Arzneimittel zur Behandlung von Sepsis

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Arzneimittel zur Behandlung und/oder Prävention von Sepsis, ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prävention von Sepsis, und ein Verfahren zur therapeutischen oder/und prophylaktischen Behandlung eines Lebewesens, das von einer Sepsis betroffen ist oder/und bei dem die Gefahr einer Sepsis besteht.

Derartige Arzneimittel und Verfahren sind im Stand der Technik allgemein bekannt.

Bei der Sepsis, die auch als Septikämie oder Blutvergiftung bezeichnet wird, handelt es sich um eine schwere, akut verlaufende Infektionserkrankung, die durch Mikroorganismen, meist Bakterien hervorgerufen wird, welche in den Blutkreislauf eines betroffenen Individuums gelangt sind. Die Mikroorganismen stammen dabei meist von einem lokal entzündlichen Herd, beispielsweise einem Abszess, den Harn- oder Gallenwegen, Herzklappen etc., und werden über den Blut- oder Lymphweg in Schüben in den Organismus ausgestreut. Zu den klinischen Symptomen der Sepsis

zählen Fieberschübe, Schüttelfrost, Verschlechterung des Allgemeinzustandes mit schwerem Krankheitsgefühl, Tachykardie, im Extremfall die Entwicklung eines septischen Schocks. Die Erreger der Sepsis sind meist Streptokokken, Staphylokokken, Escherichia coli, Proteus oder Pseudomonas. Die Erreger können sich in praktisch allen Organen ansiedeln und zu sogenannten septischen Metastasen führen. Die Diagnose von Sepsis erfolgt in der Regel durch den Nachweis des Erregers im Blut, die Therapie üblicherweise mit Antibiotika. Parallel wird versucht, den Sepsisherd bspw. operativ zu entfernen.

Trotz intensivmedizinischer Maßnahmen liegt die Letalität bei einem von einer Sepsis betroffenen Individuum bei über 50%. Bisher verfügbare Therapieansätze sind offenbar nicht in der Lage, wesentliche pathophysiologische Mechanismen zu unterbinden, die zum Zusammenbruch des Kreislaufes und Durchblutungsstörungen führen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, ein neues Arzneimittel zur Behandlung und/oder Prävention von Sepsis bereitzustellen, mit dem vorzugsweise die Nachteile aus dem Stand der Technik vermieden werden. Insbesondere soll ein solches Arzneimittel bereitgestellt werden, dass kostengünstig herstellbar ist.

Diese Aufgabe wird durch die Verwendung von Penicillamin zur Herstellung eines Arzneimittel zur Behandlung und/oder Prävention von Sepsis gelöst. Diese Aufgabe wird ferner durch ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prävention von Sepsis gelöst, das die folgenden Schritte aufweist: (1) Bereitstellung von Penicillamin, und (2) Formulierung des Penicillamins in einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.

Die Erfinder haben überraschenderweise herausgefunden, dass Penicillamin die beim Vorliegen einer Sepsis charakteristische Eryptose bzw. den suizidalen Erythrozytentod hemmen kann und deshalb zur Behandlung und/oder Prävention von Sepsis eingesetzt werden kann. Die Erfinder konnten ferner im Tierversuch nachweisen, dass

septische Mäuse nach einer Verabreichung von Penicillamin eine wesentlich längere überlebenszeit haben als unbehandelte Mäuse.

Diese Erkenntnis der Erfinder war deshalb besonders überraschend, da Nikotinamid bislang in gänzlich anderem Zusammenhang beschrieben wird.

Penicillamin ist ein bekannter Chelatbildner und wird häufig bei Schwermetallintoxikation, Cystinurie, selten zur Therapie von rheumatoider Arthritis und Sklerodermie eingesetzt.

Durand et al. (2001), Wilson's disease with severe hepatic insuffidency: beneficial effects of early administration of D-penicillamine, Gut 48, Seiten 849-852, schlagen die Verwendung von Penicillamin zur Behandlung des sogenannten Morbus Wilson vor, das auch als hepatolentikuläre Degeneration bezeichnet wird.

Die Verwendung von Penicillamin zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer Sepsis ist im Stand der Technik bislang nicht bekannt. Die Eignung von Penicillamin für diese Indikation war auch deshalb besonders überraschend, da Penicillamin in manchen Fachkreisen eine Vielzahl von schädlichen Wirkungen zugeschrieben wird, wie beispielsweise die Störung der Hämatopoese, Neuropathien, Geschmacksstörungen, gastrointestinale Beschwerden, allergische Hautreaktionen, Nierenschäden, Kreuzallergien mit Penicillin etc.

Jacobs et al. (1994), Fatal Cholestatic Hepatitis caused by D-Penicillamine, British Journal of Rhematology 33, Seiten 770-773, beschreiben sogar die Verursachung des Cholestasesyndroms durch die Verabreichung von Penicillamin, welches auch als Gallestauung bezeichnet wird, und bei dem es zu einer Retention von Bilirubin, Gallensäuren und anderen Gallenbestandteilen durch zu geringen oder fehlenden Abfluss von Galle in den Darm kommt.

Erfindungsgemäß wird unter Penicillamin D-2-Amino-3-mercapto-3-methylbutter- säure (ß-Mercaptovalin, ß,ß-Diemethylcystein), C ₅ HnNO ₂ S, M _R 149,20, verstanden. Penicillamin ist als Aminosäure ein Abbauprodukt des Penicillins und durch Hydrolyse aus diesem zu gewinnen. Synthetisches Penicillamin fällt als Racemat an, das sorgfältig gespalten werden muss, das das L-Penicillamin toxisch ist. Sowohl Penicillamin natürlichen als auch synthetischen Ursprungs ist für das erfindungsgemäße Arzneimittel geeignet.

Pharmazeutisch akzeptable Träger sind im Stand der Technik allgemein bekannt. Verwiesen wird auf die Publikationen von Bauer et al. (1999), Lehrbuch der Pharmazeutischen Technologie, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart, sowie von Rowe et al. (2006), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 5. Auflage, Pharma- ceutical Press and American Pharmacists Association. Der Inhalt der genannten Publikationen ist durch in Bezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird damit vollkommen gelöst.

Bei der erfindungsgemäßen Verwendung bzw. dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es bevorzugt, wenn das Arzneimittel für eine Applikation ausgebildet ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Oral, rektal, parenteral, lokal.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass das Arzneimittel je nach gewünschter Applikationsform bereits auf geeignete Weise ausgestaltet ist. Dem behandelnden Arzt steht dadurch eine Auswahl verschiedenster Ausgestaltungsformen des Arzneimittels zur Verfügung, wobei sich die konkrete Form an dem Zustand des Patienten, dem jeweiligen Behandlungsprogramm und weiteren Faktoren orientieren kann.

Ferner ist es bevorzugt, wenn das Arzneimittel in einer Form ausgebildet ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Pulver, Tablette, Saft, Tropfen, Kapsel, Zäpfchen, Lösung, Injektionslösung, Aerosol, Salbe, Spülung.

Mit dieser Maßnahme wird auf vorteilhafte Art und Weise bereits eine Formulierungsvariante bereitgestellt, die den unmittelbaren Einsatz von Penicillamin zur Behandlung bzw. Prävention der Sepsis ermöglicht.

Bei der erfindungsgemäßen Verwendung und dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es außerdem bevorzugt, wenn das Arzneimittel Penicillamin eine Konzentration aufweist, die bei ca. 1 μg Penicillamin pro mg Gesamtgewicht bis 1 mg/mg, vorzugsweise bei ca. 10 μg/mg bis 500 μg/mg, weiter bevorzugt bei ca. 50 μg/mg bis 250 μg/mg, höchst bevorzugt bei ca. lOOμg/mg liegt.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass ein Arzneimittel bereitgestellt wird, das nach Erkenntnissen der Erfinder den Wirkstoff in einer geeigneten Konzentration enthält.

Erfindungsgemäß ist es außerdem bevorzugt, wenn das Arzneimittel zusätzlich eine weitere gegen Sepsis wirksame Substanz aufweist.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass durch den Zusatz die Wirkungen des erfindungsgemäßen Arzneimittels gegenüber der Sepsis noch verbessert werden können. So ist es möglich, durch die Kombination mit einer weiteren Substanz einen Eingriff in die Entstehung der Sepsis an einer anderen Stelle zu bewirken, um das Krankheitsbild durch synergistische Effekte noch wirksamer zu bekämpfen.

Bevorzugt ist es, wenn es sich bei der weiteren Substanz um ein Antibiotikum handelt.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die häufigste Ursache einer Sepsis, nämlich die Infektion mit Bakterien, durch synergistische Effekte mit dem Pennicilamin noch wirkungsvoller behandelt werden kann. Geeignete Antibiotika sind Cephalosporine, penicillinasefeste Penicilline, gegebenenfalls in Kombination mit einem Aminoglyko- sid.

Vor diesem Hintergrund ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung eines Lebewesens, das von einer Sepsis betroffen ist oder/und bei dem die Gefahr einer Sepsis besteht, das folgende Schritte aufweist: (1) Bereitstellung von Penicillamin, (2) Einbringung des Penicillamins in das Lebewesen, und (3) gegebenenfalls mehrfaches Wiederholen der Schritte (1) und (2).

Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, aus denen sich weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben. Dabei wird auf die beigefügte Figur verwiesen, in der Folgendes dargestellt ist:

Fig. 1 Effekt der Komplementaktivierung auf die Exposition von Erythrozy- tenphosphatidylserin in Gegenwart und Abwesenheit von Penicillamin.

Ausfuhrungsbeispiele

1. Material und Methoden

1.1 Patienten und Plasma

Heparinisiertes Plasma wurde aus gesunden Freiwilligen oder aus Patienten gewonnen, die unter schwerer Sepsis litten und auf der Intensivstation behandelt wurden. Das heparinisierte Plasma wurde zu Erythrozyten mit identischen Blutgruppen aus gesunden Freiwilligen in vitro hinzugegeben. Die Angehörigen der Patienten und die Freiwilligen, aus denen die Erythrozyten gewonnen

wurden, erklärten hierzu ihr Einverständnis. Die Studie wurde vom Ethikkomitee der Universität Tübingen genehmigt.

1.2 Mäuse

Die in vzvo-Experimente wurden an gesunden Labormäusen durchgeführt, die unter Standardlaborbedingungen mit freiem Zugang zur Nahrung und zum Wasser gehalten wurden. Die Studie wurde vom Ethikkomitee der Universität Tübingen genehmigt.

1.3 Lösungen und Chemikalien

Die in virro-Experimente wurden bei 37 ⁰ C entweder in einer Cθ2-freien (Ringer) oder in einer 5%-igen Cθ2-Atmosphäre (Plasma) mit Erythrozyten durchgeführt, die hinsichtlich ihrer Blutgruppen aufeinander abgestimmt waren, und aus gesunden Freiwilligen isoliert wurden. Die Ringerlösung enthielt (in mM) 125 NaCl, 5 KCl, 1 MgSO ₄ , 32 N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2- Ethansulfonsäure (HEPES), 5 Glukose, 1 CaCl ₂ ; pH 7,4. Ionomycin wurde bei einer Konzentration von 1 μM verwendet; D-Erythro-N-Hexanoylsphingosin und Ionomycin wurden von Sigma (Taufkirchen, Deutschland), der Ca ⁺⁺ - Farbstoff Fluo-3/AM von Calbiochem (Bad Soden, Deutschland) bezogen.

Sofern angegeben, wurden die Erythrozyten (0,3 % Hämatokrit) entweder in Ringerlösung oder in einer Lösung mit niedriger Ionenstärke (LISS; DiaMed-ID, Cressier, Schweiz) suspendiert, und zu 1 % Serum aus Blut, das aus gesunden Spendern mit der Blutgruppe AB stammte, hinzugegeben. Die Interaktion von LISS und Serum führt zur Komplementaktivierung; vgl. Hughes-Jones et al. (1964), Optimal conditions for detecting blood group antibodies by the an- tiglobulin test, Vox. Sang. 9, Seiten 385-395; Lapierre et al. (1990) The gel test: A new way to detect red cell antigen-antibody reactions. Transfusion 30, Seiten 109 bis 113.

Die in v/vo-Experimente an den Mäusen wurden unter Standardlaborbedingungen durchgeführt.

1.4 Annexinbindung in der FACS-Analyse

Die FACS-Analyse wurde im Wesentlichen durchgeführt, wie bereits beschrieben; vgl. Lang et al. (2003), Cation Channels trigger apoptotic death of eryth- rocytes, Cell. Death Differ. 10, Seiten 249 bis 256. Nach der Inkubation mit Plasma aus den Patienten oder gesunden Individuen oder mit Ringer oder in 0,5 ml LISS- oder ABS-Serum mit oder ohne Penicillamin wurden die Zellen mit Annexin-V-Bindepuffer enthaltend (in mM) 125 NaCl, 10 HEPES; pH 7,4 und 5 CaCU gewaschen. Die Erythrozyten wurden mit Annexin-V-Fluos (Roche, Mannheim, Deutschland) bei einer 1:50 Verdünnung gefärbt. Nach 10 min. wurden die Proben 1:5 verdünnt und durch Durchflusszytometrieanalyse auf einem FACS-Calibur gemessen. Die Zellen wurden durch Vorwärts-Scatter analysiert und die Annexin-V-Fluoreszenzintensität wurde in FL-I gemessen.

1.5 Induktion der Sepsis bei Mäusen

Zur Induktion der Sepsis wurden den Mäusen 75 μg Lipopolysaccharid (LPS) pro Gramm Körpergewicht intraperitoneal verabreicht. Sofern angegeben, wurden die Mäuse zusätzlich mit 900 μg Penicillamin pro Gramm Körpergewicht intraperitoneal behandelt.

1.6 Statistik

Die Daten werden ausgedrückt als arithmetische Mittel ± SEM und eine statistische Analyse wurde mittels gepaartem Student's t-Test oder Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt, sofern erforderlich.

2. Ergebnisse

2.1 In vifro-Experimente

Jeweils 0,5ml Sepsisplasma wurden am Tag des Abnehmens mit jeweils lOμM Penicillamin, lOμM Benzyloxycarbonyl-Valin-Alanin-Aspartat-Fluoromethyl- keton (ZVAD) bzw. 0,1 μM Anti-Complement-Faktor-9-Antikörper (Anti-C9) für 24h inkubiert (immer Doppelwerte!). Als Kontrolle wurden die gleichen Ansätze mit jeweils 0,5 ml gesundem Kontrollplasma gewählt. Anschließend wurde die Annexinbindung gemessen, die als Maß der extrazellulären Phos- phatidylexposition an der Oberfläche der Erythrocyten und damit der Erythro- cytenapoptose dient.

Das Ergebnis dieses Experimentes ist in Fig. 1 dargestellt. Dort sind die arithmetischen Mittel der Annexin-V-Bindung nach 24stündiger Inkubation in Plasma von gesunden Freiwilligen (weiße Balken) oder in Sepsisplasma (schwarze Balken) in Abwesenheit (Kontrolle) oder in Gegenwart von 1 μM Penicillamin (Pen), 1 μM Komplement-Inhibitor AC 9 (AC 9) und 10 μM Caspase-Inhibitor zVAD (ZVAD) dargestellt. * zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen dem Plasma aus Sepsispatienten und Plasma aus gesunden Freiwilligen an. # zeigt einen signifikanten Unterschied gegenüber der Abwesenheit von Penicillamin an (ANOVA unter Verwendung des Dunnet's Test als post hoc Test; p < 0,05).

Dabei zeigt sich, dass das Sepsisplasma deutlich die Erythrocytenapoptose und damit die Annexinbindung steigert; vgl. Balken ganz links. Außerdem zeigt sich, dass erwartungsgemäß die bekannten Erythrocytenapoptosehemmer AC 9 und zVAD die Annexinbindung reduzieren; vgl. Balken ganz rechts (ZVAD) und zweite Balken von rechts (AC 9). überraschenderweise hemmt auch Penicillamin die durch das Sepsisplasma induzierte Erythrocytenapoptose; vgl. zweite Balken von links (Pen).

2.2 In vivo-Experimente

Als nächstes wurde die Wirksamkeit von Penicillamin zur Inhibition von Sepsis in vivo getestet. Dazu wurde in einer Gruppe von 12 Mäusen durch Verabreichung von Lipopolysaccharid (LPS; 75 μg/g Körpergewicht) experimentell eine Sepsis induziert. Der Hälfte der Gruppe (n=6) wurde zusätzlich Penicillamin verabreicht (900 μg/g Körpergewicht). Alle zwölf Mäuse wurden paarweise unter identischen Standardlaborbedingungen mit freiem Zugang zu Futter/Wasser gehalten. Die Vitalfunktionen der Mäuse wurden regelmäßig überwacht. Das Ergebnis dieses Experimentes ist in nachfolgender Tabelle dargestellt.

Tab.: überleben von Mäusen, bei denen mit Lipopolysacchariden (LPS) Sepsis ausgelöst wurde, und die Penicillamin oder kein Penicillamin (Kontrolle) erhalten haben.

Die überlebensdauer der unbehandelten septischen Mäuse lag bei durchschnittlich 17,3 +/- 2,3 Stunden, wohingegen die überlebensdauer der Mäuse, die zusätzlich mit Penicillamin behandelt wurden, bei 27,3 +/- 6,7 Stunden lag (t-test, p < 0,046). Penicillamin greift deshalb in vivo in den Metabolismus der Sepsis ein und kann die Pathologie der Sepsis positiv beeinflussen.

3. Fazit

Die Erfinder konnten damit erstmals zeigen, dass Penicillamin ein geeigneter Wirkstoff für ein Arzneimittel zur Behandlung, Inhibition und/oder Prävention der Sepsis ist.