CN1977885A | 2007-06-13 | |||
CN1539483A | 2004-10-27 | |||
CN1985902A | 2007-06-27 | |||
CN101361782A | 2009-02-11 |
CHEN, WEIHUA ET AL.: "Effects of glycyrrhizic acid on the treatment of liver disease", INTERNATIONAL JOURNAL OF DIGESTIVE DISEASES., vol. 26, no. IS.2, 2006, pages 106 - 109
See also references of EP 2609922A1
ALA-KOKKO L; PIHLAJANIEMI T; MYERS JC ET AL.: "Gene expression of type I, III and IV collagens in liver fibrosis induced by dimethylnitrosamine in the rat", BIOCHEM J, vol. 244, 1987, pages 75 - 9, XP002430226
上海精晟知识产权代理有限公司 (CN)
1、 一种治疗慢性肝病的药物组合物, 其特征是, 由黄芪总苷和甘草酸按 照重量比 3〜6 : 1组成。 2、 权利要求 1的药物组合物在制备治疗慢性肝炎药物中的应用。 3、 权利要求 1的药物组合物在制备防治肝纤维化药物中的应用。 4、 权利要求 1的药物组合物在制备防治肝硬化药物中的应用。 |
本发明涉及一种治疗慢性肝病的药物组合物 及其应用; 具体涉及一种具 有抗肝纤维化、 抗肝损伤作用的药物组合物及其应用。
肝硬化是多种慢性肝脏疾病的终末阶段, 以弥漫性肝纤维化伴异常结节 形成为其形态学特征。 肝硬化是我国常见疾病和主要死亡病因之一, 我国是 乙型肝炎高发地区, 仅慢性乙型肝炎患者达 3000万, 其中约 30%发展为肝硬 化。 已有明确证据表明肝纤维化甚至肝硬化是可逆 的, 阻断、 抑制或逆转肝 纤维化是治疗慢性肝病的一个重要目标, 但目前尚无 FDA批准的抗肝纤维化 化学或生物制剂进入临床应用。
国外肝纤维化的研究进展主要体现在发病机制 的深入研究。 美国肝纤维 化研究权威 Friedman教授曾指出: "肝纤维化机理的不断阐明使有效地抗肝 纤维化治疗成为可能, 然而, 抗肝纤维化治疗仍然是一个富有挑战的艰巨任 务, 迄今临床上尚无有效的抗肝纤维化药物, 其有效作用于肝脏而无明显毒 副作用的治疗药物研制尚需长期努力。 "
中国专利 CN1539483A于 2004年 10月 27 日公开了一种治疗慢性肝病及 抗肝纤维化的中药,属于中医药技术领域,它 是由藏红花 3-9份、 蛤蚧 3-9份、 丹参 4-18份、 鳖甲 9-24份、 黄芪 9-30份、 红参 3_9份、 当归 1_6份、 川芎 1-6份、 砂仁 1-6份、 僵虫 1-6份、 三七 3-9份、 枸杞 1-9份、 木香 1-6份组 成,经筛选清洁、 粉碎成细粉、 过筛、 混匀、 每 100克粉加蜜炼 100克,制成 蜜丸、用钴 60灭菌;本发明经临床证明,能够有效地治疗慢 性肝炎和肝纤维化, 总有效率可达 94%。
中国专利 CN1985902A于 2007年 06月 27日公开了一种治疗慢性肝病的 中药,根据 "君臣佐使"配方原则配伍,君药为生白术;臣药 包括西洋参、 猪 苓、 茯苓、 生黄芪;佐药包括垂盆草、 蛇舌草、 茵陈;使药包括炙鸡内金、 丹 参、 赤芍、 白芍;各组分的重量百分比为:生白术 5%〜18%、 西洋参 1%〜10%、 猪苓 1%〜15%、茯苓 0%〜15%、生黄芪 5%〜20%、垂盆草 10%〜50%、蛇舌草 5%〜 30%、 茵陈 1%〜15%、 炙鸡内金 1%〜10%、 丹参 0%〜15%、 赤苟 1%〜10%、 白芍 1%〜10%,各组分总和为 100%。
中国专利 CN101361782A于 2009年 02月 11日公开了一种治疗慢性肝病 的药物, 采用特定配比的虫草多糖、 苦杏仁甙、 绞股蓝总皂甙中药有效组分 或成分组成有理想疗效的抗肝纤维化、 抗肝损伤作用的药物组合物。
近年来, 中医药整体观念 (系统论方法) 指导下的病证结合、 辨证论治 对解决这一难题逐渐彰显出理论特色和临床优 势, 不但能改善临床症状及肝 功能, 显著提高患者的生活质量, 而且在抑制肝脏炎症反应及纤维组织增生, 促进肝纤维化的逆转等方面显示出优势。 我国近二十多年来的中医药抗肝纤 维化研究, 已取得显著进展。 自 2000年起, 已先后有复方鳖甲软肝片、 扶正 化瘀胶囊(片)等抗肝纤维化国家中药新药应 用于临床, 扶正化瘀片已被美 国 FDA批准在美国开展抗丙型肝炎肝纤维化 II期临床试验。 中药复方抗肝纤 维化作用是通过多途径、 多层次作用实现的, 呈现出综合效应, 与肝纤维化 发生发展的复杂病理机制相适应, 这也正是中医药整体观念的优势所在。
近二十多年来, 国内外也开展了一些抗肝纤维化中药有效组分 或成分的 研究, 并发现了一些有抗肝纤维化效应的中药有效组 分或成分。 然而, 无论 传统中药复方还是单一的有效成分, 皆有其不足之处。 传统中药复方由于成 分复杂, 质控困难, 稳定性较差, 这也是中药国际化的难题之一; 而单一组 分或成分往往难以取得良好效应或君胥效剂量 就会出现较明显的副作用。 因 此如何对传统复方 "去粗取精"而又保持中医复方配伍治疗复杂疾 的优势, 是一大难题, 也是中医药抗肝纤维化药物研究的重要发展方 向之一。
本发明所要解决的技术问题是提供一种能提 高抗肝纤维化、 抗肝损伤作 用, 能有效治疗慢性肝病的药物组合物, 并提出该药物组合物的用途。
为了解决上述技术问题, 本发明运用数学模型 "均匀设计"和正交设计分 析技术, 在现有技术基础上, 进行了有效组分 /成分配伍抗肝纤维化的研究, 采用黄 总苷 (Astragalus Astragalosides )禾口甘草酸 (Glycyrrhiza Acid) 中药有效组分或成分组成的抗肝纤维化、 抗肝损伤作用的药物组合物筛选。
本发明所述的药物组合物由黄芪总苷和甘草酸 两种组分或成分组成, 黄 芪总苷和甘草酸的重量比为 3〜6 : 1, 其中黄芪总苷来源于黄芪; 甘草酸来源 于中药甘草。
从黄芪中提取黄芪总苷以及从甘草中提取甘草 酸的方法和现有技术中的 常规方法无异。 本发明药物组合物的制备方法并无特别之处, 按重量比称取 黄芪总苷和甘草酸, 按常规方法制成临床常用制剂, 所述制剂的剂型, 包括 片剂、 颗粒剂、 胶囊剂等口服固体制剂。
本发明药物组合物经二甲基亚硝胺(Dimethylnitr osamine , DMN)和胆管 结扎 (BDL) 诱导的经典的肝损伤、 肝纤维化动物模型试验 (模型发展过程中 介入干预), 并运用 "均匀设计"和 "正交设计"筛选以及反复验证。 结果证 实, 本发明所述药物能显著降低模型大鼠肝组织胶 原含量, 减轻肝纤维化程 度和肝损伤程度, 上述作用优于各组分单用的效果。 所述 2种组分或成分配 伍组合的药物可以提高抗肝纤维化的作用, 能有效阻止肝纤维化的发展并促 进肝纤维化的逆转, 可用于治疗和预防各种慢性肝炎、 肝纤维化、 肝硬化等 病症。
图 1是实施例 1的各组大鼠肝组织天狼星红胶原染色照片 (χ ιοο )。 图 2是实施例 2的各组大鼠肝组织天狼星红胶原染色照片 ( X 100 )。
下面结合附图和具体实施例, 进一步阐述本发明。 这些实施例应理解为 仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护 范围。 在阅读了本发明记载的 内容之后, 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修 改, 这些等效变化 和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围 。
本发明的药物组合物有益效果通过下述实验证 实:
1
运用 DMN诱导的大鼠肝纤维化模型和正交设计分析获 得降低肝脏胶原含 量作用的组合物的最佳比例。
1.
Wistar雄性大鼠 160只(正常组 40只, 造模组 120只), 清洁级, 体重(150 ± 10) g, 由中科院上海实验动物中心提供。 上海中医药大学实验动物中心清 洁级动物房饲养、 造模与观察, 自由饮水。
2.
二甲基亚硝胺(Dimethylnitrosamine, DMN)和羟脯氨酸
(hydroxyproline,Hyp)标准品, 东京化成工业株式会社产品; 所用肝功能试 剂盒均购自于南京建成生物试剂公司; DAB Kit,北京中杉金桥生物技术公司, 批号: 50681680; 多聚甲醛, 中国医药集团上海化学试剂, 化学纯, 批号: F20030117, 小牛血清和 SABC 试剂盆购自武汉博士德公司; a-SMA, 购自 SIGMA公司; TGF-βΙ , Mouse Monoclonal IgG 购自 Abeam公司 (ab27969), 1 :2000稀释; Smad5, Rabbit Monoclonal IgG, 购自 Epitomics公司 (1682-1 ) , 1 :1000稀释; P-Smadl/5/8, Rabbit Monoclonal IgG, 购自 Epitomics (2737-1 ), 1 :500稀释; Smad7, Rabbit Polyclonal IgG , 购自 BioVision (3670- 100), 1 :100 稀释; BMP7, Rabbit Monoclonal IgG , 购自 Abeam (ab56023 ) , 1:2000稀释; STAT1 , Mouse Monoclonal IgG,购自 Abcam( ab78112), 1 :200稀释; P-STATl , Mouse Monoclonal IgG, MILLIPORE ( 05-1064), 1:500稀释; Arkadia, Mouse polyclonal IgG, 购自 Abeam (ab885351 ) , 1 :1000稀释; GAPDH, Mouse Monoclonal IgG, 购自 Kangchen公司 (KC-5G4) , 1:5000稀释; 近红外染料 (Alexa680) 标记的羊抗兔 IgG多克隆二抗及近红外染料(IRD800) 标记的驴 抗小鼠 IgG多克隆二抗, 均为 Li-COR公司产品。 逆转录试剂盒 (Revert Aid™ First Strand cDNA Synthesis Kit), #K1622, Ferments Life Sciences , 购于上海 麦约尔生物技术有限公司; 荧光定量 PCR检测试剂盒, SYBR Green Ex Taq™ (perfect Real Time), Lot: DRR041A, Takara Biotechnology(Dalian)Co . Ltd。 Image-Pro Plus 6. 1专业图像分析软件购自 Media Cybernetics公司; Olympus 1X70光学显微镜购自 Olympus公司。 Odyssey扫描仪及 Odyssey双色红外激光成 像系统, 均为 Li-COR公司产品; PCR扩增仪 Rotor-Gene RG-3000, 基因公司产 品; Cycler PCR仪, BIO-RAD公司产品。
3.
黄芪总苷 (Astragalus Astragalosides, A) : 来源于黄芪, 西安鸿生 生物技术有限公司产品, 规格 90%; 甘草酸 (Glycyrrhiza Acid, B ) : 来源 于甘草, 南京泽朗医药科技有限公司产品, 规格 98%。
将黄芪总苷和甘草酸按照重量比 3 : 1、 4: 1、 5 : 1和 6 : 1混合均匀, 随机 选取按不同比例混合得到的药物组合物 A+B, 用于随后的实验方案。 4.
参照 Ala- Kokko方法造模 (Ala-Kokko L, Pihlajaniemi T, Myers JC et al. Gene expression of type I, III and IV collagens in hepatic fibrosis induced by dimethylnitrosamine in the rat. Biochem J 1987; 244: 75-9. )。用生理盐水 4每 DMN 稀释为 0. 5% 的溶液, 造模组 120只大鼠以 2ml/ g 体重剂量, 腹腔注射每日 1 次, 每周前 3天连续腹腔注射, 共 4周。 正常对照组大鼠 40只腹腔注射等量生 理盐水。
5.
造模 3天末、 造模 2周末、 造模 3周末、 造模 4周末取 10只正常大鼠、 10只 模型大鼠作为模型动态观察, 从造模 2周末开始, 造模型大鼠随机分为正交设 计 1-6组及模型组, 每组各 10只, 于继续造模的同时, 正交设计组按 65 kg成 人体重临床用量等体重的 8倍量进行药物干预, 分别按照设计方案给药。 上药 临用前用 10 mL蒸馏水稀释, 按 10 ml/kg大鼠体重的剂量以相应药物灌胃, 每 日 1次, 共 2周, 并设有正常对照大鼠 (10 ) 和模型对照组 (10) ; 正常大鼠与 模型对照组以同体积蒸馏水灌胃。
6.
将黄芪总苷 A、 甘草酸 B和药物组合物 A+B作为考察因子, 每个因子分别取 2个水平 (1水平 =用药, 2水平 =不用), 获得正交设计方案。 另设模型组和正 常动物组。
7. 计量资料用 x 士 s表示, 采用 SAS 9. 1. 2, DAS 2. 1. 1和 SPSS16. 0统计软件 处理数据, 采用单因素方差分析进行多组间比较。 正常肝组织仅在汇管区和中央静脉壁见少量胶 原纤维。 DM 造模 4周时增 生的胶原纤维分割肝小叶形成较粗大、 致密的完全间隔, 正常肝小叶结构消 失, 个别形成不完整假小叶, 89%模型大鼠已形成 III期的肝纤维化。 用药组大 鼠胶原纤维增生状况有不同程度减轻, 纤维间隔较窄、 疏松而不连续, 见附 图 1。
羟脯氨酸含量测定结果显示, 与模型组相比, A+B组大鼠肝组织羟脯氨酸 含量较 4周模型对照组显著降低 (Ρ < 0. 01), 见表 1。
1.各组大鼠肝脏胶原增生程度分期
„ ( 胶原增生程度分期 (例)
Ηγρ(μ g/g)
0 I II III
N 10 237.82± 24.92 ' 10 0 0 0
28dM 9 650.44±117.08** 0 0 1 8
A+B 9 481.92± 94.12** 0 1 7 1
B 9 595.74±109.74 0 0 5 4
A 9 583.98± 118.00 0 0 6 3 注: 与同期正常对照组比较, **, <0.01 ; 与同期模型组比较, ##, <0.01 与正常组比较, 造模 4周时模型大鼠血清 ALT、 AST, ALP活性及 TBi l含量 显著升高( 0. 01 )。 与 4周模型组相比, Α+Β组大鼠血清 ALT活性显著降低
(P<0. 01); A+B及 A组血清 AST活性也显著降低 ( ^ O. 05) ; A+B及 B组大鼠血 清 ALP活性显著低于 4周模型对照组 ( 0. 01 ) ; B组大鼠血清 TBiL活性也显著 低于 4周模型对照组( 0. 05 )。 结果见表 2。
2.血清肝功能变化 (x±SD )
组 别 n ALT(U/L) AST(U/L) Alb(g/L) ALP (議 Oml) TBil (μπιοΙ/L)
N 10 16.49±6.95 27.74±12.88 34.30±2.46 28.47±4.15 7.30±2.24
28dM 9 63.71±16.45** 83.10±21.38** 23.53±3.26** 68.20±10.81 ** 16.82±6.89**
A+B 9 32.22il4.68** 63.69±14.12 # 25.56±3.67 46.17±8.69** 12.67±10.68
B 9 55.18±17.12 76.61±14.09 23.11±5.52 10.23±5.42 #
A 9 59.12±16.25 66.02±10.93 # 25.44±2.15 57.56±13.67 14.19±5.33 注: 与同期正常对照组比较, *, 尸<0.05, **, 尸<0.01。 与同期模型组比较, #, 尸<0.05,
##, 尸<0.01。 降低肝组织 Hyp含量和血清 ALT沽性的最大效应组合为 A+B;降低 AST 最大效应为 A和 A+B。 提高 Alb含量最大效应为 A和 A+B。 降低 ALP最大 效应组合为 B和 A+B。 综上, A和 B具有协同降低血清 ALT活性和肝组织 羟脯氨酸含量以及显著改善肝纤维化分期的作 用; B是降低 TBil含量的主要 成分, A药具有显著降低 AST的作用。
黄芪总皂苷与甘草酸联用或者单用对于降低 TGF-βΙ 生成均显著优于黄 芪汤原方, 并以黄芪总皂苷单用效果最为明显。提高 Smad7蛋白对 TGFB1信 号转导的负调控作用是黄芪总皂苷和甘草酸抗 肝纤维化配伍协同效应的主要 机制之一, 可能通过 IFN-?/JAK/STATl、 泛素-蛋白水解酶复合体通路等多种 信号通路而协同促进 Smad7的表达而抑制 TGFB1信号转导。
黄芪总皂苷与甘草酸单用或联用组能显著提高 DMN肝纤维化大鼠肝组 织 BMP-7mRNA、 蛋白及 P-Smadl/5/8蛋白表达, 这一作用途径不但可促进 Smad7的表达而抑制 TGFB1信号转导, 而且 BMP7蛋白表达的增加对肝纤维 化可具有保护肝细胞、 促进肝细胞再生的综合效应。
2
黄芪汤活性组分配伍抗胆管结扎大鼠肝纤维化 的疗效。
一、 材料和方法:
1. 1 实验动物
SD雄性大鼠 83只, SPF级, 体重 200〜220 g, 由中科院上海实验动物中 心提供。 合格证号: SCXK (沪) 2010-0005。 饲养于上海中医药大学实验动物 中心, 自由饮水。
黄 总阜苷 (astragalus astragalosides, AS) : 同案例 1。
甘草酸 (glycyrrhiza acid, GA): 同案例 1。
黄芪汤: 同案例 1。 熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid, UDCA): 购自 Dr. Falk Pharma GmbH。
1. 3主要试剂和仪器
同案例 1。
2 方法
2. 1 模型制备
造模组大鼠 (75只) 沿腹正中线切开, 暴露胆总管, 逆行向肝门部注入 硬化剂, 远近端结扎胆总管, 中间剪断, 关腹, 共 4周。 假手术组大鼠 (8只) 仅开腹并游离胆总管后关腹。
2. 2 分组与给药
从造模第 2周首日开始,造模大鼠随机分为 5组:黄芪汤组、 A/B联用组、 A单用组、 B单用组、 UDCA组, 每组各 12只, 于继续造模的同时, 用药组按 65 kg成人体重临床用量等体重的 8倍量进行药物干预, 黄芪汤、 A+B联用组、 A单用组、 B单用组、 UDCA组 (UDCA: 80 mg · kg-1 · d_l, ig)。 以上药临 用前用 10 mL蒸馏水溶解, 按 10 ml · kg-1大鼠体重的剂量以相应药物灌胃, 每日 1次, 共 3周, 并设有假手术对照大鼠 (8 ) 和模型对照组 (15) ; 正常 大鼠与模型对照组以同体积蒸馏水灌胃。
2. 3 样品采集与处理
至 4周末, 处死大鼠获取检测标本。 大鼠肝组织 HE染色及胶原染色、 肝 组织 Hyp 含量, 血清肝功能: ALT、 天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase , AST)及碱性磷酸酶 (alkal ine phosphatase, ALP)活性、 白蛋白 (albumin , Alb) 及总胆红素 (total bi l irubin, TBil)含量。
2. 4 统计学方法
同案例 1 BDL模型大鼠, 造模 4w内共有 31只大鼠死亡, 死亡率为 37%。 血清肝功 能显著异常, 肝组织 Hyp含量显著增高, 肝组织 HE染色可见胆管上皮细胞增 生逐渐增多, 在增生的胆管上皮细胞周围见大量胶原纤维沉 积、 正常肝细胞 逐渐减少、 炎症和坏死较轻, 形成典型的胆汁淤积性肝纤维化。 UDCA虽然较 模型组可以显著降低血清转氨酶活性( P<0. 05) , 但对病理组织学无明显改 善, 故该药不能阻止胆汁淤积引起的肝纤维化病理 进程。 A/B联用可以显著改 善大鼠 BDL肝纤维化的病理组织学变化, 与黄芪汤原方的效应基本相似, 肝 组织 Hyp含量(较同期模型组下降 27. 3%)低于黄芪汤组(较同期模型组下降 18. 4%) , 但无显著性差异; 而血清 ALT活性显著低于黄芪汤组 (P<0. 05) ; A 与 B联用组降低肝组织 Hyp含量及血清 ALT的效应分别显著优于 B单用组和 UDCA 组 (P<0. 05) ; A 与 B联用组降低血清 ALT 的效应显著优于 A单用组 (P<0. 05) , 并且 A/B联用能显著降低血清 AST、 ALP活性及 TBil含量, 升高 血清 Alb含量(P<0. 05);另外, A单用在降低降低肝组织 Hyp含量、血清 AST、 ALP活性及 TBil含量方面具有显著作用 (P<0. 05), B单用在降低 ALP活性和 TBil含量方面具有显著疗效(P<0. 05 )。 见附图 2, 表 3、 4。
Hyp X ± s 组 另 lj n Hyp^ g/g肝湿重:) 积分
N 8 199.37土 35.26 0
28dM 7 801.28土 65.90** 7.29± 0.76**
HQT 8 676.91土 65.48 ## 5.13土 0.99 ##
A+B 9 629.30± 95.01 ## 4.44土 0.73 ##
A 8 705.71土 46.52 # 6.38土 0.92 #
B 6 772.00土 86.81 $ 6.50土 0.84 $
UDCA 6 790.16± 129.85 $$ 6.83土 0.75" 注: N, 假手术组; M, 模型组; HQT, 黄芪汤组; A+B, A和 B联用组; A, A单用组; B, B单用 组; UDCA,优思弗组。 *Ρ<0.05, ** <0.01( vs N); # <0.05 , ## <0.01 ( vs M); S <0.05, $S P<0.01 ( vs A+B)。 x士 s
组 另 lj n ALT(UZL) AST(UZL) Alb(gZL) ALP(KZlOOml) TBil (μιηοΙ/L)
14.58土 2.15 25.19土 5.47 36.48土 1.23 27.41土 6.00 7.30± 1.79
8dl 64.45土 12.89** 123.65土 15.72 s1 22.51土 2.13** 82.04土 8.90** 74.59土 3.59** [QT 60.89± 16.03 s 1 18.28±20.64 27.68土 6.14 # 72.55土 5.74 # 60.44土 6.85 ##
+B 32.60土 10.34 ## 105.92土 13.00 # 26.85土 3.67* 71.65土 5.60 # 59.42土 10.14 ##
42.82±8.64 s 1 16.43±7.99 # 26.58土 4.09 71.94土 12.71 # 61.82土7.89 ## 26.66土 7.89 ## 93.67土14.46* # 25.07土5.18 77.22土 4.05 67.35土 7.39 $
UDCA 28.79土 8.61 ## 102.80±26.01 # 24.20土 3.64 79.01土 5.80 67.60土 9.62 $ 注: N, 假手术组; M, 模型组; HQT, 黄芪汤组; A+B, A和 B联用组; A, A单用组; B, B单用 组; UDCA,优思弗组。 *Ρ<0.05, ** <0.01( vs N); # <0.05 , ## <0.01 ( vs M); $ <0.05, $$ P<0.01 ( vs A+B)。
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