Beschreibung

Die Erfindung betrifft Phosphatidylverbindungen, die einen definierten hydrophilen Rest enthalten, sowie Liposomen, die eine verlängerte Lebensdauer aufweisen.

Herkömmliche Liposome weisen im Serum eine Verweilzeit von bis zu 5 Stunden auf. Insbesondere bei der Verwendung von Liposo¬ men als Träger für pharmazeutische Wirkstoffe ist jedoch eine möglichst lange Verweilzeit von Liposomen im Blutkreislauf wünschenswert .

Es wurden daraufhin die sogenannten "Stealth-Liposomen" ent¬ wickelt, die eine verlängerte Lebensdauer aufweisen. Diese "Stealth-Liposomen" sind auf der Basis von Phosphatidylver¬ bindungen aufgebaut, die einen verlängerten Polyethylenglykol- rest enthalten. Der Polyethylenglykolrest erwies sich für die angestrebte verlängerte Lebensdauer am wirksamsten bei Moleku¬ largewichten zwischen 2000 und 3000. Ein wesentlicher Nachteil dieser "Stealth-Liposomen" bzw. der Phosphatidylverbindungen mit Polyethylenglykolrest liegt allerdings darin, daß es sich nicht um exakt definierte Verbindungen handelt, da die Poly- ethylenglykolreste unterschiedliche Kettenlängen aufweisen.

Weiterhin wurde von Maruyama et al . (Int. J. Pharmac. 111 (1994) , 103-107) die Verwendung von Dipalmitoylphosphatidylpo- lyglycerinen zur Verlängerung der Liposomenzirkulation vorge- schlagen. Da jedoch von technischen Polyglycerinen ausgegangen wurde, wurden auch hier keine einheitlichen Produkte erhalten. Die technischen Polyglycerine, die aus einem Gemisch aus Poly¬ glycerinen verschiedener Kettenlänge und Monoglycerin bestehen und durch ihr mittleres Molekulargewicht charakterisiert sind, wurden mittels Phospholipase D phosphatidyliert. Mit den so erhaltenen Produkten konnte jedoch nur eine geringe Erhöhung der Lebensdauer von Liposomen in Blut beobachtet werden.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war deshalb die Bereitstel¬ lung von Verbindungen, die die Lebensdauer von Liposomen erhö¬ hen und zugleich eine exakt angebbare Zusammensetzung aufwei¬ sen.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch eine Verbindung einer allgemeinen Formel (A)

5 worin R ¹ und R ² unabhängig voneinander Wasserstoff, einen ge¬ sättigten oder ungesättigten Alkyl- oder Acylrest darstellen, der gegebenenfalls verzweigt oder/und substituiert sein kann, R ³ Wasserstoff oder einen Alkylrest darstellt, 0 n = 0 oder 1 ist, x eine ganze Zahl von 1 bis 4 darstellt und m eine ganze Zahl von 2 bis 10, falls n = 0, oder eine ganze Zahl von 1 bis 10, falls n = 1, darstellt sowie 1 ist, falls x größer als 1 ist, 5 wobei im Falle n = 0 die Verbindung hinsichtlich des Werts von m größer als 90 % einheitlich ist.

Der dieser Erfindung zugrundeliegende schrittweise Aufbau der hydrophilen Reste der Phosphatidylverbindungen der Formel (A) 0 ermöglicht es, eine genau definierte Zusammensetzung der Ver¬ bindungen zu erhalten.

Es handelt sich also bei der erfindungsgemäßen Verbindung der Formel (A) nicht um ein Gemisch verschiedener Moleküle unbe- s stimmter Zusammensetzung und Kettenlänge, sondern es kann gezielt eine gewünschte Struktur erhalten werden. Dies bedeu¬ tet, daß beispielsweise, falls das gewünschte Produkt ein Triglycerinderivat ist, also x = 1 und m = 3 in Formel (A) ,

ERSATZBLATT {REGEL 26)

der Gehalt an Monoglycerin-, Diglycerin- , Tetraglycerin- und höheren Oligoglycerinderivaten gering ist. Bevorzugt wird ein Glycerinderivat bestimmter Kettenlänge im wesentlichen frei von Glycerinderivaten anderer Kettenlänge erhalten. Insbeson- dere ist der Gehalt an Monoglycerinderivaten gering und be¬ trägt weniger als 5 %, bevorzugt weniger als 1 % und besonders bevorzugt weniger als 0,1 %, bezogen auf das gewünschte Oligo- glycerinderivat .

Erfindungsgemäß stellt die Verbindung der Formel (A) eine ein¬ heitliche Verbindung definierter Struktur dar. Bevorzugt ist die Verbindung hinsichtlich des Werts von m größer als 95 %, besonders bevorzugt größer als 99 % einheitlich. Es ist jedoch auch möglich, die Verbindung mit einer Einheitlichkeit von mehr als 99,9 % hinsichtlich des Werts von m bereitzustellen.

Bevorzugt handelt es sich bei der Verbindung um Oligoglycerin- derivate mit 2 bis 5 Glycerineinheiten, bevorzugt mit 2 bis 4 Glycerineinheiten. Es handelt sich dabei bevorzugt um 1.3- verknüpfte lineare Oligoglycerinreste.

Die Reste R ¹ und R ² stellen erfindungsgemäß bevorzugt unabhän¬ gig voneinander Wasserstoff, einen gesättigten oder ungesät¬ tigten oder C ₁ -C ₂₄ -Acylrest, bevorzugt Wasserstoff oder einen gesättigten oder ungesättigten C ₈ -C ₂₄ -Alkyl- oder C ₈ - C ₂₄ -Acylrest dar, wobei bevorzugt mindestens einer der Reste R ¹ und R ² einen Acylrest darstellt.

Der Rest R ³ stellt bevorzugt Wasserstoff oder einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen dar.

Die Verbindung der Formel (A) kann als Racemat, das eine Phos- pho-rac-(l oder 3) -oligoglycerinverknüpfung enthält oder als stereospezifisches Isomer vorliegen. Die Stereoisomere können eine Phospho-sn-1-oligoglycerinverknüpfung oder eine Phospho- sn-3-oligoglycerinverknüpfung aufweisen. Die Bildung der stereospezifischen Verknüpfung kann analog zu den in der Lite¬ ratur beschriebenen Verfahren durchgeführt werden (DE 31 30

ERSATZB π(REGEL26)

867 AI; H. Eibl et al . , Chem. Phys . Lipids, 2 _. 8 :i981) 41 (1986) , 53-63 und 47 (1988, 47-53) .

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Liposomen, die Phopsholipide oder/und Alkylphospholipide, gegebenenfalls Cholesterin und 1 bis 50 Mol-% einer Verbindung der allgemei¬ nen Formel (A)

K

CH,-CH-CH-0-P-0 •H I I I o o o ^β

oder deren Salze enthalten, wobei das Cholesterin, die Phos- pholipide, die Alkylphospholipide und die Verbindung der For¬ mel (A) zusammen 100 Mol-% ergeben, worin R ¹ und R ² unabhängig voneinander Wasserstoff, einen gesättigten oder ungesättigten Alkyl- oder Acylrest darstellen, der gegebenenfalls verzweigt oder/und substituiert sein kann,

R ³ Wasserstoff oder einen Alkylrest darstellt, n = 0 oder 1 ist, x eine ganze Zahl von 1 bis 4 darstellt und m eine ganze Zahl von 2 bis 10, falls n = 0, oder eine ganze Zahl von 1 bis 10, falls n = 1, darstellt sowie 1 ist, falls x größer als 1 ist, wobei im Falle n = 0 die

Verbindung (A) hinsichtlich des Werts von m größer als 90

% einheitlich ist.

Die erfindungsgemäßen Liposomen weisen eine Halbwertszeit im Serum von bis zu 18 bis 20 Stunden auf. Dabei wurde überra¬ schenderweise ein linearer Abfall der Liposomenkonzentration im Blut gefunden.

Erfindungsgemäß bevorzugt wird die Verbindung (A) mit einer Einheitlichkeit von größer als 95 %, besonders bevorzugt größer als 99 % hinsichtlich des Werts von m verwendet. Es ist aber auch möglich, die Verbindung (A) in praktisch reiner Form

mit einer Einheitlichkeit von größer als 99,9 % hinsichtlich des Werts von m einzusetzen.

Bevorzugt enthalten die Liposomen eine Verbindung der Formel (A) , in der x = 1 und m eine ganze Zahl von 2 bis 5, besonders bevorzugt eine ganze Zahl von 2 bis 4 darstellt.

Die Reste R ¹ und R ² der in den Liposomen enthaltenen Verbindung der Formel (A) können unabhängig voneinander Wasserstoff, einen gesättigten oder ungesättigten C ₁ -C ₂₄ -Alkyl- oder C ₁ -C ₂₄ - Acylrest, bevorzugt Wasserstoff oder einen gesättigten oder ungesättigten C ₈ -C ₂₄ -Alkyl- oder C ₈ -C ₂₄ -Acylrest darstellen. Bei dem Substituenten handelt es sich um einen Rest, der bei der Herstellung nicht interferiert. R ³ stellt bevorzugt Wasserstoff oder einen C ₁ -C ₄ -Alkylrest dar.

Die Verbindung der Formel (A) kann in den Liposomen als race- misches Gemisch, also mit einer Phospho-rac- (1 oder 3) -oligo¬ glycerinverknüpfung vorliegen. Bevorzugt liegt sie in stereo- spezifischer Form mit einer Phospho-sn-1-oligoglycerinverknüp¬ fung oder einer Phospho-sn-3-oligoglycerinverknüpfung vor.

Bevorzugt stellt mindestens einer der Reste R ¹ und R ² der For¬ mel (A) eine Acylgruppe dar.

Liposomen, in denen die Verbindung der Formel (A) mit n = 0 vorliegt, weisen bevorzugt eine negative Überschußladung auf. Es können aber auch Liposomen aus Verbindungen der Formel (A) hergestellt werden, in denen n = 1 ist. In diesem Fall weisen die Liposomen bevorzugt keine oder eine positive Überschußla- dung auf .

Die Liposomen enthalten neben einer Verbindung der Formel (A) Phospholipide oder/und Alkylphospholipide sowie gegebenenfalls Cholesterin. Bevorzugt werden 5 bis 15 Mol-% der Verbindung der Formel (A) eingesetzt. Falls die Liposome keine Überschu߬ ladung aufweisen, ist eine Zusammensetzung aus 0 bis 70 Mol-% Cholesterin, 1 bis 50 Mol-% einer Verbindung der Formel (A)

ERSÄΓZBLÄTT(REGEL26)

und Phospholipide oder/und Alkylphospholipide bevorzugt . Im Falle einer negativen Überschußladung besteht eine bevorzugte Zusammensetzung der Liposomen aus 0 bis 70 Mol-% Cholesterin, 1 bis 15 Mol-% einer Verbindung der Formel (A) sowie Phospho- lipiden oder/und Alkylphospholipiden. Ein höherer Anteil an Verbindungen der Formel (A) mit negativer Überschußladung würde zur Instabilität der Liposomen im Blutkreislauf führen. Bevorzugt umfassen die Liposomen 35 bis 43 Mol-%, besonders bevorzugt 38 bis 42 Mol-% Cholesterin, 5 bis 15 Mol-% einer Verbindung der Formel (A) und Phospholipide oder/und Alkyl¬ phospholipide.

Die Phospholipide oder/und Alkylphospholipide können bei¬ spielsweise Diacylphosphoglycerine definierter Struktur sein. Allgemein können diese Bestandteile der Lipide als Verbindun¬ gen definierter Struktur eingesetzt werden.

Im Falle x > 1 stammt der Rest -CH ₂ (-CH0H) _x -CH ₂ -0H bevorzugt von Zuckeralkoholen, die für x = 2,4 Hydroxylgruppen, für x = 3,5 Hydroxylgruppen und für x = 4,6 Hydroxylgruppen aufweisen. Beispiele solcher Reste sind Mannitderivate für x = 4, Lyxit- derivat für x = 3 und Threitderivate für x = 2.

Die erfindungsgemäßen Liposomen weisen eine deutlich erhöhte Halbwertszeit im Blutkreislauf auf. Bevorzugt beträgt ihre Halbwertszeit mindestens 10 Stunden, besonders bevorzugt mehr als 12 Stunden. Es wurden Halbwertszeiten der erfindungsge¬ mäßen Liposomen von 18 bis 20 Stunden erhalten. Überraschen¬ derweise wurden dabei absolut lineare Abfallkurven der Lipid- konzentrationen im Blut festgestellt. Erfindungsgemäß bevor¬ zugt befinden sich nach 6 Stunden mehr als 50 % und besonders bevorzugt mehr als 60 % der zugegebenen Liposomenmenge im Blut.

Als besonders überraschende Eigenschaft der erfindungsgemäßen Liposomen hat sich ihre bevorzugte Anreicherung in der Milz herausgestellt. In Abhängigkeit von der Zusammensetzung und der Größe der Liposomen wurden bereits Anreicherungsfaktoren

in der Milz im Vergleich zur Leber um etwa das 25-fache er¬ reicht. Dabei steigt die Anreicherung in der Milz verglichen mit der Leber mit zunehmendem Wert für m in Formel A und mit zunehmender Größe der Liposomen. So steigt der Anreicherungs- 5 grad in der Milz beim Übergang von SUVs (Small Unilamellar Liposomes; Durchmesser etwa 60 nm) auf LUVs (Large Unilamellar Liposomes; Durchmesser etwa 190 nm) um ein Vielfaches. Die bevorzugte Anreicherung in der Milz nimmt auch mit zunehmender Zahl der Kohlenstoffatome in R ¹ und R ² zu. 0

Darüber hinaus wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Lipo¬ somen auch in bestimmten Tumorgeweben angereichert werden. So wurde gefunden, daß eine solche Anreicherung bei dem mit Methylnitrosoharnstoff induzierten Mammakarzinom (MNU-Karzi- s nom) stattfindet.

Weiterhin können die erfindungsgemäßen Liposomen zusätzlich einen oder mehrere pharmazeutische Wirkstoffe enthalten.

0 Als Wirkstoffe können in der Regel alle Wirkstoffe verwendet werden, die sich mittels Liposomen überhaupt ins Plasma ein¬ bringen lassen. Bevorzugte Wirkstoffgruppen sind einerseits Cytostatika, insbesondere Anthracyclin-Antibiotika, wie etwa Doxorubicin, Epirubicin oder Daunomycin, wobei Doxorubicin s besonders bevorzugt ist . Weitere bevorzugte Cytostatika sind Idarubicin, Hexadecylphosphocholin, l-0ctadecyl-2-methyl-rac- glycero-3-phosphocholin, 5-Fluoruracil, cis-Platinkomplexe wie Carboplatin und Novantron sowie Mitomycine .

0 Weitere bevorzugte Wirkstoffgruppen sind immunmodulierende Substanzen wie etwa Cytokine, wobei unter diesen wiederum die Interferone und insbesondere das α-Interferon besonders bevor¬ zugt sind, anti ykotisch wirksame Substanzen (z.B. Amphoteri- cin B) und Wirkstoffe gegen Protozoenerkrankungen (Malaria, 5 Trypanosomen- und Leishmanien-Infektionen) . Ebenfalls bevor¬ zugt ist Taxol als Wirkstoff.

Eine weitere bevorzugte Wirkstoffgruppe sind lytische Wirk¬ stoffe, wie sie in der DE 41 32 345 AI beschrieben sind. Der Inhalt dieser Patentanmeldung wird hiermit durch Bezugnahme aufgenommen. Bevorzugt sind Miltefosin, Edelfoεin, Ilmofosin sowie SRI62-834.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit die Verwendung von erfindungsgemäßen Liposomen zur Herstellung eines Antitumormittels, wobei der Wirkstoff besonders bevor- zugt Doxorubicin ist.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Liposomen zur Herstellung eines Mittels zur Beeinflussung der Zellproliferation, wobei der Wirkstoff ein Cytokin, besonders bevorzugt c.-Interferon ist.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die oben beschriebenen Liposomen und in den Liposomen eingeschlossen einen oder mehrere pharmazeu¬ tische Wirkstoffe gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch üblichen Verdünnungs- , Hilfs-, Träger- und Füllstoffen ent¬ hält.

Die erfindungsgemäßen Liposomen werden nach an sich bekannten Methoden hergestellt mit hierfür gängigen Vorrichtungen. Typi¬ scherweise kann eine die verschiedenen Komponenten des Lipo- soms einschließlich 1 bis 50 Mol-% einer Verbindung der Formel (A) enthaltende Lösung in eine Lipidsuspension überführt wer- den, die dann unter hohem Druck durch Düsen oder durch Loch- scheiben gepreßt wird, wobei durch die Größe der Öffnungen in der Lochscheibe die Größe der erhaltenen Liposomen geregelt werden kann. Geeigente Maßnahmen zur Überführung einer Lipid¬ suspension in Liposomen sind dem Fachmann bekannt. Bevorzugt werden 5 bis 15 Mol-% einer Verbindung der allgemeinen Formel

(A) mit 35 bis 43 Mol-% Cholesterin und 42 bis 60 Mol-% Phos- pholipiden oder/und Alkylphospholipiden in eine Lipidsuspen-

ERSÄTZBLATT(REGEL26)

sion überführt, die dann durch geeignete Maßnahmen auf an sich bekannte Weise in Liposomen überführt wird.

Solch bekannte Verfahren können auch zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung, die die erfindungsgemäßen Lipo¬ somen und einen oder mehrere pharmazeutische Wirkstoffe ent¬ hält, verwendet werden. Zum Einschluß wasserunlöslicher Wirk¬ stoffe wird der Wirkstoff dabei zusammen mit den Lipidbestand- teilen gelöst, während zum Einschluß wasserlöslicher Wirk- Stoffe der Lipidfilm mit einer wäßrigen Lösung versetzt wird, die den wasserlöslichen Wirkstoff enthält.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (A) können für n = 1 durch Verknüpfen eines definierten Oligoglycerins über die Aminogruppe mit einem Phosphatidylethanolamin hergestellt werden. Dabei erhält man neutrale Verbindungen, also Verbin¬ dungen ohne Überschußladung. Bei den zur Verknüpfung einge¬ setzten definierten Oligoglycerinen handelt es sich um Ver¬ bindungen der Formel (B) .

Zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel (A) , in der n = 0 ist, wird ein definiertes Oligoglycerin mit einem Phosphatidylglycerin verknüpf . Weiterhin können Verbindungen der allgemeinen Formel (A) mit n = 0 dadurch hergestellt wer- den, daß ein definiertes Oligoglycerin oder ein C ₄ -C ₆ -Zucker- alkohol unter Verwendung eines Phosphorylierungsmittels mit einem Alkohol der Formel CH ₂ -OR ¹ -CHOR ² -CHOH verknüpft wird. Bevorzugt wird als Phosphorylierungsmittel P0C1 ₃ verwendet.

Die Herstellung von Phospholipiden aus Diacylglycerinen ist in der Literatur beschrieben (DE 32 39 817 AI; P. Woolley et al . , Chem. Phys. Lipids 4_7 (1988) , 55-62; H. Eibl et al . , Chem. Phys . Lipids 4_7 (1988) , 63-68) und kann entsprechend angewen¬ det werden.

Durch die oben beschriebenen Verfahren kann eine racemische Verbindung gebildet werden, die eine Phospho-rac- (1 oder 3)- oligoglycerinverknüpfung enthält. Bevorzugt werden durch die

Verfahren stereospezifische Verbindungen gebildet, die eine Phopsho-sn-1-oligoglycerinverknüpfung oder eine Phopsho-sn-3- oligoglycerinverknüpfung aufweist. Bevorzugt wird zur Herstel¬ lung einer Verbindung der Formel (A) ein lineares Oligoglyce- rin definierter Kettenlänge eingesetzt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein geschütztes Oligoglycerin der Formel (B) ,

CH ₂ - CH ₂ CH, - O - CH ₂ CH CH, - 0 t I H /

O 0 0

\ /

/ \

CH ₃ CH ₃

worin Y eine ganze Zahl von 1 bis 9 und X eine Benzyl-, Alkyl- oder Tetrahydropropanylgruppe darstellt. Bevorzugt ist Y eine ganze Zahl von 1 bis 3. Erfindungsgemäß gelingt es, 1.3-ver¬ knüpfte Oligoglycerine in praktisch reiner Form zu erhalten. Es können Oligoglycerine einer bestimmten Kettenlänge herge¬ stellt werden, die praktisch keine Verunreinigungen durch Oligoglycerine anderer Kettenlänge enthalten. Zudem weisen die erfindungsgemäß verwendeten Oligoglycerine praktisch keine Verunreinigung durch monomeres Glycerin auf. Es handelt sich also um einheitliche Verbindungen definierter Struktur.

In dem Oligoglycerin kann X auch eine andere geeignete Schutz¬ gruppe darstellen. Weiterhin kann anstelle von Aceton auch eine andere Schutzgruppe, insbesondere ein anderes Keton vor- handen sein.

Weiterhin umfaßt die Erfindung Alkyloligoglycerine der Formel (C)

,

worin Y eine ganze Zahl von 0 bis 8, bevorzugt eine ganze Zahl von 1 bis 3 darstellt und einer der Reste X oder Z einen ge¬ sättigten oder ungesättigten Alkylrest und der andere der Reste Wasserstoff darstellt. Auch bei den Alkyloligoglycerinen handelt es sich um einheitliche Verbindungen definierter Struktur.

Die Herstellung von Oligoglycerinen, geschützten Oligoglyceri- nen und Alkyloligoglycerinen ist von besonderem Interesse, weil mit Hilfe dieser Ausgangsstoffe eine Reihe von wichtigen und neuen Hilfsstoffen zur Lösungsvermittlung und zur Verbes¬ serung der Membranpermeation erhalten werden können. Von be¬ sonderem Interesse zur Verlängerung der Liposomenlebenszeit im Blut ist die Herstellung von Phosphatidyloligoglycerinderiva- ten der Formel (A) , die zusätzliche Hydroxylgruppen im polaren Bereich tragen.

Aufgrund der bevorzugten Anreicherung der erfindungsgemäßen Liposomen in der Milz eignen sich diese Liposomen generell für die selektive Einführung von Substanzen in die Milz. Hierbei kann es sich um Arzneimittel, Kontrastmittel oder dgl. han¬ deln. Insbesondere ist dies aber für die Verbesserung der Qualität von Impfstoffen von Bedeutung, da die Milz für die Bildung von Antikörpern im Rahmen des Immunsystems besonders wichtig ist. Ebenso ist die festgestellte Anreicherung der erfindungsgemäßen Liposomen in Tumorgewebe von Bedeutung für die spezifische Zufuhr von Wirkstoffen, Kontrastmitteln und dgl. in ein solches Tumorgewebe.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen näher erläutert. In den Zeich¬ nungen stellen dar:

Figur 1 eine graphische Darstellung, welche die Verteilung der erfindungsgemäßen Liposomen in Milz und Leber pro Gesamtorgan darstellt .

Figur 2 eine graphische Darstellung, welche die Verteilung der erfindungsgemäßen Liposomen in Milz und Leber pro Gramm Organ darstellt.

Figur 3 eine graphische Darstellung, welche den Blutspiegel- kurvenverlauf in Abhängigkeit von der Zeit für verschiedene erfindungsgemäße Liposomen darstellt.

Beispiel 1

In einem Tierversuch wurden Liposomen verwendet, die aus 40 Mol-% Cholesterin, 10 Mol-% Phosphatidylglycerin und 50 % Dipalmitoyllecithin bestanden. Dabei ergab sich eine Halb¬ wertszeit im Serum von 4 Stunden mit einer typischen Abkling¬ kurve, d.h. anfangs sehr rasche Abnahme, später langsamere Abnahme .

Es wurden Liposomen der gleichen Zusammensetzung hergestellt, in denen das Phosphatidylglycerin durch ein erfindungsgemäßes Phosphatidylglycerin G2 ersetzt. Es wurde eine Halbwertszeit im Serum von 18 bis 20 Stunden mit absolut linearer Abfall¬ kurve erhalten. Die lineare Abfallkurve wurde unabhängig von der Größe der hergestellten Liposomen gefunden. Es wurde mit 50 nm Liposomen und mit 150 nm Liposomen der gleiche lineare Abfall der Liposomkonzentration im Serum gefunden. Weiterhin wurde die lineare Abnahme der Liposomenkonzentration im Blut bei verschiedenen Anfangskonzentrationen festgestellt.

Beispie l 2

Prozentualer Anteil der Liposomen in der Blutzirkulation nach

6 Stunden

s Es wurden erfindungsgemäße Liposomen aus Dipalmitoyl-sn-G-3- PC/Cholesterin/Dipalmitoyl-sn-G-3-PG _γ im molaren Verhältnis von 45 : 45 : 10 hergestellt. Der prozentuale Anteil der ursprüng¬ lich zugegebenen Liposomenmenge, die nach 6 Stunden im Blut gefunden wurden, sind in Tabelle 1 angegeben. Zum Vergleich o sind die von Maruyama et al . unter den gleichen Bedingungen für das System Distearyl-sn-G-3-PC/Cholesterin/Dipalmitoyl-sn- G-3-PG _yι 45 : 45 : 10 erhaltenen Werte angegeben. Es zeigt sich eine deutliche Erhöhung der gefundenen Liposomenmenge im Ver¬ gleich zum Stand der Technik. 5

5 Beispiel 3

Liposomen aus 1, 2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin, 1,2- Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoglyceroglycerin (PG _n ) und Cholesterin im molaren Verhältnis 4:1:5 wurden mit tritium¬ markiertem Inulin dotiert. Diese Liposomen wurden in einer 0 Dosierung von 100 μmol Lipid pro kg Ratte an Ratten verab¬ reicht und nach 72 Stunden die Verteilung dieser Liposomen über die Organe Milz und Leber durch Messung der Radioaktivi¬ tät bestimmt. Die Organgewichte der Leber variierten zwischen 9 und 10 g, die der Milz zwischen 0,6 und 0,7 g. Figur 1 der beigefügten Zeichnung zeigt, daß bei einem etwa 15-fach höhe¬ ren Lebergewicht bei Verwendung von SUVs die Verteilung mit zusätzlicher Zahl der Glycerineinheiten (x = 1; = 1 bis 4 in Formel A) zugunsten der Milz erheblich zunimmt.

In Figur 2 ist die Aufnahme der Liposomen in die Organe Milz und Leber pro Gramm Organ wiedergegeben. Danach enthält die Milz bei n = 4 eine etwa 9 mal so hohe Konzentration an Lipo¬ somen wie die Leber, für m = 1 ist der Anreicherungsfaktor gleich 4. Die Figuren 1 und 2 zeigen zudem in der letzten Spalte den Effekt der Liposomengröße. Für LUVs mit einem Durchmesser von 190 nm ergibt sich daraus eine weitere Ver¬ stärkung der Anreicherung in der Milz, so daß bereits bei n = 2 der Anreicherungsfaktor gleich 24 ist. Praktisch wird mit diesen Liposomen das Organ Leber nicht mehr erreicht.

Beispie l 4

Herstellung von Verbindungen der Formel (A)

Beispiel 4a: Zentrales Zwischenprodukt der Formel I

Die Oligoglycerine Diglycerin (G ₂ ) , Triglycerin (G ₃ ) und Tetra- glycerin (G ₄ ) können aus einem leicht erreichbaren, zentralen Zwischenprodukt der Formel I, 1.2-Isopropyliden-rac-glyce- ro-3. l-rac-glycero-3-allylether, hergestellt werden (siehe Schema A) .

- CH = CH, I

1) Epoxidation

2) Öffnung mit Allylalkohol

3) Epoxidation

4) saure Spaltung

Schema A : Oligoglycerine aus Formel I

Das in Formel I beschriebene Zwischenprodukt kann in großen Mengen aus käuflichem Allylglycidylether durch NaOH kataly¬ sierte Ringöffnung mit ebenfalls im Chemikalienhandel erhält- lichem 1.2-Isopropyliden-rac-glycerin erhalten werden:

E ^p oxidöffnunq mit Alkoholen (allgemeines Beispiel)

Herstellung des zentralen Zwischenproduktes der Formel I : 1.2-Isopropyliden-rac-G ₁ -3.1-0.0-3-0-allyl-rac-G ₂

0 / \

CH ₂ —

1.2-Isopropyliden-G Mengen NaOH)

<- (G,)

<- (G ₂ )

(G ₃ )

1.2-Isopropyliden-rac-glycerin (MG 132.16; 16 Mol - 2115 g) wird mit katalytischen Mengen NaOH (MG 40.00; 0.6 Mol - 24 g) versetzt und unter Rühren und Erwärmen auf 80°C in Lösung s gebracht. Bei 80°C wird Allyl-glycidyl-ether (MG 114.14; 6 Mol - 685 g) tropfenweise in einem Zeitraum von 2 Stunden zugege¬ ben und der Ansatz noch weitere 2 Stunden bei 80°C gerührt. Zu diesem Zeitpunkt hat sich das Epoxid vollständig (Rf 0.8 in Ether) unter Bildung des G ₃ -Bausteines (Rf 0.60 in Ether) o umgesetzt. Das überschüssige Isopropyliden-rac-glycerin hat einen Rf-Wert von 0.65 in Ether und wird bei 75°C / 10 mbar aus dem Reaktionsgemisch entfernt. Der Rückstand wird mit 1 1 Diisopropylether versetzt und zweimal mit jeweils 1 1 NaCl (1 %-ige Lösung in H ₂ 0) extrahiert. Die organische Phase wird 5 einrotiert und destilliert (Kpi ₁₀ -1 mbar 125°C) .

Die Ausbeute an reinem Produkt, 1.2-Isopropyliden-rac-G ₁ -3.1- 0.0-3-0-allyl-rac-G ₂ . (MG 246.30) , ist 1025 g (ca. 70 %) .

0 Anstelle von 1.2-Isopropyliden-rac-glycerin können andere primäre Alkohole sowie Allylalkohol und Benzylalkohol nach den angegebenen Bedingungen umgesetzt werden. Entsprechend können auch andere Epoxide auf die gleiche Weise eingesetzt werden.

5 Das Zwischenprodukt der Formel I kann auch aus 1.2-Isopropyli- den-rac-glycero-3-glycidylether durch NaOH katalysierte Ring¬ öffnung mit Allylalkohol erhalten werden. In diesem Falle muß zunächst 1.2-Isopropyliden-rac-glycero-3-glycidylether aus Allylglycerin hergestellt werden. 0

Beispiel 4b :

Alkylierung von primären oder sekundären Hydroxylgruppen ( allgemeines Beispiel ) 5

He rs t e l lung e ine s z ent ra l en Zwi s chenprodukt e s : l ^ - Isopropyliden-rac-G^ . 1- 0 . 0 -2 -0 -benzyl-3 - 0 -allyl -rac-G ₂

CH, CH, — CH, CH, —

^C 6 ^H 5 - (G^

/

10

0

J

15 CH, —CH =CH,

Das zentrale Zwi schenprodukt , 1.2 - I so - propyliden-rac-G _j -3. l-rac-G ₂ -0-allylether (MG 246.30; 0.5 Mol

20 - 123 g) wird in 500 ml Tetrahydrofuran gelöst, mit Benzyl- chlorid (0.6 Mol - 76 g) versetzt und unter Rückfluß gekocht. Man läßt K-tert. Butylat (0.7 Mol - 79 g) gelöst in 500 ml Tetrahydrofuran langsam eintropfen. Die Reaktion ist nach 30 Minuten Kochen unter Rückfluß abgeschlossen (DC-Kontrolle -

25 Rf-Werte in Ethylether: Edukt, Rf = 0.1; Produkt, RF = 0.4) . Das Reaktionsgemisch wird mit 1 1 Diisopropylether und mit 1 1 1%-iger NaCl-Lösung versetzt, geschüttelt, und die obere Phase einrotiert. Das Produkt kann direkt weiterverwendet werden oder durch Chromatographie an Kieselgel in reiner Form in ca.

30 90%-iger Ausbeute gewonnen werden.

Summenformel C ₁₉ H ₂₈ 0 ₅ (MG 336.42)

ber. : C, 67.83; H, 8.39; 0, 23.79 35 gef. : C, 67.78; H, 8.34; 0, -

Anstelle von Benzylchlorid können auch Benzylbromid, Allyl- chlorid oder Allylbromid sowie die Halogenide oder Mesylate

von primären Alkoholen verwendet werden. Insbesondere führen die Produkte aus der Reaktion primärer oder sekundärer Hydroxylgruppen mit Alkylmesylaten in hohen Ausbeuten (> 90%) zu den gewünschten Zielverbindungen.

Beispiel 4c:

Svnthesesequenz O-Allylether → O-Propenylether → Alkohol (all¬ gemeines Beispiel]

Herstellung von 2-0-Benzyl-rac-Gi-l .3-0.0-1.2-isopropyl- iden-rac-G ₂

CH- CH.

\ /

/ \

I

CH ₂ _ CH ₂ -CH ₂ CH ₂ - C ₆ H ₅ (G,)

CH ₂ - CH -CH ₂ (G ₂ )

CH, — CH = CH,

1) K-tert- Butylat in Dimethylformainid

2) HC1 / H ₂ 0 in 1-Propanol

CH. - CH -CH, CH,

I ' - ^C 6 ^H 5

/ l I

CH„ - CH - CH,

rne thoxypropan

Umlagerung

1.2-Isopropyl den-rac-G ₁ -3.1-0.0-2-0-benzyl-3-0-allyl-rac-G ₂ (0.5 Mol - 168 g) wird in 500 ml DMF gelöst und mit K-tert. s Butylat (0.7 Mol - 79 g) versetzt. Man erhitzt unter Rühren auf 110 bis 115°C (Temperatur im Reaktionsgemisch) , beläßt die Reaktion für 15 Minuten bei dieser Temperatur und kühlt das Reaktionsgemisch auf 20°C. Nach Zugabe von 500 ml Diisopropyl¬ ether und 500 ml 1% NaCl wird die obere Diisopropyletherphase 0 abgenommen und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt (DC-Kon- trolle - Rf-Werte in Hexan/Diisopropylether (1:1) : Edukt, Rf = 0.2; Produk , Rf = 0.4) .

Abspaltung der Propenyl-Schutzgruppe 5

Der Rückstand aus obiger Reaktion, ca. 168 g, wird in 500 ml Methanol gelöst und unter Rückfluß nach Zugabe von 50 ml 1 M HC1 gekocht. Nach 60 Minuten ist die Reaktion beendet (DC-Kon- trolle in Hexan/Diisopropylether (1:1) : Edukt, Rf = 0.4; Pro¬ 0 dukt, Rf = 0) . Die Ausbeute an rac-Gi-3. l-rac-G ₂ -2-0-benzyl- ether beträgt > 90%. Unter den sauren Bedingungen der Pro- penylabspaltung wird auch die Isopropylidenschutzgruppe ent¬ fernt. Bei Bedarf kann die Isopropylidenschutzgruppe wieder in die 1.2-Posιtιon eingeführt werden. 5

Einführung der Isopropyliden-Schutzgruppe

Der Rückstand der obigen Reaktion (ca. 0.5 Mol) wird m 300 ml THF gelöst, nacheinander mit 2.2-Dimethoxypropan (0.5 Mol - 52 0 g) und 0.2 g H ₂ S0 ₄ in 10 ml THF versetzt und 2 Stunden bei 25°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wird mit gesättigter Na ₂ C0 ₃ -Lö- sung neutralisiert, der Niederschlag abgesaugt und das Filtrag im Vakuum mit Xylol einrotiert und dadurch von Wasser befreit. Das Produkt wird durch Chromatographie an Kieselgel 60 (Merck, 5 Korngröße 0.2 - 0.5 mm) gereinigt (Rf-Werte in Diethylether: Edukt, Rf = 0.0; Produkt, Rf = 0.4) . Man erhält 121 g des für die Herstellung von Phosphatidyl-diglycerinen (G ₂ -Grundkörper) wichtigen Zwischenproduktes.

G,-Grundσerύst : 2-0-Benzyl-rac-Gj-l .3-0.0-1.2-isopro- pyliden-rac-G ₂ (Ausbeute 82%) .

Summenformel: C ₁₅ H ₂₄ 0 ₅ (MG 296.36) ber. :C, 64.85; H, 8.16; 0, 26.99 gef . :C, 64.82; H, 8.14; 0, -

Entsprechend können die für die Herstellung der Phosphatidyl- oligoglycerine wichtigen Zwischenprodukte mit höheren Oligo- glycerinanteilen hergestellt werden. Einige Analysedaten für zentrale Zwischenprodukte sind nachfolgend zusammengestellt worden :

G, -Grundgerüst : 2 -0 -Benzyl-rac-Gj-1.3-0.0-2-0-benzyl-rac- G ₂ -1.3-0.0-1.2-isopropyliden-rac-G ₃

Summenformel: C ₂ H ₃₆ 0 ₇ (MG 460.56) ber. : C, 67,81; H, 7.88; 0, 24.32 gef. : C, 67,75; H, 7.85; 0, -

G„ -Grundgerüst :

2-0-Benzyl-rac-G _! - [1.3-0.0 -2 -O-benzyl -G] ₂ -1.3-0.0-1.2-iso- propyliden - rac -G ₄

Summenformel: C ₃₆ H ₄₈ 0 ₉ (MG 624.77) ber. : C, 69.21; H, 7.74; 0, 23.05 gef. : C, 69.17; H, 7.69; 0, -

G. -Grundgerüst :

2-0-Benzyl-rac-Gi [1.3-0.0-2-0-benzyl-rac-G] ₄ -l .3-0.0-1.2-iso- propy 1 iden - rac - G ₆ Summenformel: C ₅₆ H ₇₂ 0 ₁₃ (MG 953.172) ber. : C, 70.57; H, 7.61; 0, 21.82 gef. : C, 70.56; H, 7.54; 0, -

C-Grundgerüst : 2-0-Benzyl-rac-G _! - [1.3-0.0-2-0-benzyl-rac-G] ₆ -l.3-0.0-1.2- isopropyliden-rac-G ₈

Summenformel: C ₇₆ H ₉₆ 0 ₁₇ (MG 1281.58) ber. : C, 71.23; H, 7.55; 0, 21.22 gef. : C, 71, 15; H, 7.53; 0, -

Beispiel 4d:

Substanzen, die die Tetrahvdropyranyl-Schutzgruppe tragen (anstelle von Benzyl)

(Herstellung von Phosphatidyl-oligoglycerinen, die unge- sättigte Fettsäuren enthalten)

Für die Durchführung dieser Variante wird 1.2-Isopro- pyliden-rac-glycero-3-0-allylether nach H. Eibl und P. Woolley, Chem. Phys. Lipids 4.1 (1986) 53-63, hergestellt und epoxidiert.

Epoxidation (allgemeines Beispiel)

1.2-Isopropyliden-rac-glycero-3-0-allylether (MG 172.22; 1 Mol - 172 g) wird in 1 1 CH ₂ C1 ₂ gelöst. 3-Chlorperoxybenzoesäure (1.1 Mol) wird portionsweise zugegeben und für 6 Stunden bei 25 - 30°C gerührt. Das Edukt (Rf 0.5 in Diethylether/Pentan 1:1) hat sich vollständig in das gewünschte Produkt (Rf 0.2 in obigem System) umgesetzt. Man saugt vom Niederschlag ab, gibt zum Filtrat 100 g Na ₂ C0 ₃ und rührt für weitere 3 Stunden bei 20°C. Man saugt den Niederschlag ab und entfernt das Lösungs¬ mittel im Vakuum. Die Ausbeute an Epoxid (MG 188.22) beträgt 170 g (90%) . Das Epoxid wird nun, wie unter Epoxidöffnung mit Alkoholen (Beisp. 4a) beschrieben, mit Benzylalkohol in l-O-Benzyl-rac-G^ .1-0.0-2.3-isopropyliden-rac-G ₂ umgewandelt und die freie OH-Gruppe mit 3.4-Dihydro-2H-Pyran in das Tetra- hydropyranderivat umgewandelt .

Einführung der Tetrahydropyran-Schutzgruppe (allgemeines Bei- spiel)

l-O-Benzyl-rac-Gi-3.1-0.0-2.3-isopropyliden-rac-G ₂ (MG 296.36; 1 Mol - 296 g) wird in 1 1 THF gelöst, mit 1.4 Mol 3.4-Di-

ERS _Ä TZBL _Ä TT(REGEL26)

hydro-2H-Pyran versetzt und 0.1 Mol Toluolsulfonsäure zugege¬ ben. Nach 1 Stunde ist die Umsetzung abgeschlossen (Edukt, Rf 0.65; Produkt, Rf 0.90 in Diethylether) . Man versetzt mit 1 1 0.2 Mol Na ₂ C0 ₃ Lösung und mit 1 1 Diisopropylether und schüt- telt in einem Scheidetrichter gut durch. Die obere Phase wird einrotiert und das Produkt durch Hydrogenolyse mit H ₂ in Ge¬ genwart eines Pd/C-Katalysators (5% Pd auf Alkohole) in den G ₂ -Baustein mit freier Hydroxylgruppe umgewandelt.

G2-Grundgerüst : 2-0-Tetrahydropyranyl-rac-Gi-l .3-0.0-1.2-iso- propyliden-rac-G ₂ (Ausbeute 80% bezogen auf das Epoxid)

Summenformel: C ₁₄ H ₂₇ 0 ₆ (MG 291.36) ber. : C, 57.71; H, 9.34; 0, 32.95 gef. : C, 57.59; H, 9.29; 0, -

Entsprechend können die Verbindungen mit anderen Grundgerüsten in THP-geschützte Strukturen umgewandelt werden. Z.B. kann der 3-0-Allylether von Beispiel 4a in ein Epoxid umgewandelt und mit Allylalkohol geöffnet werden. Es entsteht wieder ein 3-0-Allylether, der epoxidiert und mit Benzylalkohol geöffnet wird zu unten stehendem Produkt, das durch Einführung von 3 THP-Schutzgruppen und katalytische Hydrogenolyse in ein Zwi¬ schenprodukt mit G ₄ -Grundgerüst umgewandelt werden kann.

Benzyl I

0 OH

1 I

CH _? - CH - CH _? i

0 OH

1 I

CH ₉ - CH -CH _? ^L I

0 OH CH, CH, ι l / ³

CH, - CH - CH, C ² I ² / \

0 0 0

1 I ι CH ₂ — CH — CH ₂

G„-Grundgerüs :

2-O-THP-rac-Gi [1.3-0.0-2-0-THP-rac-G] ₂ -l .3-0.0-1.2-isopropyl- iden-rac-G ₄

Summenformel: C ₃₀ H ₄₅ 0 ₂ (MG 607.75) ber. : C, 59.29; H, 9.12; 0, 31.59 gef. : C, 59.24; H, 9.08; 0, -

Beispiel 4e:

Weiterverarbeitung des Zwischenprodukts der Formel I

G-,-Grundkörper (racemisch)

Aus Formel I kann ein zentrales Zwischenprodukt für die Her¬ stellung der G ₂ -Grundkörper erhalten werden (siehe Schema B) . Dazu wird die sekundäre OH-Funktion in Formel I alkyliert, benzyliert oder mit Tetrahydropyranyl geschützt.

Formel I

g ng der THP-Schutzgruppe

CH _? - CH - CH, l | I ^ά

0 0 0

C CH ₂ - CH - CH ₂

3 3 0 0 l I I I CH ₂ - CH = CH ₂

Schema B : Zentrales Zwischenprodukt zur Herstellung der

G ₂ -Grundkörper :

X = gesättigtes oder ungesättigtes Alkyl , Benzyl oder THP

Alkyl-G _? -Verbindungen

1) 2-0-Alkyl-rac-G ₁ -1.3-0.0-rac-G.

Die Zwischenverbindung der Formel II mit X = Alkyl wird von den Schutzgruppen befreit. Es wurden folgende Verbindungen dargestellt :

(194.23) (250.33) (318.45) (334.49) (418.65) (472.75)

2) l-0-Alkyl-rac-G,-3.1-0.0-rac-G-,

In der Zwischenverbindung der Formel II mit X = Benzyl wird Allyl aus der 1-Position entfernt und die entsprechende Alkyl- kette in 1-Position eingeführt. Nach Entfernung der Schutz¬ gruppen wurden folgende Verbindungen erhalten:

l-O-Methyl-G, : 1-O-Propyl-G, : 1-0-Nonyl-G-,: 1-Q-Undecyl-G _? : 1-O-Dodecyl-G,: 1-O-Octadecyl-G,:

Ungesättigte 1-O-Alkyldiglyceride können auch direkt über Epoxidöffnung von 1.2-Isopropyliden-glycero-glycidylether (Schema D, Formel IV) mit Alkoholen erhalten, z.B. 1-O-Undecenyl-G-: C ₁₇ H ₃₄ 0 ₅ (318.45)

Dieser Weg ist jedoch nur für kürzerkettige Alkohole geeignet, da die Ausbeuten für längerkettige Alkohole wie z.B. Oleylal- kohol gering sind. Zur Herstellung von l-01eyl-G ₂ wird deshalb

ein Syntheseweg über 2-O-THP-glycero-1.3-O.0- (1.2-isopropyl- iden) -glycerin vorgezogen (Schema D, Formel V) 1-O-Oleyl-G,: C ₂₄ H ₄₈ 0 ₅ (416.64)

Zwischenprodukte für die Synthese von Phospholipiden, die Dicylcerine im polaren Bereich enthalten

Verbindungen mit günstigen Schutzgruppen für diese Synthesen enthalten in G _x eine 2-0-Benzylether- oder eine 2-O-Tetrahydro- pyranylethergruppe :

1) 2-O-Benvzl-rac-G,-! .3-0.0- (1.2-isopropyliden) -rac-G :

C ₁₆ H ₂₄ 0 ₅ (296.36)

Die Verbindung der Formel III wird durch basische Umlagerung von Allyl in Propenyl, Benzylierung der sekundären OH-Gruppe und anschließende saure Abspaltung der Propenylschutzgruppe erhalten.

Formel I

1) Umlagerung Allyl/Propenyl

2) Benzylierung 3) saure Spaltung

Schema C: Ausgangsprodukt für Phosphatidyl-di-glycerine mit gesättigten Fettsäureresten.

2) 2-O-Tetrahvdropyranyl-rac-G _! -! .3-0.0- ⁽ 1.2-isopropyliden) - rac-G, : C ₁₄ G ₂₇ 0 ₆ (291.36)

Die Verbindung der Formel V wird aus Allylglycerin herge¬ stellt. Nach Anlagerung von Isopropyliden wird epoxydiert und man erhält das Zwischenprodukt IV. nach Öffnung des Epoxids mit Benzylalkohol wird die THP-Schutzgruppe eingeführt und die Benzylgruppe entfernt.

CH, - CH - CH,

OH OH 0

Allylglycerin CH ₂ - CH - CH ₂

1 ) H ; 2 .2-Dimethoxypropan

2) Epoxi dati on

CH, - CH - CH,

1 , i L.

mit Benzylalkohol

CH, - CH - CH,

Schema D : Ausgangsprodukt für Phosphat idyl -di - glycerine mit ungesätt igten Fett säureresten

Gi - Grundkörper ( race isch )

Aus dem zentralen Zwischenprodukt der Formel II können unter Einbeziehung der Allylgruppe die Triglyceride entwickelt wer¬ den. Nach Epoxidation können aus dem Epoxid verschiedene Zwi¬ schen- oder Endprodukte von pharmazeutischen Interesse herge- stellt werden.

Zwisc :hneen: produkt II

Epoxidation

CH, - CH - CH, 1 1 I ^c

Schema E: Ausgangsprodukte für die Herstellung von G,-Grundkör- pern .

Aus dem zentralen Zwischenprodukt der Formel VI können Trigly- cerine hergestellt werden; das Zwischenprodukt dient auch zur Herstellung des G ₄ -Grundkörpers. In der Formel VI stellt X Wasserstoff, einen gesättigten Alkyl-, einen Benzyl- oder einen THP-Rest dar.

Alkyl-G ₃ -Verbindungen

1) 1-O-Alkyl-rac-G,-1.3-0.Q-rac-G-,-1.3-0.0-rac-G,

Das Epoxid der Formel VI (X = H) wird mit Alkoholen direkt geöffnet und ergibt nach Abspaltung der Isopropyliden-Schutz- gruppe folgende Verbindungen:

1-O-Ethyl-G, : C H ₂₄ 0 ₇ (268.30) l-0-Hexyl-G _r : C ₁₅ H ₃₂ 0 ₇ (324.41)

1-O-Nonyl-G,: C _ιe H ₃₈ 0 ₇ (366.491)

1-O-Undecenyl-G, : C ₂₀ H ₄₀ O ₇ (392.53) s 1-O-Dodecyl-G, : C ₂₁ H ₄₄ 0 ₇ (408.57)

Für längerkettige Alkohole sind die Ausbeuten bei der direkten Öffnung schlecht. Deshalb wurden die Oleyl- und Erucyl-Ver¬ bindungen von G ₃ durch Öffnung von VI (X = THP) mit Benyzl, o Schutz der gebildeten sekundären Hydroxylgruppen mit THP, katalytische Debenzylierung, Alkylierung in 1-Position und Entfernung der Schutzgruppen hergestellt.

1-O-Oleyl-G- : C ₂₇ H ₅₄ 0 ₇ (490.72) s 1-O-Erucyl-G, : C ₃₁ H ₆₂ 0 ₇ (456.82)

2) 2-O-Alkyl-rac-G ₁ -1.3-0.0-rac-G--1.3-0.0-rac-G

Das Epoxid der Formel VI (X = Benzyl oder THP) wird mit Allyl- 0 alkohol geöffnet und in der 2-Position alkyliert. Die Schutz¬ gruppen werden auf übliche Weise entfernt. Bei der Herstellung der ungesättigten 2-0-Alkylverbindungen muß die Umlagerung der Allyl-Schutzgruppe vor der Alkylierung erfolgen. Außerdem kann in diesem Fall in G ₂ nur die THP-Schutzgruppe, nicht aber 5 Benzyl verwendet werden. Folgende Verbindungen wurden herge¬ stellt:

Zwischenprodukte für die Synthese von Phospholipiden, die Triglyceride im polaren Bereich enthalten

s Günstige Schutzgruppen für den Aufbau von Phospholipiden, die G ₃ -Reste im polaren Bereich enthalten, sind Benzylreste und Tetrahydropyranylreste (THP) . Benzylreste können einfach und unter milden Bedingungen entfernt werden, allerdings mit der Einschränkung, daß nur gesättigte Fettsäuren verwendet werden o können. THP-Reste sind von besonderem Interesse, da sie in Verbindung mit Isopropylschutzgruppen in einem Schritt abge¬ löst werden können.

1) 2-Q-Benvzl-rac-G ₁ -l .3-0.0- (2-O-Benzyl) -rac-G-,-1.3-0.0- (1.2- 5 isopropyliden) -rac-G-,

C ₂₆ H ₃₆ 0 ₇ (460.56)

Diese Verbindung kann aus dem zentralen Zwischenprodukt VI (X = Benzyl) durch Öffnen mit Allylalkohol, Benzylierung der 2- 0 Position und Abspaltung der Allylschutzgruppe erhalten werden. Sie wird im Text als Formel VII bezeichnet.

2) 2-O-THP-rac-G,-1.3-0.0- (2-0-THP) -rac-G-,-1.3-0.0- (1.2-iso¬ propyliden) -rac-G-, : 5 C ₂₂ H ₄₁ 0 ₉ (449.56)

Zur Darstellung ungesättigter G ₃ -Phospholipide wird in VI der Rest X = THP verwendet. Man öffnet das Epoxid VI mit Benzylal¬ kohol, schützt die freiwerdende sekundäre Hydroxylgruppe mit 0 THP und entfernt den Benzylrest katalytisch mit H ₂ /Pt. Die so hergestellte Verbindung wird im Text als Formel VIII bezeich¬ net .

Zusätzliche Bemerkungen 5

In der bisherigen Beschreibung haben wir von der Tatsache nicht Gebrauch gemacht, daß in der Formel VI für X = gesättig¬ tes Alkyl einfach Verbindungen folgender Struktur hergestellt

werdenkönnen: l-O-Alkyl-rac-Gi-3.1-0.0- (2-0-alkyl) -rac-G ₂ -3.1- rac-G ₃ . Die Vertreter dieser neuen Strukturen wurden herge¬ stellt durch Öffnen des Epoxids VI (X = Hexadecyl) mit CH ₃ OH oder Undecenylalkohol und Abspaltung der Isopropyliden Schutz- gruppe

1-0-Methyl-rac-G _] -3.1-0.0- (2.O-hexadecyl) -rac-G-,-3.l-rac-G ₃ :

C ₂₆ H ₅₄ 0 ₇ (478.71)

1-O-Undecenyl- rac -0,-3.1-0.0- ( 2 -O- hexadecyl ) -rac-G-, -3.1-0.0- rac-G ₃

C ₃₆ H ₇ ,0 ₇ (616.958)

G„-Grundkάrper (racemisch)

Aus dem zentralen Zwischenprodukt der Formel IX können G ₄ - Grundkörper hergestellt werden.

Zwischenprodukt VI (X = H, gesättigtes Alkyl,

Benzyl oder THP) 1) Öffnung mit Allylalkohol

2) X = H: Epoxidation

X = Be: Benzylierung von

2-0H, dann Epoxida¬ tion ^{x = T P:} Einführung von THP in 2 -OH, dann - CH - CH, . _. _ ,

| _| -• Epoxidation 0 0 i '

X CH, - CH - CH,

C- I l £■ 0 0

X CH, -CH -CH,

IX ² \ / ²

Schema F: Ausgangsprodukte für die Herstellung von G,-Grundkör¬ pern.

Aus dem zentralen Zwischenprodukt der Formel IX können Tetra- glycerine hergestellt werden. Sie können auch zur Herstellung von Pentaglycerinen verwendet werden.

Aus den Zwischenverbindungen können auch Oligoglycerine mit zwei oder mehr Alkylresten hergestellt werden. Geeignete Aus- gangsverbindungen hierfür sind Moleküle der Formel IX in denen X einen gesättigten Alkylrest darstellt.

Alkyl-G ₁ -Verbindungen

1) 1-0-Alkyl-rac-G,-!.3-0.0-rac-G-,-1.3-0.0-rac-G,-l .3-0.0- rac-G,,

Das Epoxid der Formel IX, X = H, wird mit Alkoholen direkt geöffnet. Das ergibt nach Abspaltung der Isopropyliden-Schutz- gruppe folgende Substanzen:

l-0-Ethyl-G ₄ : C ₁₄ H ₃₀ O ₉ (342.38) l-0-Hexyl-G ₄ : C ₁₈ H _3B 0 ₉ (398.49) l-0-Undecyl-G ₄ : C ₁₉ H ₄₀ O ₉ (412.52) l-0-Undecenyl-G ₄ : C ₁₉ H ₃₈ 0 ₉ (410.50)

1-0-Dodecyl-G ₄ : C ₂₀ H ₄₂ O ₉ (426.54)

Dieser Weg ist nur für kürzerkettige Alkohole geeignet, da die Ausbeuten für längerkettige Alkohole stark abfallen.

Für längerkettige Alkohole, die gesättigt sind, muß deshalb wie bei G ₂ und G ₃ ein Syntheseweg über das zentrale Zwischenprodut mit X = Benzyl gewählt werden. Man öffnet mit Allylalkohol, benzyliert die freiwerdende 2-OH-Gruppe, ent- fernt die Allylgruppe in der 1-Position und alkyliert die 1- Position. Nach Entfernen der Schutzgruppen erhält man:

l-0-Hexadeyl-G ₄ : C ₂₄ H ₅₀ O ₉ (482.99)

1-0-Octadecyl-G ₄ : C ₂₆ H ₅₄ 0 ₉ (510.70) l-0-Behenyl-G ₄ : C ₃₀ H ₆₂ O ₉ (566.81)

5

2. 2-O-Alkyl-rac-G^l .3.-0.0- rac-G, -1.3-0.0- rac-G, -1.2-0.0- rac-G,

Die zentrale Zwischenverbindung der Formel IX wird mit Allyl- o alkohol geöffnet und die freiwerdende 2-Position alkyliert. Nach Entfernen der Schutzgruppen erhält man:

(356.41) (398,49) (440.57) (410.50) (426.54) (483.99) (510.70) (508.69) (564.80)

Zwischenprodukte für die Synthese von Phospholipiden, die Tetraglycerine im polaren Bereich enthalten. 5

Verbindungen mit günstigen Schutzgruppen für diese Synthesen sind entsprechend den Erfahrungen für die Synthese von G ₂ - und G ₃ -Verbindungen Benzyl- und Tetrahydropyranylether.

0 1) 2-O-Benzyl-rac-G _! -! .3-0.0- (2-0-benzyl) -rac-G-,-1.3-0.0- (2- 0-benzyl) -rac-G,-l.3-0.0- (1.2-isopropyliden) -rac-G, : C ₃₆ H ₄₈ 0 ₉ (624.77)

Die zur Synthese von Phospholipiden mit G ₄ -Resten im polaren s Bereich wichtige Zwischenverbindung wird aus Formel IX, X = Benzyl durch Öffnen des Epoxids mit Allylalkohol, anschließen¬ der Benzylierung der freiwerdenden 2-OH-Gruppe und Entfernung

von Allyl hergestellt. Die Verbindung erscheint im Text als Formel X.

2. 2-0-THP-rac-G,-1.3-0.0- (2-0-THP) -rac-G-,-1.3-0.0- (2-0-THP) - s rac-G,-1.3-0.0- (1.2-isopropyliden) -rac-G, :

C ₃₀ H ₄₅ O ₂ (607.75)

Zur Herstellung dieser Verbindung, die zur Darstellung unge¬ sättigter Phospholipide mit G ₄ -Grundkörpern im polaren Bereich o geeignet ist, geht man analog vor, wie bei der Herstellung der G ₃ -Verbindung. Man öffnet das Epoxid VII, X = THP mit Benzylal¬ kohol, schützt die freiwerdende 2-OH-Gruppe mit THP und ent¬ fernt Benzyl mit H ₂ (Pd/C-Katalyse) . Die Verbindung wird im Text unter Formel XI genannt . 5

ZWISCHENPRODUKTE FÜR DIE SYNTHESE VON PHOSPHOLIPIDEN, DIE

OLIGOGLYCERINE IM POLAREN BEREICH ENTHALTEN UND EINE SN-1-

VERKNÜPFUNG ZUM PHOSPHAT ERMÖGLICHEN (NATÜRLICHE KONFIGU¬ RATION) 0

Bei der bisherigen Herstellung der Verbindungen, die für einen

Einbau in den polaren Bereich von Phospholipiden geeignet sind

(Formeln III und V für G ₂ , Formeln VII und VIII für G ₃ , Formeln

X und XI für G ₄ ) , wurde nicht darauf geachtet, daß in natürli- 5 chem Phosphatidylglycerin, d.h. in 1.2-Diacyl-sn-glycero-3- phospho-sn-1-glycerin, die Verknüpfung von Phosphat mit dem nicht acylierten Glycerin eine sn-1-Verknüpfung ist. Da die Liposomenbestandteile als Karrier von Arzneimitteln möglichst in natürlicher Konfiguration verwendet werden, wurden Synthe- 0 sewege entwickelt, die auch eine sn-1-Konfiguration des pola¬ ren Oligoglycerins zulassen (Schema G) .

sn-l-G^G-,-Verknüpfung

Die stereospezifische Verknüpfung kann analog zu den in der Literatur beschriebenen Verfahren durchgeführt werden (DE 31

30 867 AI; H. Eibl, Chem. Phys. Lipids 28. (1981) 1-5; H. Eibl

et al. , Chem. Phys. Lipids 4_1 (1986) 53-63; H. Eibl et al. , Chem. Phys. Lipids 4_7 (1988) 47-53) .

Das Ausgangsprodukt für diese Verknüpfung ist 2-0-Benzyl-3-0- allyl-sn-glycerin, das nach Epoxidation durch Hydrolyse in das Diol umgewandelt wird. Nach Umsetzung mit H ^* /2.2-Dimethoxypro- pan entsteht 2-0-Be-sn-G _n -3.l-0.0- (1.2-isopropyliden) -rac-G,. ein Molekül der Formel XII, das eine sn-1-Verknüpfung zur Phosphatgruppe in Phospholipiden ermöglicht und dem Racemat der Formel III entspricht.

sn-1-Gj-G _? -G-,-Verknüpfung

Das Ausgangsprodukt für diese Verknüpfung ist wieder 2-0-Ben- zyl-3-0-allyl-sn-glycerin. Nach Schutz der sn-1-Position mit THP wird epoxidiert und der Epoxidring mit 1.2-Isopropyliden- glycerin geöffnet. Man benzyliert die frei werdende OH-Funk¬ tion in G ₂ , entfernt die THP-Schutzgruppe und erhält das Mole¬ kül der Formel XIII, das eine sn-1-Verknüpfung zur Phosphat- gruppe in Phospholipiden ermöglicht. Das Molekül XIII ent¬ spricht dem Racemat der Formel VII.

sn-1-G ₁ -G ₇ -G,-G,,-Verknüpfung

Ausgangsprodukt ist wieder 2-0-Benzyl-3-0-allyl-sn-glycerin, um die sn-1-Verknüpfung zu gewährleisten. Nach Einführung der THP-Schutzgruppe wird epoxidiert und das Epoxid mit Allylalko¬ hol geöffnet. Nach Epoxidation des Zwischenproduktes wird mit Isopropylidenglycerin geöffnet, die beiden freien OH-Gruppen benzyliert und THP entfernt. Man erhält XIV, das eine sn-1- Verknüpfung zum Phosphat ermöglicht und dem Racemat der Formel X entspricht .

Wenn erwünscht, können entsprechend auch Verbindungen mit sn- 3-G ₁ -G ₂ -, sn-3-G ₁ -G ₂ -G ₃ - oder sn-3-G ₁ -G ₂ -G ₃ -G ₄ -Verknüpfung zum

Phosphat hergestellt werden. In diesem Falle muß in einer gleichen Sequenz von Reaktionen anstelle von 2-0-Benzyl-2-0-

ERSATZBL _Ä TT(REGEL26)

allyl-sn-glycerin das enantiomere 2-0-Benzyl-l-0-allyl-sn- glycerin eingesetzt werden.

sn-1-G _j -G-.-VerknÜpfung

CH - 0 _κ CH ₃ v.

sn-l-G _ι -G ₇ -G _? -Verknüpfung sn - 1 r CH ₂ - OH k CH - OBe

3 i- CH ₂ - 0 - CH ₂

CH - OBe I

CH - 0. .CH»

XIV I C

CH ₂ -0 ^{/ V} CH ₃

Schema G: Bausteine für Phospholipide, die eine sn-l-G _κ -

Verknüpfung ermöglichen (x = 2 - 4) . Ausgangs¬ produkt ist 2-0-Benzyl-3-O-allyl-sn-glycerin.

5 Beispiel 4f:

Zwischenprodukte, die Zuckeralkohole enthalten (allgemeine Beispiele)

Wichtige Zwischenprodukte sind hier vor allem solche Zuckeral- ιo kohole, die preislich günstig zu erwerben oder aus diesen durch einfache Umsetzungen erreicht werden können (siehe dazu beiliegende Tabelle) . Interessant sind insbesondere D-Mannit als offene Form von Inosit, -Xylit, das bei einer Phsophory- lierung am mittleren C-Atom keine optische Aktivität besitzt i5 und das als 1.2; 4.5-Diisopropyliden-Xylit leicht zu erhalten ist, sowie meso-Erythrit . Als Schutzgruppen werden hier mei¬ stens Isopropyliden, Trityl in Kombination mit Benzyl oder Allyl eingesetzt. Auch die Tetrahydropyranyl-Schutzgruppe hat hier eine gewisse Bedeutung. Beispielhaft werden hier einige 20 Möglichkeiten beschrieben.

1.2 ,-4.5-Diisopropyliden-Xylit (allgemeines Beispiel für die Einführung der Isopropyliden-Schutzgruppe)

5 Xylit (1.0 Mol - 152 g) wird in 500 ml 2-Propanol aufge¬ schlämmt und Dimethoxypropan (3.0 Mol - 312 g) zugegeben. Man versetzt mit 6 g H ₂ S0 ₄ in 100 ml 2-Propanol und erwärmt auf 50 °C. Nach 30 Minuten ist alles gelöst. Man versetzt mit soviel konzentriertem Ammoniak, bis das Reaktionsgemisch einen pH-

30 Wert von ungefähr 8 aufweist. Nach Entfernen des Lösungsmit¬ tels am Rotationsverdampfer in Vakuum wird der Rückstand in Hexan aufgenommen und auf -20 °C gekühlt. Es fallen schöne, weiße Kristalle aus, die abgesaugt und für die Phosphorylie- rung verwendet werden.

35

Summenformel : C _lα H ₁₉ 0 ₅ (MG 231 . 27 ) ber . : C , 57 . 13 ; H , 8 . 28 ; 0 , 34 . 59 gef . : C , 57 . 01 ; H , 8 , 27 ; 0 , -

Strukturformeln einiger Zuckeralkohole C ₄ H ₁₀ O ₄ meso-Ervthrit D-Threil L-Threit

C ₅ H ₁₂ 0 ₅

Adonii (Ribitol) D[+)-Arabit L(-)-Arabit Xylit (Xvlitol)

C _ft H ₁₄ 0„

Dulcit (Galactit) D-Mannit D-Sorbit

ERSÄTZBLATT (REGEL 26)

1.2 ;3.4-Diιsopropyliden-5-benzyl-D-Mannιt (allgemeines Bei¬ spiel für die Verwendung von Tritylschutzgruppen in Verbindung mit Benzylschutzgruppen)

s Ausgehend von 1.2 ; 3.4 ; 5.6-Trusopropyliden-D-Mannit (MG 302.36) , das analog zur Herstellung des Xylit-Derivates erhal¬ ten wurde, wird durch vorsichtige Abspaltung der Schutzgruppe in etwa 30 %-ιger Ausbeute 1.2.3.4-Diisopropylιden-D-Mannιt erhalten. Trusopropyliden-D-Mannit (1.0 Mol - 302 g) wird in o 600 ml CH ₃ 0H gelöst, mit Amberlyst 15 (5 g) und 70 g H ₂ 0 ver¬ setzt. Man erwärmt auf 50 °C und rührt die Lösung bei dieser Temperatur für 40 Minuten (Edukt, RF 0.9; 1.2 ;3.4-Derivat, Rf 0.7; 3.4-Derιvat, Rf 0.1 in CHC1 ₃ /CH ₃ 0H 1:1) , kühlt auf 20 °C und filtriert zu 7,5 ml 25 % Ammoniak m 25 ml 2-Propanol (pH 5 - 8) . Beim Abkühlen auf 4 °C fällt das Ausgangsprodukt aus und kann zurückgewonnen werden (ca. 120 g, ~ 40 %) . Das Filtrat wird einrotiert und durch Chromatographie an Kieselgel 60

(Merck, Darmstadt) gereinigt. Man erhält 84 g (~ 32 %) an

1.2 :3 , 4-Diιsopropyliden-D-Mannιt, das aus Hexan kristallin 0 erhalten werden kann.

Summenformel: C ₁₂ H ₂₂ 0 ₆ (MG 262.30) ber. : C, 54.95; H, 8.45; 0, 36.60 gef. : C, 54.89; H, 8.34; 0. - 5

Umsetzung von 1.2 ;3.4-Diisopropylιden-D-Mannιt mit Tritylchlo¬ rid und Benzylchlorid (allgemeines Beispiel für die Tritylie- rung und anschließende Alkylierung)

0 1.2 :3.4-Diisopropyliden-D-Mannιt (0.2 Mol - 52 g) wird in 300 ml Toluol gelöst, mit Triethylamm (0,30 Mol - 30 g) versetzt und unter Rückfluß gekocht. Man tropft Tritylchlorid (MG 278.78; Mol - 64 g) in 200 ml Toluol zu und kocht weitere 60 Minuten unter Rückfluß (Edukt, Rf 0.7; Produkt, Rf 0.90 in 5 CHC1 ₃ /CH ₃ 0H 10:1) . Die Reaktion ist dann abgeschlossen. Man kühlt auf 20 °C, filtriert ausgefallenes Triethylammhydro- chlorid ab und rotiert das Filtrat ein. Der obige Rückstand wird in 400 ml THF aufgenommen, mit Benzylchlorid (0.3 Mol -

38 g) versetzt und unter Rückfluß gekocht. Man tropft K-tert. - Butylat (0.25 Mol - 28 g) - gelöst in 200 ml THF - ein und arbeitet das Reaktionsgemisch nach 1 Stunde auf (Edukt, Rf 0.90; Produkt, Rf 1.00 in CHCl ₃ /CH ₃ OH 10:1) . Man extrahiert das Reaktionsgemisch nach Zusatz von 300 ml Diisopropylether mit 600 ml H ₂ 0, nimmt die obere Phase ab und entfernt das Lösungs¬ mittel im Vakuum. Der obige Rückstand wird direkt weiterver¬ wendet .

Abspaltung der Tritylschutzgruppe unter Erhalt der 3.4-Iso- propyliden-Schutzgruppe (allgemeines Beispiel)

Der ölige Rückstand der vorhergehenden Reaktion (-0.2 Mol) wird in 600 ml Aceton/CH ₃ 0H 1:1 gelöst und mit 3 ml H ₂ S0 ₄ ver- setzt. Man rührt bei 40 °C für 40 Minuten und beobachtet eine vollständige Abspaltung der Trityl- und der 1.2-Isopropyliden¬ schutzgruppe (Edukt, Rf 0.95; Produkt, Rf 0.15 in Ether) . Das Reaktionsgemisch wird mit Ammoniak auf pH ~ 8 gebracht, fil¬ triert und einrotiert. Der Rückstand wird in Kieselgel chroma- tographiert und aus Hexan kristallisiert.

2-O-Benyzl-3.4-isopropyliden-D-Mannit

Summenformel: C ₁₆ H ₂₄ 0 ₆ (MG 312.36) ber. : C, 61.52; H, 7.74; 0, 30.73 gef. : C, 61.44; H, 7.72; 0, -

Wie in Beispiel 4c angegeben, kann die Isopropyliden-Schutz- gruppe in 5.6-Position wieder eingeführt werden. Es entsteht ein zentrales Zwischenprodukt für die Synthese von Phosphati- dyl-D-Mannit-Verbindungen, 2-0-Benzyl-3.4 ;5.6-diisopropyliden- D-Mannit.

Summenformel: C _ιg H ₂₈ 0 ₆ (MG 352.42) ber. : C, 64.75; H, 8.01; 0, 27.24 gef. : C, 64,68; H, 7.94; 0, -

Bausteine aus Zuckeralkoholen, die durch Kombination einer Periodatabspaltung eines vicinalen Diols und Reduktion des entstehenden Aldehyds mit Natriumborhydrid erhalten werden (allgemeines Beispiel)

1.2 :3.4-Diisopropyliden-D-Mannit (0.2 Mol - 26 g) wird nach H. Eibl, Chem. Phys. Lipids 18. (1981) 1-5, in 200 ml CH ₃ OH gelöst und zu einer Lösung von 0.2 Mol Natriummetaperjodat in 500 ml Wasser gegeben. Die Temperatur soll 30 °C nicht übersteigen. Nach 15 Minuten ist die Reaktion beendet. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wird mit 5 M KOH in Wasser auf pH = 8 er¬ höht. Die ausgefallenen Salze werden abfiltriert und der ent¬ standene Aldehyd mit Natriumborhydrid (0,25 Mol) reduziert. Man erhält in > 90 %-iger Ausbeute 1.2 : 3.4-Diisopropyliden-D- Lyxit, das mit 600 ml Chloroform extrahiert wird. Die Chloro¬ form-Phase wird einrotiert und das Produkt aus Hexan kristal ^¬ lisiert .

Summenformel : C _u H ₁₉ 0 ₅ (MG 231 . 27 ) ber . : C , 57 . 13 ; H , 8 . 28 ; 0 , 34 . 59 gef . : C , 57 . 07 ; H , 8 . 21 , 0 , -

Durch Verwendung dieser unterschiedlichen Möglichkeiten, Mono- isopropylidenabspaltung, Perjodatabspaltung der vicinalen Diole zu den Aldehyden und Natriumborhydridreduktion in Kom¬ bination mit der Variation Trityl/Alkyl können die unter¬ schiedlichsten geschützten Zuckeralkohole erhalten werden, die

durch Acylierung oder Phosphorylierung in interessante Alkyl-, Acyl- oder Phosphatidylverbindungen umgewandelt werden können.

Herstellung einfacher Ester- und Etherderivate aus den ge- s schilderten Oligoglycerinen und Zuckeralkoholen (allgemeine Beschreibung)

Möglichkeiten der Veresterung oder Veretherung mit an¬ schließender Abspaltung der Schutzgruppen wurden in verschie- ιo denen Publikationen beschrieben. In den im folgenden aufge¬ führten Artikeln finden sich zudem unterschiedliche Methoden der Phosphorylierung. Diese Methoden können hier analog ver¬ wendet werden.

i5 Eibl, H.

Synthesis of glycerophospholipids Chem. Phys. Lipids 26 _. (1980) 405-429

Eibl, H. 20 Phospholipid Synthesis

In: Liposomes: Fro Physical Structure to Therapeutic Applications (CG. Knight, editor) Elsevier, Amsterdam (1981) 19-50

25 Eibl, H. and Kovatchev, S.

Preparation of phospholipids and of their analogs by phospho¬ lipase D. In: Methods of Enzymology. Vol. 72. Ed. J.M. Lowen- stein, Academic Press, New York (1981) 632-639

30 Eibl, H. : Phospholipide als funktioneile Bausteine biologi¬ scher Membranen Angew. Chemie .96. (1984) 247-262

Eibl, H. : Phospholipids as functional constituents of biomem- branes Angew. Chem. Int. Ed. Engl . 2 . (1984) 257-271

35

Eibl, H. Phospholipid synthesis: Oxazaphoεpholanes and dioxaphospholanes as intermediates. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75 (1978) 4074-4077

Eibl, H. and Wooley, P. : Synthesis of enantiomerically pure glyceryl esters and ethers. I. Methods employing the precursor 1, 2-isorpropylidene-sn-glycerol . Chem. Phys. Lipids 4_1 (1986) 53-63

Eibl. H. and Wooley, P. : Synthesis of enantiomerically pure glyceryl esters and ethers. II. Methods employing the precursor 3 , -isopropylindene-D-mannitol. Chem. Phys. Kipids 47 (1988) 47-53

Eibl. H. and Wooley, P. : A general synthetic method for enantiomerically pure ester and ether lysophospholipids . Chem. Phys. Lipids 4J7 (1988) 63-68

Wooley, P. and Eibl, H. : Synthesis of enantiomerically pure phospholipids including phosphatidylserine and phosphatidylglycerol. Chem. Phys. Lipids 4_7 (1988) 55-62

Beispiel 4g:

Zwischenprodukte zur Synthese von Phospholipiden, die Zucker¬ alkohole im polaren Bereich enthalten.

Wie bisher beschrieben, hat die Einführung im polaren Bereich von Phospholipiden über Oligoglycerine einen ausgeprägten

Effekt auf die Blutzrikulation, wenn diese Substanzen als

Liposomenbestandteile eingesetzt werden. Mit gleichem Ergebnis können aber anstelle der Oligoglycerine auch Zuckeralkohole verwendet werden, z.B. Phosphorsäureester von D-Mannit, D- Lyxit und D-Threit. Diese Verbindungen können mit geeigneten

Schutzgruppen (siehe dazu Schema H) auf die für Oligoglycerine beschriebene Weise in Phospholipide eingeführt werden. Bei den beschriebenen Derivaten führt die Kopplung mit Phospholipiden wieder zu einer sn-1-Verknüpfung der Phosphorsäure mit dem Zuckeralkohol.

D-Mannit-Derivat

Aus 1.2.6.5-Diisopropyliden-D-Mannit kann durch Benzylierung in 3.4-Position und Abspaltung der Isopropyliden-Schutzgruppen 3.4-0. O-Dibenzyl-D-Mannit hergestellt werden. Nach Einführung der Isopropyliden-Schutzgruppe in 1.2-Position, Tritylierung und Benzylierung der freien OH-Gruppe erhält man nach Abspal¬ tung der Tritylgruppe die Verbindung XV, die in den polaren Bereich von Phospholipiden eingebaut werden kann.

D-Lyxit-Derivat

1.2-Isopropyliden-3.4-0. O-dibenyzl-D-mannit (siehe oben) wird mit Perjodsäure gespalten und mit NaBH ₄ zum Alkohol XVI redu¬ ziert. Diese Verbindung kann in den polaren Bereich von Phospholipiden eingebaut werden.

D-Mannit -Derivat ( 6 -Hydroxylgruppen)

CH - OBe i

CH - OBe I

CH - OBe I X CH ₂ - 0H

D-Lvxit -Derivat ( 5 -Hydroxylgruppen ; aus D-Mannit :

XVI

D- Threit -Derivat ( 4 -Hydroxylgruppen ; aus D-Mannit )

XVII H ₂ - OH

Schema H: Polvalkohole mit mindestens 4 Hydroxylgruppen zum Einbau in den polaren Bereich von Phospholipiden

D-Threit-Derivat

Die Verbindung XVI wird durch Benzylierung in 1.2-Isopropyl- iden-3.4.5-0.0.0-Tribenyzl-D-Lyxit umgewandelt. Nach Abspal¬ tung der Isopropyliden-Schutzgruppe, Perjodsäurespaltung und Reduktion zum Alkohol erhält man XVII. Diese kann in gewohnter Weise in den polaren Bereich von Phospholipiden eingebaut werden.

Phospholipide, die Oligoglycerine im polaren Bereich enthalten

Wir haben in früheren Publikationen beschrieben, wie auf ein- fache Weise Phospholipide aus Diacylglycerinen mit gesättigten und ungesättigten Fettsäureketten, mit zwei gleichen oder zwei unterschiedlichen Fettsäureketten hergestellt werden können.

(DE 32 39 817 Ar; P. Woolley et al . Chem. Phys. Lipids 47

(1988) 55-62; H. Eibl et al . , Chem. Phys. Lipids £7 (1988) 63- 68) . Entsprechend können auch Acyl/Alkyl- oder Alkyl/Acylgly- cerine als Ausgangsprodukt verwendet werden. Dagegen sind

Phospholipide, die Dialkylglycerine enthalten, metabolisch extrem stabil und können praktisch nicht resorbiert werden.

Die genannten Verbindungen können prinzipiell nach zwei unter¬ schiedlichen Methoden dargestellt werden. Dies ergibt sich aus der Tatsache, daß aus zwei Alkoholen, R _α -OH und R ₂ -OH, ein Phosphorsäurediester hergestellt werden soll .

Die Alkohole unter R.-OH sind Alkohole, die ein Glyceringrund- gerüst mit zwei Fettsäureketten und eine freie Hydroxylgruppe enthalten. Sie können aber auch nur eine Fettsäurekette und eine zusätzliche Schutzgruppe, meist Benzyl, zur Herstellung von Monoacrylphospholipiden enthalten, R^OH kann aber auch einen Alkohol mit einem einfachen Alkylrest mit einer oder zwei eis-Doppelbindungen darstellen.

Die Alkohole unter R ₂ -0H sind Alkohole, die im bisherigen Text als G ₂ , G ₃ und G ₄ bezeichnet wurden. Sie sind unter den Strukturformeln III und V (für G ₂ ) , VII und VIII (für G ₃ ) und X bis XIV (für G ₄ ) genannt. Entsprechend können auch die Zuckeralkoholderivate XV bis XVII eingesetzt werden.

Wie zwei Alkohole R^OH und R ₂ -0H in guten Ausbeuten zur Her¬ stellung von Phosphorsäurediestern eingesetzt werden können, ist in Schema G beschrieben.

Beispielsweise ergibt sich für R _j = 1.2-Dipalmitoyl-sn-G und R ₂ = Formel XI nach Entfernung der Schutzgruppen folgende Struk¬ tur :

CH ₂ - 0 -C0 -(CH ₂ ) ₁₄

CH - 0 -CO - (CH _? ) ₁₄ 0

CH, - 0 -P - 0 - CH, - C

CH, - CH - CH, ^ά I ^■• I ^z

OH OH

Schema G: Phosphorsäurediester der Formel R^-PO ^" -, - R-,; Na*

Als Phosphorylierungsmittel wird Phosphoroxychlorid einge¬ setzt. Aus den beiden über Phosphat zu verknüpfenden Alkoholen R _x OH oder R ₂ OH wird zunächst das entsprechende Phosphorsäuredi- chlorid hergestellt, das durch Umsetzung mit dem jeweils ande¬ ren Alkohol zum Phosphorsäuremonochlorid umgesetzt wird. Leicht basische Hydrolyse führt dann zu den Phosphorsäuredi- estern, die nach Abspaltung der Schutzgruppen beispielsweise in XVIII übergehen, in 1.2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-Gi- G ₂ -G ₃ -G ₄ ; Na^-Salz.

Die in der Folge beschriebenen Beispiele können durch andere Kombination der Fettsäureketten oder durch Einführung weiterer Fettsäuren, auch synthetischer und natürlicher Herkunft, be- liebig erweitert werden. Die hergestellten Phosphatidyl-Oligo- glycerine können je nach Bedarf und nach Einstellung auf eine gewünschte Eigenschaft im Oligoglycerinbereich auch noch wei¬ tere Alkylketten oder auch Fettsäurereste enthalten.

Die hier vorgestellten Verfahren, basierend auf Oligoglyceri¬ nen können also in vielfältiger Weise eingesetzt und modifi¬ ziert werden, um die Eigenschaften von Liposomen zu variieren und zu beeinflussen. In Analogie zu den

Hexydecylphosphocholinen den Erucylphosphocholinen sind diese Substanzen möglicherweise aber auch wichtige biologisch aktive Moleküle, die die Signaltransduktion und damit zelluläre Funk¬ tionswege beeinflussen.

Beispiele für Phospho - G ₁ - G-,- Verbindungen

1. 1.2 -Dipalmitoyl-sn-glycero-3 - phospho - G _x -G ₂ ; Na ⁺ -Salz: C ₄₁ H ₈₀ NaO ₁₂ P (819.04)

2. 1.2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-G ₁ -G ₂ ;

Na ⁺ -Salz: C ₃₇ H ₇₂ Na0 ₁₂ P (762.93)

3. 1.2-Distearoyl-sn-glycero-3 -phospho-Gi-Gs ;

Na ^* -Salz: C ₄₅ H ₈₈ Na0 ₁₂ P (875.14) 4. l-Palmitoyl-2-lauroyl-sn-glycero-3-phospho-G ₁ -G ₂ ; Na ⁺ -Salz: C ₃₇ H ₇₂ Na0 ₁₂ P (762.93)

5. l-Stearoyl-2-lauroyl-sn-glycero-3-phospho-G ₁ -G ₂ ;

Na ⁺ -Salz: C ₃₉ H ₇₆ Na0 ₁₂ P (790.98)

6. 1.2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-G ₁ -G ₂ ; Na ⁺ -Salz: C _4S H ₈₄ Na0 ₁₂ P (871.11)

7. l .2-Dierucyl-sn-glycero-3 - phospho -Gj-G;,, ^•

Na ⁺ -Salz: C _S3 H ₁₀₀ NaO ₁₂ P (983.32)

8. l-Stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-G ₁ -G ₂ ;

Na ^* -Salz: C _4S H ₈₆ Na0 ₁₂ P (873.13) 9. l-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-G ₁ -G ₂ ;

Na ^* -Salz: C ₄₃ H ₈₂ Na0 ₁₂ P (845.07)

10. l-Stearoyl-2-myristoyl-sn-glycero-3-phospho-G ₁ -G ₂ ;

Na ^* -Salz: C ₄₁ H ₈₀ NaO ₁₂ P (819.04)

11. l-Stearoyl-2-palmitoyl-sn-glycero-3-phospho-G ₁ -G ₂ ; Na ^* -Salz: C ₄₃ H ₈₄ Na0 ₁₂ P (847.09)

12. l-Myristoyl-sn-glycero-3-phospho-G,-G ₂ ;

Na ^* -Salz: C ₂₃ H ₄₆ Na0 ₁₁ P (552.57)

13. l-Palmitoyl-sn-glycero-3-phospho-G ₁ -G ₂ ;

Na ^* -Salz: C ₂₅ H _S0 NaO--.P (580.62)

10 14. l-Stearoyl-sn-glycero-3 -phospho-Gi-G _j ,-

Na ^* -Salz: C ₂₇ H ₅₄ NaO _n P (608.68)

15. Erucyl-phospho-Gi-G _; ,;

15

Na ⁺ -Salz: C ₂₈ H ₅₆ Na0 ₈ P (574.71)

16. Octadecyl-phospho-G ₁ -G ₂ ;

20 Na'-Salz: C ₂₄ H _S0 NaO ₈ P (520.62!

17. Hexadecyl -phospho-G ₁ -G ₂ , ^•

Na ^* -Salz: C ₂₂ H ₄₆ NaO _e P (492.56!

18. Tetradecyl-phospho-G ₁ -G ₂ ;

Na'-Salz: C ₂₀ H ₄₂ NaO ₈ P (464.51)

30 19. Oleyl-phospho-Gi-Gj,-

Na ^* -Salz: C ₂₄ H ₄₈ NaO _β P (518.60)

20. l-0-Octadecyl-2-0-methyl-sn-glycero-3 -phospho-Gi-G _j ,-

35 Na'-Salz: C _2e H ₅₈ NaO ₁₀ P (608.72)

Beispiele für Phospho-G^C-G^-Verbindungen

40

1. 1.2 -Dipalmitoyl- sn-glycero- 3 -phospho -G^G^G-, ; Na ^* -Salz: C ₄₄ H ₈₆ Na0 ₁₄ P (893.12)

45

2. 1.2-Distearoyl-sn-glycero-3-phospho-G ₁ -G ₂ -G ₃ ; Na ^* -Salz: C ₄₈ H ₉₄ Na0 ₁₄ P (949.22) so 3. l-Palmitoyl-2-lauroyl-sn-glycero-3-phospho-G ₁ -G ₂ -G ₃ ; Na ^* -Salz: C ₄₀ H ₇₈ NaO ₁₄ P (837.01)

4. l-Stearoyl-2-lauroyl-sn-glycero-3-phospho-G ₁ -G ₂ -G ₃ ;

55

Na ^* -Salz: C ₄₂ H ₈₂ Na0 ₁₄ P 865.06!

ERSATZBLAπ (REGEL 26)

5. 1.2 -Dioleoyl-sn-glycero-3 -phospho-G, -G ₂ -G ₃ ; Na ^* -Salz: C„H ₉₀ NaO ₁₄ P (945.19) 6. 1.2-Dierucyl-sn-glycero-3-phospho-G ₁ -G ₂ -G ₃ ; Na ^* -Salz: C ₅₆ H ₁₀₆ NaO ₁₄ P (1057.40)

7. l-Stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-G ₁ -G ₂ -G ₃ ;

10

Na'-Salz: C ₄₈ H ₉₂ Na0 ₁₄ P (947.21)

8. l-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-G ₁ -G ₂ -G ₃ ; i5 Na ^* -Salz: C ₄₆ H ₈₈ Na0 ₁₄ P (919.148)

9. l-Stearoyl-sn-glycero-3-phospho-G ₁ -G ₂ -G ₃ ;

Na ^* -Salz: C ₃₀ H ₆₀ NaO ₁₃ P (682.76)

20

10. Erucyl-phospho-G ₁ -G ₂ -G ₃ ;

Na ^* -Salz: C ₃₁ H ₆₂ NaO ₁₀ P (648.79)

25 11. Octadecyl-phospho-G ₁ -G ₂ -G ₃ ;

Na ^* -Salz: C ₂₇ H ₅₆ NaO ₁₀ P (594.69)

12. Hexadecyl -phospho-G ₁ -G ₂ -G ₃ ;

30

Na ^* -Salz: C ₂₅ H _S2 NaO ₁₀ P (566.64)

13. 3-0-Octadecyl-2-0-methyl-sn-glycero-l-phospho-G ₁ -G ₂ -G ₃ ; 35 Na ^* -Salz: C ₃₁ H ₆₄ Na0 ₁₂ P (682.80)

Beispiele für Phospho-G,-Gy-G _^ -G^-Verbindungen

40

1. 1.2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3 -phospho-G ₁ -G ₂ -G ₃ -G ₄ ;

Na ^* -Salz: C ₄₇ H ₉₂ Na0 ₁₆ P (967.20)

45 2. 1.2-Distearoyl-sn-glycero-3-phospho-G ₁ -G ₂ -G ₃ -G ₄ ;

Na'-Salz: C ₅₁ H ₁₀₀ NaO ₁₆ P (1023.30)

3. l-Stearoyl-2-lauroyl-sn-glycero-3-phospho-G ₁ -G ₂ -G ₃ -G ₄ ;

50

Na ^* -Salz: C ₄₅ H ₈₈ Na0 ₁₆ P (939.14)

1.2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-G ₁ -G ₂ -G ₃ -G ₄ ;

55 Na ^* -Salz: C ₅₁ H ₉₆ Na0 ₁₆ P ;i019.27)

5. 1.2-Dierucyl-sn-glycero-3-phospho-G ₁ -G ₂ -G ₃ -G ₄ ;

Na ^* -Salz: C ₅₉ H ₁₁₂ Na0 ₁₆ P (1131.48) 6. l-Stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-G ₁ -G ₂ -G ₃ -G ₄ ;

Na ^* -Salz: C ₅₁ H ₉₈ Na0 ₁₆ P (1021.29)

7. Erucyl-phospho-G ₁ -G ₂ -G ₃ -G ₄ ;

Na'-Salz: C ₃₄ H ₆₈ Na0 ₁₂ P (722.87)

Beispiele für Phospho-sn-G,-Verknüpfungen

sn-l-G^G,:

1. 1.2-Dipylmitoyl-sn-glycero-3 - phospho -sn-l-G ₁ -G ₂ ;

Na ^* -Salz: C ₄₁ H ₈₀ Na0 ₁₂ P (819.04)

2. 1.2-Distearoyl-sn-glycero-3-phospho-sn-l-G ₁ -G ₂ ; Na ^* -Salz: C ₄₅ H ₈₈ Na0 ₁₂ P (875.14)

3. l-Stearoyl-2-lauroyl-sn-glycero-3-phospho-sn-l-G ₁ -G ₂ ;

Na ⁺ -Salz: C ₃₉ H ₇₆ Na0 ₁₂ P (790.98)

4. l-Stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-sn-l-G ₁ -G ₂ ;

Na*-Salz: C ₄₅ H ₈₆ Na0 ₁₂ P (873.13)

sn-l-G ₁ -G _? -G-, :

1. Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-sn-l-G ₁ -G ₂ -G ₃ ; Na*-Salz: C ₄₄ H ₈₆ Na0 ₁₄ P (893.12)

2. 1.2-Distearoyl-sn-glycero-3-phospho-sn-l-G ₁ -G ₂ -G ₃ ;

Na ^* -Salz: C ₄₈ H ₉₄ Na0 ₁₄ P (949.22)

sn-l-G ₁ -G ₂ -G ₃ -G ₄ :

1. 1.2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-sn-l-G ₁ -G ₂ -G ₃ -G ₄ ; Na*-Salz: C ₄₇ H ₉₂ Na0 ₁₆ P (967.20)

2. ^' 1.2-Distearoyl-sn-glycero-3-phospho-εn-l-G ₁ -G ₂ -G ₃ -G ₄ ; Na ^* -Salz: C ₅₁ H ₁₀₀ NaO ₁₆ P (1023.30)

Beispiele für Verknüpfungen mit Zuckeralkoholen

Phospho-D-Manni -Verbindungen

5

1. 1.2 -Dipalmitoyl-sn-glycero- 3 -phospho-D-mannit;

Na ⁺ -Salz: C ₄₁ H ₈₀ NaO ₁₃ P (835.03) o 2. 1.2-Distearoyl-sn-glycero-3-phospho-D-mannit ;

Na ^* -Salz: C ₄₅ H ₈₈ Na0 ₁₃ P (891.13)

3. l-Palmitoyl-2-lauroyl-sn-glycero-3-phospho-D-mannit ; 5

Na ^* -Salz: C ₃₇ H ₇₂ Na0 ₁₃ P (788.92)

4. l-Stearoyl-2-lauroyl-sn-glycero-3 -phospho-D-mannit ; Na ^* -Salz: C ₃₉ H ₇₆ Na0 ₁₃ P (806.97)

5. l-Stearoyl-2-myristoyl-sn-glycero-3-phospho-D-mannit ; Na'-Salz: C ₄₁ H _β0 NaO ₁₃ P (835.03) 5

6. l-Stearoyl-sn-glycero-3-phospho-D-mannit ; Na ^* -Salz: C ₂₇ H ₅₄ Na0 ₁₂ P (624.67) 0 7. Octadecyl-phospho-D-mannit ;

Na ^* -Salz: C ₂₄ H ₅₀ NaO ₉ P (536.61)

8. 1-0-Octadecyl- 2 -O-methyl-sn-glycero- 3 -phospho-D-mannit ; 5 — —

Na ^* -Salz: C ₂₈ H ₅₈ Na0 ₁₁ P (624.71)

Phospho - D - Lvxi t - Verbindungen 0

1. 1.2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-D-lyxit ; Na ⁺ -Salz: C ₄₀ H ₇₈ NaO ₁₂ P (805.00) 5 2. 1.2-Distearoyl-sn-glycero-3-phospho-D-lyxit ; Na ^* -Salz: C ₄₄ H ₈₆ Na0 ₁₂ P (861.10)

3. 1 - Palmitoyl - 2 - lauroyl- sn-glycero- 3 -phospho-D- lyxit ; o

Na ^* -Salz: C ₃₆ H ₇₀ NaO ₁₂ P (758.89) l-Stearoyl-2-lauroyl-sn-glycero-3 -phospho-D- lyxit ; 5 Na ^* -Salz: C ₃₈ H ₇₄ Na0 ₁₂ P ;776.94!

5. l-Stearoyl-2-myristoyl-sn-glycero-3-phospho-D-lyxit ; Na ^* -Salz: C ₄₀ H _7S NaO ₁₂ P (805.00)

Phospho-D-Threit-Verbindungen

1. 1.2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-D-threit; Na'-Salz: C^H^NaO^P (774.97)

2. 1.2-Distearoyl-sn-glycero-3-phospho-D- hreit; Na ^* -Salz: C ₄₃ H ₈₄ Na0 ₁₁ P (831.07)

3. 1-Stearoyl-2-lauroyl-sn-glycero-3-phospho-D-threit;

Na ^* -Salz: C ₃₇ H ₇₂ NaO _u P (746.91) 4. l-Stearoyl-2-myristoyl-sn-glycero-3-phospho-D-threit; Na*-Salz: C ₃₉ H ₇₆ NaO _n P (774.97)

Beispiel 4h:

Phosphorylierungsschritte (allgemeine Vorschrift) am Beispiel der Darstellung von 1.2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-σly- ceroglvcerin, Na -Salz

In einem 1 1 Dreihalskolben werden P0C1 ₃ (0.1 Mol - 15.3 g) in 15 ml THF vorgelegt. Unter starkem Rühren und Eiskühlung tropft man 1.2-Dipalmitoyl-sn-glycerin (0.1 Mol - 57 g) in 100 ml THF und separat Triethylamin (0.11 Mol - 11 g) so ein, daß stets ein leichter Überschuß von Triethylamin über 1.2-Di- palmitoyl-sn-glycerin vorhanden ist, um den sich bildenden Chlorwasserstoff aufzunehmen. Die Temperatur im Reaktionsge¬ misch soll dabei 16 °C nicht übersteigen. Nach dem Eintropfen beläßt man noch 30 Minuten bei 16 °C und überprüft durch DC- Chromatographie die Vollständigkeit der Reaktion. (1.2-Di- palmitoyl-sn-glycerin, RF 0.8; 1.2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3- phosphorsäuredichlorid wird durch Methanolyse in den entspre¬ chenden Phosphorsäuredimethylester umgewandelt, Rf 0.4 in Ether. )

Der zweite Phosphorylierungsschritt wird nun mit einem ge¬ schützten Oligoglycerin durchgeführt. Hier wird die Umsetzung mit 2-0-Benzyl-rac-G _j -l .3-0.0-1.2-isopropyliden-rac-G _: be¬ schrieben. Man tropft in das Reaktionsgemisch mit 1.2-Di- palmitoyl-sn-glycero-3-phosphorsäuredichlorid obigen Alkohol (0.105 Mol - 31 g) und Triethylamin (0.13 - 13 g) in 100 ml THF so ein, daß die Temperatur im Reaktionsgemisch 40 °C nicht übersteigt. Nach 3 Stunden bei 40 °C ist die Reaktion abge¬ schlossen (Ausgangsprodukt als Phosphorsäuredimethylester, Rf 0.4; Produkt als Methylester, Rf 0.7 in Ether) . Man filtriert vom ausgefallenem Triethylaminhydrochlorid ab und hydrolysiert das Reaktinsgemisch, im wesentlichen 1.2-Dipalmitoyl-sn-gly- cero-3 -phospho-2-O-benzyl-rac-glycero-l .3-0.0-1.2 -iso¬ propyliden-rac-glycerin-monochlorid neben nicht vollständig umgesetztem 1.2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphorsäuredi- chlorid, mit 26 g Na ₂ C0 ₃ gelöst in 260 ml H ₂ 0. Nach 4 Stunden wird mit 400 ml Diisopropylether versetzt und die obere Phase, die das Produkt enthält, so weit einrotiert, bis sich erste Kristalle bilden. Nun versetzt man mit 500 ml Aceton und saugt bei 20 °C die gebildeten Kristalle ab. Das Filtrat enthält das geschützte Phosphatidylglyceroglycerin, Na ^* -Salz (Rf 0.6 in CHCl ₃ /CH ₃ OH/Eisessig/H ₂ 0 600:60:20:5) . Nach Entfernen des Lö¬ sungsmittels erhält man 48 g Rohprodukt, das in 140 ml Essig¬ säure und 60 ml H ₂ 0 für 30 Minuten auf 60 - 70 °C erwärmt wird (Abspaltung der Isopropylidenschutzgruppe) . Man versetzt mit 500 ml CHC1 ₃ , 600 ml CH ₃ 0H und 400 ml H ₂ 0 und schüttelt gut durch. Die untere CHC1 ₃ -Phase wird nochmals mit 600 ml CH ₃ OH und 500 ml H ₂ 0 gewaschen, dabei aber so viel Na ₂ C0 ₃ zusetzen, daß der pH-Wert der wäßrigen Phase 6 erreicht. Die untere Chloroformphase wird einrotiert und der Rückstand in 400 ml THF aufgenommen. Zur Entfernung der Benzylschutzgruppe wird die Lösung mit 6 g Pd/C versetzt und in H ₂ -Atmosphäre de- benzyliert. Die Reaktion ist nach etwa 4 Stunden beendet. Man filtriert vom Katalysator ab, entfernt das Lösungsmittel und nimmt den Rückstand (~ 30 g) in 100 ml CHC1 ₃ auf. Man versetzt mit 900 ml Aceton und saugt die entstehenden Kristalle ab. Man erhält ein weißes Pulver, 1.2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3- phospho-glycero-glycerin, Na"-Salz, Ausbeute: 26 g (~ 32 %) .

Summenformel: C ₄₁ H _8C Na0 ₁₂ P (MG 819.04) ber. : C, 60.13; H, 9.85; Na, 2.81; 0, 23.44; P, 3.78 gef. : C, 60.01; H, 9.79; Na, - ; 0, - ; P, 3.69

1.2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-glycero-glycero-glyc erin,

Na ^* -Salz

Summenformel: C ₄₄ H ₈₆ Na0 ₁₄ P (MG 893.12) ber. : C, 59.17; H, 9.71; Na, 2.57; 0, 25.08; P, 3.47 gef. : C, 59.11; H, 9.62; Na, - ; 0, - ; P, 3.45

1.2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-glvcero-glvcero-glyc erin,

Na ^* -Salz

Summenformel: C ₄₇ H ₉₂ Na0 ₁₆ P (MG 967.20) ber. : C, 58.37; H, 9.59; Na, 2.38; 0, 26.47; P, 3.20 gef. : C, 58.29; H, 9.53; Na, - ; 0, - ; P, 3.19

Für die Herstellung von Phosphatidyl-oligoglycerinen mit einer aliphatischen Kette, den sogenannten Lysophosphatidyl-oligo- glycerinen, kann von Verbindungen ausgegangen werden, die in der sn-2-Position des Glycerins eine Benzylethergruppe tragen, z.B. l-Palmitoyl-2-O-benzyl-sn-glycerin, l-Stearoyl-2-O-ben- zyl-sn-glycerin, l-O-Hexadecyl-2-O-benzyl-sn-glycerin, 1-0- 0ctadecyl-2-0-benzyl-sn-glycerin usw. Die Herstellung dieser Verbindungen haben wir in den Publikationen H. Eibl und P. Woolley, Chem. Phys. Lipids 4_1 (1986) 53-63 und Chem. Phys. Lipids 47 (1988) 55-62 beschrieben. Diese Verbindungen werden in der für die Herstellung von 1.2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3- phospho-glyceroglycerin, Na*-Salz, beschriebenen Weise phospho- ryliert und mit den geschützten Oligoglycerinen umgesetzt. Die Abspaltung der Schutzgruppen erfolgt analog. Im letzten Schritt erfolgt durch katalytische Hydrogenolyse mit Pd/C ⁽ 5 % auf Aktivkohle) sowohl die Abspaltung der Benzylgruppen im Oligoglycerinbereich wie am Glycerin, das eine Acyl- oder Alkylgruppe trägt (siehe dazu die Beispiele) .

Die Herstellung der Alkylphospho-oligoglycerine dagegen ist einfach, da in diesem Fall die entsprechenden Alkohole nach gegebenem Phosphorylierungsschema umgesetzt werden. Für die

Darstellung der ungesättigten Vertreter muß allerdings die Tetrahydropyranylschutzgruppe anstelle der Benzylschutzgruppe verwendet werden.

Für die Synthese der ungesättigten Vertreter dieser Stoffklasse eine grundsätzlich andere Strategie beschritten werden. Hier erfolgt die Phosphorylierung von 1.2-Dibenzyl-sn- glycerin in der beschriebenen Weise (siehe dazu auch die deutsche Patentanmeldung DE 32 39 817) , dann schließt sich die Umsetzung mit einem tetrahydropyranyl-geschützten Oligo¬ glycerin an. Anstelle der Hydrolyse wird eine Methanolyse durchgeführt, wobei Phosphorsäuretriester erhalten werden, z.B. für 2-O-Tetrahydropyranyl-rac-Gj-1.3-0.0-1.2-isopro¬ pyliden-rac-G ₂ ;

CH _? - 0 CH ₂ - C ₆ H ₅

I

CH - 0 CH ₂ - C _g H ₅ I / THP

CH, - CH -CH, ^ά \ ' ^ά

0 0

CH X ₃ CH ₃

Dieses zentrale Zwischenprodukt wird nun mit Pd/C (5 % auf Aktivkohle) einer Hydrogenolyse unterworfen. Man erhält:

CH ₂ - OH

f -°" THP pu 0 0

0 - P - 0 - CH, - CH - CH,

' i ^{2 0CH} 3 0

Es können nun beliebige ungesättigte und auch gesättigte Fett¬ säuren in die Positionen sn-1 und sn-2 des Glycerinmoleküls eingeführt werden. Danach erfolgt, wie in unserer früheren Patentanmeldung beschrieben, die Abspaltung der Methylgruppe mit LiBr und danach die Hydrolyse der Isopropyliden- und Te- trahydropyranylschutzgruppen in 70 %-iger Essigsäure bei 60 bis 70 °C. Die DioleoylVerbindungen kristallisieren schwer und müssen deshalb durch Chromatographie gereinigt werden, während die Dierucylverbindungen bereits gut in kristalliner Form erhalten werden können.

Auch zur Herstellung der gemischtkettigen Phosphatidyl-oligo- glycerine ist die Phosphorsäuretriester-Strategie empfehlens- wert. In diesem Falle werden wie bei der Synthese der Lyso- phosphatidyl-oligoglycerine die l-Acyl-2-O-benzyl-sn-glycerine oder die l-O-Alkyl-2-O-benzyl-sn-glycerine als Ausgangspro¬ dukte verwendet und analog zu 1.2-Dibenzyl-sn-glycerin umge¬ setzt. In diesem Falle erhält man als Zwischenprodukte nach katalytischer Debenzylierung für die G ₂ -Verbindung:

R - 0 - CH,

H ₂

OCH, 0

J i

CH _? - CH - CH _? ι r

0 0

CH ₃ CH ₃

R = a) C0-(CH ₂ ) _χ -CH ₃ b) (CH ₂ ) _y -CH ₃

Nun können in die freie sn-2-Position ungesättigte Fettsäuren eingeführt werden und diese Moleküle wie beschrieben von ihren Schutzgruppen befreit werden. Angenehm ist, daß Moleküle mit der Fettsäurekombination l-Palmitoyl-2-oleoyl- oder 1- Stearoyl-2-oleoyl bereits gut kristallisieren.

Beispiel 5 : Weitere Eigenschaften

Mit steigender Anzahl der Glycerinmoleküle wächst die Anzahl der freien Hydroxylgruppen und damit die Polarität. Bei einem Anteil von 5 % in Wasser bildet PP-G-PG ₄ als einziges PP-G-PG _n eine klare isotrope Lösung. Die Lipide PP-G-PG _lf PP-G-PG ₂ und PP-G-PG ₃ lösen sich beim Erwärmen über 40 °C in Wasser und bilden Überstrukturen. Nach Unterschreiten dieser Temperatur bilden sich mit unterschiedlich ausgeprägten Hysteresen lamellare Strukturen, die durch Anisotropie (Doppelbrechung im polarisierten Licht) erkennbar sind. Die PP-G-PG- _L -Lösung trübt sich am schnellsten und überschüssiges Lipid fällt nach Stehenlassen bei Raumtemperatur aus. Die lamellaren Phasen von PP-G-PG ₂ und PP-G-PG ₃ bleiben auch bei niedrigen Temperaturen

(bis 4 °C) stabil. Während der Übergang von der isotropen in die anisotrope Phase bei Raumtemperatur für PP-G-PG ₂ nach einigen Minuten erkennbar wird, erfordert dies für PP-G-PG, mehrere Stunden. Die Unterschiede in der Polarität äußern sich auch in verschiedenen Retentionsfaktoren (Rf-Wert) im Dünn¬ schichtchromatogramm auf Kieselgel.