Gegenstand der Erfindung sind Phasenträger für die Vertei¬ lungschromatographie von Makromolekülen insbesondere im wäßrigen Polyethylenglykol-Dextran-Zweiphasensystem, Ver¬ fahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung.

Es ist bekannt, daß man biologische Makromoleküle, sub¬ zelluläre Einheiten, Bakterien und eukaryotische Zellen durch Gegenstromverteilung im wäßrigen Polyethylenglykol- Dextran-Syste trennen kann (P.A. Albertson "Partition of Cell Particles and Macromolecules" (1971), 2nd Ed., Alm- quist & Wiksell, Stockholm). Diese Gegenstromverteilungs¬ verfahren sind nun aber apparativ äußerst aufwendig und zeitraubend, insbesondere wenn bei kleinen Verteilungskoeffizien¬ ten eine große Vielzahl von Gegenstromverteilungsstufen notwendig ist, um die gewünschte Trennung zu erreichen Es wurden daher bereits Versuche unternommen, diesen Ge¬ genstromverteilungsprozeß durch ein verteilungschrcπatographische Verfahren zu ersetzen, da es in dieser Weise wesentlich einfacher möglich ist, eine Vielzahl von Trennungsstufen zu erreichen. Allerdings scheiterten diese Versuche bis¬ lang an geeigneten Trägern für die stationäre Phase.

Bislang konnten lediglich doppelsträngige Nucleinsäuren im wäßrigen Polyethylenglykol-Dextran-System unter Ver¬ wendung von Cellulose als Träger für die dextranreiche stationäre Phase chromatographisch getrennt werden (W. Mül ler, H.J. Schuetz, C. Guerrier-Takada, P.E. Cole und R. Potts, Nucleic Acids Research, Vol. 7, Nr. 8 (1979) 2483 bis 2499 und W. Müller und G. Küte eier, Eur. J. Bioche . 128 (1982), 231 bis 238). Bei diesen Untersuchungen der Flüssig/Flüssig-Chro atographie von DNA-Fragmenten wurde als Trägermaterialien für die dextranreiche Phase des wäßrigen Polyethylenglykol-Dextran-Systems eine Reihe

von Materialien eingesetzt, von denen sich insbesondere " Cellulose als geeignet erwiesen hat, da es eine ausrei¬ chende Affinität für die dextranreiche Phase zeigt. Für Proteine und proteinhaltige Zellbestandteile sind diese Phasenträger aber wegen ihrer ausgeprägten Adsorptions¬ eigenschaften nicht anwendbar; auch bei Ribonucleinsäuren machen sich adsorptionsbedingte Störeffekte schon bemerk¬ bar. Kationische oder anionische Gele auf Polysaccharid- basis binden die dextranreiche Phase zwar ähnlich gut wie Cellulose, sind jedoch nur für isokratische Trennpro¬ zesse zu benutzen, da die Phase abgestoßen wird, sobald sich das elektrische Phasenpotential im Zuge der Gra- dientenelution mit verschiedenen Salzen in der mobilen, polyethylenreichen Phase ändert.

Unter den neutralen Gelen, die als potentielle Phasen¬ träger für eine solche Verteilungschromatographie in Frage kämen, sind- poröse Mischpolymere auf Vinylbasis (Fraktogele der Firma Merck, Darmstadt) sowie die Poly- acrylamidgele (Biogele der Firma Biorad). Erstere binden für eine generelle Anwendung eine zu geringe Menge der Dextranphasen, während im letzteren Falle die gebundene Phase für Makromoleküle kaum zugänglich ist. Dieser Sach¬ verhalt wird auch in der oben angesprochenen iteratur- stelle Eur. J. Biochem. 128 (1982), Seite 233 deutlich hervorgehoben. Diese Unzugänglichkeit der gebundenen Phase gilt auch für Polyacrylamid-Agarose-Kombinations- gele ^' (beispielsweise die AcA-Ultrogele der Firma IDF).

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht somit darin, Phasenträger mit universellem Anwendungsbereich für die Verteilungschromatographie von Makromolekülen zu schaffen, die eine hervorragende Trennung in einfacher Weise ermöglichen, leicht herzustellen sind und für die . Trennung von nieder- und hochmolekularen Ribonuclein¬ säuren ebenso geeignet sind wie für subzelluläre Einheiten und ganze Zellen, was namentlich für die Virusforschung

und _V iroidforschung von großer Bedeutung ist.

Es hat sich nunmehr gezeigt, daß diese Aufgaben mit Hilfe von Phasenträgern gelöst werden kann, die Grundträgerteil- chen umfassen, deren Oberfläche mit einem fest anhaften¬ den Material mit Affinität für eine der Phasen des Phasen¬ systems für die Verteilungschromatographie beschichtet ist.

Gegenstand der Erfindung sind daher die Phasenträger ge¬ mäß Hauptanspruch. Die Unteransprüche betreffen besonders bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstan¬ des sowie ein Verfahren zur Herstellung dieser Phasenträ¬ ger und deren Verwendung.

Die Erfindung betrifft somit Phasenträger für die Vertei¬ lungschromatographie von Makromolekülen, namentlich ein- strängigen Nucleinsäuren und insbesondere Proteinen sowie subzellulären Einheiten und ganzen Zellen, die aus nicht- adsorptiven, in dem Phasensystem unlöslichen Grundträger¬ teilchen mit einer durchschnittlichen Teilchengröße im Bereich von 7 bis 2000 um bestehen, deren Oberfläche mit einem in dem Phasensystem unlöslichen, fest anhaftenden Material mit Affinität für eine der Phasen des Phasensy- stems für die Verteilungschromatographie beschichtet ist.

Bei dem erfindungsgemäßen Phasenträger sind die Grundträ¬ gerteilchen mit einem festanhaftenden Material mit Affi¬ nität für eine der Phasen, namentlich die Dextranphase des Polyethylenglykol-Dextran-Zweiphasensystems, be¬ schichtet, was zur Folge hat, daß bei diesen Kombinations¬ teilchen die Dextranphase zwangsläufig an der Oberfläche gebunden wird und in dieser Weise auch für extrem große Moleküle bis zu ganzen Zellen zugänglich wird. Auf der an- deren Seite sorgen die Grundträgerteilchen für die erfor¬ derliche mechanische Stabilität des Phasenträgers.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung be¬ stehen die Grundträgerteilchen aus einem anorganischen und/oder organischen Material, beispielsweise aus Alumi¬ niumoxid, einem Silicat, Kieselgur, Kieselgel, Cellulose, Cellulosederivaten, vernetzten! Dextran, vernetzter Agaro- se oder einem Polymer oder Copolymer auf der Grundlage von Monomeren, wie Acrylsäure, Acrylamid, Acrylsäure- estern, Acrylnitril, Methacrylsäure, Methacrylamid, Methacrylsäur estern, Methacrylnitril und/oder Vinylverbindungen oder Gemischen aus d sen Monomeren. Besonders bevorzugt ist es, daß die Grund¬ trägerteilchen aus einem dieser angegebenen Materialien in hydroxylierter Form bestehen, da es in dieser Weise ohne weiteres möglich ist, die Oberflächenschicht fest mit den Grundträgerteilchen zu verbinden, namentlich eine chemi- sehe Bindung zwischen dem Material der Oberfächenschicht und dem der Grundträgerteilchen zu erreichen.

Besonders vorteilhaft ist es, Grundträgerteilchen aus ei¬ nem diolsubstituierten Kieselgel, einem hydrophilisierten Polymethacrylat, einem Silicat mit stärkeartiger Beschich¬ tung oder einem porösen Polymer auf Vinylbasis einzuset¬ zen.

Mit besonderem Vorteil besitzen die Grundträgerteilchen des erfindungsgemäßen Phasenträgers eine durchschnittli¬ che Teilchengröße von 7 bis 100 um und insbesondere von 10 bis 50 um.

Einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung zufolge sind die Grundträgerteilchen mit einem polymeren Material beschichtet, das mit besonderem Vorteil chemisch an das Material der Grundträgerteilchen gebunden ist. Da¬ bei hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen, die Grundträgerteilchen mit einem. synthetischen Polymer oder Copolymer zu beschichten, welches durch Aufpfropfen der monomeren Bestandteile auf die Grundträgerteilchen gebil-

det wird. Für diesen Zweck hat sich aufgepfropftes Poly- acrylamid und insbesondere lineares oder schwach vernetz- tes Polyacrylamid am für den angestrebten Trenneffekt geeignetsten erwiesen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung dieses Phasenträgers, welches darin be¬ steht, die Grundträgerteilchen der oben beschriebenen Art chemisch mit dem in Form einer Oberflächenschicht aufge- brachten polymeren Material zu verbinden. Vorzugsweise wird dies in der Weise durchgeführt, daß man die Grund¬ trägerteilchen durch Pfropfpolymerisation mit der Ober¬ flächenschicht aus dem polymeren Material versieht.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens werden die Grundträgerteilchen aus einem hydroxylierten Material der oben angegebenen Art in einer das bzw. die Monomeren enthaltenden Lösung suspendiert, worauf das Auf¬ pfropfen des polymeren Materials im Zuge einer Redoxpoly- merisation unter Sauerstoffausschluß bewirkt wird. Dabei kann man bei diesem Verfahren mit Vorteil als Polymerisa¬ tionskatalysator Cer(IV)-ionen verwenden, da dieses Mate¬ rial die Bildung der die Polymerisation begünstigenden freien Radikale ausschließlich an der Oberfläche der Grundträgerteilchen bewirkt, so daß die Polymerisation in Form einer Pfropfpolymerisation abläuft. Bezüglich Einzelheiten dieses an sich bekannten Verfahrens darf auf G. Mino und S. Kaizer an in Journal of Polymer Science, Vol. XXXI, Nr. 122 (1958), 242 bis 243 verwiesen werden.

Bei dieser Verfahrensführung setzt man das zur Bildung des als Oberflächenschicht bevorzugten Polyacrylamids verwendete Acrylamid vorzugsweise in Form einer wäßrigen Lösung ein.

Es hat sich gezeigt, daß bei der oben angesprochenen Redox- polymerisation in Gegenwart von Cer(IV)-ionen die PfropfPo¬ lymerisation von Acrylamid unter sorgfältigem Sauerstoff¬ ausschluß innerhalb von 30 bis 240 Minuten eine genügend dichte Polyacrylamidschicht auf den Grundträgerteilchen ergibt, die zur Bindung einer ausreichenden Menge der Dex¬ tranphase für die Verteilungschromatographie im wäßrigen Polyethylenglykol-Dextran-System ausreich .

Im einzelnen wurden die folgenden Träger mit Erfolg mit einer Polyacrylamidschicht versehen:

^M Superosβ"' ": Vernetzte Agarose der Firma Pharmacia, Teilchengröße 25 bis 40 μm, "Lichrosorb ® "-Diol: Diolsubstituiertes Kieselgel der Firma Merck, Teilchengröße 10 um, "Separon He a 1000® ": Hydrophilisiertes Polymeth¬ acrylat der Laboratory Instruments Works, Prag, Teilchengröße 16 bis 21 um, "TSK-SIL 3000®": Silicatträger mit stärkeartiger

Beschichtung der Firma Toyo Soda, Teil¬ chengröße 10 um (unter anderem Inhalt der "Blauen Säule" der Firma LKB) , "TSK-HW-40(S) ®, -55(S) -65(S) und -75(S)": Poröse Mis polymere auf Vinylbasis, ^■ 1m Xq OH/g , der Firma Toyo Soda, erhältlich als "Fractogele" der Firma Merck, Teilchen¬ größe 25 bis 40 um.

Es hat sich gezeigt, daß die erfindungsgemäßen Phasenträger für die Trennung von nieder- und hochmolekula¬ ren Ribonucleinsäuren, von doppelsträngigen Nucleinsäuren, von subzellulären Einheiten und ganzen Zellen geeignet sind, so daß sie für die Isolierung von Viroid-RNA aus pflanzlichen Rohextrakten und für die chromatographische Trennung subzellulärer Einheiten und ganzen Zellen unter

anderem für medizinisch-diagnostische Zwecke angewandt werden können.

Gegenstand der- Erfindung ist daher auch die Verwendung der oben definierten Phasenträger zur verteilungschromatogra¬ phischen Trennung von Makromolekülen, Biopolymeren, sub¬ zellulären Einheiten und ganzen Zellen in wäßrigen Zwei- und Mehrphasensystemen auf Polymerbasis, wie sie bei¬ spielsweise von P.A. Albertson ("Partition of Cell Particles and Macromolecules" (1971), 2nd Ed. Almquist

& Wiksell, Stockholm, S. 18-30) beschrieben worden sind, insbesondere in wäßrigen Polyethylenglykol-Dextran- Zweiphasensystemen. Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

B e i s p i e l 1

Dieses Beispiel verdeutlicht die Herstellung eines erfin- dungsgemäßen Phasenträgers.

Man beschickt einen mit einem Gaseinleitungsrohr, einem Tropftrichter und einem VakuumanschluÖ versehenen Drei¬ halskolben mit Giner Lösung von 50g Acrylamid in 500 ml destilliertem Wasser und suspendiert 20g Grundträgerteil- chen aus einem diolsubstituierten Kieselgel ( Lichrosorb ( ^v* -R ^/ )-

Diol der Firma Merck) mit einer Teilchengröße von 10 μ in dieser Lösung. Dann spült man zunächst während 5 Minu¬ ten mit nachgereinigtem Stickstoff, evakuiert und füllt erneut mit Stickstoff. Diese Maßnahmen des Evakuierens und Befüllens mit Stickstoff wiederholt man zweimal »wonach man 15ml einer 0,2 M Lösung von Cer( TV)-ammoniumnitrat in 1 N Salpetersäure unter Rühren zusetzt. Man leitet unter mäßigem Rühren während 60 Minuten Stickstoff durch die Suspension, wobei die Intensität der gelben Farbe der

Cer(IV)-ionen deutlich abnimmt. Dann versetzt man die Sus¬ pension unter Luftzutritt mit weiteren 20g der Grundträger¬ teilchen und filtriert nach dem Mischen unter Druck über ein Blaubandfilter (Schleicher & Schüll Nr. 589 ³ ) ab. Nach dem Waschen mit 400ml destilliertem Wasser wäscht man mit

rund 400 ml einer 0,2 M Natriumacetatlösung in einem Cacodylat-Puffer (10 mM Natriutncacodylat/ mM Ethylendiamin tetraes ^' sigsäure, pH-Wert ^» 6).

In gleicher Weise versieht man Grundträgerteilchen aus den oben spezifisch angesprochenen Materialien mit einer Polyacrylamidschicht, wobei es nicht notwendig ist, die oben angegebene Verdünnung des polyacrylamidbeschich- teten Trägers mit nichtbeschichtetem Material durchzu- führen. Im Fall von Grundträgerteilchen aus "Lichrosorb ^ö ' ist diese Verdünnung erforderlich, um das beschichtete Ma¬ terial filtrierbar zu machen und somit die Beschichtung mi der Dextranphase zu begünstigen.

B e i s p i e l

Zur Verdeutlichung der Trenneigenschaf en des erfindungs¬ gemäßen Phasenträgers wurden Vergleichsversuche durchge¬ führt, bei denen die erfindungsgemäßen Phasenträger Pha¬ senträgern gegenübergestellt wurden, die lediglich aus den Grundträgerteilchen des entsprechenden erfindungsge¬ mäßen Phasent∑ägers bestehen.

Zunächst wurden die Phasenträger mit der Dextranphase des Polyethylenglykol-Dextran-Systems wie folgt beschich- tet.

Das gewaschene Material wurde im Druckfilter bei 37 ^β C mit 2,5 Volumen der Dextranphase des Polyethylenglykol-Dex- tran-Syste s (hergestellt durch Lösen von 66,3 g Dextran T500 und 5,4 g Polyethylenglykol 8000 in 428,3 ml 0,2 M Natriumacetat in dem in Beispiel 1 beschriebenen Cacody¬ lat-Puffer) gespült, wonach der Phasenüberschuß mit der polyethylenglykolreichen Oberphase des gleichen Systems (hergestellt durch Lösen von 3 g Dextran T500, 71,7 g Po- lyethylenglykol 8000 in 925,3 ml 0,2 M Natriumacetat in dem Cacodylat-Puffer) ausgewaschen wurde. Nach dem Suspendieren

des Materials in 3 Volumen Oberphase wurde der in dieser Weise erhaltene Phasenträger in ein geeignetes Chromato¬ graphierohr mit einem auf 37 ^β C thermostatisierten Heiz¬ mantel eingeschlämmt.

Dann wurden die Trenneigenschaften der in dieser Weise mit der Dextranphase versehenen unbeschichteten Grundträ¬ gerteilchen einerseits bzw. der erfindungsgemäßen Phasen¬ träger andererseits untersucht, und zwar unter Verwendung eines Probenmaterials auf der Grundläge eines Gemisches aus Transfer-RNA (tRNA) und 5sRNA. Beide RNA-Komponenten gehören zu den löslichen Ribonucleinsäuren und besitzen die folgenden Eigenschaften:

tRNA: Molgewicht * 30 000, besteht aus 40 bis 60 gleich großen Spezies, die sich in ihrer Aminosäureakzeptoraktivität unterscheiden.

5sRNA: Molgewicht = 43 000, bei den meisten Orga- nismen einheitliche RNA, die eine Rolle bei der Übertragung einer RNA-Basensequenz in eine A inosäuresequenz spielt.

Die Trennung erfolgt in dem Polyethylenglykol-Dextran-Sy- stem "D" aus 6,20 Gew.-% Dextran, 4,40 Gew.-% Polyethylen¬ glykol und 89,40 Gew.-% Wasser, welches in der Unterphase aus 13,25 Gew.-% Dextran, 1,07 Gew.-% Polyethylenglykol und 85,68 Gew.-% Wasser und in der Oberphase aus 0,30 Gew.-% Dextran, 7,17 Gew.-% Polyethylenglykol und 92,53 Gew.-% Wasser besteht (dieses und ähnliche Polyethylen- glykol-Dextran-Systeme sind aus der oben angesprochenen Literaturstelle P.A. Albertson bekannt, siehe insbesonde¬ re das Phasendiagramm auf Seite 264) . Bei diesem Polyethy- lenglykol-Dextran-Zweiphasensystem läßt sich der Vertei- lungskoeffizient insbesondere durch die Ionenzusammenset¬ zung beeinflussen, d. h. durch die Zugabe unterschiedli-

eher Salze, wobei die Lithiumionen den Verteilungskoeffi¬ zienten ^' K -steigern, während die anderen Alkalikationen den entgegengesetzten Effekt ausüben.

Bei der hier durchgeführten Trennung werden daher im Pha¬ senpaar die folgenden Elektroiyte verwendet:

10 mM Natrium-Cacodylat-Puffer mit einem pH-Wert von 6,0 3 mM Natriumazid

1 mM Natriumsalz der Ethylendiamintetraessigsäure + 0,2 M Natriumacetat.

Die Trennung erfolgt bei einer Temperatur von 37 ^β C in der thermostatisierten Chromatographiesäule.

Die Probenmengen sind in OD- _c ^-Einheiten angegeben, d. h. als optische Dichte bei einer Wellenläne von -254 n , wo¬ bei 25 OD ₂₅₄ ^{1 m<} 3 ^RNA entsprechen.

Die bei diesen Trennungen erhaltenen Ergebnisse sind in den beigefügten Fig. 1 bis 6 dargestellt, wobei diese Figuren im einzelnen folgendes zeigen:

Fig. 1 Vergleichsversuch: Chromatographie einer

10 OD ₂₅₄ -Probe an einer Säule, die mit Grund¬ trägerteilchen aus nicht mit Polyacrylamid beschichtetem "Lichrosorb^ "-Diol gefüllt ist. Säulenvolümen: 55 ml, Flußrate: 18 ml/h;

Fig. 2 Erfindungsgemäßer Versuch: Trennung einer farbstoffhaltigen 50 OD-g.-Probe an einer Säule, die mit polyacrylamidbeschichteten Grundträgerteilchen aus "Lichrosorb® "-Diol beschickt ist. Säulenvolumen: 8,4 ml, Flu߬ rate: 15 ml/h;

Fig. 3 Vergleichsversuch: Chromatographie einer

19 OD-, _e .-Probe an einer mit Grundträgerteil- chen a ² u ⁵ s ⁴ "Superose ß ^Vö . " beschichteten Säule,

Säulcnvolumen: 10 ml, Flußrate: 9 ml/h;

Fig. 4 Erfindungsgemäßer Versuch: Trennung einer

50 OD2,5 _e 4.-Probe an einer Säule, dieÄmit Poly- acrylamid beschichteten "Superose ^v * ^y "-Teil¬ chen beschickt ist, Säulenvolumen: 60 ml, Flußrate: 20 ml/h;

Fig. 5 Vergleichsversuch: Chromatographie einer

35 OD- _e ^Probe an einer mit Grundträgerteil¬ chen aus "TSK-HW-40(S) " beschickten Säule, Säulenvolumen: 65 ml, Flußrate: 15 ml/h;

Fig. 6 Erfindungsgemäßer Versuch: Trennung ^" einer

35 OD ₂₅ .-Probe an einer Säule, die mit Poly- acrylamid beschichteten "TSK-HW-40(S) "-Grund- trägcrteilchen beschickt ist, Säulenvolumen:

65 ml, Flußrate: 15 ml/h.

Aus den obigen Figuren ist ersichtlich, daß mit Hilfe der erfindungsgemäßen Phasenträger im Vergleich zu Säulen, die die unbeschichteten Grundträgerteilchen enthalten, eine überraschend saubere Trennung der Bestandteile des eingesetzten Trenngemisches möglich ist. Damit ist aber ersichtlich, daß die erfindungsgemäßen Phasenträger eine unerwartet vorteilhafte Eignung für die Trennung von biologischen Makromolekülen besitzen, die in keiner Weise vorausgesehen werden konnte, und mit großem Vorteil für Trennverfahren und medinzinisch-diagnostische Verfahren angewandt werden können.