2를 V5 (invitrogen, P/N46-0705)항체를 이용해 측정하였다. 그 결과 제조된 SPOCK2-V5 플라스미드를 주입한 세포에서 과발현된 SPOCK2를 검출됨에 따라 과발현을 확인하였다. 비교예 1. SPOCK2 발현이 저해된 세포주 제조

SPOCK2의 발현이 저해된 세포주를 비교예로서 제조하기 위해 하기 표 2의 서열로 이루어진 SPOCK2 siRNA를 리포좀 주입법으로 A549세포에 도입한 후, 10% FBS DMEM미디어에서 48시간 배양하였다. 대조군 siRNA는 세포에 siRNA도입에 의한 siRNA자체의 비특이적 효과를 배제하기 위하여 사용하였다ᅳ

【표 2】

실시예 2: 인플루엔자 Α바이러스증식 억제 효과 2-1 : 인플루엔자 A 바이러스 감염 세포

실시예 1에서 제조한 SPOCK2를 과발현하는 A549 세포주를 FBS가 포함되지 않은 DMEM 미디어로 교체하는 동시에 GFP가 태깅된 인플루엔자 A 바이러스 (Prof. adolfo-Garcia Sastre) 10TCID ^4/ /ml로 24시간 감염한 후, 트립신을 이용해 떼어낸 세포를 FACS tube에 옮긴 후， 4% paraformaldehyde로 고정한다. FACS buffer (0.5%FBS in PBS)로 vortexing하였다.

2- 2: 유세포분석을 통해 세포내 바이러스양측정

상기 세포주내 바이러스 양을 측정하기 위하여 유동세포분석기를 사용하여 단일 세포 내 바이러스 양을 정량하였다. 세포계수법을 사용하여 GFP 신호를 측정하였다.

동일한 방법으로, 상기 비교예 1에서 siRNA를 도입하여 SPOCK2의 발현이 저해된 세포주에 대하여도 상기 유동세포분석기를 사용하여 GFP 신호를 측정하였다.

A549세포 내 바이러스 양을 GFP통해 측정한 결과와 siRNA를 통한 SPOCK2의 silencing정도를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 볼 수 있듯 siRNA를 통하여 SPOCK2 발현이 저해된 경우 인플루엔자 바이러스가 증가하였고 SPOCK2 단백질이 인플루엔자 바이러스 증식에 영향을 미친다는 점을 확인하였다. 실시예 3. 인플루엔자 A바이러스유전자의 발현측정

3- 1 : 인플루엔자 A바이러스 감염 세포

실시예 1에서 얻어진 따라 SPOCK2에 V5를 표지하였고, 이를 A549세포에 도입하여 SPOCK2를 과발현시킨 후， 인플루엔자 A 바이러스를 감염시켰다.

3-2: 유전자 HA발현 확인

이 후, RNA iso plus(Takara, 일본)를 이용하여 세포의 RNA를 추출하였다. 세포 내 바이러스 양을 RNA수준에서 관찰하기 위해 바이러스 유전자 (HA)의 발현을 Real Time-qPCR을 이용하여 측정하였다.

구체적으로, 상기 세포 RNA는 RNAiso plus (Takara, 일본)를 이용하여 주줄하고, 주줄된 RNA 0.5ug를 Improm-II reverse transcriptase system (Promega, 미국)와 Random oligomer를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 실시간 역전사 중합 연쇄 반웅을 위해 추출된 상기 RNA, 아래 표 3에 나타낸 각 표적을 특이적으로 인지하는 프라이머, SYBR premix Ex-Taq (Takara, 일본) , 50X Rox (Takara, 일본) (프라이머 각 5pmol, SYBR premix Ex-Taq 2.5ul, 50X Rox0.2ul, cDNA lul, DW up to lOul)을 One-StepTM Real Time PCR system (Applied Biosystem)에서 반웅시켰다. (holding stage: 95 15분 cycling stage: [95 15초 57 ^° C 15초 72 ^° C 15초〕 <40 cycles> melting curve stage: [95 15초 72 ^° C 0.5분 95 ^° C 15초〕)ᅳ 실험에 사용되는 각 표적 RNA를 특이적으로 인지하는 프라이머의 서열은 표 3에 나타내었다.

【표 3]

상기 측정 결과와 SPOCK2-V5과발현 정도를 도 2에 나타내었다. 도 3에서 확인할 수 있듯 SPOCK2를 과발현한 경우 세포 내 인플루엔자 바이러스 유전자 (HA) 발현이 RNA수준에서 감소하였으며, 이를 통해 SPOCK2 단백질에 의하여 바이러스 증식을 억제할 수 있음을 확인하였다.

3-3: NP 단백질 감소 측정

3-1에서 감염된 세포를 용해 버퍼를 이용해 용해물을 추출한 후， 바이러스 단백질 (NP)의 발현을 웨스턴 블랏 방법으로 확인하였다. 구체적으로 상기 A549 세포주를 용해 버퍼 (25mM Tris-HCl pH 7.5, 150mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 0.5% deoxycholate)로 용해한 용해물을 SDS-PAGE로 분리한 후, SPOCK2 (Santacruz), NP(Santacruz), V5(Invitrogen)을 특이적으로 인지하는 항체를 이용하여 각 단백질의 발현양을 측정하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에서 확인할 수 있듯이 SPOCK2 단백질의 발현에 의해

인플루엔자 바이러스 단백질인 NP 단백질 수준이 현저히

감소하였으며, 이를 통해 SPOCK2 단백질에 의하여 바이러스 증식이 억제되었음을 확인하였다. 실시예 4. 인플루엔자 A바이러스 침입 저해 효과측정

면역 형광 염색법을 사용하여 인플루엔자 A 바이러스 감염 시, 인플루엔자 바이러스의 세포 내 위치를 확인하였다.

실시예 3-1의 SPOCK2에 V5를 표지하고 SPOCK2를 과발현한 후, A549 세포주에 인플루엔자 바이러스 20TCID ^4/ /ml을 감염시켰다. A549 세포주를 덮개 유리 (cover glass)위에서 배양한 후， 4% paraformaldehyde로 세포를 고정했다. 4에서 90분간 배양한 후， 고정된 세포를 바이러스 부착 상태로 정의하고, 이후 37 에서 20분 배양 후， 고정된 세포를 초기 바이러스 침입상태로 정의 하였다.

각 상태에서 0.2% Triton X-100을 사용하여 세포의 투과성을 높이고,

NP(Santacurz), SPOCK2(Santacruz)와 Anti-mouse

IgG-Alexa-488(Invitrogen) Anti-mo sue IgG-Alexa568(Invitrogen) 항체를 이용하여 세포 내 위치를 표지 하였다. 세포의 핵은 Hoechst 33258 (Sigam)를 이용하였다. 형광신호를 형광현미경으로 확인하고 이를 Image J 프로그램으로 분석하여 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 5에서 확인 할 수 있듯이， 바이러스 부착의 경우 녹색형광으로 보이는 NP단백질의 위치나 밝기가 SPOCK2의 과발현에 의해 변화하지 않았다. 하지만, 바이러스 침입의 초기 과정에서는 SPOCK2가 과발현된 세포에서 녹색형광의 밝기가 현저히 줄어들어 있는 것으로 보아 SPOCK2가 바이러스 침입을 저해한다는 것을 확인하였다. 실시예 5. 바이러스 의존 RNA증합효소 활성 조절 여부측정

상기 A549 세포 주에서 인플루엔자 바이러스의 RNA 의존 RNA 중합효소 활성을 측정하기 위해 이들의 주요인자인 (PBl, PB2. PA, NP)의 플라스미드 DNA를 제작한 후 리포좀 도입 방법으로 세포에 주입하여 과발현하고, 이들에 의해 복제되는 RNA (서열번호 11)를 리포터로 사용하여 중합효소 활성을 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 Real Time-qPCR을 이용하여 측정하였다.

그 결과 도 6에서 확인 할 수 있듯이 SPOCK2의 과발현에 의한 RNA의존 RNA증합효소 활성에는 변화가 없는 것을 확인하였다. 실시예 6.바이러스 방출 저해 효과 확인.

실시예 3-1의 SPOCK2에 V5를 표지하고 SPOCK2를 과발현한 후， A549 세포주에 인플루엔자 바이러스 20TCID ^4/ /ml을 감염시켰다. 이후 세포 밖으로 방출된 바이러스 양을 측정하기 위해 세포를 배양한 미디어를 채취해 이로부터 단백질을 TCA 침전을 이용해 추출했다. 이를 위해 100% TCA가 최종 농도가 20%가 되도록 추가 후 얼음에서 1시간 반웅 시킨다. 이 후 OOOrpm으로 10분간 원심분리를 통해 단백질을 침전시키고 침전된 단백질을 0.01 M HC1 I 90% 아세톤으로 3번 세척과정을 거친다. 이를 웨스턴 블랏을 통한 SDS-PAGE상에서 단백질 분리 후， NP 항체 (abeam, abl28193)을 이용하여 NP단백질 양을 측정함으로써 바이러스의 양을 측정하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에서 확인할 수 있듯이， SPOCK2의 과발현에 의해 미디어로 방출된 바이러스 양이 현저히 감소했음을 확인하였다. 당화과정이 결여된 SPOCK2 N225D-V5를 사용하였을 때는 이러한 현상이 나타나지 않는 것으로 보아 당화 과정이 SPOCK2의 바이러스 억제 효과에 있어 중요하다는 것을 알 수 있다. 실시예 7. 인플루엔자 바이러스 감염에 따른 SPOCK2의 세포 내 위치 이동

실시예 3-1의 SPOCK2에 V5를 표지하고 SPOCK2를 과발현한 후,

A549 세포주에 인플루엔자 바이러스 20TCID ^4/ /ml을 감염시켰다. 감염시킨 직후， 6시간, 및 12시간 후 SPOCK2와 NP 단백질을 각각 면역 형광 염색법으로 표지 한 후, 형광현미경으로 확인하였다.

구체적인 표지 방법은 상기 실시예 5와 동일하게 수행하였으며 형광 현미경으로 확인한 형광 신호를 도 9에 나타내었다.

도 8에서 확인할 수 있듯이 바이러스 감염에 따라 세포 막 근처에 존재하던 SPOCK2의 발현이 핵 근처로 이동하였고， 이러한 이동은

NP단백질의 이동과 일치하는 것을 확인 하였다. 이를 통하여

SPOCK2와 NP와의 colocalization을 통해 바이러스의 감염을 제어할 수 있다는 가능성을 확인하였다.