Domaine technique

[001] La présente invention concerne les dérivés de dicyanomethanides de phthalazinium et leur utilisation à des fins médicales et/ou de diagnostic.

Etat de la technique

[002] Dans le domaine médical, une étape de diagnostique est souvent nécessaire. Des tests simples sur supports solides permettent d'obtenir un résultat rapide, au moins préliminaire, sans devoir faire d'analyses complètes en laboratoire. Ces tests sont en général de type immunitaires, ou nécessitent un appariement de molécules spécifiques, et comportent un indicateur visuel tel qu'une couleur. D'autres méthodes de détection, comme la scintigraphie sont parfois utilisées. Dans tous les cas, au moins une partie des composants nécessaires au diagnostique doit être greffée de manière permanente sur un support solide, qu'il soit en verre, en matériau synthétique ou d'une autre nature. Cela implique l'utilisation d'un lien et d'une réaction de couplage avec un biosenseur, lequel peut être un peptide, un fragment d'ADN ou d'ARN ou toute autre biomolécule d'intérêt. Le lien doit en outre être greffé sur le support solide. De telles opérations nécessitent le plus souvent de modifier chimiquement le biosenseur à greffer sur le support de sorte à ce qu'il réagisse avec le lien, au risque d'en modifier ses propriétés ou de le dénaturer. Par ailleurs, les liens utilisés sont souvent développés spécifiquement pour un diagnostique donné, ce qui requiert des efforts de développement pouvant retarder le développement de tels dispositifs de diagnostiques.

[003] De nombreuses méthodes de greffage d'acides nucléiques sur un support solide, à des fins de test diagnostique par exemple, impliquent l'utilisation de molécules organiques, telles que celles décrites dans EP1075544. [004] Le document titled Sc(OTf)3-catalysed [3+3] cycloaddition of cyclopropane 1,1 diesters with phthalazinium dicyanomethanides, Organic Letters Vol.17, No 17, 14 août 2015, pages 4220-4223 présente une étude sur la cycloaddition du dérivés de dicyanomethanides de phthalazinium.

[005] Dans le domaine des diagnostiques sur support solide, l'étape de détection nécessite le plus souvent une réaction chimique. C'est le cas notamment des tests de type ELISA, où une enzyme spécifique est associée à un anticorps de détection et permet de faire varier la couleur de l'échantillon. L'élaboration d'un tel procédé nécessite donc de coupler un anticorps à une enzyme spécifique, avec le risque de dénaturer l'enzyme de détection.

[006] Outre le domaine du diagnostique, le greffage de biomolécules sur un support solide est couramment utilisé dans les activités de recherche, telles que le screening de nouvelles molécules, impliquant souvent de très larges librairies d'échantillons.

[007] Dans le domaine médical ou pharmaceutique, le couplage de plusieurs molécules est souvent indiqué par exemple pour cibler une action thérapeutique particulière. Les peptides, polypeptides, protéines font ainsi souvent l'objet de fonctionnalisation chimique pour le développement de produits pharmacologiques. De telles fonctionnalisations permettent d'améliorer les effets thérapeutiques, ou d'atténuer les effets secondaires, ou de produire de nouveaux effets. Des biomolécules telles que des anticorps peuvent être fonctionnalisées avec une autre molécule thérapeutique de sorte à cibler précisément les cellules à traiter. Cette approche est notamment déployée en oncologie pour délivrer le traitement spécifiquement aux cellules cancéreuses et limiter ou éviter les effets secondaires. Cependant, la réaction de fonctionnalisation ou de couplage de telles biomolécules avec d'autres molécules peut se révéler complexe et peut modifier ou dénaturer les biomolécules. Le plus souvent, la molécule intermédiaire, faisant le lien entre les molécules, doit être spécifiquement développée pour les molécules à apparier, ce qui rend le travail fastidieux. En outre, il n'est pas toujours facile de contrôler dans quelle mesure le couplage est effectivement réalisé.

[008] A des fins de diagnostique, de recherche et développement ou d'application thérapeutique, il apparaît nécessaire de développer un lien chimique utilisable aisément dans un grand nombre d'applications différentes de sorte à accélérer et simplifier la production de nouveaux dispositifs de test, de diagnostique ou des méthodes thérapeutiques.

[009] L'intolérance au lactose représente un problème majeur pour l'alimentation des nourrissons. Le polymorphisme LCT-13910 C/T de l'intron 13 a été identifié comme responsable de l'intolérance lactose. Le diagnostique nécessite cependant des analyses en laboratoire. Il convient donc de développer un test de diagnostique facile à produire et à mettre en œuvre pour caractériser rapidement une intolérance au lactose.

[010] Il existe un réel intérêt à développer de nouveaux dérivés permettant en particulier de fonctionnaliser des peptides ou des protéines ou d'autres polymères biologiques tels que des acides nucléiques. Il existe en outre un réel intérêt pour de nouveaux agents de liaison permettant de fixer de tels polymères biologiques sur un support solide. Plus particulièrement, il apparaît nécessaire de développer de nouveaux dérivés susceptibles de permettre divers types d'applications, telles que des fonctionnalisations de peptides ou d'acides nucléiques ou leur greffage sur un support solide, ou comme agent révélateur dans un test diagnostique.

[011] Bref résumé de l'invention

[012] Un but de la présente invention est de proposer un lien chimique adapté au greffage ou au couplage d'une biomolécule sur un support solide et/ou à une molécule conjuguée. En l'occurrence, il s'agit de proposer un lien chimique applicable à une multitude de biomolécules, incluant les peptides, protéines, acides nucléiques ou ribonucléiques, sans devoir être modifié ou impliquant peu de modifications. Il s'agit en outre de proposer un lien chimique ne nécessitant pas ou peu de modification des biomolécules à coupler ou greffer de sorte à ne pas les dénaturer.

[013] Un autre but de la présente invention est de proposer un lien chimique permettant des couplages séquentiels et/ou alternatifs sur différents supports solides. En d'autres termes, un même lien chimique peut être utilisé pour le greffage de biomolécules sur différents types de supports. L'objectif est de produire un lien comportant plusieurs fonctions chimiques réactives pouvant être activées de manière indépendante pour permettre le couplage séquentiel et/ou alternatif.

[014] Un autre but de la présente invention est de proposer un lien chimique adapté pour réagir spontanément avec un ou plusieurs sites réactifs d'une biomolécule de sorte à effectuer un couplage ou un greffage rapide et simple, dans des conditions de réactions douces. De préférence le lien chimique réagit de façon sélective sur un ou plusieurs sites prédéterminés.

[015] Un autre but de la présente invention est de proposer un lien chimique permettant de visualiser aisément et instantanément l'établissement du couplage ou du greffage des molécules. Un autre but est de pouvoir doser ou suivre l'avancement du couplage de manière visuelle directe ou via un dispositif optique.

[016] Un autre but de la présente invention est de proposer une méthode de production de biosimilaires, ainsi que les biosimilaires ainsi produits, au moyen de la fonctionnalisation de protéines ou d'anticorps avec un principe actif.

[017] Un autre but de la présente invention est de proposer une méthode de production d'un dispositif de test ou de diagnostique impliquant un lien chimique. En l'occurrence, la méthode de production permet de greffer une ou plusieurs biomolécules sur un support solide et/ou de la coupler avec une autre molécule, de manière simple, rapide et peu coûteuse. [018] Un autre but de la présente invention est de proposer un test d'identification d'un marqueur biologique, de façon simple, rapide et fiable, dans lequel au moins un des éléments du test est lié à un support solide. En particulier, la présente invention propose un test diagnostique de l'intolérance au lactose facile à mettre en œuvre.

[019] Un autre but de la présente invention est de proposer un test immunologique comprenant un indicateur coloré ne résultant pas d'une activité enzymatique. L'objectif est en particulier de proposer un test immunologique ayant un indicateur coloré fiable, robuste et facile à mettre en œuvre.

[020] Un autre but de la présente invention est de proposer un kit comprenant un test diagnostique et un lien de greffage et/ou de couplage d'un biosenseur sur un support solide.

[021] Un autre but de la présente invention est de proposer une méthode de couplage d'une biomolécule avec une autre molécule, en particulier une molécule présentant une activité thérapeutique. Il s'agit également de proposer une méthode ou un procédé de fonctionnalisation de peptides, de protéines ou d'acides nucléique ou ribonucléique.

[022] Un autre but de l'invention est de proposer une méthode ou un procédé de greffage d'un biosenseur sur une surface solide de façon fiable, robuste et simple.

[023] Un autre but de la présente invention est de proposer une méthode de captage de certaines biomolécules ou catégories de biomolécules via l'immobilisation de peptides, de protéines ou d'acides nucléiques sur un support solide. Avantageusement le captage d'un peptide ou d'un acide nucléique permet en outre un dosage instantané, de préférence via une indication visuelle directe ou identifiable par un appareil optique. [024] Un autre but de la présente invention est de proposer une méthode de fonctionnalisation d'une surface solide via l'immobilisation de peptides, de protéines ou d'acides nucléiques. En particulier, l'objectif est de rendre réactive une telle surface à un stimulus particulier, notamment un stimulus lumineux. Un objectif est de fonctionnaliser une surface solide avec des cryptochromes de sorte à devenir photosensible.

[025] Selon l'invention, ces buts sont atteints notamment au moyen des dérivés de dicyanomethanide de phthalazimium de formule (I) décrits dans les revendications, utilisés comme liens pour le greffage de biomolécules sur une surface solide ou pour lien de couplage avec d'autres molécules. Ces buts sont également atteints au moyen des dispositifs de test et/ou de diagnostique impliquant l'utilisation de dérivés de dicyanomethanide de phthalazimium de formule (I). Ces buts sont également atteints au moyen d'un test de diagnostique de type PLISA (Polymer-Linked Immuno assay) comprenant un polymère pourvu d'un ou plusieurs sites réactifs aux dérivés de dicyanomethanide de phthalazimium de formule (I).

[026] L'invention représente notamment l'avantage de proposer un lien applicable à différentes applications avec peu ou pas de modifications chimiques. L'invention permet de dériver des peptides et acides nucléique, ou de greffer des surfaces solides via des liaisons covalentes par des réactions « one-pot ». L'invention permet d'immobiliser localement des biosenseurs sur une surface solide de sorte à produire des tests multiplexes. Les spots sont limités à des surfaces de l'ordre de 100 pm ou 50 pm. L'invention permet de fonctionnaliser des surfaces solides avec une monocouche de biomolécules. L'invention permet de produire des tests et des diagnostiques avec des quantités restreintes de matériel biologique greffé sur la surface solide, de l'ordre de 10 à 50 fois moins que pour les méthodes déjà connues.

Brève des fiqures

[027] La présente invention est illustrée par les figures suivantes : Figure 1 : représentation schématique d'une application de test selon un exemple de la présente invention,

• Figure 2a, 2b, 2c : Spectres ESI-MS des composés P14 (A), P11 (B) et P12 (C) où les m/z = [M+H]+ sont respectivement de 229, 225 et 240

• Figures 3a, 3b, 3c : Graphiques représentants l'absorbance à différentes concentration pour les composés P14, P11 et P12 dissous dans une solution d'eau et acétonitrile (4:6).

• Figure 4 : Spectres LC pour les échantillons (A), (B) et (C), seuls les spectres MS mesurés pour les pics indiqués sont montrés, ceux-ci correspondant au peptide seul (A), le composé P14 (B) et le peptide incubé en présence du composé P14 à 80°C pendant 3 heures,

• Figure 5 : (A) Image montrant la différence en morphologie de l'APA natif (gauche) et de l'APA modifié (droite). (B) Spectre ATR-FTIR de l'APA natif et (C) de l'APA modifié.

• Figure 6 : Spectre MS déconvolué pour (A) mAb QC de Roche, (B) mAb natif et (C) mAb dérivatisé.

• Figure 7 : Spectre MS, en haut: mAb natif et en bas: le mAb dérivatisé,

• Fig.8 : (A) Comparaison PLISA avec ELISA avec les produits de la présente invention. A droite l'absorbance mesurée par ELISA et la vitesse de consommation du colorant par PLISA. (B) Exemple de profil de consommation du colorant en fonction du temps et un exemple de calcul correspondant à l'échantillon de concentration 1 ng/ml (1000 pg/ml) en IFN,

• Fig.9 : Corrélation mesurée entre les mesures certifiées Abbott (contrôle) avec celles obtenues par PLISA avec des produits selon la présente invention, • Figure 10a et 10b : (A) Effet de la puissance du laser sur la réactivité du composé P14 et (B) comparaison de la réactivité entre l'illumination par LED et lampe à mercure de (120 W),

• Figures 11 a, 11 b : (A) Cinétique de la réaction exprimée en fonction de la perte d'absorbance en pourcentage pour les dérivés P14, P11 et P12, (B) Effet de la diminution en oxygène sur la réaction chimique avec une perte de moitié en efficacité,

• Figure 12 : Schéma montrant la distribution des anticorps sur le biocapteur selon un exemple de la présente invention, 3x 8 points avec bloque 1 dédié à la détection du HCV, le bloque 2 à HTLV et le bloque 3 au HIV,

• Figure 13a et13b : (A) Fluorescence de Cy5 mesurée avec un instrument FluoChem M avec un temps d'exposition de 500ms. Les intensités en fluorescence sont mesurées pour des biocapteurs selon la présente invention. La haute spécificité du test montre aucun signal pour les patients sains, ni de réactivité croisée. De gauche à droite, les points caractérisent respectivement le bloque 1, le bloque 2, le bloque 3 et le contrôle. (B) Graphique exprimant le rapport de la fluorescence par spot divisé par la fluorescence du signal positif, montrant la haute spécificité du test. Les bases d'erreurs ont été générées en répétant l'expérience à deux reprises.

• Figure 14 : Schéma de l'amplification spécifique liée à la présence d'un polymorphisme selon la présente invention. Si l'échantillon d'ADN s'apparie à l'amorce LB alors une réaction d'élongation se déroule avec l'enrichissement en molécules fluorescentes Cy5, qui pourront être visualisées grâce à une caméra,

Figure 15 : Résultats obtenus en appliquant la LAMP sur surface solide sur 6 patients selon un mode de réalisation de la présente invention. Les patients 1, 2 et 5 qui génèrent le plus dé signa sont positifs à l'allèle T. Les patients 3, 4 et 7 correspondent au signal de base, ainsi ils sont considérez comme négatif (allèle C). e(s) de mode de réalisation de l'invention

[028] Pour les besoins de la présente invention un lien chimique désigne une molécule organique comprenant au moins un site fonctionnel permettant de lier de manière covalente cette molécule organique à une autre molécule, en particulier une biomolécule, une molécule à tester ou faisant office de biosenseur. Le site fonctionnel peut être en l'occurrence un groupement dicyanométhanide. La liaison covalente peut être établie par toute réaction chimique connue dans des conditions de réaction suffisamment douces pour ne pas dénaturer la biomolécule ou le biosenseur visé. En particulier, la réaction s'effectue sans chauffage ou avec un chauffage modéré, à une température inférieure à 40°C ou 35°C ou 30°C. La réaction s'effectue dans un milieu aqueux et/ou sans solvent organique. La réaction est de préférence spontanée. La réaction est de préférence sélective d'un ou plusieurs sites prédéterminés de la biomolécule à greffer ou du biosenseur. La liaison covalente peut être établie via une cycloaddition. Le site de réaction prédéterminé de la biomolécule peut comporter une insaturation, telle qu'une double liaison, susceptible de réagir dans une cycloaddition.

[029] La molécule formant le lien chimique selon la présente invention comporte avantageusement un ou plusieurs autres sites fonctionnels permettant de lier la molécule organique sur une surface solide ou sur une autre molécule. En particulier, des surfaces de silicium ou de verre, comportant des restes - SiOH, peuvent être utilisées à cette fin. Une fonction amine, telle que celle d'un acide aminé, peut également être utilisée à cette fin. Des surfaces de produits synthétiques comportant des sites réactifs tels que des insaturations, en particulier des groupe allyl, peuvent alternativement être utilisées. Par exemple, des supports à base d'acrylonitrile de styrène et de butadiène, ABS (Acrylonitrile Butabiène Styrene) peuvent être utilisés. La molécule organique faisant office de lien comporte alors une ou plusieurs fonctions chimiques susceptibles d'interagir avec l'une ou plusieurs de ces fonctions de ces surfaces solides. Les fonctions chimiques de la molécule organique servant de lien peuvent être libres ou bien protégées de sorte à être chimiquement libérées in-situ. Qu'elle comporte ou non des fonctions chimiques permettant son greffage sur une surface solide, la molécule organique servant de lien peut être utilisée en solution sans être nécessairement greffée sur un support solide.

[030] Selon une disposition avantageuse, la molécule organique faisant office de lien peut produire un effet visuel lors de sa réaction avec une molécule à tester ou une biomolécule. En particulier, la molécule organique servant de lien, lorsqu'elle est en solution, peut colorer la solution avec une intensités liée à sa concentration, ou directement proportionnelle à sa concentration. La coloration due à la molécule organique faisant office de lien peut varier ou disparaître lorsqu'elle a réagi avec une biomolécule ou une molécule à tester, ou une surface solide. Avantageusement, la variation ou la disparition de couleur peut être avantageusement utilisée pour suivre l'avancement d'une réaction de couplage ou de greffage. Dans le cas où la molécule organique réagit sur une biomolécule ou une molécule à tester, la variation ou la disparition de couleur qui en résulte peut permettre de doser la biomolécule ou molécule à tester.

[031] Les termes de surface solide ou de support, et tout équivalent, désignent indistinctement tout matériau solide susceptible de recevoir et de maintenir des molécules organiques servant de lien avec d'autres molécules ou des biomolécules. Selon les besoins, une surface solide peut prendre la forme d'une plaque aux dimensions macroscopiques, permettant notamment d'effectuer un test visuel ou colorimétrique. Alternativement une surface solide peut être constituée d'un ensemble de microbilles, également connues sous le terme anglais de « microbeads ». Alternativement, une surface solide peut être un matériau poreux offrant une large surface de contact avec le milieu extérieur tel que des zéolites ou matériaux similaires. Une surface solide peut désigner alternativement un ensemble de fibres textiles ou synthétiques. Une surface peut être faite de, ou comporter, la cellulose. Il est entendu que le support ou la surface solide ou tout terme équivalent désigne un élément hors solution, même en présence d'une solution.

[032] Le terme de biomolécule désigne toute molécule d'intérêt biologique ou issue du monde vivant, en particulier des macromolécules de type peptide, protéine, anticorps, enzyme, hormone, récepteur biologique, récepteur transmembranaire, acide nucléique, acide ribonucléique, acide désoxyribonucléique, ainsi que leur dérivés, sels, et combinaisons. Les biomolécules peuvent être fonctionnalisées de sorte à comporter des portions non naturelles. En particulier, une biomolécule peut être modifiée de sorte à présenter une fonction réactive vis-à-vis du lien chimique selon la présente invention. Une fonction hydroxyde, telle que l'extrémité 3' d'un acide nucléique, peut par exemple être modifiée en amine. Un biomolécule peut par exemple être liée ou combinée à du rose de bengale. Les biomolécules peuvent en outre désigner des acides gras, acides aminés, neurotransmetteurs. De préférence, le terme de biomolécule désigne une molécule du monde vivant à tester ou identifier au moyen des produits et méthodes de la présente invention.

[033] Les termes de molécule à tester désigne toute molécule dont la présence dans un échantillon doit être identifiée au moyen des produits et méthodes de la présente invention. Une molécule à tester peut être une biomolécule telle que définie ci-dessus. Alternativement une molécule à tester peut être ou comprendre une molécule synthétique comportant au moins un site réactif permettant de l'identifier. Plus particulièrement, une molécule à tester peut être un polymère, tel qu'un acide polyacrylique, comportant au moins une fonction réactive avec le lien décrit ci-dessus, notamment un acide polyacrylique de plus de 200 ou 300 ou 400 ou 450 KDa fonctionnalisé avec des allyles.

[034] Le terme de biosenseur désigne toute molécule adaptée à s'apparier de manière spécifique avec une biomolécule ou une molécule à tester dans les conditions de la présente description. Un biosenseur peut en l'occurrence comporter un ou plusieurs épitopes. Un biosenseur peut prendre la forme d'une séquence d'ADN ou d'ARN pouvant s'apparier avec une séquence complémentaire d'une biomolécule ou d'une molécule à tester. Alternativement, un biosenseur peut prendre la forme d'un peptide ou d'une protéine dont la séquence peut être reconnue par un anticorps. Un biosenseur peut être également désigné sous le terme de biocapteur.

Molécule

[035] La molécule organique utilisée comme lien est représentée par les dérivés de dicyanomethanide de phthalazimium de formule (I) ci-dessous : dans laquelle les substituants R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , et R ⁶ désignent indépendamment l'un de l'autre un atome ou groupe d'atomes sélectionné parmi le groupe consistant en

- un atome d'hydrogène, SO3 , PO4 , NO2, -NHS,

- -(CH ₂ )X-OR ⁷ , -(CH ₂ )X-OH, -(CH ₂ ) _X -N R ⁷ R ⁸ , -(CH ₂ ) _X -N H R ⁸ , -(CH ₂ ) _X -CON R ⁷ R ⁸ , - (CH ₂ )X-CON H R ⁸ , -(CH ₂ )X-CON H ₂ , -(CH ₂ )X-CO ₂ N R ⁷ R ⁸ , -(CH ₂ )X-CO ₂ N H R ⁸ , - (CH ₂ )X-COR ⁷ , -(CH ₂ )X-COH, -(CH ₂ )X-COOR ⁷ , -(CH ₂ )X-COOH, -(CH ₂ )X-SR ⁷ , - (CH ₂ )X-SH, -(CH ₂ )X-SOR ⁷ , -(CH ₂ )X-SOH, -(CH ₂ )X-SO ₂ R ⁷ , -(CH ₂ )X-SO ₂ H OÙ x est un nombre entier compris entre 0 et 10, de préférence entre 0 et 5,

- un atome d'halogène, et où R ⁷ désigne un atome ou groupe d'atomes sélectionné parmi le groupe consistant en • un alkyl linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, pouvant être saturé, mono-insaturé ou poly-insaturé, dans lequel 1 ou plusieurs atomes d'hydrogène peuvent être indépendamment l'un de l'autre remplacés par un atome d'halogène, un groupement -COR ¹⁰ , -CO2R ¹⁰ , -OR ¹⁰ , -NO2, NHR ¹⁰ , -CON3 , -N3, ou un groupement phényl éventuellement substitué par 1, 2, 3 ou 4 groupements indépendamment sélectionnés dans le groupe consistant en -COR ¹⁰ , -CO2R ¹⁰ , - OR ¹⁰ , -NO2, -NHR ¹⁰ -CON ₃ et N ₃ ,

• un cycloalkyl comprenant 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 atomes de carbones, pouvant être saturé, mono-insaturé, doublement ou triplement insaturé, dans lequel 1 ou plusieurs atomes d'hydrogène peuvent être indépendamment l'un de l'autre remplacés par un atome d'halogène, un groupement -COR ¹⁰ , -CO2R ¹⁰ , -OR ¹⁰ , - NO2, NHR ¹⁰ , -CON3, N3, ou un groupement phényl éventuellement substitué par 1, 2, 3 ou 4 groupements indépendamment sélectionnés par le groupe consistant en - COR ¹⁰ , -CO2R ¹⁰ , -OR ¹⁰ , -NO2, NHR ¹⁰ , -CON ₃ , -N ₃ , et

• un groupement aromatique comprenant 1 ou 2 cycles aromatiques éventuellement substitué par 1, 2, 3 ou 4 groupements indépendamment sélectionnés parmi le groupe consistant en -COR ¹⁰ , -CO2R ¹⁰ , -OR ¹⁰ , -NO ₂ , -NHR ¹⁰ , -CON ₃ , N ₃ ou -C(CN) ₂ , où R ⁸ désigne un atome ou groupe d'atomes sélectionné parmi le groupe consistant en

- un atome d'hydrogène et

- R7, ou bien dans laquelle Rs forme avec R ⁷ dans les groupes -(CH2) _X -NR ⁷ R ⁸ , -(CH2) _X - CONR ⁷ R ⁸ , -(CH2) _X -CO2NR ⁷ R ⁸ , un hétérocycle comprenant de 4, 5, 6 ou 7 atomes de carbone, où 1 ou 2 groupes -CH2- peuvent être indépendamment l'un de l'autre remplacés par -CO-, ou -CS-, et où deux atomes de carbone contigus peuvent être liés par une double liaison ; où R ¹⁰ désigne un atome d'hydrogène ou un groupe alkyl saturé comprenant de 1 à 4 atomes de carbone ; où au moins l'un des substituants R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , et R ⁶ en particulier l'un des substituants R ² , R ³ , R ⁵ , et R ⁶ est différent de H, ou bien si l'un des 6 substituants R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , et R ⁶ , en particulier si l'un des substituants R ¹ , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , et R ⁶ , est un atome de chlore, ou un groupe -OCH3, -SCH3, -CF3, ou un phenyl non substitué ou substitué par un group -OR ¹⁰ , alors au moins l'un des 5 autres substituants est différent de H, ou si 2 des substituants R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , et R ⁶ sont des groupes -CH3, en particulier R ⁴ , R ⁵ , alors au moins l'un des 4 autres substituants est différent de H, ou si 2 des substituants R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , et R ⁶ , en particulier les substituants R ⁴ , R ⁵ sont des halogènes, en particulier des atomes de chlore, alors au moins l'un des autres substituants, en particulier les substituants R ¹ , R ² , R ³ et R ⁶ est différent de H.

[036] Selon un mode de réalisation particulier, le substituant R ⁶ désigne un atome d'hydrogène, SO3 , PO4 , NHS ou NO2,

- les substituant R ² et R ⁵ désignent indépendamment l'un de l'autre un atome ou un groupe d'atomes sélectionné dans le groupe consistant en un atome d'hydrogène, NHS, -(CH2)x-COOR ⁷ , -(CH2)x-COOH, -(CH2) _X - CO2NR ⁷ R ⁸ , -(CH2) _X -CONR ⁷ R ⁸ OÙ x est un nombre entier correspondant à 0 ou 1,

- les substituants R ³ et R ⁴ désignent indépendamment l'un de l'autre un atome ou un groupe d'atomes sélectionné dans le groupe consistant en un atome d'hydrogène, un atome d'halogène, NO2, -OR ¹⁰ et - COR ¹⁰ ,

• où R ⁷ désigne un atome ou groupe d'atomes sélectionné parmi le groupe consistant en un alkyl linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, pouvant être saturé, mono- insaturé ou poly-insaturé, dans lequel 1 ou plusieurs atomes d'hydrogène peuvent être indépendamment l'un de l'autre remplacés par un atome d'halogène, un groupement -COR ¹⁰ , - CO2R ¹⁰ , -OR ¹⁰ , -NO2, -NHR ¹⁰ , -N3, -CON3 ou un groupement phényl éventuellement substitué par 1, 2, 3 ou 4 groupements indépendamment sélectionnés par le groupe consistant en - COR ¹⁰ , -CO2R ¹⁰ , -OR ¹⁰ , -NO2, -NHR ¹⁰ -CON3, N ₃ , -C(CN) ₂ ’ OU dénote un groupement aromatique comprenant 1 cycle aromatiques éventuellement substitué par 1 ou 2 groupements indépendamment sélectionnés parmi le groupe consistant en - COR ¹⁰ , -CO2R ¹⁰ , -OR ¹⁰ , -NO2, -NHR ¹⁰ , -CON ₃ , N ₃ OU -C(CN) ₂ , où R ⁸ désigne un atome ou groupe d'atomes sélectionné parmi le groupe consistant en un atome d'hydrogène et

R7, ou bien dans laquelle R ⁸ forme avec R ⁷ dans le groupe -(CH2) _X -CO2NR ⁷ R ⁸ , un hétérocycle comprenant de 4, 5, ou 6 atomes de carbone, où 1 ou 2 groupes -CH2- peuvent être indépendamment l'un de l'autre remplacés par -CO-, ou -CS-, et où deux atomes de carbone contigus peuvent être liés par une double liaison ; où R ¹⁰ désigne un atome d'hydrogène ou un groupe alkyl saturé comprenant de 1 à 4 atomes de carbone ; où au moins l'un des substituants R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , et R ⁶ en particulier l'un des substituants R ² , R ³ , R ⁵ , et R ⁶ est différent de H, ou bien si l'un des 6 substituants R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , et R ⁶ , en particulier si l'un des substituants R ¹ , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , et R ⁶ , est un atome de chlore, ou un groupe -OCH3, -SCH3, -CF3, ou un phenyl non substitué ou substitué par un group -OR ¹⁰ , alors au moins l'un des 5 autres substituants est différent de H, ou si 2 des substituants R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , et R ⁶ sont des groupes -CH3, en particulier R ⁴ , R ⁵ , alors au moins l'un des 4 autres substituants est différent de H, ou si 2 des substituants R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , et R ⁶ , en particulier les substituants R ⁴ , R ⁵ sont des halogènes, en particulier des atomes de chlore, alors au moins l'un des autres substituants, en particulier les substituants R ¹ , R ² , R ³ et R ⁶ est différent de H. [037] Selon un autre mode de réalisation, le substituant R ¹ désigne un atome d'hydrogène, - le substituant R ⁶ désigne un atome d'hydrogène, SO3 ou PO4 ,

- les substituants R ² et R ⁵ désignent indépendamment l'un de l'autre un atome ou un groupe d'atomes sélectionné dans le groupe consistant en un atome d'hydrogène, NHS, -COOR ⁷ , -COOH, -CO2NR ⁷ R ⁸ , ou l'un des groupes

- les substituants R ³ et R ⁴ désignent indépendamment l'un de l'autre un atome ou un groupe d'atomes sélectionné dans le groupe consistant en un atome d'hydrogène, NO2, un atome de chlore, et un atome de fluor, où R ⁸ désigne un atome ou groupe d'atomes sélectionné parmi le groupe consistant en un atome d'hydrogène et

R ₇ , où R ⁷ désigne un atome ou groupe d'atomes sélectionné parmi le groupe consistant en un alkyl saturé linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, dans lequel 1 ou plusieurs atomes d'hydrogène peuvent être indépendamment l'un de l'autre remplacés par un atome d'halogène, un groupement -COR ¹⁰ , -CO2R ¹⁰ , -OR ¹⁰ , -NO2, -NHR ¹⁰ , -CON3- -N ₃ ou bien dans laquelle Rs forme avec R ⁷ dans le groupe -CO2NR ⁷ R ⁸ , un hétérocycle comprenant de 4, ou 5 atomes de carbone, où 1 ou 2 groupes - CH2- peuvent être indépendamment l'un de l'autre remplacés par -CO-, ou - CS-, et où deux atomes de carbone contigus peuvent être liés par une double liaison ;

[038] Selon un mode de réalisation, les substituants R ¹ et R ⁴ dans la formule (I) désignent tous deux un atome d'hydrogène et les substituants R ² , R ³ , R ⁵ , et R ⁶ sont tels que définis plus haut.

[039] Selon un mode de réalisation, le substituant R ² dans la formule (I) désigne un atome ou un groupe d'atomes sélectionné dans le groupe consistant en un atome d'hydrogène, un halogène, de préférence un chlore, un groupe CO2H, CO2R ⁷ , -(CH2) _X -OR ⁷ , -(CH2) _X -OH, ou un groupe et les substituants R ¹ , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , R ⁶ et R ⁷ sont tels que définis plus haut.

[040] Selon un mode de réalisation, le groupe R ³ dans la formule (I) désigne un atome d'hydrogène ou un groupe NO2 et les autres substituants sont tels que définis plus haut.

[041 ] Selon un mode de réalisation le substituant R ⁵ désigne un atome d'hydrogène ou un groupe CO2H, CO2R ⁷ et les autres substituants sont tels que décrit plus haut.

[042] Selon un mode de réalisation le substituant R ⁶ désigne un atome d'hydrogène, SO3 ou PO4 , et les autres substituants sont tels que définis plus haut.

[043] Selon un mode de réalisation, l'un des deux substituants R ² et R ⁵ désigne un atome d'hydrogène et l'autre un atome ou groupe d'atomes tels que définis plus haut et différent de l'hydrogène, les autres substituants étant tels que définis plus haut.

[044] Selon un mode de réalisation, l'un des substituants R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , et R ⁶ est sélectionné parmi le groupe -(CH2) _X -CONR ⁷ R ⁸ , -(CH2) _X -CONHR ⁸ , - (CH ₂ ) _X -CON H2, -(CH2) _X -CO ₂ NR ⁷ R ⁸ , -(CH2) _X -CO ₂ NHR ⁸ , -(CH ₂ ) _X -COR ⁷ , -(CH ₂ ) _X -COH, -(CH ₂ ) _X -COOR ⁷ , -(CH ₂ ) _X -COOH, -(CH ₂ ) _X -SOR ⁷ , -(CH ₂ ) _X -SOH, -(CH2) _X -SO ₂ R ⁷ , et - (CH2) _X -SO ₂ H, de préférence -(CH ₂ ) _X -COOH et -(CH ₂ ) _X -COOR ⁷ , où x, R ⁷ , R ⁸ et les autres des substituants R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , et R ⁶ sont tels que définis dans les modes de réalisation ici-décrits. En particulier, un tel substituants R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , et R ⁶ est adapté pour l'établissement d'une liaison chimique avec une biomolécule, notamment une liaison peptidique avec un acide aminé d'un peptide, d'une protéine, d'un antigène, d'un anticorps ou d'une enzyme, ou une fonction amine remplaçant la fonction hydroxyde d'une extrémité 3' d'un acide nucléique.

[045] Dans la définition de R ⁷ de l'un ou l'autre des modes de réalisation ici-décrit, et sauf mention contraire, l'expression « groupement aromatique » désigne les cycles phényl et naphtyle, les hétérocycles, en particulier les hétérocycles azotés comprenant 1 à 2 atomes d'azote, plus particulièrement des cycles de type pyrole, pyridine, pyridinium, phtalazine, phtalazinium, la quinoline, isoquinoline, pyrimidine, pyrimidinium, pyrazine, pyrazinium.

[046] Selon un mode de réalisation, la molécule organique utilisée comme lien est représentée par les dérivés de dicyanomethanide de phthalazimium de formule (I) ci-dessus dans laquelle :

- les substituants R ¹ et R ⁴ dans la formule (I) désignent tous deux un atome d'hydrogène,

- le substituant R ⁵ désigne un atome d'hydrogène ou un groupe CO2H, CO2R ⁷ ,

- le substituant R ⁶ désigne un atome d'hydrogène, SO3 ou PO4 ,

- le substituant R ² dans la formule (I) désigne un atome ou un groupe d'atomes sélectionné dans le groupe consistant en un atome d'hydrogène, un halogène, de préférence un chlore, un groupe CO2H, CO2R ⁷ , -(CH ₂ ) _X -OR ⁷ , -(CH ₂ ) _X -OH, OU un groupe où R ⁷ désigne un atome ou groupe d'atomes sélectionné parmi le groupe consistant en un alkyl linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 6 atomes de carbone.

[047] Dans la formule (I) selon la présente invention, les substituants R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , R ⁶ , R ⁷ , R ⁸ , R ¹⁰ et x sont tels que définis dans les différents modes de réalisation ci-dessous, sous réserve que les conditions suivantes restent remplies : au moins l'un des substituants R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , et R ⁶ en particulier l'un des substituants R ² , R ³ , R ⁵ , et R ⁶ est différent de H,

- si l'un des 6 substituants R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , et R ⁶ , en particulier si l'un des substituants R ¹ , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , et R ⁶ , est un atome de chlore, ou un groupe -OCH3, -SCH3, -CF3, ou phenyl, alors au moins l'un des 5 autres substituants est différent de H,

- si 2 des substituants R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , et R ⁶ sont des groupes -CH3, alors au moins l'un des 4 autres substituants est différent de H,

- si 2 des substituants R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , et R ⁶ , en particulier les substituants R ⁴ , R ⁵ sont des halogènes, en particulier des atomes de chlore, alors au moins l'un des autres substituants, en particulier les substituants R ¹ , R ² , R ³ et R ⁶ est différent de H. [048] De manière privilégiée, les dérivés de dicyanométhanide de phthalazinium selon la présente invention sont sélectionnés parmi les composés suivants :

[049] Les composés de formule (I) peuvent être préparés selon le procédé de production décrit ci-après. Les dérivés de dicyanométhanide de phthalazinium (I) sont produits à partir de dérivés de la phthalazine. En particulier, le composé de formule (Ib), dans lequel les substituants R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ et R ⁶ sont tels que décrits plus haut, est mis en réaction avec l'oxyde de tétracyanoéthylène (TCNEO) selon le schéma suivant :

[050] Les composés obéissant à la formule (lb) dans lesquels R ² désigne un groupement -(CF -COOH où x est égal à 0 et où R ¹ , R ³ , R ⁴ , R ⁵ et R ⁶ sont tels que défini plus haut, sont obtenus à partir de dérivés de phthalazine où R ² =H selon les réactions suivantes :

Alternativement, les composés obéissant à la formule (lb) dans lesquels R ² désigne un groupement -(CH2) _X -COOH où x est égal à 0 et où R ¹ , R ³ , R ⁴ , R ⁵ et R ⁶ sont tels que défini plus haut, peuvent être obtenus selon les réactions suivantes :

[051 ] La présente invention couvre également l'utilisation d'un composé de formule (I) tel que décrit ici, ou un composé (P14) pour la fonctionnalisation d'un polymère ou d'une biomolécule et/ou le greffage d'un tel polymère ou d'une telle biomolécule sur un support solide. La biomolécule ou le support solide comporte au moins une fonction réactive adaptée à réagir avec la fonction dicyanomethanide d'un composé de formule (I) ou du composé (P14) par cyclisation. Le procédé comprend une étape de mettre le composé de formule (I) ou le composé (P14) en réaction avec la biomolécule ou le support solide de sorte que la fonction dicyanomethanide réagisse sur l'une ou plusieurs de leurs fonctions réactives.

[052] Dans le cas d'un greffage, le procédé comprend en outre l'étape de faire réagir l'un des substituants R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , et R ⁶ du composé de formule (I) sur une fonction réactive adaptée du support solide si la fonction dicyanomethanide est mise en réaction avec une fonction réactive de la biomolécule, ou de faire réagir l'un des substituants R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , et R ⁶ du composé de formule (I) sur une fonction réactive adaptée de la biomolécule si la fonction dicyanomethanide est mise en réaction avec une fonction réactive du support solide. la biomolécule peut être un peptide ou une protéine (PT) comprenant au moins un tryptophane dont la double liaison réagit avec la fonction dicyanomethanide du composé de formule (1) ou du composé (P14). Alternativement, la biomélécule peut comporter une fonction amine et l'un des substituants R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , et R ⁶ du composé de formule (I) peut comprendre une fonction -COOH ou équivalente, de sorte à pouvoir former une liaison avec la fonction amine de la biomolécule. Alternativement, la biomolécule forme un complexe de type Peptide Nucleic Acid lié, associé ou combiné à du rose de bengale pouvant générer un superoxyde en présence de l'oxygène dissout dans le milieu réactionnel, formant ainsi une fonction réactive pouvant participer à une cycloaddition avec la fonction dicyanomethanide du composé de formule (I) ou du composé (P14).

Fonctionnalisation et/ou qreffaqe de peptides et protéines

[053] La présente invention couvre également une méthode de fonctionnalisation d'une biomolécule de type peptides et/ou protéines (PT), incluant les enzymes et les anticorps, ou leur greffage sur un support solide. A cet effet, les composés de formule (I) sont mis en réaction avec un peptide ou une protéine (PT) comprenant au moins un tryptophane, de sorte à réagir avec le groupement indole du tryptophane. Les substituants R et R' représentent les acides aminés du peptide (PT) liés au tryptophane. Le peptide ou la protéine modifiée (III) peut alors être obtenue suite à la réaction du dipôle de formule (I) sur la double liaison de l'indole : (P2) (PT) (HI)

Plus particulièrement la fonctionnalisation peut s'opérer avec les composés de formule (I) ci-dessous (I) (PT) (III)

Où les substituants R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , et R ⁶ sont tels que décrits plus haut et où les substituants R et R' désignent les acides aminés des peptides ou proteine (PT) liés au trypthophane.

[054] Alternativement un composé tel que le composé P14 peut être impliqué dans la même réaction : [055] Selon un mode de réalisation, tous les sites d'une telle biomolécule (PT) accessibles au composé de formule (I) peuvent être fonctionnalisés de manière identique, avec un composés de formule (I) ou le produit (P14) dans lequel tous les groupes R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ et R ⁶ sont identiques pour chaque site.

[056] Selon un autre mode de réalisation, les sites de la biomolécule (PT) sont fonctionnalisés par deux ou plus de deux composés de formule (I) dont au moins l'un des groupes R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ et R ⁶ est différent d'un site de la biomolécule à l'autre. Un site de la biomolécule s'entend ici comme une fonction chimique propre à réagir avec un composé de formule (I) ou le composé (P14) ici décrits. En l'occurrence, un site peut être un tryptophane.

[057] L'un des groupements R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ et R ⁶ peut comporter un groupe réactionnel permettant de fixer la biomolécule fonctionnalisée (PT) sur un support solide. Par exemple, des supports solides tels que le verre, la cellulose ou des polymères d'acrylonitrile de butadiène et de styrène (ABS ; Acrylonitrile Butadiene Styrene) peuvent être utilisés. Selon les besoins, un ou plusieurs des groupes R ³ , R ⁴ ou R ⁶ peuvent être dérivés avec une amine. Dans le cas d'un support en verre, un ou plusieurs des groupes R ⁴ ou R ⁵ peuvent être dérivés par un silane de sorte à réagir avec la surface du verre.

[058] Les composés de formule (I) peuvent alternativement être mis en réaction avec le styrène (ST), pour conduire aux composés de formule (IV) suivant la réaction suivante : En particulier, les composés de formule (I) peuvent être mis en réaction selon le schéma suivant :

Où les substituants R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , et R ⁶ sont tels que décrits plus haut.

[059] Alternativement, le produit P14 peut être impliqué dans une telle réaction : [060] La double liaison du styrène sur laquelle réagit le composant de formule (I) peut être l'extrémité libre d'un support solide comprenant du polystyrène. En particulier, des microbilles de polystyrène peuvent être utilisées comme support solide. L'un ou plusieurs des groupes R ³ , R ⁴ , R ⁵ , R ⁶ peuvent être adaptés pour réagir avec une biomolécule ou une molécule à tester.

[061 ] De cette manière, un peptide ou une protéine peut être fixée de manière covalente sur le support au moyen du lien décrit ci-dessus via une réaction de cycloaddition. Dans le cas où la fonction dicyanométhanide de la molécule de formule (I) réagit sur la double liaison du support solide. L'un des substituants R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ et R ⁶ est choisit de sorte à pouvoir établir une liaison covalente avec un peptide ou une protéine.

[062] Des acides nucléiques tels que des oligomères d'ADN ou d'ARN peuvent également être fixés sur un support solide en utilisant le lien décrit ici. Dans le cas d'un oligomère d'ADN, la molécule de formule (I) peut être mise en réaction avec une ou plusieurs des bases thymines comprises dans l'ADN. Dans le cas de l'ARN, la molécule de formule (I) peut être mise en réaction avec une ou plusieurs des bases uracyl comprises dans l'ARN.

[063] Les réactions décrites ici, telles que la réaction des produits de formule (I) avec le styrène, le tryptophane, la thymine et l'uracile, peuvent être effectuées dans des conditions thermiques usuelles connues de l'homme de métier. Alternativement, une irradiation lumineuse peut être utilisées selon les besoins, telles qu'une irradiation UV ou UV-visible.

[064] Dans le cas où la fonction dicyanométhanide réagit avec le support solide, par exemple sur un groupe styrène, l'un ou plusieurs des groupes R ³ , R ⁴ , R ⁵ , R ⁶ peut être impliqué dans une réaction avec une biomolécule ou une molécule à tester. Tout type de réaction peut alors être envisagée, qu'elle soit sélective ou non d'un site particulier de la biomolécule ou de la molécule à tester.

[065] Sur un support solide donné, plusieurs zones peuvent être définies et un composé de formule (I) différent peut être greffé dans chacune des zones (voir figure 12). En l'occurrence, lorsque la fonction dicyanométhanide réagit avec le support solide, au moins l'un des groupes R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ et R ⁶ peut varier d'une zone à l'autre de sorte à réagir avec différentes biomolécules. Ainsi, plusieurs biomolécules se trouvent greffées sur un support.

[066] Alternativement, le lien de formule (I) peut être utilisé pour le couplage d'une biomolécule avec un une autre molécule selon les mêmes dispositions que décrit précédemment. Dans ce cas, la fonction dicyanométhanide réagit avec une base thymine, une base uracyl ou un tryptophane d'une biomolécule ou d'une molécule à tester et l'un ou plusieurs des groupes R ³ , R ⁴ , R ⁵ , R ⁶ réagissent avec l'autre molécule à coupler à la biomolécule. La molécule couplée peut être de du type peptide, protéine ou acide nucléique. La molécule couplée peut alternativement être une molécule synthétique telle qu'un polymère, éventuellement fonctionnalisé. Un tel polymère peut être par exemple un acide polyacrylique fonctionnalisé avec des allyls.

[067] La situation inverse est bien entendu également possible, dans laquelle la fonction dicyanométhanide réagit avec la molécule à coupler et l'un des groupes R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ et R ⁶ réagit avec une biomolécule ou une molécule à détecter.

[068] Selon un mode de réalisation particulier, l'un des groupes R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ et R ⁶ comporte une fonction dicyanométhanide de sorte que le lien de formule (I) comporte deux fonctions dicyanométhanide. Ainsi, le lien de formule (I) peut se coupler sélectivement à une base thymine, uracile, un tryptophane ou un styrène via l'une de ses fonctions dicyanométhanide et sélectivement a une base thymine, uracile, un tryptophane d'une autre molécule via sa seconde fonction dicyanométhanide.

[069] Selon un mode de réalisation, la molécule de formule (I) est en solution de sorte à réagir avec la surface solide ou une biomolécule ou une molécule à tester également en solution. Le composé de formule (I), lorsqu'il est libre, induit une couleur donnée à la solution, qui disparaît ou change lorsqu'il réagit avec la surface solide ou la biomolécule ou la molécule à tester. Le greffage du lien sur la surface ou la fonctionnalisation de biomolécules ou de molécules à tester peut alors être suivi visuellement. L'avancement ou la complétude de la réaction peut être déterminé via un dispositif optique ou en comparaison avec une échelle de couleur préalablement déterminée. Test diagnostique à base d'un e et test d'intolérance au lactose

[070] Selon un mode de réalisation, le diagnostic selon la présente description comprend une étape a) de fixation du composé (I) de manière covalente sur un support solide. La fixation s'effectue dans les conditions décrites plus haut.

[071] Selon un mode de réalisation, la fonction dicyanométhanide du composé de formule (I) est mise en réaction avec une insaturation du styrène d'un support comprenant du polystyrène, en solution, dans des conditions thermiques usuelles.

[072] Le test comporte une étape b) de réaction du composé de formule (I) avec un oligomère d'acide nucléique à greffer sur le support solide.

[073] Selon un mode de réalisation, un des groupements R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ o R ⁶ de préférence R ⁴ ou R ⁵ , est mis en réaction avec l'acide nucléique à fixer sur le support solide. Les deux étapes a) et b) peuvent être conduites dans cet ordre ou peuvent être inversées en fonction des besoins.

[074] Le test comporte une étape c) de reconnaissance de l'oligomère d'acide nucléique fixé sur le support solide par un oligomère complémentaire. Selon un mode de réalisation, l'oligomère complémentaire est simplement incubé sur le support greffé à une concentration de 0.5 pM dans un tampon physiologique (phosphate buffered saline) pendant 30 min à température ambiante. Ensuite, le support est rincé avec le tampon phosphate pour retirer l'excédant d'oligomère complémentaire.

[075] Le test comporte en outre une étape d) d'amplification permettant d'augmenter le signal à détecter.

[076] Le test comporte une étape finale e) de détection permettant de déterminer si l'oligomère complémentaire s'est effectivement fixé sur l'oligomère immobilisé sur le support solide. [077] Selon un mode de réalisation particulier, le test concerne un test diagnostic d'intolérance au lactose. A cet effet, une séquence de peptide acide nucléique (peptide nucleic acid (PNA)) complémentaire au polymorphisme LCT-13910 C/T de l'intron 13 du gène MCM6 est fixé sur un support en cellulose via l'un des groupe R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ o R ⁶ du composant (I) au moyen d'une fonction chimique photosensible. La séquence de peptide acide nucléique est alors greffée via la fonction dicyanométhanide du lien de formule (I). Un échantillon de sang du patient est prélevé et déposé sur le support solide comprenant la séquence peptide acide nucléique de sorte à vérifier la présence ou non d'une séquence complémentaire. Une étape d'amplification connue sous l'acronyme LAMP est effectuée et le test est lu.

Kit et test diaqnostique

[078] La présente description couvre la méthode de test décrite ci-dessus et les éléments du test diagnostique. Les éléments du test diagnostique peuvent être proposés sous forme de kit comprenant au moins un support solide. Plusieurs supports solides comprenant des matériaux différents tels que du verre, de la cellulose ou un polystyrène, peuvent être inclus et utilisables pour différentes applications. Alternativement ou en plus, un support solide peut comporter plusieurs zones prédéfinies et adaptées pour greffer différents type de molécules.

[079] Le kit comprend au moins une dose d'un produit de formule (I). Plusieurs doses peuvent être présentes, soit toutes identiques, soit comportant différentes quantités de produits de formule (I). Dans le cas où plusieurs doses sont présentes, elles peuvent contenir toutes le même produit de formule (I). Alternativement, une sélection de plusieurs produits de formule (I) différents peut être proposée, dans lesquels au moins un des groupes R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ o R ⁶ varie. Chacun des produits de formule (I) peut être préconisé pour une ou plusieurs applications spécifiques. Selon un mode de réalisation, les différents produits de formule (I) sont utilisés comme tests précurseur pour sélectionner le meilleur d'entre eux pour un opérer un diagnostique spécifique. [080] Le ou les produits de formule (I) peuvent être présentés sous toute forme adéquate, telle que sous forme de poudre à solubiliser ou déjà en solution.

[081] Le kit comporte au moins un biosenseur spécifique d'une biomolécule ou d'une molécule à tester. Plusieurs biosenseurs peuvent être proposés selon les besoins, pouvant être indépendamment sélectionnés parmi un peptide, une protéine, une enzyme, un anticorps, un acide ribonucléique, un acide désoxyribonucléique, ou tout équivalent fonctionnalisé ou additivé.

[082] Selon les besoins, le kit de test peut comporter un ou plusieurs produits tels que des anticorps, enzyme, ou indicateur coloré permettant d'identifier et éventuellement doser une biomolécule ou une molécule à tester.

[083] Le kit peut en outre comprendre un ou plusieurs accessoires tels que pipettes, vials ou récipients permettant de mettre en pratique le test.

[084] Le kit peut en outre comporter une notice ou des indications techniques à l'attention de l'utilisateur et permettant de mettre en œuvre le diagnostique et/ou d'en lire le résultat.

[085] Selon un mode de réalisation particulier, le kit selon la présente description comporte au moins un support solide dont la surface est pourvue de fonctions chimiques réactives adéquates, au moins une dose d'un produit de formule (I) pouvant réagir avec les fonctions chimiques du support et au moins un biosenseur comprenant au moins une fonction chimique pouvant réagir avec le composé de formule (I), où le composé de formule (I) est utilisé comme lien pour greffer le biosenseur sur le support. Le biosenseur peut être en particulier une séquence de peptide acide nucléique (peptide nucleic acid (PNA)) complémentaire au polymorphisme LCT-13910 C/T de l'intron 13 du gène MCM6. [086] Selon un autre mode de réalisation, le kit selon la présente description comporte au moins un support solide et un biosenseur greffé ou pouvant être greffé sur le support solide, au moins une dose d'un produit de formule (I) en solution ou pouvant être mis en solution et au moins un complexe révélateur pouvant réagir avec le composé de formule (I). En l'occurrence, le complexe révélateur peut être un anticorps primaire ou secondaire fonctionnalisé avec un polymère comprenant une ou plusieurs fonctions adaptées à réagir avec le composé de formule (I), en particulier avec la fonction dicyanométhanide du composé de formule (I) en solution. Par exemple, le complexe révélateur peut être un anticorps fonctionnalisé avec un acide polyacrylique comprenant des fonctions allyl accessible au produit de formule (I).

Utilisation du produit de formule (I) comme révélateur

[087] La figure 1 schématise un test PLISA dans lequel un composé de formule (I) selon la présente description est utilisé en solution comme indicateur coloré. Un biosenseur comprenant un épitope E est fixé sur une surface solide. Il peut être fixé par tout moyen déjà connu. Alternativement, le biosenseur peut être fixé au support solide au moyen d'un composé de formule (I), comme décrit ici. Un anticorps de détection, fonctionnalisé avec un polymère révélateur P, est associé à l'épitope E soit directement soit indirectement. Un composé de formule (I) en solution est mis en contact avec le polymère révélateur de sorte à réagir avec lui. La réaction du composé de formule (I) avec le polymère révélateur P s'accompagne d'une variation ou d'une disparition de la couleur de la solution. La couleur de la solution peut être visible directement ou dans le domaine de l'UV. Elle peut être mesurable par comparaison avec une échelle de couleur préétablie ou au moyen d'un dispositif optique adapté.

[088] Selon un mode de réalisation, un anticorps primaire A1 est apparié à l'épitope E et un complexe C formé d'un anticorps secondaire A2 fonctionnalisé avec un polymère P est associé à l'anticorps primaire A1 comme illustré dans la figure 1. Selon un autre mode de réalisation, un complexe C formé d'un anticorps fonctionnalisé par un polymère révélateur Pest directement apparié à l'épitope E. Le polymère fonctionnalisé peut être par exemple un acide polyacrylique pourvu de une ou plusieurs fonctions allyl accessible au produit de formule (I), en particulier à sa fonction dicyanométhanide.

[089] La méthode de test comporte ainsi une étape a') d'apparier un complexe C de détection formé d'un anticorps primaire A1 ou secondaire A2 fonctionnalisé avec un polymère de révélation P à l'épitope E d'un biosenseur fixé sur une surface solide.

[090] La méthode comporte une étape b') de mettre en solution un composé de formule (I) de sorte à le faire réagir avec le polymère de révélation P. Le composé de formule (I) peut être présent dans la solution à une concentration prédéterminée. Le composé de formule (I) peut induire une coloration de la solution. La couleur de la solution peut changer ou disparaître au cours de la réaction du composé de formule (I) avec le polymère de révélation P.

[091] La méthode peut comporter une étape c') de détection optique ou visuelle de la coloration de la solution de sorte à suivre la réaction et/ou doser la quantité de composé de formule (I) ayant réagi avec le polymère de révélation P.

[092] La méthode PLISA peut comporter une étape préalable d'étalonnage de la coloration en fonction de la concentration du composé de formule (I).

Elaboration d'un test de diagnostique

[093] La présente description porte en outre sur l'élaboration rapide et simple d'un test sur support solide sur la base d'un composé ou d'un ensemble de composés de formule (I). De préférence le ou les composés de formule (I) sont déjà disponibles et n'ont pas été produits spécifiquement pour l'occasion. [094] L'élaboration d'un tel test comprend une étape a") d'évaluation d'un ou plusieurs composés de formule (I) dans une réaction de couplage avec un biosenseur déterminé ou avec une biomolécule ou avec une molécule à tester. Selon un mode de réalisation, le biosenseur est un peptide ou une protéine comprenant au moins une insaturation libre d'un tryptophane, un acide déoxyribonucléique comprenant au moins une base thymine libre ou un acide ribonucléique comportant au moins une base uracile libre, et mis en réaction avec la fonction dicyanométhanide du ou des composé de formule (I). Selon un autre mode de réalisation, la molécule à tester comprend un polymère P comportant au moins une fonction chimique propre à réagir avec au moins l'un des groupes R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , R ⁶ ou dicyanométhanide du composé de formule (I). Par exemple, le polymère P peut être un acide polyacrylique fonctionnalisé avec des groupements allyl. De préférence, le groupe dicyanométhanide réagit avec les fonctions allyl du polymère P.

[095] L'étape d'évaluation peut comprendre une étape a1") de détermination de l'avancement ou la complétude de la réaction, par exemple au moyen d'une mesure colorimétrique ou par UV. De préférence, plusieurs composés de formule (I) sont utilisés, dans lesquels au moins un des groupes R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ ou R ⁶ varie. Les composés de formule (I) permettant les réactions les plus complètes ou les plus rapides peuvent être sélectionnés. D'autres critères que la cinétique ou le rendement de la réaction peuvent être pris en considération.

[096] Selon un mode de réalisation, plusieurs des groupes R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ ou R ⁶ sont adaptés à réagir sur un support spécifique tel que le verre, la cellulose ou le polystyrène. Ils peuvent être indépendamment les uns des autres libres ou bien protégés par un groupe protecteur. Dans ce dernier cas, une étape préalable d'activation de l'un ou plusieurs de ces groupes, par déprotection par exemple, doit être prévue si les composés doivent être greffés sur un support. De la sorte, les composés de formule (I), une fois couplés au biosenseur, peuvent être greffés sur différents supports. Alternativement, tous les composés de formule (I) comprennent une fonction chimique identique adaptée à greffer le composé correspondant sur un support adapté. En l'occurrence, l'un des groupes R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ ou R ⁶ peut comporter une telle fonction, telle qu'un silane ou une amine, et les autres des groupes R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ o R ⁶ peuvent être définis librement.

[097] Selon un mode de réalisation alternatif, plusieurs composés de formules (I), liés au biosenseur, sont greffés sur plusieurs zones distinctes d'un même support. Dans ce cas, l'un des groupes R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ ou R ⁶ destiné à réagir sur le support est identique pour l'ensemble des composés de formule (I) testés.

[098] Il est entendu que, inversement, la fonction dicyanométhanide peut être dédiée au greffage des composé de formule (I) sur un support en polystyrène et que les groupes R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ o R ⁶ peuvent être destinés à leur couplage avec des biomolécules ou des biosenseurs. Leur diversité permet ainsi d'optimiser l'adéquation du composé de formule (I), utilisé corne lien, au biosenseur ou à la biomolécule.

[099] Dans le cas où un composé de formule (I) est testé sur un polymère P tel que décrit plus haut, le greffage n'est pas nécessaire à l'élaboration du test diagnostique.

[100] Il est entendu qu'un ou plusieurs des composés de formules (I) peuvent indépendamment être évalués pour le greffage d'un biosenseur ou d'une biomolécule sur un support solide ou pour la fonctionnalisation d'un polymère P tel que décrit ci-dessus, ou pour les deux.

[101 ] L'étape d'évaluation peut comporter une étape de tests comparatifs a2"). Selon une mode de réalisation, les différents composés de formule (I) greffés au support et couplés au biosenseur, sont mis en contact direct ou indirect avec une biomolécule ou une molécule à tester. Des paramètres tels que la sensibilité, la fiabilité, la rapidité, la reproductibilité relatifs aux différents composé de formule (I) sont comparés. Les composés de formule (I) associés aux meilleurs résultats peuvent être identifiés et sélectionnés. Le suivi des réaction peuvent comprendre un test de colorimétrie ou une mesure optique dans le visible ou dans l'UV. [102] Selon un autre mode de réalisation, le polymère P forme avec un anticorps primaire A1 ou secondaire A2 un complexe de détection C d'un test de diagnostique, le complexe de détection étant lié directement ou indirectement à un biosenseur greffé sur un support solide. Les différents composés de formule (I), en solution, sont alors mis en contact avec ledit polymère P de sorte à réagir avec lui. Des paramètres tels que la sensibilité, la fiabilité, la rapidité, la reproductibilité relatifs aux différents composés de formule (I) sont comparés. Les composés de formule (I) associés aux meilleurs résultats peuvent être identifiés et sélectionnés. Le suivi des réaction peuvent comprendre un test de colorimétrie ou une mesure optique dans le visible ou dans l'UV.

[103] L'élaboration d'un test de diagnostique peut comporter une étape b") de sélection d'un ou plusieurs composés de formule (I) parmi les différents composés de formule (I) impliqués dans l'une ou plusieurs des étapes a"), a1") a2"). La sélection de tels composés peut prendre en considération l'un ou plusieurs des résultats des étapes a1") et a2"). Une pondération relative à l'une ou l'autre de ces étapes peut être considérée.

[104] Sur la base d'un nombre restreint de composés de formule (I) déjà disponibles, étant utilisés comme liens de greffage sur une surface, ou comme produit révélateur en solution sur un complexe de détection, un test de diagnostique spécifique à la molécule à tester peut être élaboré rapidement et présenter une bonne sensibilité et/ou fiabilité. Il n'est alors pas nécessaire de produire un lien ou un révélateur totalement nouveau pour chaque diagnostique.

[105] L'élaboration du test diagnostique peut en outre comporter une étape c") de produire de nouveaux composés de formule (I) en fonction des indications recueillies lors des étapes précédentes, de sorte à optimiser ou améliorer les performances du test. Notamment, l'un ou plusieurs des groupes R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ o R ⁶ peuvent être directement corrélés aux performance du composés de formule (I) pour une biomolécule donnée et optimisés en conséquence. [106] Selon un mode de réalisation, les résultats des tests sont stockés dans des bases de données de sorte à pouvoir faire l'objet d'analyses ultérieures. Selon un mode de réalisation, les bases de données peuvent être consultées par un programme d'intelligence artificielle et/ou de modélisation, de sorte à sélectionner et/ou produire des composés de formule (I) les plus adaptés à une biomolécule donnée.

Les modes de réalisations décrits ici n'ont pas vocation à être mutuellement exclusifs. Ils peuvent en l'occurrence se compléter, se chevaucher ou comporter des éléments communs. Ils peuvent être combinés totalement ou en partie dans la mesure des réalités pratiques.

Les différentes applications mentionnées ici, incluant la fonctionnalisation et/ou le greffage de peptides et protéines, le test diagnostique à base d'un oligomère d'acide nucléique, le test d'intolérance au lactose, tout autre test diagnostic, l'utilisation des composés selon la présente invention comme révélateur, l'élaboration d'un test diagnostic, peuvent être effectuées au moyen d'un ou plusieurs produit de formule (I) tels que définis plus haut. Alternativement ou en plus, ces applications peuvent être mises en œuvre au moyen de la molécule P14 ci-dessous : Exemples de tetracvanoethvlene (TCNEO)

Une solution de tetracyanoethylene (3.0 g, 34 mmol) dans 22 ml d'acétonitrile est refroidie à 5°C dans un bain d'acétone et de glace. 2.66 ml de peroxyde d'hydrogène (34 mmol) sont ajoutés goutte à goutte à une vitesse telle que la température du mélange reste comprise entre 10°C et 12°C. Le mélange est agité pendant encore 5 minutes après l'ajout du peroxyde d'hydrogène, puis dilué avec 150 ml d'eau glacée, de sorte à former un précipité solide blanc. Le précipité est séché sous vide et utilisé immédiatement.

Carbonitrile-2-phthalazinium (la)

Une solution S1 comprenant 130.2 mg (2 mmol) de cyanure de potassium dissous dans 2 ml d'eau déminéralisée et une solution S2 de 2.5 ml de chlorure de benzoyl (2 mmol) dans 3 ml de dichlorométane sont préparées. Dans un ballon tricol muni d'une trappe à gaz, 65,7 mg (2 mmol) de phthalazine sont dissous dans 1.5 ml de dichlorométhane, puis la solution S2 est ajoutée goutte à goutte sous agitation. La solution S1 est ensuite ajoutée goutte à goutte et le mélange réactionnel est agité pendant 12 heures à température ambiante. 10 ml d'une solution saturée de bicarbonate de sodium sons ensuite ajoutés et le produit est extrait avec 6 ml de dichlorométhane. La phase organique est séché par du sulfate de sodium, filtrée et le solvant est évaporée.

Phthalazinium-2-carboxylic acide (Ib)

Le composé carbonitrile-2-phthalazinium (la) est hydrolysé par de l'acide bromhydrique dans l'acide acétique. Pour ce faire, 10 ml du carbonitrile-2- phthalazinium (la) sont solubilisés dans l'acide acétique et 1 ml d'acide bromhydrique est ajouté goutte à goutte sous agitation. La réaction est agitée pendant 30 minutes à température ambiante, neutralisée par 3 ml NaOH 1 M, puis extraite avec 5 ml d'acétate d'éthyle. La phase organique est évaporée et le produit est purifié par trois recristallisations dans de l'éther froid.

Phthalazinium-2- acide 1,3-dipôle (I)

910 mg de Phthalazinium-2-carboxylic acide (Ib) sont dissous dans 40 ml d'acétate d'éthyle à une température inférieure à 0°C dans un bain de glace. La solution froide est traitée avec 5ml d'oxyde de tetracyanoethylene (TCNEO) (1.0 g, 7.0 mmol). Un précipité jaune se forme immédiatement et est collecté par filtration puis séché sous vide.

Spectroscopie FTIR : -COOH (3410 cm ¹ )

RMN ¹ H : Aromatiques 7,42-7,49(m, H1), 7,51-7-67 (m, H2, H3, H4), 8,16-8,19 (t, H5).

Spectrométrie de masse : M/z = 239

Couplaqe avec le trvptophane

1 mg de tryptophane (4.9 pmole) est ajouté à 2 ml d'eau déminéralisée, puis 500 pl d'une solution de 1.3 mg du composé phthalazinium-2- dicyanométhanide carboxylique acide 1,3-dipôle (I) (4.9 pmol) dans de l'eau déminéralisée sont ajoutés. Le mélange réactionnel est chauffé à 80°C pendant 9 heures et caractérisé par LC/MS.

1 mg de styrène (9.6 pmole) est solubilisé dans 1.5 ml d'eau déminéralisé, puis 500 pl d'une solution de 2.3 mg du composé phthalazinium-2- dicyanométhanide carboxylique acide 1,3-dipôle (I) (9.6 pmole) dans de l'eau déminéralisée sont ajoutés. Le mélange réactionnel est chauffé à 80°C pendant 9 heures et caractérisé par LC/MS. azine (P11)

Une solution composée de 0.465g de phthalazine sont dissous dans 24.6ml de POCI3 99% (262mmol, 82.2 eq) est chauffée à reflux pendant 5 heures. Ensuite la solution est neutralisée par 2M NaOH, extraite avec du diethyl éther, séchée par sodium de sulphate et concentrée par évaporation pour obtenir une masse de 0.42g de 1-chlorophthalzine. La réaction a été suivie par TLC (hexane/AcOEt 1 :1). Rendement = 80%. ine (P12)

Une solution composée de 0.1g de 1-chlorophthalazine (0.6 mmol, 1 eq) dans 5 ml de DMSO est ajoutée à une solution de 0.064g de methoxide de sodium (1.19 mmol, 2 eq) dans 0.3 ml de MeOH. La solution résultante devient rapidement orange foncé. Le mélange réactif est chauffé à 50°C pendant 24 heures et ensuite refroidi à température ambiante. Le produite est extrait à l'AcOEt, lavé avec une solution saturée de NaCI, séché sur du sulfate de sodium et concerté par évaporation. 78.8 mg du produit produit sont obtenus. Rendement = 82% ine (P13)

Une solution de 1g de phtalazine 3 (7,68 mmol) dans 7ml d'acide sulfurique 96% a été chauffée à 90°C. A cette solution brune, 3,7 g de KNO3 ont été ajoutés par portions pendant 30 minutes. La solution devient jaune clair. Le mélange réactionnel est agité pendant 16 heures. Ensuite, ile mélange réactionnel est versé sur de la glace, neutralisé avec une solution d'hydroxyde d'ammonium à 25%. Le précipité a été filtré, séché sous vide pour obtenir 0,785 g d'un solide jaune-beige. Rendement = 58,3 % des dérivés Phthalazinium-2-di -1- azine é P11 (valable aussi le dérivé et nitro

0.91 g de 1-chlorophthalazine (3.97 mmol, 1 eq) sont dissout dans 40 ml AcOEt et refroidi à 0°C dans un bain de glace. Une solution composée de 0.86 g de TCNEO (3.97 mmol, 1 eq) dans 5 ml de AcOEt est ajoutée goutte à goutte sur 2 minutes à la solution de 1-chlorophthalazine.

Le précipité jaune qui se forme est filtré et séché sous-vide pour obtenir 1.25g de poudre jaune. Rendement = 92%

Mesure de la cinétique de réaction avec l'allylamine

Les composés de formule (I), ainsi que le composé P14, sont utilisés comme indicateur d'avancement d'une réaction avec une biomolécule, une molécule synthétique ou un support solide. La fonction dicyanomethanide agit ici comme dipôle sur une double liaison, conduisant à une variation de l'absorbance du composé (I) mis en réaction.

Le groupement allyle est utilisé pour démontrer la réactivité des composés P14, P11 et P12 à température ambiante. La cinétique pour chacun des dérivés est mesurées par le suivi de la perte d'absorbance pour une concentration en allylamine de 7.82E-8 M et une concentration de 2.35E-5 M pour les composés P14, P11 et P12. Les figures 3a, 3b, 3c expriment le pourcentage de perte d'absorbance, en fonction du temps, où le suivi a été effectué à 409 nm pour le composé P14, 417 nm pour le composé P11 et 404 nm pour le composé P12.

Le composé P11 montre une réactivité et une stabilité adéquate avec l'allylamine. La stabilité de sa réaction a été démontrée par la répétition de celle-ci sur trois jours en suivant le même protocole. Le coefficient de variation (CV) calculé aux temps indiqués, montre des variations en dessous de 4% (tableau 2).

Tableau 2 : Conjugaison du composé P14 avec un peptide

La fonction dicyanomethanide d'un composé de formule (I) ou du composé 14 agit comme dipôle sur un tryptophane d'une peptide. Le peptide de séquence SEQ ID1 WSVGGRPPGFPPFRG (1 tryptophane terminal) a une masse attendue de m/z 1612.82. Le peptide est incubé à 80°C pendant 3h en présence de 1,1 eq de dérivé P14 utilisé comme dipôle, avec un spectre LC- MS mesuré à la fin de l'incubation. La figure 4 montre les différents spectres LC-MS obtenus pour le peptide seul (A), le dipôle seul (B) et le peptide incubé à 80°C pendant 3h en présence du dipôle (C). Une différence de masse de 177.98 +- 0.091 est mesurée entre le contrôle (A) avec le peptide incubé en présence de la molécule P14 (C). Ceci représente une différence de 18 Da entre la masse attendue du dérivé peptique et celle mesurée par MS. Cette différence est attribuée à la déshydratation partielle du peptide par le processus d'incubation à 80°C. Les spectres obtenus sont visibles sur la figure 4 avec le spectre MS mesuré pour les pics indiqués. Les masses mesurées sont listées pour chacun des échantillons dans le tableau 3.

Tableau 3 :

Polymer linked immunoassay (PLISA)

Synthèse du polymère modifié

Les composés de formule (I), ainsi que le composé P14 sont utilisés comme indicateur coloré dans un test immunologique. La réaction de la fonction dicyanomethanide comme dipôle sur les doubles liaison du polymère conduit à une décoloration de la solution.

Afin de conduire un test immunologique, le polymère commercial (acide polyacrylic, APA) de taille importante (450 KDa) est modifié avec de l'allylamine en présence d'un des composés Pl i, P12 et P14, utilisé comme colorant indicateur du suivi de la réaction, et un PEG-Azide pour la conjugaison du polymère à l'anticorps par chimie click, selon le protocole suivant :

Dérivation avec azide de APA

La réaction d'Ugi-Passerini a été réalisée afin de dérivatiser le polymère avec le linker Ald-PEG4-N3 par la formation d'une liaison amide. Ici, seul un petit excès de réactifs est ajouté afin de garder le contrôle sur la charge du linker, qui devrait être idéalement d'une unité par polymère. APA est d'abord solubilisé dans de l'eau distillée (37,5 ml), ce qui conduit à un pH acide de 2,73. Le pH a été corrigé à 4,85 avec du NaOH 5M. Ensuite, la méthylamine est ajoutée et le pH est corrigé à un pH de 6,95 avec du NaOH 5M.

L'isocyanure de tert-butyle est ajouté, le pH est augmenté à 7,13 et l'Ald- PEG4-N3 est ajouté à la solution température ambiante pendant 17h. A la fin de l'incubation, une légère diminution du pH a été mesurée vers 6,92 (Delta pH -0,18), attribuée à la consommation de méthylamine au cours de la réaction conduisant à une liaison amide.

Modification allylique de APA-Azide

La solution de polymère à pH 6,92 (37 ml, 10,52 mg/ml de polymère) est utilisée pour la conjugaison allylique. 1,491 g d'EDAC sont dissous dans la solution et le pH est corrigé à 5,7 avec HCl 5%. La diminution du pH s'accompagne d'une augmentation drastique de la turbidité, qui est devenue presque gélatineuse.

584 pl d'allylamine sont ajoutés à la solution, augmentant le pH jusqu'à 9,0, la solution redevenant claire. Le pH est corrigé à 5,93-6 avec HCl 5%, accompagné d'une augmentation de la turbidité et de l'apparition de petits agrégats facilement dissolu par agitation.

La solution visqueuse est incubée à température ambiante sous agitation pendant 24h. Après l'incubation, la solution est redevenue claire avec un pH plus acide atteignant 5,08. La diminution du pH vers des valeurs plus acides est un phénomène rapporté pour le couplage par l'EDC dans des solutions non tamponnées. Dans notre cas, ce phénomène est attribué à la consommation de l'allylamine et de l'EDC. Pour stopper la réaction, 2 ml de Tris 1 M pH7.5 ont été ajoutés à la solution et incubé pendant 5 minutes.

Les molécules n'ayant pas réagi sont éliminées par extraction avec de l'éther diéthylique (4 x 40 ml), conditions dans lesquels le polymère précipite partiellement. La solution devient légèrement trouble après l'extraction, et redevient claire après évaporation des résidus de solvant organique dissous dans l'eau. La solution visqueuse (30 ml) est lyophilisée.

Après lyophilisation, une pastille collante est récupérée pesant 945 mg.

La caractérisation du polymère est réalisée par FTIR-ATR (spectroscopie infrarouge transformée de Fourier, réflectance totale atténuée) sur un instrument Jasco FTIR 6100 System. Les spectres ont été pris sur le polymère lyophilisé après dérivatisation chimique et ont été comparés au polymère non traité (Fig. 5). La formation de liaison amides en remplacement des carboxyles de l'APA est montrée par la FTIR. La comparaison montre le déplacement du pic du carbonyle à 1600 cm-1 vers 1520 et 1550 cm-1 , appelés amides I et II, respectivement, reflète la formation de la liaison amide par les groupements allylamine. Ceci est également vrai pour les liaisons amide formées par la réaction d'Ugi-Passerini, mais avec une contribution mineure due à la faible quantité de PEG4-azide confrontée à l'allylamine. Le signal large à 3000 cm-1 est attribué aux groupes hydroxyles impliqués dans les unités carboxyliques portées par le polymère. La forte atténuation de ce signal est également liée à la formation de liaisons amides par l'allylamine lorsque des groupes hydroxyles sont impliqués. Les signaux situés entre 2700- 3000 cm-1 sont attribués aux vibrations d'étirement C-H générées par l'ajout de groupes allyles au polymère. Le signal à environ 3300 cm-1 est attribué à l'étirement N-H de l'amine secondaire de l'amide qui a été formé.

Dérivatisation d'un anticorps l'anticorps est préparé pour sa fixation au polymère par dérivatisation avec le groupement BCN qui réagit par chimie click avec le polymère.

Ajout du groupement BCN à l'anticorps Afin d'atteindre 10 eq BCN-NHS, 291,3 pl de B sont ajoutés à la solution A suivi d'une incubation à température ambiante pendant 1 h sous agitation (rotateur Stuart). L'ajout de B représente une dilution de moins de 10 %, soit une concentration finale d'anticorps de 0,911 mg/ml contenant 0,8 % de DMSO. La réaction est arrêtée par une incubation de 20 minutes avec 1 i de Tris pH7.5 1 M ajouté à la fin de l'incubation. La purification a été réalisée par filtration avec un filtre à spin 30K MWCO pendant 15 min à 4000g-1 à 4°C. A partir d'un volume de départ de 3 ml, 200 pl ont été obtenus à la fin de la centrifugation. L'échantillon a ensuite été remis en suspension dans 3 ml de PBS et la centrifugation a de nouveau été effectuée dans les mêmes conditions. L'opération a été répétée 3 fois. Le signal UV-VIS pris à 280 nm montre une perte discrète d'anticorps au cours du processus de purification évaluée à moins de 5 %.

Caractérisation de l'anticorps dérivé

La spectrométrie LC-MS est réalisée au moyen d'un spectromètre de masse à haute résolution (HRMS) Q Exactive plus hybrid quadrupole-orbitrap device couplé à un système UHPLC ultimate, tous deux de Thermo Fisher. La colonne chromatographique est de type acquity UPLC Protein BEH C4, 300 Â, 1,7pm, 2,1x50 mm des eaux avec une phase mobile composée de A) 0,1 % d'acide formique dans l'eau et B) 0,1 % d'acide formique dans l'acétonitrile. Le gradient est de 20-50% B en 2,75 min à 500 pl/min à une température de colonne de 40°C. La résolution HRMS est réglée sur la valeur la plus basse (c'est-à-dire 17k) pour éviter la collision et la fragmentation du mAb dans la cellule d'orbitrap, ce qui entraînerait une perte de sensibilité. En outre, la tension dans la pile API a été augmentée à 70 V avec un niveau RF de 90 pour la lentille S afin d'améliorer la transmission du mAb. Les anticorps intacts et leurs dérivés ont été mesurés dans du PBS sans réduction par le DTT en raison de la présence d'isoformes susceptibles de compliquer l'interprétation.

Les figures 2a, 2b, 2c montrent les spectres MS déconvolué du (A) contrôle de qualité et mAb d'étalonnage fournis par Roche, (B) mAb13-18 natif et (C) mAb13-18 dérivé avec la partie BCN. La déconvolution a été réalisée avec le logiciel UniDev V.6.0.1 de Marty et al. (Anal. Chem., 2015, DOI 10.1021/acs.analchem.5b00140) en utilisant les paramètres indiqués en annexe. Le spectre A montre une distribution très étroite du signal autour de 149 Kda qui s'étend avec mAb13-18, indiquant la présence de plusieurs isoformes de l'anticorps avec des masses allant de 14'7092 Da à 148'597 Da. L'anticorps mAb13-18 sous sa forme native et dérivée présente des profils de pics différents, très probablement en raison de la dérivatisation réussie avec la partie BCN.

En comparant les masses déconvoluées d'intensités similaires, une différence de masse allant de 150 à 200 Da est observée, ce qui correspond à la dérivatisation de l'azide. En outre, en calculant le décalage m/z attendu dû à l'ajout de 177 Da pour un ion 50+ de l'IgG intacte (environ 148 kDa), la différence m/z devrait être d'environ 3,54u. La figure 7 montre que les spectres MS autour de m/z 2960 présentent des schémas similaires avec le décalage m/z attendu de 3,5u. modifié

L'APA dérivé avec des groupes azides et l'anticorps avec BCN réagissent spontanément lorsqu'ils sont mélangés par chimie click. Pour cette réaction, l'objectif est de 2 polymères par anticorps, donc 2 équivalents de solution mère de polymère sont ajoutés.

945 mg de polymère modifié sont solubilisés dans 15 ml d'eau déminéralisée (63 mg/ml). L'absorbance UV-Vis a été mesurée dans la gamme de 500-600 nm pour évaluer la présence d'agrégats dans la solution et aucun signal n'a été observé. Après dissolution du polymère, le pH mesuré à une valeur de 5,45 et corrigé à pH 7,31 avec NaOH 5M. La conjugaison est ensuite initiée en mélangeant le volume entier d'anticorps dérivé comprenant le BCN avec le polymère modifié, en ajoutant 490 ul de polymère à 63 mg/ml (1,02 eq) et en agitant pendant 48 heures à 4°C.

Caractérisation du re

Un gel SDS-PAGE a été réalisé sur le conjugué généré sans colorant de gradient 4-15% fourni par Bio-Rad (Figure 8). Les images ont été prises avec une caméra Bio-rad ChemiDoc MP. Le conjugué est exclu du gel en raison de sa taille importante (>1MDalton). Par conséquent, seuls les anticorps non liés migrent, ce qui est une indication de l'efficacité du couplage. Un signal très faible est observé pour les conjugués, ce qui indique un faible niveau d'anticorps n'ayant pas réagi et une bonne performance de réaction par rapport à l'anticorps natif à la même concentration. Le rendement de la réaction est estimé à 88% en quantifiant la densité des bandes pour les conjugués et en les comparant à l'anticorps natif correspondant, à l'aide du logiciel image J.

Test immunologiques avec ère

Test immunologiques avec échantillon reconstitué

Le test immunologique est conduit par une approche ELISA standard sauf que le conjugué enzyme-anticorps utilisé est le conjugué polymère-anticorps décrit ci-dessus. A la place de mesurer la formation d'une coloration, nous mesurons la consommation du colorant (un produit de la formule (I) ou le produit P14) par le polymère conjugué. Ainsi la concentration est exprimée en fonction de la vitesse de consommation du colorant où la différence d'absorbance dans un intervalle de temps t est mesurée et la relation suivante est appliquée Vitesse=1000*(Delta Abs/Delta t). Ici le temps de réaction est de 15 minutes.

Le principe est utilisé pour la quantification de IFN de souris en utilisant le kit commercial (Thermo Fisher, BMS326) et est comparé au test ELISA standard qui est effectué en parallèle. La figure 8 montre la comparaison des quantifications effectuées où la réponse en fonction de la concentration est exprimée en vitesse de consommation pour PLISA et de l'absorbance du colorant pour ELISA.

Test immunologiques avec échantillons de patients quantifiés en laboratoire clinique

Des échantillons de sérums humains ont été soumis à la quantification par PLISA et comparés à ELISA. Un kit commercial pour la quantification des lipoprotéines de haute densité (Thermo Fisher High-density Lipoprotein Cholesterol (HDL-C) Colorimetric Assay Kit, référence: EEA012) est utilisé avec le conjugué ici-décrit, sur des échantillons humains. Ces échantillons ont été quantifiés par un laboratoire certifié (Cerba) sur un instrument Abbott avec un kit Alinity c Ultra HDL d'Abbott. La corrélation entre le test certifié et le protocole ici-décrit est de 99% sur un panel de 84 patients, distribués ainsi: 12 concentrations différentes avec 7 patients par concentration. Ici le sérum de patients a été dilué 10x sur la plateforme PLISA. La vitesse de réaction est déterminée sur un intervalle de temps de 15 min.

Réaction avec les su

Les composés dipolaires de formule (I), ainsi que le produit P14, réagissent rapidement avec des superoxides générés par le colorant Rose de Bengal (RB) à partir de l'oxygène dissout naturellement dans l'eau. Le schéma ci-dessous présente la réaction de formation d'endoperoxides par les superoxides réagissant sur un produit de formule (I) ou sur le produit (P14) par simple mélange. La réaction est illuminée par de la lumière verte (550nm).

L'efficacité de la réaction en fonction de l'intensité en lumière verte est testée pour le composé P14 où une augmentation significative du rendement, inversement proportionnel à l'intensité du rayonnement est observé (figure 10a). Une LED commerciale verte et une lampe à mercure (120 W) équipée d'un filtre pour ne laisser passer que la lumière verte ont été comparées avec une meilleure réponse pour la LED (6W), ceci en adéquation avec l'effet de l'intensité lumineuse sur la réactivité (figure 10b).

Les produits P11 et P12 sont aussi comparés aux performances du composé P14 en utilisant uniquement la LED verte. Ici le dérivé P12 offre la meilleure réponse (figure 11a). Les conditions utilisées sont : [RB] = 6.67E-8 M, [composé P14] = 2.34E-5 M, [composé Pl i] = 2.34E-5 M et [composé P12] = 2.34E-5 M à une température de 25°C dans une solution composée d'un mélange d'eau et d'acetonitrile (4:6). La corrélation entre la décoloration et la réaction des superoxides est montrée par la diminution de la réactivé lorsque la solution aqueuse est d'abord traitée à l'azote afin de diminuer la quantité d'oxygène dissous (figure 11 b).

Le composé (I) ou le composé P14 est ainsi utilisé pour l'immobilisation de l'amorce qui permettra l'amplification par LAMP. Les amplicons obtenus comportent des groupements fluorescents (Cy5) dont l'intensité du signal fluorescent peut être quantifiée.

Alternativement, le rose de bengal peut être lié à un Peptide Nucleic Acid (PNA) tel que « PNA beacon hairpin ». Sans polymorphisme le complexe reste "fermé" laissant le rose de bengal inactivé. En présence d'un polymorphisme, le complexe s'"ouvre'', permettant au rose de bengal de réagir sur un composé de formule (I) ou sur le composé (P14). Cette approche permet une détection directement en solution, sans nécessairement immobiliser un amplicon sur une surface. En outre, le système est grandement simplifié, car seulement le complexe PNA/Rose de bengal et le colorant sont utilisés sans i) séquences d'ADN et ii) ni enzyme. Selon cette approche, le composé de formule (I) ou le composé (P14) sert de révélateur. Réaction avec des surfaces d'im d'un test immunologique

La fonction dicvanomethanide des composés de formule (I) ainsi que du composé P14 peut réaqir avec une insaturation d'un support solide. Le dérivé carboxylique P1 est utilisé pour la fonctionnalisation de l'Acrylonitrile Butadiene Styrene (ABS) où l'insaturation du polymère est utilisé pour faire réagir un produit de formule (I) ou le produit P14 comme dipôle et créer une cyclisation.

Le test immunologique préparé est basé sur un sandwich avec un anticorps de capture immobilisé à la surface puis l'anticorps secondaire pour la reconnaissance et un anticorps de détection marqué avec un fluorophore Alexa 488 pour la quantification. L'immobilisation de l'anticorps de capture se fait par l'activation préalable du groupement carboxylique du dérivé P2 cyclisé qui réagira avec les groupements amine de l'anticorps pour former une liaison amide, résultant à la liaison de l'anticorps sur le support solide. La démonstration du fonctionnement de l'approche a été conduite en détectant le sida (HIV), l'hépatite C (HCV) et le virus T-lymphotropique humain 1 (HTLV) sur des échantillons de sérum humain.

Préparation du biosenseur pour la détection d'anticorps contre les virus HIV, HTLV et HCV

Une surface d'ABS de 2 x 2 cm est immergée dans 10 ml d'une solution composée de 1mg de la molécule P1 dans un mélange d'eau et d'acetonitrile (2:8). La solution est incubée à 50°C durant 12h suivi d'un nettoyage avec de l'eau et de l'éthanol. La surface est séchée et incubée dans un mélange d' EDC (200mM)/NHS (50mM) dans un tampon MES pH 6 durant 2h. La surface est lavée avec le tampon MES et de l'eau déminéralisée avant d'être séchée.

Les anticorps de capture (1 g/ml dans du PBS 1x pH7.4 + 0.05% tween) sont déposés grâce à un instrument (nanospotter), formant un spot composé de 25 gouttes de 500 pL (figure 14) pour un volume total de 12,5 L. Le gouttes sont déposées selon le schéma de la figure 12 où trois bloques de 8 spots sont préparés pour chacune des cibles, respectivement bloque 1 = anti-abHCV, bloque 2 = anti-abHTLV et bloque 3 = anti-abHIV. La surface est spottée et incubée 2h dans un environnement saturé en humidité. Après lavage de la surface avec PBS 1x + 0.1 % tween + 2% BSA, celle-ci est bloquée par incubation dans le même tampon pendant 3h. La surface est finalement lavée avec du tampon (50 mL) PBS 1x pH7,4 + 0.1 % tween et de l'eau déminéralisée (20 mL) avant d'être séchée.

Test immunoloqique

Le test immunologique est conduit en utilisant des échantillons de sérum humains certifiés par le National Institute for Biological Standards and Controls (NIBSC, UK) positifs à l'HCV, le HIV et le HTLV et un contrôle négatif pour les trois pathologies. Un biocapteur par pathologie ainsi qu'un contrôle sont réalisés de manière identiques (total 4 biocapteurs). Les biocapteurs sont montés sur des supports formant des puits pour chacun des spots (24 puits). Dans chacun des puits, 100 pL de serum non dilué est ajouté puis incubé à température ambiante pendant 2h. Chaque puit est lavé 5x avec 200 pL de PBS 1x + 0.1 % tween + 2% BSA. Après le dernier lavage, la surface est retournée est tapotée afin de retirer le reste de liquide du puit. 100 pL d'anticorps secondaire (1 ug/mL) sont ajoutés dans chacun des puits et incubés pendant 1 heure à température ambiante. Les puits sont vidés et le support est démonté et la surface est lavée avec du PBS 1x + 0.1 % tween + 2% BSA (50 mL). Ensuite la surface est immergée dans un solution (5ml) de PBS 1x pH7.4 + 0.05 % tween contenant l'anticorps fluorescent (polyclonal anti-Rabbit IgG Alexa fluo488) à 1 pg/ml pendant 2h sous une faible agitation. Comme tous les anticorps primaires sont exprimés dans le lapin, un seul anticorps secondaire suffit. La surface est ensuite lavée avec PBS 1x + 0.05% tween avant la mesure de l'intensité de fluorescence (figure 13).

Test génétique de l'intolérance au lactose

Le test génétique de l'intolérance au lactose est préparé suivant la technique LAMP, permettant d'identifier les polymorphismes liés à l'intolérance au lactose, de la manière suivante : 1. Préparation de la surface avec immobilisation d'une séquence d'ADN spécifique qui agit comme amorce de la LAMP. Ici la même approche que pour l'anticorps est appliquée où l'anticorps est remplacé par une séquence d'ADN possédant une amine en position 5'. La goutte est déposés à l'aide d'une micropipette

2. Extraction de l'ADN à partir d'un écouvillon buccale

3. LAMP sur la surface

4. Lavage et mesure de la fluorescence généré par les amplicons immobilisés à la surface

Afin de déterminer l'intolérance au lactose, la présence de l'allèle T en position 13'910 du gènes MCM6, exclusivement lié à la perte d'activité de la lactase, est analysée.

Préparation du biocapteur

Une surface d'ABS de 2 x 2 cm est immergée dans 10 ml d'une solution composée de 1mg du composé P1 (dérivé carboxylique, composé P1) dans un mélange d'eau et d'acetonitrile (2:8). La solution est incubée à 50°C durant 12h suivi d'un nettoyage avec de l'eau et de l'éthanol. La surface est séchée et incubée dans un mélange de EDC (200mM)/NHS (50 mM) dans un tampon MES pH 6 durant 2h. La surface est lavée avec le buffer MES et de l'eau déminéralisée avant d'être séchée.

Ensuite 25 pmoles d'ADN LB dans 0.5 pL de tampon SSC (0.75 M NaCl + 0.075 M sodium citrate) sont déposés pour chaque spot à la main avec une micropipette. La surface spottée est incubée 2h dans un environnement saturé en humidité. Après lavage de la surface avec le tampon SSC, celle-ci est bloquée par incubation dans le tampon SSC 5x pH7.5 + 0.1 % tween + 1 % BSA pendant 3h. La surface est finalement lavée avec du tampon (50 mL) SSC et de l'eau déminéralisée stérile (20 mL) avant d'être séchée. Test génétique de l'intolérance au lactose

Les échantillons humains ont été collectés par écouvillon buccal (Isohelix, SK- 2S) et l'ADN est extrait en utilisant le kit NucleoSpin Tissue (Macherey et Nagel) où toutes les étapes fournies par le producteur ont été suivies. La concentration d'ADN est mesurée par nanodrop et la concentration ajustée à 20 ng/pl. L'ADN purifié est soumis à l'amplification par LAMP sans correction de la concentration. 5 pL d'ADN purifié sont utilisés pour les réactions d'amplification, où la LAMP a été conduite conformément aux instructions du fabricant du kit LavaLAMP DNA Components (Lucigen #30076-1). Les composants LAMP en solution sont mélangés en présence de la surface solide contenant la séquence LB immobilisée et incubé à 68°C pendant 30 min.

SEQ-ID 2 : 5'-GGGGAGTAGTACGAAAGGG-3'

SEQ-ID 3 : 5'-TCCACGAGGATAGGTCAGTGGAAGATGGGACGCTTGAA-3' SEQ-ID 4 : 5'-TCCACGAGGATAGGTCAGTGGAAGATGGGACGCTTGAA-3'

SEQ-ID 5 : 5'-TGCAGGGCTCAAAGAACAATCTAACTGGCCTCAAAG-GAACTC-3' SEQ-ID 6 : 5'-TAAAACTAGGAAAACGCAGG-3'

SEQ-ID 7 : 5'-GGCAATACAGATAAGATAATGTAGT-3'

Après 30 min de réaction d'amplification, le support solide est retiré et lavé avec du tampon SSC 5x (20 mL). La fluorescence des amplicons fluorescent Cy5 immobilisés, est mesurée sur un instrument Fluochem M (figure 15). Ici seul la détection de l'allèle T est opérée, car il est spécifiquement lié à la perte d'activité de la lactase. Ici 6 patients (3 positifs : allèle T et 3 négatifs : allèle C) ont été testés et le résultat comparé au test préalablement effectué dans un laboratoire certifié. Les résultats obtenus avec l'approche LAMP sont totalement corrélés avec ceux obtenus par le laboratoire central.