C0X2 아세틸화제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치 료용 약학적 조성물

【기술분야】

본 출원은 2018년 3월 21일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2018-0032669 호를우선권으로주장하고， 상기 명세서 전체는본출원의 참고문헌이다. 본 발명은 C0X2(cyclooxygenase-2) 아세틸화제를 유효성분으로 포함하는 퇴 행성 신경질환의 예방또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로， 보다 상세하게는 뇌 신경세포에서 아밀로이드-13의 침착을 억제하고， 뉴런에서 SPM(specialized proresolving mediator)의 분비를 촉진하는 효과가 있는 C0X2 아세틸화제를 유효성 분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

【배경기술】

알츠하이머 (Alzheimer’s disease, 이하 ‘AD’라 함)는 가장 일반적인 형태의 치매로서， 세포 밖 아밀로이드 플라그 및 응집된 아밀로이드 |3(AP)로 이루어진 세 포 내 신경섬유매듭의 축적이 특징적으로 나타나 결과적으로 인지 장애 및 치매 증 상이 유발된다. 이러한 특징들 이외에도, 일반적으로 Ai3와 밀접하게 관련이 되어 있는신경 아교세포(glia cell) (특히， 미세아교세포)의 조절장애 역시 관찰이 된다. 알츠하이머와 같은 퇴행성 신경질환 환자의 뇌에서 기능이 상실된 미세아교 세포는 AP의 축적에 반응하거나 및/또는 감소된 A|3 식작용에 의해 전-염증성 (pro-inflammatory)사이토카인들을분비함으로써 질환의 진행에 관여하고 있다. 미 세아교세포의 기능상실은또한만성적인 염증반응을유발하기도 한다. 이러한 염증 반응의 해결은 염증성 반응의 최종 단계에 있으며, Lipoxin A4(LxA4) , Resolvin El(RvEl) 및 Resolvin Dl(RvDl)을 포함하는 SPMs(special ized proresolving mediator)라고 불리는 신경염증 종결 조절인자에 의해 염증성 반응이 해소될 수 있 다. 이는 Ml표현형에서 M2로 편향되어 활성화된 표현형으로의 전환， 전-염증성 사 이토카인의 하향조절(downregulat ion) 및 사멸세포 및 찌꺼지의 제거와같은신경아 교세포의 기능을 회복시키는 결과를 가져온다. 최근 연구에 따르면， AD환자에서 염 증반응의 해소 기능 (SPMs)이 실조되어 있다는 것이 보고되고 있다. 스핑고신 카이나제(Sphingosine kinase, 이하 ’SphK’라 함) 1 및 2는스핑고 신을 염증반응을 조절하는 것으로 알려져 있는 생리활성 지질인 스핑고신- 1-포스페 이트 (S1P)로 전환하는데 관여하고 있는 핵심 효소이다. 최근, 염증반응에서 SphK의 역할이 다양한 질병 (천식， 류마티스 관절염 등)에 관한 연구 주제가 되고 있다. 그 러나, AD환자의 뇌에서 신경염증반응에 대한 SphK의 역할은충분히 연구가되어 있 지 않다.

【발명의 상세한설명】

【기술적 과제】

이에， 본 발명자들은 퇴행성 신경질환에서 SphKl의 역할을 밝히기 위해서 예 의 노력을 기울인 결과， SphKl은 C0X2(cyclooxygenase 2)의 아세틸화를 증가시킴으 로써 신경염증 종결 조절 인자의 분비를 촉진하고, 결과적으로 M2 -유사한 표현형의 미세아교세포로의 전환을유도함으로써 발휘된다는 것을 발견하였다. 또한， 세의 뇌 에서 SphKl을 증가시키면 C0X2의 아세틸화가 증가되고， 결과적으로 신경아교세포를 통한 Ai3 식작용이 개선되어 인지 장애를 개선할수 있다는 것을 확인하고 본 발명 을완성하게 되었다. 따라서， 본 발명의 목적은 C0X2(cyclooxygenase-2) 아세틸화제를 유효성분으 로포함하는 퇴행성 신경질환 예방또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다. 또한， 본 발명의 목적은 C0X2(cyclooxygenase-2) 아세틸화제로 구성되는 퇴 행성 신경질환 예방또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 C0X2(cyclooxygenase-2) 아세틸화제로 필수적으로 구성되는 퇴행성 신경질환 예방또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른목적은 하기 단계를 포함하는 퇴행성 신경질환 예방또는 치 료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다:

(a) SphKl의 mRNA또는 단백질을 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단 계; (b) 시험물질을 처리한세포와처리하지 않은세포에서 상기 SphKl의 mRNA또는 단백질의 발현량을측정하는 단계; (c) 시험물질을처리하지 않은세포와 비교해 상 기 SphKl의 mRNA또는 단백질의 발현량을 증가시킨 물질을 선별하는 단계; (d) 상기 (c) 단계에서 선별된 시험물질을 C0X2 단백질을 발현하는 세포에 처리하는 단계; (e) 시험물질을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포에서 상기 C0X2의 아세틸화 정도 를측정하는 단계; 및 (f) 시험물질을 처리하지 않은세포와비교해 상기 C0X2단백 2019/182191 1»（：1^1{2018/004640

3

질의 아세틸화 정도를 증가시킨 물질을 퇴행성 신경질환 예방또는 치료제로 선별하 는 단계 . 본 발명의 다른 목적은 (3) 퇴행성 신경질환이 의심되는 환자로부터 생물학 적 시료를 제공하는 단계; ( 상기 시료에서 31)^1의 1^1? 또는 단백질의 발현 수 준을 측정하고 00X2의 아세틸화 정도를 측정하는 단계 ; 및 ( 상기 3? 1의 요 또는 단백질의 발현수준 및 (1)X2의 아세틸화 정도를 정상인과 비교하여 그 정도가 감소된 환자를 퇴행성 신경질환에 걸린 것으로 판정하는 단계를 포함하는， 퇴행성 신경질환 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 제제를 제조하기 위한 (1供2(0% 10 ₍ »7요61½36-2) 아세틸화제의 용도를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 (1次2(0% 10¥0¾611336-2) 아세틸화제를 포함하는 조성 물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경 질환 치료 방법을 제공하는 것이다.

【기술적 해결방법】

상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (1次2( ；% 10 ₍ »7융611336-2) 아세틸화제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 (1次2( ； 10이0¾61 36-2) 아세틸화제로 구성되는 퇴행성 신경 질환 예방또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 0供2 % 100¾¾¥336-2) 아세틸화제로 필수적으로 구성되는 퇴행 성 신경질환 예방또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기 단계를 포함하는 퇴 행성 신경질환 예방또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다:

(3) 1)此1의 또는 단백질을 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단 계; ( 시험물질을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포에서 상기

단백질의 발현량을 측정하는 단계; (0 시험물질을 처리하지 않은 세포와 비교해 상 기 으1)狀1의 쇼또는 단백질의 발현량을 증가시킨 물질을 선별하는 단계; ((1) 상가 (0) 단계에서 선별된 시험물질을 00X2 단백질을 발현하는 세포에 처리하는 단계; 2019/182191 1»（그1^1{2018/004640

4

(&) 시험물질을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포에서 상기 0)X2의 아세틸화 정도 를측정하는 단계; 및 (0 시험물질을 처리하지 않은세포와비교해 상기 00X2단백 질의 아세틸화 정도를 증가시킨 물질을 퇴행성 신경질환 예방또는 치료제로선별하 는단계. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (3) 퇴행성 신경질환이 의심되는 환자로부터 생물학적 시료를 제공하는 단계; 0)) 상기 시료에서 31)^1의 단백질의 발현 수준을 측정하고 0)X2의 아세틸화 정도를 측정하는 단계; 및 ((：) 상기 1)狀1의 011¾桃또는 단백질의 발현수준 및 (1)X2의 아세틸화 정도를 정상 인과 비교하여 그 정도가 감소된 환자를 퇴행성 신경질환에 걸린 것으로 판정하는 단계를포함하는， 퇴행성 신경질환진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 퇴행성 신경질환 예방또 는 치료용 제제를 제조하기 아세틸화제의 용도를 제공 한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은

아세틸화제를 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환 치료 방법을 제공한다. 이하, 본 발명에 대하여 보다상세히 설명한다. 본 발명은 (1¾2(0 ₍ ：】0¥ 용611336-2) 아세틸화제를 유효성분으로 포함하는 퇴 행성 신경질환 예방또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한본 발명은 (1次2(0 10¥0¾611336-2) 아세틸화제로 구성되는 퇴행성 신경 질환 예방또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 (^(次2 7010¥0¾611크36-2) 아세틸화제로 필수적으로 구성되는 퇴행 성 신경질환 예방또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 일실시예에 따르면， 본 발명자들은 신경세포에서 스핑고신 카이나 제 1(31) 1 03 ½ 11336 1 , 1)111 )의 발현이 저하되면 00X2 아세틸화 및 염증반응 을 해소하는 신경염증 종결 조절 인자의 분비가 저하되어 비정상적인 염증반응들이 일어나 알츠하이머-유사의 병변이 나타난다는 것을 확인하였다. 반면에, 31)볘1의 발 현이 증가되면 신경세포에서 C0X2 아세틸화 및 염증반응을 해소하는 신경염증 종결 조절 인자의 분비 증가되고， 미세아교세포의 기능 회복 및 이로 인한 A|3 식작용이 향상되어 결과적으로 알츠하이머-유사 병변이 완화된다는 것을 확인하였다. 본 발명의 다른 일실시예에 따르면， 알츠하이머성 신경세포에서는 C0X2의 아 세틸화가 저하되어 있으며, 이러한 신경세포에서의 C0X2 아세틸화가 SphKl에 의해 특이적으로 조절된다는 것을 확인하였다. 즉， 신경세포의 SphKl은 [ ^w C]acetyl-CoA 의 존재하에서 acetyl -CoA의존적인 아세틸트랜스퍼라제 (acetyl transferase) 활성을 나타냈으며, 결과적으로 C0X2의 아세틸화를 증가시키는 작용을 나타냈다. 또한， SphKl는 C0X2의 아세틸화를 통해 신경염증 종결 조절 인자의 분비를 조절하는 것으 로 확인되었다. 본 발명의 다른 일실시예에 따르면， SphKl에 의한 C0X2의 아세틸화는 C0X2의 아미노산서열 중 565번째 세린에서 나타난다는 것을 확인하였다. 본 발명에서 상기 C0X2의 아미노산 서열은 GeneBank accession No.AAR23927.1을 통해서 확인할 수 있 다. 이와 같이， ( 0 신경세포에서 3? 1이 증가되면 00X2 아세틸화가 증가되어 신경염증종결 조절 인자의 분비가촉진되며, 결과적으로 퇴행성 신경질환의 진행이 효과적으로 차단될 수 있다는 것 및 의한 0)X2의 아세틸화는 0)X2의 아미노산서열 중 565번째 세린에서 나타난다는 것은, 본 발명자가본 발명을 통해 서 처음으로공개하는 것이다. 따라서 , 본 발명에서 상기 00X2 아세틸화제란 0)X2의 아미노산서열 중 어느 하나 이상의 아미노산의 아세틸화를유도하는 물질을 의미하며， 바람직하게는 31 ₎ 1 의 활성 또는 발현을증진시키거나 00X2 아세틸화를유도하여 아밀로이드- 13의 침착 을 억제하고, 신경세포에서 신경염증 종결 조절 인자의 분비를 촉진하는 효과를 나 타내는 것을특징으로 할수 있다.

또한， 본 발명에서 상기 0)X2 아세틸화제는 바람직하게는 (1)X2의 565번째 세 린을 아세틸화시키는 것을특징으로 할수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 00X2 아세틸화제는 바람직하게는 하기 화학식 1로 표시되는화합물인 것을특징으로 할수 있다.

[화학식 1] 2019/182191 1»（：1^1{2018/004640

6

상기 식에서，

¾은 수소， 치환 또는 비치환의 아~（：10의 직쇄 또는 측쇄의 알킬 또는 -] \ ₂ ?0 ₃ 이며;

¾는 수소 또는 치환또는 비치환의 다~（：10의 직쇄 또는 측쇄의 알킬이며; 상기 II은 1~15의 정수이다. 여기서， 상기 ’치환 또는 비치환'에서의 ’치환’은 중수소， 시아노기， 할로겐 기， 히드록시기， 니트로기， 탄소수 1 내지 24의 알킬기, 탄소수 1 내지 24의 할로겐 화된 알킬기 , 탄소수 2 내지 24의 알케닐기 , 탄소수 2 내지 24의 알키닐기， 탄소수 1 내지 24의 헤테로알킬기 , 탄소수 6 내지 24의 아릴기， 탄소수 7 내지 24의 아릴알 킬기， 탄소수 2 내지 24의 헤테로아릴기 또는 탄소수 2 내지 24의 헤테로아릴알킬 기， 탄소수 1 내지 24의 알콕시기, 탄소수 1 내지 24의 알킬아미노기， 탄소수 6 내 지 24의 아릴아미노기， 탄소수 1 내지 24의 헤테로아릴아미노기， 탄소수 1 내지 24 의 알킬실릴기, 탄소수 6 내지 24의 아릴실릴기, 탄소수 6 내지 24의 아릴옥시기로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 치환기로 치환되는 것을 의미한다. 한편， 본 발명에서의 상기 ’’치환 또는 비치환된 알 킬기”에서 상기 알킬기의 범위를 고려하여 보면, 알킬기의 탄소수의 범위는 각각 상기 치환기가 치환된 부분을 고려하지 않고 비치환된 것으로 보았을 때의 알킬 부분을 구성하는 전체 탄소수를 의미하는 것이다. 본 발명에서 상기 ¾은 바람직하게는 수소， （：1 7의 직쇄 또는 측쇄 알킬 또 는 - ¾灰） ₃ 일 수 있으며, 더 바람직하게는 수소， （：1 5의 직쇄 또는 측쇄 알킬 또는 - ¾的 ₃ 일 수 있으며， 가장 바람직하게는 수소 또는 - ¾灰） ₃ 일 수 있다. 본 발명에서 상기 ¾는 바람직하게는 수소 또는 치환 또는 비치환의 （：1 7의 직쇄 또는 측쇄의 알킬일 수 있으며， 더 바람직하게는 수소 또는 치환 또는 비치환 의 에5의 직쇄 또는 측쇄의 알킬일 수 있으며， 보다 더 바람직하게는 （：1 3의 직 쇄 또는측쇄의 알킬일 수 있으며, 가장바람직하게는 메틸일 수 있다. 본 발명에서 상기 II은 바람직하게는 3~15의 정수일 수 있으며， 더 바람직하 게는 7~15의 정수일 수 있으며， 보다더 바람직하게는 9~13의 정수일 수 있으며， 가 장바람직하게는 10~12일 수 있다. 본 발명에서 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 진행성 핵상 마비， 다계통 위축증， 감람핵-뇌교-소뇌 위축증 (0ᄄ시， 샤이-드래거 증후군, 선조체 -흑질 퇴행증， 헌팅톤병， 근위축성 측색 경화증 본태성 진전증， 피질-기저핵 퇴행증, 미만성 루이 소체 질환， 파킨스-산名 -치매 복합증， 픽병， 뇌허혈 및 뇌경색 으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 00X2아세틸화제를 단독으로 함유하거나또 는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체， 부형제 또는 희석제를추가로 함유할수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대， 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여 용 담체를 추가로 포함할 수 있다 . 경구 투여용 담체는 락토스， 전분， 셀룰로스 유 도체， 마그네슘스테아레이트， 스테아르산등을포함할수 있다. 또한， 비경구 투여 용담체는물, 적합한오일， 식염수， 수성 글루코스 및 글리콜등을포함할수 있으 며, 안정화제 및 보존제를추가로포함할수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소 나트륨， 아황산나트륨또는 아스코르브산과 같은항산화제가 있다. 적합한보존제로 는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington’ s Pharmaceutical Sciences, 19th ed. , Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995) . 본 발명의 약학적 조성물은 인간을 비롯한포유동물에 어떠한 방법으로도 투 여할 수 있다. 예를 들면， 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투 여방법으로는 이에 한정되지는 않으나， 정맥내， 근육내， 동맥내, 골수내, 경막내， 심장내， 경피， 피하， 복강내， 비강내， 장관, 국소， 설하 ^' 또는 직장내 투여일 수 있 다. 바람직하게는본 발명의 약학적 조성물은 경구투여될 수 있다. 예컨대， 본 발명 의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자 ( 하는 방법, 또는 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다. 경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립， 정제, 환제， 당 의정제, 캡슐제， 액제, 겔제, 시럽제， 슬러리제， 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방 법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어 , 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형 제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함 으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈， 덱 스트로즈, 수크로즈， 솔비톨， 만니톨， 자일리톨， 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하 는 당류와 옥수수 전분， 밀 전분， 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀 룰로즈 , 메틸 셀룰로즈 , 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸- 셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한， 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈， 한천， 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가， 본 발명의 약학적 조성 물은 항응집제, 윤활제， 습윤제， 향료， 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있 다. 비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제， 크림제， 로션제, 외용연고제， 오일 제， 보습제， 겔제， 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제 형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company , Easton, Pennsylvania 18042 , Chapter 87： Blaug, Seymour)에 기재되어 있 다. ^' 본 발명의 약학적 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자 에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분，할 치 료 방법 (fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물의 전체 용량은 1일당 환자 체중 lkg 당 약 O.Olug 내지 1 ,000 mg, 가장 바람직하게는 0. 1 ug내지 100 mg일 수 있다. 그러나상기 본 발명 의 약학적 조성물의 투여 용량은 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령， 체중, 건강상태, 성별， 질환의 중증도， 식이 및 배설율등다양한요인들을고려하 여 환자에 대한유효 투여량이 결정되는 것이므로， 이러한 점을 고려할 때 당 분야 의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명의 약학적 조성물을 퇴행성 신경질환 치료제로서의 특정한용도에 따른 적절한유효투여량을 결정할수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형， 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다. 본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) SphKl의 mRNA 또는 단백질을 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단 계 ;

(b) 시험물질을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포에서 상기 SphKl의 mRNA 또는 단백질의 발현량을측정하는 단계;

(c) 시험물질을 처리하지 않은 세포와 비교해 상기 SphKl의 mRNA또는 단백 질의 발현량을증가시킨 물질을선별하는 단계;

(d) 상기 (c) 단계에서 선별된 시험물질을 C0X2 단백질을 발현하는 세포에 처리하는 단계;

(e) 시험물질을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포에서 상기 C0X2의 아세틸 화 정도를측정하는 단계 ; 및

(f ) 시험물질을 처리하지 않은 세포와 비교해 상기 C0X2 단백질의 아세틸화 정도를증가시킨 물질을 퇴행성 신경질환 예방또는 치료제로선별하는 단계. 본 발명에서 상기 SphKl의 mRNA 또는 단백질을 발현하는 세포는 SphKl의 mRNA또는 단백질이 내인적으로 (endogenous) 발현 또는 일시적으로 고발현된 세포를 포함하며， 또는 SphKl을 암호화하는 핵산을 세포 내에 도입하여 형질전환시킴으로써 과발현되도록 하여 사용할수 있으나, 이에 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에서 ‘단백질’ 은 ‘폴리펩타이드 (polypept ide)’ 또는 ‘펩타이드 (pept ide)’ 와 호환성 있게 사용되며， 예컨대， 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다. 상기 ‘폴리뉴클레오티드 (polynucleot ide)’ 또는 ‘핵산’ 은 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보 뉴클레오티드 (DNA) 또는 리보뉴클레오티드 (RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는 한， 자 연적으로 생성되는 뉴클.레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클 레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다. ' mRNA’는 단백질 합성 과정에서 특정 유전 자의 염기서열의 유전 정보를 폴리펩티드를 형성하는 리보솜으로 전달하는 RNA이다. 본 발명 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “시험물질” 은 C0X2의 아세틸화에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 siRNA(smal 1 interference RNA) , shRNA( short hai rpin RNA) , miRNA(mi croRNA) , 리보자임 (r ibozyme) , DNAzyme , PNA(pept ide nuclei c aci ds) , 안티센스 올리고뉴클레오타이드， 항체 , 앱타머， 천연추출물 또는 화학물질을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 또한， 상기 (a) 단계에서 사용되는 세포는 실험동물의 형태로 제공될 수 있 으며， 이 경우본 발명의 스크리닝 방법은 상기 실험동물에게 퇴행성 신경질환을 유 도하는 단계를 추가로 포함하며 , 시험물질과의 접촉은 비경구 또는 경구투여， 정위 주사를 포함하나， 이로 제한하는 것은 아니며， 당업자라면 시험물질을 동물에게 테 스트하기 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다. 시험물질을 처리하는 것은 시험물질을 세포 또는 조직 배양 배지에 추가한 후 세포를 일정 시간 배양하는 것을 의미한다. 상기 세포가 실험동물 형태로 제공될 때, 시험물질과의 접촉은 비경구 또는 경구 투여， 정위주사를 포함하는 이로 제한되 는 것은 아니며, 당업자라면 시험물질을 동물에게 테스트하기 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다. 본 발명의 상기 (b) 단계에서 SphKl의 mRNA 발현량 측정은 RT-PCR , 정량적 또는 반정량적 RT-PCR(Quent i tat i ve or semi -Quent i tat ive RT-PCR) , 정량적 또는 반 정량적 리얼 타임 RT-PCR(Quent i tat ive or semi-Quent i tat ive real-t ime RT-PCR) , 노던 블롯 (northern bl ot ) 및 DNA또는 RNA 칩 (chip)을 이용하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 상기 (b) 단계에서 SphKl의 단백질 발현량 측정은 웨스턴 블롯, ELISA , 방사선면역분석법， 방사면역확산법 , 오우크레로니⑴ uchter lony) 면역확산법， 로케트 면역전기영동， 면역조직화학염색， 면역침전분석， 보체고정분석, FACS 및 단 백질 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 방법을 이용하여 측정될 수 있으 나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 상기 (c) 단계에서 C0X2 단백질을 발현하는 세포는 C0X2 단백질이 내인적으로 (endogenous) 발현 또는 일시적으로 고발현된 세포를 포함하며, 또는 C0X2를 암호화하는 핵산을 세포 내에 도입하여 형질전환시킴으로써 과발현 되도록 하여 사용할수 있으나, 이에 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 상기 (e) 단계에서 C0X2의 아세틸화정도를 측정하는 방법은 방사 선자동사진법， l iquid scint i l lat ion count ing, 분자량 분석 및 액체 색층 분석 매 스 분석법으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서는 위의 ^· 방법 중 [ ¹⁴ C]acetyl-CoA 존재 하에서 반응시킨 신경세포의 C0X2 단백질을 면역침강 법을 이용하여 분리 후, [ ¹⁴ C]에 대해 l iquid scint i l lat ion count ing을사용하여 C0X2의 아세틸화 정도를평가하였다. 본 발명의 일실시예에 따르면, SphKl의 활성화는 C0X2의 아세틸화를 촉진하 여 신경세포에서 신경염증 종결 조절 인자의 분비를 유도함으로써 신경염증을 완화 하는 효과가 발휘된다. 또한, SphKl의 활성화는 Ai3의 식작용을 나타내는 미세아교 세포의 기능을 회복시켜 A|3의 축적에 의해 나타나는 다양한 퇴행성 신경질환의 병 변을 완화하는 효과가 있다. 따라서， 상기 ( _a ) 내지 (c) 단계를 통해 SphKl의 발현, 또는 효소의 활성을 증진시키는물질을 선별한후， 상기 (d) 내지 (0 단계를통해 C0X2의 아세틸화 및/ 또는신경염증종결 조절 인자의 분비를 시키는물질을 다시 한번 선별한다면， 퇴행 성 신경질환에 대해 더 우수한 예방 또는 치료효과를 나타내는 물질을 스크리닝 할 수 있다. 전술한 바와 같이, SphKl에 의한 C0X2의 아세틸화는 C0X2의 아미노산 서열 중 565번째 세린에서 나타나는 것이므로, 본 발명에서 상기 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료제 스크리닝 방법은 C0X2의 565번째 세린을 아세틸화 시키는 시험물질을 선별하는 것을특징으로 할수 있다. 본 발명은 또한 (a) 퇴행성 신경질환이 의심되는 환자로부터 생물학적 시료 를 제공하는 단계 ; 2019/182191 1»（：1^1{2018/004640

12

( 상기 시료에서 요1)볘1의 미요· 또는 단백질의 발현 수준을 측정하고 00X2 의 아세틸화 정도를 측정하는 단계; 및

(0) 상기 요1)能1의 쇼 또는 단백질의 발현수준 및 0)X2의 아세틸화 정도를 정상인과 비교하여 그 정도가 감소된 환자를 퇴행성 신경질환에 걸린 것으로 판정하 는 단계를 포함하는, 퇴행성 신경질환 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한 다. 본 발명의 일실시예에 따르면， 알츠하이머 동물의 뇌에서 0)X2의 아세틸화 및 신경염증 종결 인자의 분비가 야생형과 비교해 현저히 감소되어 있는 것을 확인 할 수 있었다. 따라서， 퇴행성 신경질환이 의심되는 환자로부터 수득한 생물학적 시 료에서 정상인과 비교해 31>11또1의 또는 단백질의 발현이 감소되어 있고 (1)X2의 아세틸화가 저하되어 있다면 해당 환자에게서 퇴행성 신경질환이 진행되고 있는 것 으로 판정할 수 있다.

또한， 단백질의 발현 및 0)X2의 아세틸화가 저하되어 있 을 뿐만 아니라, 신경염증 종결 조절 인자의 발현량이 감소되어 있는 것을 추가로 확인한다면 보다 정확하게 퇴행성 신경질환이 진행되고 있는지 여부를 판정할 수 있 다. 본 발명에서 상기 생물학적 시료란 뇌 조직， 뇌 세포， 뇌 척수액, 전혈， 혈 청， 혈장， 타액, 객담, 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아 니며， 바람직하게는 뇌 조직， 뇌 세포 또는 뇌 척수액일 수 있다. 상기 ( 단계에서 단백질의 발현 수준을 측정하는 방법 및

(：(次2의 아세틸화 정도를 측정하는 방법에 대해서는 전술한 바와 같다. 또한， 본 발명은 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 제제를 제조하기 위한 (1次2( 0}^：10¥0¾611336-2) 아세틸화제의 용도를 제공한다 . 또한, 본 발명은 0X)X2 ( 10¥0¾611336-2) 아세틸화제를 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 상기 ‘유효량’ 이란 개체에게 투여하였을 때， 퇴행성 신경질환의 개선, 치료, 예방, 검출, 진단또는 퇴행성 신경질환의 억제 또는 감소효과를 나타 내는 양을 말하며, 상기 ‘개체’ 란동물， 바람직하게는포유동물, 특히 인간을포함 하는 동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포， 조직， 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는상기 효과가필요한환자 (patient) 일 수 있다.

본 발명의 상기 ‘치료’ 는 퇴행성 신경질환또는 퇴행성 신경질환의 증상을 개선시키는 것을포괄적으로 지칭하고, 이는 퇴행성 신경질환을 치유하거나, 실질적 으로 예방하거나， 또는상태를 개선시키는 것을포함할수 있으며， 퇴행성 신경질환 으로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완화시키거나, 치유하거나 예 방하는 것을포함하나, 이에 제한되는 것은아니다. 본 발명의 용어 을 포함하는 (comprising)’ 이란 ‘함유하는’ 또는 ‘특징 으로하는’ 과동일하게 사용되며， 조성물또는 방법에 있어서， 언급되지 않은추가 적인 성분 요소 또는 방법 단계 등을 배제하지 않는다. 용어 로 구성되는 (consisting of)’ 이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소， 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 ‘필수적으로 구성되는(essential ly consisting of)’ 이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서， 기재된 성분 요소 또는 단계와 더불 어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는성분 요소또는 단계 등을 포함하는 것을 의미한다. ^'

【발명의 효과】

본 발명의 C0X2 아세틸화제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은， 신경세포에서의 신경염증종결 조절 인자분비를촉진 하여 신경염증을 완화하는 효과가 있어， 퇴행성 신경질환의 예방또는 치료제 개발 에 매우유용하게 사용될 수 있다.

【도면의 간단한설명】

도 는 SphKl과 acety卜CoA의 결합을평가한 결과이다.

도 내는 SphKl과 acetyl-CoA의 해리도를 평가한결과이다.

도 1C는 SphKl, acetyl -CoA, sphingosine의 존재하에 C0X2 아세틸화를 평가 한결과이다 ( [ ¹⁴ C] 아스피린을 처리한시험군을 양성 대조군으로설정).

도 1D는 LC-MS/MS를 이용해 SphKl, acetyl-CoA및/또는 sphingosine의 존재 하에 C0X2의 아세틸화에 의한분자량 변화를 확인한.결과이다.

도 내는 LC-MS/MS를 이용해 SphKl, acetyl-CoA및/또는 sphingosine의 존재 2019/182191 1»（：1^1{2018/004640

14

하에 0）X2의 3565 잔기에 아세틸화가 일어나는 것을 확인한 결과이다.

도 는 （：（及2단백질의 565에 돌연변이를 일으켰을 때， 아세틸화가 잘 일어 나지 않는 것을 확인한 결과이다. 도 2쇼는 야생형（肝） 신경세포에 31）狀1 처리 하였을 때， 3] ₃ 此1 및 31止他의 발현을 평가한 결과이다.

도 28는 신경세포에 1）狀1 묘 를 처리 하였을 때， 00X2 단백질의 아세틸 화를 확인한 결과이다（[ ¹⁴ 이 아스피린을 처리한 야생형 신경세포을 양성 대조군으로 설정）.

도 2（3는 신경세포에 하였을 때， 1 ， 射 빛 1切1）1 등 신경염증 종결 조절 인자比 분비를 확인한 결과이다.

도 21）는 신경세포에 ^요 를 처리 하였을 때， 1 -1此/! 를 이용하여

15생-1^ 의 분비를 확인한 결과이다. 도 3쇼는 야생형， 요 및 £1）¾ 1 당 마우스에서 유래한 신경세포에서 00X2 단백질의 아세틸화 어세이를 수행한 결과이다. [ ¹⁴ 0] 아 스피린을 처리한 신경세포을 양성 대조군으로 설정했다.

도 3묘는 야생형, 쇼 1 ³ /?31, APP/PSl/SphKl 용 및 31止災1 용 마우스에서 래한신경세포의 CM에서 1^쇼4 및 £：1의 단백질량을 측정한 결과이다.

도 3〔:는 야생형 요 마우스에서 래한신경세포에서 I乂:-MS/MS를 이용하여 15-묘-1 쇼4의 양을 특정한 결과이다. 도 4쇼는 야생형， 쇼 ! ⁵ 序31， APP/PSl/SphKl 요 및 $1）11X1 용 마우스의 뇌 피질에서 미세아교세포（比 ₃ 1）의 면역형광 이미지（왼쪽） 및 이를 정량화한 결과（오른 쪽）를 나타낸 것이다.

도 48는 마우스의 뇌 피질에서 별아교세포犯 쇼：?）의 면역형광 이미지（왼쪽） 및 이를 정량화한 결과（오른쪽）을 나타낸 결과이다.

도 4（：는 마우스의 뇌에서 Ml 및 M2 염증성 마커의 수준을 평 가한 결과이다（ 1 마커: TNF-a 11-^, 11 _> -6 3 ^08, 면역조절 인자 : 比10, 1^2마커: 11厂4， （1 용1）. 도 5쇼는 쇼 序 및 쇼므 此 용 마우스의 뇌 피질에서 쇼兵 플라 크 주위의 미세아교세포를 확인한 결과이다. 도 5B는 야생형, APP/PS1, APP/PSl/SphKl tg 및 SphKl tg 마우스의 뇌 피질에서 미세아교포의 식작용능력을 확인한 결과이다.

도 5C는 APP/PS1 및 APP/PSl/SphKl tg 마우스의 뇌 피질에서 미세아교 세포의 리소좀내에서 A|3플라크가소화되는 것으로 확인한결과이다.

도 5D는 야생형， APP/PS1, APP/PSl/SphKl tg 및 SphKl tg 마우스의 미 세아교세포에서 A|B 분해 효소 (NEP, MMP9 및 IDE) 및 식작용 마커 (CD36)의 mRNA발현을 확인한 결과이다.

도 5E는 야생형， APP/PS1, APP/PSl/SphKl tg 및 SphKl tg 마우스의 미 세아교세포에서 식작용마커 (CD36)의 단백질 발현을 확인한결과이다.

도 5F는 APP/PS1 및 APP/PSl/SphKl tg 마우스의 뇌 피질에서 식작용이 일어난 AP플라크의 크기를 확인한 결과이다. 도 6A는 APP/PS1 및 APP/PSl/SphKl tg 마우스의 뇌 수질 및 해마에서 티오플라빈 S ThioS, A|B 플라크)의 면역형광염색을 나타내는 도면과 (왼쪽)， AP가 차지하고 있는 면적을 정량한 결과이다 (오른쪽， n=6/그룹).

도 6B는 마우스 뇌에서 A|340 및 AP42의 축적을 면역형광염색으로 분석한 결과이다.

도 6C는 마우스 뇌에서 AP40 및 AP42의 축적을 ELISA 키트로 분석한 결 과이다.

^' 도 6D는 맥관장애 정량화한 결과이다.

도 6E는타우단백질 정량화한 결과이다.

도 6F-I는 각 동물군의 뇌 피질에서 시냅토파이신 (F)， MAP2(G), 시냅신 1 (H) 또는 PSD95 (I)를 면역형광염색 및 정량화하여 나타낸 결과이다. 도 7A는 야생형 (n = 14)， APP/PS1 (n = 12)， APP/PSl/SphKl tg (n = 12)， 및 SphKl tg (n = 13) 마우스의 모리스 워터 메이즈 테스트를 통한 학습 및 기억력 평가결과이다.

도 7B~D는 시험 11일째에 표적 플랫폼에서 소요된 시간®), 다른 사분면에 서 소요된 시간 (C)을측정하고， 경로의 길이, 수영속도 및 60초 동안에 각각의 동물 이 작은타겟 지역으로 들어간횟수 (D)를측정한결과이다.

도 7E는 테스트 10일째에 수영 경로를 나타낸다.

도 7F는 fear conditioning시험 동안에 contextual 및 tone task 결과를 나 타낸 것이다. 도 7（3는 오픈필드 테스트 동안에 벽면 및 중심부에서 소요된 시간을 측정한 결과와중심부의 비율을 나타낸 결과이다.

도 71 ^· !는오픈필드 테스트동안에 마우스의 이동 경로를 나타낸 것이다. 도 8쇼는 00X2 아세틸화제의 화학구조를 나타낸 도면이다.

도 88는 00X2 아세틸화제 처리에 의한 신경염증종결 조절 인자（SPMs） 분 비를 확인한결과이다.

00X2 아세틸화를 일으키는 것을 확인한 결과이다.

도 81）는 1£-1此/1 를 이용해 N-acetyl 31 1뇨 0 1½의 존재하에 0）X2의 5565 잔기에 아세틸화가 일어나는 것을 확인한결과이다. 도 9쇼는 야생형, N-acetyl 31止 空0 1½, 1 ᅵ720

（3油 0 1½ 유도체） 및 ! ³ 를 주사한 마우스의 뇌 피질에서 미세아교세포（¾ ） 의 면역형광 이미지（왼쪽） 및 이를 정량화한결과（오른쪽）를 나타낸 것이다.

도 98는 마우스의 뇌 피질에서 별아교세포（GFAP）의 면역형광 이미지（왼쪽） 및 이를 정량화한결과（오른쪽）을나타낸 결과이다.

도 9（：는 쇼 序 및 쇼므므序 에 31 매0 1½， 720

（31） 1 _½0 1½ 유도체） 및 311 ³ 를 주사한 마우스의 뇌 수질 및 해마에서 티오플라빈 5（^03, 플라크）의 면역형광염색을 나타내는 도면과（위쪽）， 차지하고 있 는 면적을 정량（아래쪽）한 결과이다.

N-acetyl 313 1½0 1½， 1 720 모리스 워터 메이즈 테스트를 통 한학습 및 기억력 평가결과이다.

【발명의 실시를 위한 형태】

이하본 발명을상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다. á실험방법 ñ

1. 마우스

IACUCCKyungpook National University Institutional Animal Care and Use Committee)에서 마우스실험에 대한승인을 받았다. C57BL/6 마우스 (Charles River, UK)를 바탕으로 APPswe(hAPP695swe) 또는 PS 1 (presenilin- 1 M 146 V)¾· 과발현시킨 형질전환 마우스 라인을 이용하였다 [이하, APP 마우스: APPswe를 과 발현하는 마우스， PS1 마우스: presenilin-lM146V를 과발현하는 마우스; GlaxoSmithKline ]

SphKl tg (SphKl 유전자 과발현 마우스)와 APP 마우스 및 APP/PS1 마우 스와교배시켜 APP/PSl/SphKl tg마우스를 제조하였다.

2. SphK siRNA처리

SphKl siRNA (Dharmacon SMART pool) 및 siRNA 대조군 (Dharmacon) 을 E18 C57BL/6 마우스의 신경세포에 48시간 동안 처리 하였다. 신경세포를 수집 하여 아세틸화 및 신경염증종결 조절 인자를 분석 하였다.

3. 면역형광법

마우스의 대뇌 및 해마를 고정 후, 아밀로이드 -p(Ap) 42에 대한 항- 20G10 (마우스， 1:1000) 및 A|3 40에 대한 항 -G30(토끼， 1: 1000)， 항- MAP2(닭, 1:2000)， 항- Synaptophysin (마우스, 1: 100), 항- Synapsinl (토끼, 1:500), 항 -PSD95(마우스, 1: 100), 항- Iba-1 (토끼, 1:500)， 항- GFAP (토끼， 1:500)을 함께 배 양하였다. 상기 부위를 Fluoview SV1000 이미징 소프트웨어 (Olympus FV1000, Japan)를 장착한 레이저 스캐닝 공초점 현미경 또는 Olympus BX51 현미경을 이용 하여 분석하였다. Metamorph software(Molecular Devices)를 이용하여 총 조직의 넓이에 대한 염색된 부위의 넓이의 퍼센트를 정량화하였다.

4. 정량적 리얼타임 PCR

상업적으로 이용 가능한 RNeasy 키트 (QIAGEN)를 이용하여 제조사의 메뉴 얼에 따라 RNA를 추출하였다. cDNA는 상업적으로 이용 가능한 cDNA 키트 (Takara Bio Inc.)를 이용하여 전체 RNA 5yg 으로부터 합성되었다. 정량적 리얼타 임 PCR은 Corbett research RG-6000 real-time PCR instrument을 이용하여 수 행했다.

5. 웨스턴블롯

웨스턴 블롯팅을 이용하여 상기 단백질들의 발현을 분석하였다. 우선 ◦036(1\[0\013 51010510313) 및 |3 -액틴 크 크 011å)에 대한 항체를 이용하였고, 밀도 정량화 (densitometric quantification)는 ImageJ 소프트웨어 (US National Institutes of Health)를 이용하여 수행하였다.

6. 면역효소검사법

상업적으로 이용 가능한 ELISA 키트 (Biosource)를 이용하였고， 마우스의 반 구를 균질화하여 0.02M의 구아니딘 (guanidine)을 포함하는 완충액에 넣어 A|3 ELISA를 위한 시료를 준비 하였다. 신경염증 종결조절 인자 측정을 위해서는 마우 스 대뇌로부터 신경세포를 배양 후 Conditioned media (CM)를 준비하였다. 이 후, 제조사의 메뉴얼에 따라， A|3 및 SPM에 대한 ELISA를수행하였다.

7. 행동실험

학습 및 기억에 대한 잠재적 효과를 확인하기 위하여， MWM(Morris water maze)와 fear conditioning 실험을 수행하였다. MWM는 마우스에 대하여 10일 동 안 하루에 4번씩 과제를 학습시켰고， 11일째 되는 날에 플랫픔을 제거하고, 탐침시 험 (probe trial)을 수행하였다. Fear conditioning은 첫째 날은 마우스를 conditioning chamber에 넣고, 소리 자극 (10 kHz, 70 dB) 및 전기자극 (0.3 mA, 1 s)을 주었다. 둘째 날은 첫째 날과 같은 conditioning chamber에서 자극 없이 공간 에 대한 기억력을 확인했고, 셋째 날은 다른 conditioning chamber에서 소리자극만 주었을 때 두려움에 대한 기억력 테스트를 수행하였다. 운동능력과 즉각적인 활동력 을 평가하기 위한오픈필드 테스트를수행하였다. 오픈필드 테스트는마우스를 10분 동안사각형의 박스에 넣어 전반적인 운동은력과시간 및 거리를 측정하였다.

8. COX2아세틸화정도측정 방법

[ ^u C]acetyl-CoA존재 하에서 37 °C 1시간 반응시킨 신경세포의 COX2 단백 질을 면역침강법을 이용하여 분리한 후, [ ¹⁴ C]에 대해 liquid scintillation counting 을수행하였다.

8. Acetyltransferase의 효소학적 분석

SphKl의 acetyl-CoA 결합 활성을 10mM sphingosine의 존재 하에서 필터 결합 분석으로 분석 하였다. SphKl에 대한 [ ³ H] acety卜 CoA의 결합 속도 (Vbinding)를 acetyl-CoA농도로 나타내었다. 포화플롯의 비선형 회귀 분석은 K _cat (촉매 상수) 및 K _M (Michaelis-Menten 상수)를 이용하여 acetyl-CoA 및 SphKl 결합활성을나타내었다. 9. LC-MS/MS

신경세포에서 SphKl과 신경염증 종결조절 인자의 분비의 관계를 확인하기 위해, 9개월 된 WT, APP/PS1, APP/PSl/SphKl tg 및 SphKl tg 마우스로부터 신 경세포를 분리하였다. 신경세포를 초음파 처리하고 2.5mM acetyl-CoA (Sigma) (24시간， 37 ^° C)와 함께 배양하였다. 또한, CM은 SphKl siRNA또는 대조군 siRNA 로 처리한 신경세포로부터 수확 하였다. 각각의 세포 용해물 또는 CM의 200/d 분 액을 15-S ^~ LxA4-d5 (내부 표준， Cayman chemical) 용액 100/zg/m公 100/^, 1% 포름산 용액 100ul 및 600yl의 물을 혼합 한 후， 에틸아세테이트 4ml를 첨가 하였 다. vortexing과 centrifuging (13,200 rpm) 후 각각 10 분 동안， 혼합물을 2 시간 동안 deep freezer에서 동결시켰다. 유기 상층액을 분리하고， 질소 기류 하에서 건 조시켰다. 남은 용액을 LC-MS/MS 시스템에 주입 된 60% 아세토니트릴 용액으로 재구성 하였다. 이 샘플은 Agilent 1290 HPLC 시스템에 연결된 Agilent 6470 Triple Quad LC-MS/MS 시스템 (Agilent, Wilmington, DE， USA)을 사용하여 15-R-LxA4 농도 분석을수행하였다.

COX2의 아세틸화 ·부위를 확인하기 위해 trichroloacetic acid (Merck)로 COX2 효소를 침전시키고 건조시켰다. 건조 된 추출물을 l¾iL의 5M우레아용액에 재현탁하고 37 ^° C에서 0.1M 암모늄바이카보네이트 완충액을 lug 트 ^' 립신 (Promega) 과 함께 16시간 동안 배양했다. 그런 다음 샘플을 1M DTT (GE Healthcare)로 실 온에서 1시간동안 처리 한 다음 1M iodoacetamide (Sigma)로 1시간동안 알킬화 시켰다. 시퀀싱을 위해 단백질 샘플을 ZORBAX 300SB-C18 컬럼에 로드했다. BioTools 3.2 SR5 (Bruker Daltonics)로 펩타이드를 확인하였다.

9. COX2아세틸화제 처리

신경염증 종결조절 인자 측정을 위해서는 마우스 대뇌로부터 신경세포를 배 양 투 10nM N-acetyl sphingosine 1 phsosphate (Toronto Research chemical s , C262710) 및 N-acetyl sphingosine (Sigma, 01912)를 처리하여 CM을 준비하였다. COX2 아세틸화 분석을 위해서는 마우스 대뇌로부터 신경세포를 배양 후 2uCi [ ¹⁴ C]N-acetyl sphingosine (ARC, ARC 1024) 처리하여 준비하였다. 또한， 인 비보 ( In vivo) 실험을 위하여는 7개월령의 APP/PS1 마우스에 5mg/kg N-acetyl sphingosine (Sigma, 01912)， lmg/kg FTY720 및 3uM SIP를 4주 _. 동안 매일 복강주사를 통해 주입 하였다.

＜실험결과＞ 1. SphKl는 acetyltransferase로서 C0X2의 S565잔기에 아세틸화를유도함

SphKl의 acetyltransferase 활성을 확인하기 위해, 효소로부터의 아세틸기의 결합 및 해리 분석을수행 하였다. SphKl에 아세틸기의 결합은 acetyhCoA의 농도가 증가함에 따라포화되어 K _M 및 K _cat 값은 각각 58.2^ 및 0.0185 11 ^_1 이었다 （도 1A） . 평형 투석 실험 후， 결합된 아세틸기는 또한 농도 의존적으로 경쟁적인 유리 acetyl-CoA의 존재하에 acetyl -CoA： SphKl 복합체로부터 해리되었다. acetyl-CoA와 SpWQ의 이러한 해리는 높은 억제제 농도로 포화되어 6.8 의 K _D 값을 나타내었다 （도 IB）. ¾ 값 （즉, 결합 친화성）과 비교하여 더 낮은 K _D （즉, 해리 상수） 값은 SphKl의 acetyl transferase특성을 제시 하였다.

다음으로, C0X2와 관련하여 SphKl의 acetyl transferase 활성을 확인하기 위 해, 정제된 SphKl을 sphingosine의 존재 또는 부재하에 C0X2 및 [ ¹⁴ C] acetyl-CoA와 함께 배양 후 아세틸화를 측정하였다. 또한 C0X2 S516 잔기에 아세틸화를 일으킨다 고 알려진 아스피린을 양성대조군으로사용하여 아세틸화정도를 확인하였다. 도 1C 의 결과를 참고하면, SphKl이 Sphingosine 존재 하에서 C0X2에 대해 아스피린보다 더 높은 수준의 아세틸화를 유도하는 것을 확인할 수 있으며， 이는 SphKl이 acetyltransferase 활성을 나타내어 sphingosine 또는 sphingosine 중간체를 통해 C0X2에 아세틸화를유도할수 있음을나타낸다（도 1C）.

마지막으로， SphKl에 의해 아세틸화된 C0X2의 아세틸화 위치를 확인하기 위 해 SphKl , acetyl -CoA및 sphingosine을 C0X2에 처리하였다.

위와 같이， SphKl , acetyl-CoA 및 sphingosine을 처리한 C0X2는 아세틸기를 갖고， sphingosine 없이 처리한 C0X2는 아세틸기를 갖고 있지 않았다. 또한， SphKl 의 존재 하에서 C0X2의 펩타이드 560-GCPFTSFSVPDPELIK-575에 대한세린 565 （S565） 가 아세틸화 된 것으로 확인되었다 （도 1D,E）. 이의 인과 관계를 확립하기 위해 본 발명자는 C0X2의 S565를 Ala 565 잔기 （S565A）로 돌연변이 시킨 후， 아세틸화 분석 을수행했다. 야생형의 C0X2는 SphKl과 sphingosine에 의해 아세틸화되었지만 S565A 돌연변이된 C0X2는 SphKl 존재 하에서 아세틸화가 감소되었으며, 이러한 결과는 C0X2의 S565가 SphKl 매개 C0X2 아세틸화의 주요 표적 부위임을 나타낸다（도 1F）. 특히 SphKl에 의한 C0X2 S565의 아세틸화는 아스피린이 아세틸화시키는 위치（S516） 와는다른위치임을 확인 하였다.

2. 신경세포에서 SphKl을 억제하였을 때， 00X2아세틸화의 감소에 의해 신경 염증종결 조절 인자분비 감소를초래함

신경세포에서 SphKl과 C0X2 아세틸화의 상관관계를 보다 직접적으로 확인하 2019/182191 1»（：1^1{2018/004640

21

기 위해, 야생형 신경세포에 처리하고 00X2 아세틸화를 확인하였다. 31） 1 四쇼를 처리한 신경세포에서 0）X2 아세틸화가 감소하는 것을 확인 하였다 （도 2 .

다음으로 00X2 아세틸화에 의한 신경염증 종결 조절인자의 변화를 관찰하였 다. 요1）¾1 ^ 쇼를 처리한 신경세포로부터 유래한 신경염증 종결 조절 인자 인 느始4 및 이 감소되어 있음을 확인하였다（도 20.

또한, 比-1狀/1 를 이용하여 신경염증 종결 조절 인자를 측정하였을 때， 00X2 아세틸화에 의해 생성되는 15 -1^ 4가 1）出（1 ^ 쇼를 처리한 신경세포에서 감소되 어 있었다（도 21））. 즉， ¾） 1을 억제하였을 때， 00X2 아세틸화의 감소에 의해 신경 염증 종결 조절 인자（특히 15냉-1^ 4）가 감소하는 것을 확인 할수 있었다.

3. 알츠하이머 동물모델은 00X2 아세틸화 및 신경염증 종결 조절 인자 분비 가 감소되어 있고， 이는 51仙나과발현에 의해 개선됨

본 발명자들은 !）狀1 쇼 처리한 후 나타나는 상기 결과들이 알츠하이머 동물 모델에서도 일어나는지 확인하기 위해 9개월령 마우스에서 분리한 신경세포에 [ ¹⁴ 이 기-（：0요을 처리하고， （：（及2를 정제하여 아세틸화 정도를 분석하였다. 야생형 마우스와 비교해, 汗와 마우스의 신경세포에서는 낮은 정도의 00X2 아세틸화가 나타났고, 용 마우스의 신경세포에서는 0及2의 아세틸화가 증가되어 있었다（도 3시.

1^\4 및 먀 발현량은 야생형 신경세포로부터 유래한 에서보다 射 신경세포로부터 유래한 현저히 감소되어 있었으며, 신경세 포로부터 유래한 에서는 회복되어 있었다（도 3 . 또한， 1£-1路/1 를 이용하여 신 경염증 종결 조절 인자를 측정 하였을 때， 00X2 아세틸화에 의해 생성되는 15 -1 14가 알츠하이머 동물모델에서 감소되어 있었으며， 31）^1을 과발현 하였을 때 회복되어 있었다（도 30. 즉， 알츠하이머 동물모델에서 00X2 아세틸화 및 신경염 증 종결 조절 인자의 분비가 감소되어 있고， 이는 3? 1의 과발현에 의해 개선될 수 있음을 의미한다.

4. 증가된 31）^1이 汗 마우스에서 신경염증 종결 조절 인자를 분비함으 로써 신경 염증을조절함

본 발명자들은 증가된 31＞볘1이 신경염증 종결 조절 인자를 분비함으로써 신 경염증반응에 미치는 영향을 판단하기 위해서， 미세아교세포와 별아교세포의 변화를 관찰하였다. 요 마우스는 汗 마우스와 비교해 미세아교세포와 별아교세포의 현저한 저하를 나타내었다（도 4A,B）. 게다가, APP/PSl/SphKl tg마우 스는 APP/PS1마우스와비교해 전-염증성 Ml마커들과 면역 조절 사이토카인들의 감 소를 나타냈으며， 항-염증성 M2마커들의 발현이 증가되어 있었다（도 4C）.

종합적으로， 이러한 결과들은 SphKl과발현은 C0X2의 아세틸화를 유도함으로 써 신경염증 종결 조절 인자의 분비를 촉진하여 AD뇌에서 염증 반응을 개선할 수 있음을나타낸다.

5. SphKl과발현에 의해 분비된 신경염증 종결 조절 인자는 미세아교세포의 A兵식작용을조절함

증가된 SphKl에 의해 분비된 신경염증 종결 조절 인자가 Ai3로 미세아교세포 의 모집（recruitment）를 회복시키는지 여부를 판단하기 위해, 플라크주변의 미세아 교세포의 숫자를 정량화했다. 그 결과, APP/PS1 마우스와 비교해 APP/PSl/SphKl tg 마우스에서 미세아교세포의 모집이 증가되어 있었다（도 5A）.

그 다음으로, 뇌 절편을 이용하여 식세포 어세이를 수행하였다. APP/PS1 마 우스와 비교해 APP/PSl/SphKl tg마우스에서 식세포 작용을 나타내는 미세아교세포 의 수가증가되어 있었다（도 5B）. 이러한효과를 더 알아보기 위하여， 미세아교세포 의 A욘 식작용성을 in vivo로 평가하였다. APP/PSl/SphKl tg뇌는 리소좀 및 A|B와 함께 염색되는 미세아교세포의 수가 증가되어 있었다. 중요한 것은， 미세아교세포 내의 파고리소좀（phagolysosome）은 APP/PS1마우스와비교해 APP/PSl/SphKl tg마우 스의 피질에서 증가되어 있었다. 플라크와 연관된 미세아교세포 분석 결과, SphKl이 과발현된 APP/PS1마우스에서 파고리소좀에 함입된 AP를 포함하고 있는 세포의 비 율이 증가한 것으로 나타났다. 파고리소좀에 포함된 Ap의 양이 APP/PSl/SphKl tg 마우스의 뇌에서 증가되어 있었다（도 50.

다음으로, Nepri lysin（NEP） , matrix metal lopeptidase 9（MMP9） , 인슐린 분해 효소（IDE） 등 AP 분해 효소의 발현을 분석 하였다. 이러한효소들의 발현량은 변하 지 않았지만, 미세아교세포의 식작용이 일어날 때 증가하는 것으로 알려진 CD36은 APP/PSl/SphKl tg마우스에서 회복되었다（도 5D，E）.

한편.， 미세아교세포의 식자용은 Ai3 플라크의 core보다 A|3의 외부 부분의 감소를 유도한다고 알려져 있다. 이에 따른 A|3 플라크 형태 분석에서 APP/PSl/SphKl tg 마우스는 작은 （<25 pm） 플라크를 유의하게 증가시켰고， 중형 （25-50 /패） 및 대형 > 50 fm） 플라크는유의하게 감소되어 A|3의 외측부분이 미세 아교에 의해 식작용 되었다는 것을 확인하였다（도 5F）.

이상의 결과를 통해， 증가된 신경세포의 SphKl은 C0X2의 아세틸화를 증가시 킴으로써 신경염증 종결 조절 인자의 분비가 증가되어, 결과적으로 APP/PS1 마우스 에서 미세아교세포의 AP 식작용이 증대 되었음을 알수 있었다.

6. SphKl과발현에 의해 분비된 신경염증 종결 조절 인자는 마우스의 AD병 변을완화함

APP/PSl/SphKl tg마우스에서 증가된 SphKl활성에 의해 분비된 신경염증종 결 조절 인자가 의 병변에 어떠한 영향을 끼치는지를 알아보기 위하여， 첫 번째로 AP 프로파일을 규명하였다. A |340 및 A|342의 티오플라빈 S（ThioS）염색， 면역형광 염색 및 ELISA실험 결과， APP/PS1마우스와비교해 APP/PSl/SphKl tg마우스에서 A 兵가현저히 낮은 것으로나타났다（도 6A~C） . APP/PSl/SphKl tg마우스에서 뇌의 아 밀로이드 맥관장애（angiopathy） 역시 감소되어 있었다（도 6D） . 야생형 마우스와 비 교해 APP/PS1 마우스에서 시냅토파이신， MAP2, 시냄신 1 및 PSD95 라벨 밀도가 감소 되어 있었다. 그러나, APP/PSl/SphKl tg마우스에서는 야생형의 그것과유사한정도 로 라벨 밀도가회복되어 있었다（도 6F-I）.

7. SphKl과발현에 의해 분비된 신경염증 조절 인자는 알츠하이머 동물모델 의 인지기능을회복시킴

본 발명자들은 또한 학습과 기억의 변화를 평가하기 위하여 모리스 워터 메 이즈실험 및 fear conditioning실험을수행하였다. 주령이 오래된 APP/PS1마우스 는 기억 형성에서 심각한문제를 나타낸 반면에, APP/PSl/SphKl tg마우스는 이러한 문제가어느정도완화되어 있는 것을 확인할수 있었다（도 7A-F） .

운동능력과 즉각적인 활동력을 평가하기 위하여， 오픈필드 테스트를 수행하 였다. APP/PSl/SphKl tg마우스는 APP/PS1 마우스와 비교해 향상된 운동능력 및 즉 각적인 활동력을나타내었다 （도 7G-H）.

종합적으로， 이러한 결과들은 APP/PS1 마우스와 비교해 APP/PSl/SphKl tg마 우스는 신경세포에서 SphKl의 발현이 증가되어 있고， 이로 인해 C0X2의 아세틸화가 증가되어， 결과적으로 AP의 축적이 감소되고 학습 및 기억능력이 향상되었다는 것 을나타낸다.

8. SphKl에 의해 생성된 C0X2 아세틸화제는신경염증종결 조절 인자분비를 촉진시킴

본 발명자는 상기 실험결과들을 바탕으로 C0X2의 아세틸화를 유도할수 있는 화합물이 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료효과를 나타낼 것인지 여부를 직접적으 2019/182191 1»（：1^1{2018/004640

24

로 확인하기 위해 일련의 실험을 진행하였다.

구체적으로, 본 발명자는 1 크애 근 및 1、1- 1

31） 1¾0 1½이 （1）X2의 아세틸화를 유도할 수 있을 것으로 예상하였고, 이를 이용하 여 이하실험을 진행하였다（도 8시.

우선， 상기 선정된 화합물들이 신경세포에서 신경염증 종결 조절 인자 분비 를 촉진하는지 확인하기 위해서, 사平汗 신경세포에 - 드如 卵 1 애 또는 - 塔애 을 처리한 후 신경염증 종결 조절 인자의 발 현량을 확인 하였다. 그 결과, 마우스의 신경세포에서

이 - 해 애 근 51）11 1용0311½을 처리 하였을 때 회복되는 것을 확인하였다（도 8 .

다음으로는 상기 화합물들에 의한 신경염증 종결 조절 인자 분비가 00X2 아 세틸화 증가에 의한 것인지 확인하기 위해서 0 ¹⁴ °1 부착된

이용하여 확인하였고， 0 ¹⁴ - 31）11 썽0311½은 위에서 확인한 31）11X1,

（도 80）.

즉， 상기 화합물들은 00X2 아세틸화를 유도하여 신경염증 종결 조절 인자의 분비를 촉진하며, 특히 이러한 아세틸화는（1）X2의 565에서 나타난다는 것을 직접적 으로 확인함으로써 퇴행성 신경질환의 치료에 있어서 （：（次2의 8565 아세틸화가 매우 핵심적인 치료 타겟이 될 수 있음을 다시 한번 확인할 수 있었다.

9. 00X2 아세틸화제는 신경염증 종결 조절 인자 분비를 촉진하여 알츠하이머 동물모델의 병변을 감소시킴 .

본 발명자들은 상기 실험을 통해 확인한 00X2 아세틸화제 중 하나인 므序와 동물모델에 주사하여 세 병변을 확인 하였다. 먼저 신경염증 종결 조절 인자를 분비함으로써 신경염증반응에 미치는 영향을 판단하기 위해서, 미세아교세포와 별아교세포의 변화를 관찰하였다. - 31） 0 116을 주사한 ?八¾1 마우스는 마우스와 비교해 미세아 교세포와 별아교세포의 현저한 저하를 나타내었다（도 9쇼3）. 마우스와 비교해 주사한 /므 마우스에서 양이 현저히 낮은 것으로 나타났고/기억력 및 인지력이 개선되는 것을 확인 하였다（도 90,0）. 그러나 31止 抑 116 유도체인 肝 720 및 ! ⁵ 를 주사하였을 때에는 알츠하이머 동물 모델과 2019/182191 1»（：1^1{2018/004640

25

비교하여 미세아교세포와 별아교세포의 활성에 차이를 보이지 않았고， 쇼 침착 감 소 및 기억력 개선 효과도 나타나지 않았다（도 9 .

이상의 결과를 통해， 00X2 아세틸화제는 門7720과 같은 유도체 및 ! ⁵ 와 달리 신경염증 종결 조절 인자를 분비를 촉진하여 므序 마우스에서 신 경염증 감소， 쇼욘 침착 감소 및 기억력 개선 등과 같이 병변을 감소시키는 효과 를 나타낸다는 것을 확인하였다

【산업상 이용가능성】

본 발명의 00X2 아세틸화제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은， 신경세포에서 00X2 아세틸화를 촉진하여 신경염증 종 결인자를 분비함으로써 신경염증을 완화하는 효과가 있어， 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료제 개발에 매우 유용하게 사용될 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 우수 하다.