Phytase présentant une arginine dans son site catalytique pour l'hydrolyse de l'acide phytique en monophosphate inorganique et en myo-inositol libre

L'invention concerne l'utilisation d'une phytase comprenant une arginine dans son site actif pour la fabrication d'un additif nutritionnel ou d'un aliment pour animaux.

Les phytases sont des enzymes qui catalysent l'hydrolyse de l'acide phytique (myo-inositol hexakisphosphate, InsP ₆ ) en monophosphate inorganique, en myo-inositol phosphate de degré de phosphorylation inférieur (ImP ₅ à InsPi) et en myo- inositol libre dans certains cas. Selon la nomenclature officielle sur les enzymes du Comité de l'Union Internationale de Biochimie (IUPAC-IUB, 1977), les phytases font partie des hydrolases capables d'hydrolyser les liaisons phosphomonoester (EC 3.1.3) et sont classées en 3-phytase (EC 3.1.3.8), 6-phytase (EC 3.1.3.26) et 5-phytase (EC 3.1.3.72) en fonction du premier groupement phosphate de l'acide phytique hydrolyse (la position 2 du cycle est attribuée au carbone porteur de la liaison axiale, l'acide phytique possédant cinq de ses groupements phosphates en position équatoriale et le dernier en position axiale).

L'acide phytique et les phytates sont la forme majeure de stockage du phosphore dans les céréales, les plantes légumineuses et oléagineuses. Ils constituent la source principale de phosphore des aliments pour animaux à base de plantes, notamment les animaux monogastriques (volailles et porcs). Cependant, les animaux monogastriques ne possèdent pas suffisament d'enzymes intestinales permettant la dégradation de l'acide phytique et des phytates pour fournir les quantités de phosphate inorganique qui leur sont nécessaires. En outre, l'acide phytique est un facteur antinutritionnel, qui forme des complexes avec les protéines et les ions (Fe ⁺ , Ca ⁺ , Zn ²⁺ , Mg ²⁺ ) et diminue donc les disponibilités des protéines et des ions.

Les rations alimentaires des animaux monogastriques doivent donc être supplémentées en phosphate inorganique, alors que le phosphore contenu dans l'acide phytique et les phytates est excrété et contribue à l'eutrophisation des eaux de surface dans les zones d'élevage intensif d'animaux monogastriques.

La complémentation des rations des animaux monogastriques par des enzymes est une solution actuellement employée pour améliorer la biodisponibilité du phosphore contenu dans l'acide phytique et les phytates et pour diminuer la supplémentation des aliments avec du phosphore inorganique et réduire ainsi l'excrétion de phosphore dans les zones d'élevage intensif.

Les phytases qui sont utilisées comme additif en alimentation animale, permettent d'une part d'augmenter la disponibilité du phosphore phytique, d'autre part d'améliorer la digestibilité des aliments. De plus, la libération de phosphate phytique diminue considérablement les coûts dus à la supplémentation en phosphate, ainsi que la pollution provoquée par un excès de phosphates excrétés.

Les phytases sont notamment présentes dans les microorganismes, en particulier les champignons, les bactéries et les levures. Parmi les champignons, on citera notamment les genres Aspergillus {Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Aspergillus fumigatus), Pénicillium, Mucor et Rhizopus. Tous les champignons producteurs de phytase extracellulaire sont des champignons filamenteux. Des champignons filamenteux comme Peniophora lycii, Agrocybe pediades ou Trametes pubescens produisent également des phytases. Parmi les bactéries, on peut citer Pseudomonas sp., Klebsiella sp., Escherichia coli, Enterobacter sp., Bacillus subtilis, Aerobacter aerogenes, Bacillus amyloliquefaciens . Les genres Bacillus et Enterobacter produisent une phytase extracellulaire. Parmi les levures, on peut citer Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Torulopsis candida, Debaryomyces castellii, Debaryomyces occidentalis, Kluyveromyces fragilis, Schwanniomyces occidentalis et Schwanniomyces castellii. Selon la nouvelle classification (Nakase T., Suzuki M., Phaff HJ. and Kurtzman C.P., 1998 pi 57-167 in C. P. Kurtzman and J.W. FeIl (ed), The Yeasts, A taxonomic study, 4 ^eme Ed. Elsevier Sci. Publication Amsterdam), Schwanniomyces castellii Capriotti est synonyme de Schwanniomyces occidentalis Kloker et de Debaryomyces occidentalis Klocker var. occidentalis.

De nombreuses phytases de microorganismes ont été étudiées. Néanmoins, la plupart des phytases décrites à ce jour n'hydrolysent que partiellement l'acide phytique et les phytates et certaines avec des cinétiques très lentes.

A ce jour, parmi les levures, seule la phytase de la levure Schwanniomyces occidentalis a été décrite comme hydrolysant tous les groupements phosphate du phytate (EP 0 699 762 ; Segueilha L., Lambrechts C, Boze H., Moulin G., Galzy P., (1992) Purification and properties of a phytase from Schwanniomyces castelliii, J. Ferm. Bioeng., 74, 7-1 1). D'après EP 0 699 762, la phytase de Schwanniomyces occidentalis est sensible aux cations (ZnCl ₂ et CuCl ₂ notamment) ce qui n'est pas favorable à une utilisation en alimentation animale car ces cations sont présents dans le bol alimentaire (Segueilha et ai, 1992).

Les inventeurs de la présente invention ont précédemment étudié et caractérisé la phytase de la levure Debaryomyces castellii (demande de brevet

PCT/FR06/001652). Cette phytase est capable d'hydrolyser la totalité des groupements phosphates de l'acide phytique ou du phytate jusqu'à libération du myo-inositol.

Les inventeurs ont mis en évidence l'origine de cette activité, c'est-à-dire de l'hydrolyse de l'acide phytique et les phytates jusqu'à libération du /wyo-inositol.

Cette activité réside dans l'existence d'un acide aminé déterminé en position 211, en l'espèce une arginine. La présente invention propose des peptides présentant une activité phytase, hydrolysant tous les groupements phospate du phytate et dont l'activité dépend peu des conditions de mise en œuvre de l'enzyme. Ce peptide comprend une arginine en position 211 de sa séquence peptidique, la position des acides aminés étant définie par rapport à la séquence peptidique de la phytase de

Debaryomyces castellii selon SEQ ID NO: 1.

Description des séquences

SEQ ID NO: 1 : Séquence de la phytase de Debaryomyces castellii CBS 2923.

SEQ ID NO:2 : Séquence génomique du gène de la phytase de Debaryomyces castellii

CBS 2923. SEQ ID NO:3 : Séquence consensus des phosphatases acides.

SEQ ID NO:4 : Motif de la phytase de Debaryomyces castellii correspondant à la séquence consensus des phosphatases acides de la SEQ ID NO:3.

SEQ ID NO : 5 : Séquence de la phytase de Aspergillus niger (numéro d'accession

NCBI AAS00648) SEQ ID NO : 6 : Séquence de la phytase de Peniophora lycii numéro d'accession NCBI

: CAC48195)

SEQ ID NO:7 : Séquence de la phosphatase de Schizosaccharomyces pombe (numéro d'accession NCBI : CAAl 8863)

SEQ ID NO:8 : Séquence de la phosphatase de Schizosaccharomyces pombe (numéro d'accession NCBI : CAA40258)

SEQ ID NO:9 : Séquence de la phosphatase de Schizosaccharomyces pombe (numéro d'accession NCBI : CAB68657)

SEQ ID NO: 10 : Séquence de la phosphatase de Schwanniomyces occidentalis

CBS2863 (numéro d'accession NCBI : CAB70441 ) SEQ ID NO: 1 1 : Séquence de la phosphatase de Candida albicans (numéro d'accession

NCBI : XP_713452)

SEQ ID NO: 12 : Séquence de la phosphatase de Candida albicans (numéro d'accession

NCBI : XP_718379)

SEQ ID NO: 13 : Séquence de la phosphatase de Kodamaea ohmeri (numéro d'accession NCBI : ABU53001) SEQ ID NO: 14 : Séquence de la phosphatase de Debaryomyces hansenii (numéro d'accession NCBI : XP 460696)

SEQ ID NO: 15 : Séquence de la phosphatase de Debaryomyces hansenii (numéro d'accession NCBI : XP 458051)

SEQ ID NO: 16 : Séquence de la phosphatase de Candida albicans (numéro d'accession NCBI : XP 722801)

SEQ ID NO: 17 : Séquence de la phytase de Pichia stipitis (numéro d'accession NCBI :

XP OOl 385026)

SEQ ID NO: 18 : Séquence de la phosphatase de Pichia guilliermondii (numéro d'accession NCBI : XP 001485772) SEQ ID NO: 19 : Séquence de la phytase de Pichia stipitis (numéro d'accession NCBI :

XPJ)Ol 385109)

SEQ ID NO: 20 : Séquence de la phytase de Debaryomyces hansenii (numéro d'accession NCBI : XP 460696)

SEQ ID NO: 21 : Séquence de la phosphatase de Kluyveromyces lactis (numéro d'accession NCBI : CAA83964)

SEQ ID NO: 22 : Séquence de la phosphatase de Kluyveromyces lactis (numéro d'accession NCBI : XP 451007)

SEQ ID NO: 23 : Séquence de la phosphatase de Saccharomyces cerevisiae (numéro d'accession NCBI : NP 009434) SEQ ID NO: 24 : Séquence de la phosphatase de Saccharomyces cerevisiae (numéro d'accession NCBI : NP O 12087)

SEQ ID NO: 25 : Séquence de la phosphatase de Saccharomyces cerevisiae (numéro d'accession NCBI : NP 009650)

SEQ ID NO: 26 : Séquence de la phosphatase de Saccharomyces cerevisiae (numéro d'accession NCBI : NP 009651 )

SEQ ID NO: 27 : Séquence de la phytase de Pichia angusta (numéro d'accession

NCBI : ACC62537)

SEQ ID NO: 28 : Séquence de la phytase de Pichia pastoris (numéro d'accession NCBI

: P52291) SEQ ID NO: 29 : Séquence de la phosphatase d'Aspergillus niger (phyt B) (numéro d'accession NCBI : P34754)

SEQ ID NO: 30 : Séquence de la phytase d'Aspergillus fumigatus (numéro d'accession

NCBI : XP_751017)

SEQ ID NO: 31 : Séquence de la phytase de Pénicillium sp. (numéro d'accession

NCBI : WO03054199)

SEQ ID NO: 32 : Séquence de la phytase d'Escheήchia coli (numéro d'accession

NCBI : AAN28334)

SEQ ID NO: 33 : Séquence de la phytase de Bacillus subtillis (numéro d'accession

NCBI : CAB91845)

SEQ ID NO:34 amorce sens H73A l ^ier fragment SEQ ID NO:35 amorce antisens H73A l ^ιer fragment SEQ ID NO:36 amorce sens H73A 2 ^ιeme fragment SEQ ID NO:37 amorce antisens H73A 2 ^ιeme fragment SEQ ID NO:38 amorce sens H73A fragment final SEQ ID NO:39 amorce antisens H73A fragment final SEQ ID NO:40 amorce sens R21 IA l ^ier fragment SEQ ID NO:41 amorce antisens R21 IA l ^ier fragment SEQ ID NO:42 amorce sens R211 A 2 ^lème fragment SEQ ID NO:43 amorce antisens R21 IA 2 ^ieme fragment SEQ ID NO:44 amorce sens R211 A fragment final SEQ ID NO:45 amorce antisens R21 IA fragment final

SEQ ID NO: 46 : Séquence de la phosphatase de Lodderomyces elongisporus (numéro d'accession NCBI : XPJ)Ol 528805)

SEQ ID NO: 47 : Séquence de la phosphatase de Pichia stipitis (numéro d'accession NCBI : XPJ)01385108)

Description de l'invention

L'invention a pour objet l'utilisation d'un peptide ayant une activité phytase comprenant une arginine en position 21 1 de sa séquence peptidique, la position des acides aminés étant définie par rapport à la séquence peptidique de la phytase de

Debaryomyces castellii selon SEQ ID NO: 1, pour la préparation d'un additif nutritionnel ou d'un aliment pour animaux, le peptide ayant une activité phytase n'étant pas issu de Schwanniomyces occidentalis. Dans le texte de la description, toutes les indications de position d'acides aminés particuliers sont faites par rapport à la séquence primaire de la phytase de Debaryomyces castellii.

La présente invention concerne également l'utilisation d'une souche à l'état isolée non modifiée génétiquement ou d'un organisme hôte transformé, produisant un peptide ayant une activité phytase comprenant une arginine en position 21 1 de sa séquence peptidique pour la préparation d'un additif nutritionnel ou d'un aliment pour animaux, le peptide ayant une activité phytase n'étant pas issu de Schwanniomyces occidentalis.

L'invention se rapporte aussi à l'utilisation d'une souche à l'état isolé non modifiée génétiquement ou d'un organisme hôte transformé, comprenant un polynucléotide codant pour un peptide ayant une activité phytase comprenant une arginine en position 211 de sa séquence peptidique pour la préparation d'un additif nutritionnel ou d'un aliment pour animaux, le peptide ayant une activité phytase n'étant pas issu de Schwanniomyces occidentalis.

L'invention concerne aussi l'utilisation d'un organisme hôte transformé, comprenant une cassette d'expression consistant en, dans le sens de la transcription : - un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte,

- un polynucléotide codant pour un peptide ayant une activité phytase comprenant une arginine en position 211 de sa séquence peptidique, et

- une séquence terminatrice dans le même organisme hôte, pour la préparation d'un additif nutritionnel ou d'un aliment pour animaux, le peptide ayant une activité phytase n'étant pas issu de Schwanniomyces occidentalis.

L'invention concerne également l'utilisation d'un organisme hôte transformé, comprenant un vecteur comprenant un polynucléotide codant pour un peptide ayant une activité phytase comprenant une arginine en position 21 1 de sa séquence peptidique pour la préparation d'un additif nutritionnel ou d'un aliment pour animaux, le peptide ayant une activité phytase n'étant pas issu de Schwanniomyces occidentalis.

Un autre objet de la présente invention est relatif à l'utilisation d'un mélange protéique ou d'un moût de fermentation susceptible d'être obtenu par une souche à l'état isolé non modifiée génétiquement ou par un organisme hôte produisant un peptide ayant une activité phytase comprenant une arginine en position 21 1 de sa séquence peptidique pour la préparation d'un additif nutritionnel ou d'un aliment pour animaux, le peptide ayant une activité phytase n'étant pas issu de Schwanniomyces occidentalis.

Un autre objet encore de la présente invention est relatif à l'utilisation d'un mélange de peptides ayant une activité phytase comprenant au moins un peptide ayant

une activité phytase présentant une arginine en position 211 de sa séquence peptidique pour la préparation d'un additif nutritionnel ou d'un aliment pour animaux.

Selon un mode de réalisation de la présente invention, le peptide ayant une activité phytase comprend en outre un acide aspartique en position 338 de sa séquence peptidique.

Selon un mode de réalisation de la présente invention, le peptide ayant une activité phytase comprend la séquence peptidique SEQ ID NO:3.

Selon un mode de réalisation de la présente invention, les utilisations susmentionnées sont réalisées en vue de l'hydrolyse de l'acide phytique en monophosphate inorganique et en rayo-inositol libre, ou en vue de l'hydrolyse du myo- inositol 2-monophosphate en monophosphate inorganique et en myo-inositol libre.

Un autre objet enfin de la présente invention concerne l'utilisation d'un peptide ayant une activité phytase comprenant une arginine en position 211 de sa séquence peptidique pour l'hydrolyse de l'acide phytique en monophosphate inorganique et en myo-inositol libre, le peptide ayant une activité phytase n'étant pas issu de Schwanniomyces occidentalis.

Phytases

La présente invention concerne donc l'utilisation d'une phytase présentant une arginine dans son site actif. Selon la présente invention, la position des acides aminés est définie par rapport à la séquence peptidique de la phytase de Debaryomyces castellii selon SEQ ID NO: 1, le peptide ayant une activité phytase n'étant pas issu de Schwanniomyces occidentalis. La séquence de la phytase de D. castellii est donc la séquence de référence. Toutes les indications de position d'acides aminés particuliers sont faites par rapport à la séquence primaire de cette phytase.

La figure 1 représente un alignement de séquences décrites dans l'état de la technique, alignées par rapport à la séquence de D. castellii (SEQ ID NO: 1) comme référence. La séquence de la phytase de D. castellii figure en bas de chaque page de la figure 1. Certains acides aminés de la séquence sont soulignés et un nombre est indiqué en dessous de cet acide aminé. Ce nombre correspond à la numérotation de l'acide aminé dans la séquence SEQ ID NO: 1. Par exemple, en première page de la figure 1, un résidu de méthionine est souligné et le chiffre 1 apparaît en dessous, ce qui signifie

que ladite méthionine est l'acide aminé situé en première position de la séquence SEQ ID NO: 1. Egalement, en page 3 de la figure 1, un résidu d'arginine est souligné et le nombre 21 1 figure en dessous, ce qui signifie que ce résidu d'arginine est en position 211 dans SEQ ID NO: 1. Par convention dans cette demande, la numérotation des acides aminés des autres phytases se fait par. rapport à la séquence de D. castellii. L'alignement des séquences est par exemple réalisé au moyen de Vector NTi 9:1.0, programme d'alignement AlignX.. (Clustal W algorithm) (Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com) ou en utilisant l'outil CLUSTAW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/). Sur la base d'un tel alignement, l'homme du métier peut identifier la nature et la position d'un acide aminé dans une autre séquence de phytase correspondant.

Les abréviations suivantes ont été utilisées : DC Debaryomyces castellii CBS 2923 (numéro d'accession NCBI : EFl 21003)

DO Schwanniomyces occidentalis CBS 2863 (numéro d'accession NCBI :

CAB70441)

SC-I Saccharomyces cerevisiae (numéro d'accession NCBI : NP 009434)

SC-2 Saccharomyces cerevisiae (numéro d'accession NCBI : NP 009650) SC-3 Saccharomyces cerevisiae (numéro d'accession NCBI : NP 009651) SC-4 Saccharomyces cerevisiae (numéro d'accession NCBI : NP O 12087) PP Pichia pastoris (numéro d'accession NCBI : P52291 ) AN-A Aspergillus niger (phyt A) (numéro d'accession NCBI : AAS00648) PL Peniophora lycii (numéro d'accession NCBI : CAC48195) AN-B Aspergillus niger (phyt B) (numéro d'accession NCBI : P34754) AF Aspergillus fumigatus (numéro d'accession NCBI : XP 751017) EC Escherichia coli (numéro d'accession NCBI : AAN28334) SP-I Schizosaccharomyces pombe (numéro d'accession NCBI : CAAl 8863) SP-2 Schizosaccharomyces pombe (numéro d'accession NCBI : CAA40258) SP-3 Schizosaccharomyces pombe (numéro d'accession NCBI : CAB68657) CA- 1 Candida albicans (numéro d'accession NCBI :XP_713452) CA-2 Candida albicans (numéro d'accession NCBI : XP_722801) CA-3 Candida albicans (numéro d'accession NCBI : XP 718379) LE Lodderomyces elongisporus NRRL4239 (numéro d'accession NCBI :XP_001527604)

PS-I Pichia stipitis CBS 6054 (numéro d'accession NCBI : XP 001385108)

PS-2 Pichia stipitis CBS 6054 (numéro d'accession NCBI : XP 001385026) PS-3 Pichia stipitis CBS 6054 (numéro d'accession NCBI : XP 001385109) KO Kodamaea ohmeri (numéro d'accession NCBI : ABU53OO1) DH-I Debaryomyces hansenii CBS 767 (numéro d'accession NCBI : XP-458051) DH-2 Debaryomyces hansenii CBS 767 (numéro d'accession NCBI : XP-460692) DH-3 Debaryomyces hansenii CBS 767 (numéro d'accession NCBI : XP-460696) PG Pichia guillermondii ATCC6260 (numéro d'accession NCBI : XP 001485772) KL-I Kluyveromyces lactis (PHO5) (numéro d'accession NCBI :CAA83964) KL-2 Kluyveromyces lactis (PHO3) (numéro d'accession NCBI :XP_451007) PA Pichia angusta (numéro d'accession NCBI : AAC62537)

P.sp Pénicillium sp. CBS10989 (numéro d'accession NCBI : WO03054199) BS Bacillus subtillis (numéro d'accession NCBI : CAB91845)

La phytase de Debaryomyces castellii CBS 2923 est représentée dans le listage de séquences à la SEQ ID NO: 1.

Par "phytase", on entend un polypeptide ou une enzyme qui catalyse l'hydrolyse de l'acide phytique (/nyo-inositol hexakisphosphate, InsP ₆ ) en monophosphate inorganique, en /wyo-inositol phosphate de degré de phosphorylation inférieur (InsP ₅ à InsP]) et en /wyo-inositol libre dans certains cas. Selon la nomenclature officielle sur les enzymes du comité de l'Union Internationale de Biochimie (IUPAC-IUB, 1977), les phytases appartiennent à la classe des hydrolases, sous classe des ester hydrolases et sous sous classe des phospho monoester hydrolases parmi lesquelles on trouve les phosphatases et les phytases. Toutes les phosphatases n'hydrolysent pas l'acide phytique et les phytates. A ce jour, certaines enzymes ont été identifiées comme des phosphatases, mais on ne sait pas si ces enzymes sont également des phytases.

Les inventeurs ont mis en évidence un résidu d'arginine en position 21 1 de la séquence peptidique de Debaryomyces castellii (SEQ ID NO: 1) comme résidu capable de lier le /wyo-inositol 2-monophosphate, qui stabilise le complexe enzyme- substrat et hydrolyse l'acide phytique et les phytates jusqu'à libération du myo-inositol. Les inventeurs ont en outre démontré que d'autres peptides ayant une activité phytase et présentant une arginine en position 21 1 de leur séquence peptidique (position définie par alignement avec SEQ ID NO: 1), sont également capables d'hydrolyser l'acide phytique et les phytates jusqu'à libération du myo-inositol.

La présente invention concerne donc l'utilisation d'un peptide ayant une activité phytase comprenant une arginine en position 21 1 de sa séquence peptidique pour la préparation d'un additif nutritionnel ou d'un aliment pour animaux, le peptide ayant une activité phytase n'étant pas issu de Schwanniomyces occidentalis. Selon un autre mode de réalisation, la présente invention concerne l'utilisation d'un peptide ayant une activité phytase comprenant une arginine en position 211 de sa séquence peptidique pour l'hydrolyse du rayo-inositol hexakisphosphate en monophosphate inorganique et en myo-inositol libre, le peptide ayant une activité phytase n'étant pas issu de Schwanniomyces occidentalis.

La phytase de la SEQ ID NO: 1 comprend le motif RHGERYP ou Arg His GIy Glu Arg Tyr Pro (SEQ ID NO:4, acides aminés 72 à 78 de SEQ ID NO: 1) correspondant à la séquence consensus RHGXRXP (SEQ ID NO:3). Cette séquence consensus selon SEQ ID NO:3 est présente dans le site actif de nombreuses phosphatases acides. La phytase de la SEQ ID NO: 1 possède également le motif HD (ou His Asp) présent chez de nombreuses phytases. Ce motif est retrouvé dans la partie C-terminale aux acides aminés 335 et 336 de la SEQ ID NO: 1.

Dans un mode de réalisation de l'invention, les peptides selon l'invention possèdent le motif RHGERYP (SEQ ID NO:4) ou un autre motif correspondant à la séquence consensus RHGXRXP (SEQ ID NO:3). Préférentiellement, les peptides de l'invention possèdent également un motif HD. Ainsi selon ce mode de réalisation, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un peptide présentant une activité phytase comprenant une arginine en position 211 de sa séquence peptidique, ladite phytase comprenant le motif RHGXRXP (ou séquence peptidique SEQ ID NO:3) ou le motif RHGERYP (ou séquence peptidique SEQ ID NO:4), pour la préparation d'un additif nutritionnel ou d'un aliment pour animaux, le peptide ayant une activité phytase n'étant pas issu de Schwanniomyces occidentalis.

Les inventeurs ont en outre mis en évidence un résidu d'acide aspartique en position 338 de la séquence peptidique de Debaryomyces castellii (SEQ ID NO: 1) comme résidu capable de stabiliser l'arginine en position 21 1. Les inventeurs ont en outre vérifié que les autres peptides ayant une activité phytase, présentant une arginine en position 21 1 de leur séquence peptidique, et capables d'hydrolyser l'acide phytique et les phytates jusqu'à libération du /wyo-inositol, présentent également un résidu d'acide aspartique en position 338 de leur séquence peptidique (position définie par alignement avec SEQ ID NO: 1).

Ainsi, selon un autre mode de réalisation, l'invention a pour objet l'utilisation d'un peptide présentant une activité phytase comprenant :

- une arginine en position 211 de sa séquence peptidique,

- un acide aspartique en position 338 de sa séquence peptidique, la position des acides aminés étant définie par rapport à la séquence peptidique de la phytase de Debaryomyces castellii selon SEQ ID NO: 1, pour la préparation d'un additif nutritionnel ou d'un aliment pour animaux, le peptide ayant une activité phytase n'étant pas issu de Schwanniomyces occidentalis.

Dans un autre mode de réalisation de la présente invention, les peptides ayant une activité phytase sont glycosylés.

En outre, dans un autre mode encore de réalisation de l'invention, les peptides ayant une activité phytase portent au moins un pont disulfure.

La phytase de Debaryomyces castellii est une enzyme sécrétée par cette levure dans son environnement extracellulaire. Pour l'expression et la sécrétion par un organisme hôte recombinant, les peptides ayant une activité phytase peuvent être fusionnés à leur extrémité N-terminale avec un peptide signal reconnu par cet organisme hôte.

Les phytases de l'invention peuvent être isolées ou purifiées de leur environnement naturel. Elles peuvent être préparées au moyen de différents procédés. Ces procédés sont notamment la purification à partir de sources naturelles telles que des cellules exprimant naturellement ces peptides, la production de peptides recombinants par des cellules hôtes appropriées et leur purification ultérieure, la production par synthèse chimique ou, enfin, une combinaison de ces différentes approches. Ces différents procédés de production sont connus de l'homme du métier. Ainsi, les phytases de la présente invention peuvent être isolées à partir de tout microorganisme producteur de phytase. Les phytases de la présente invention peuvent également être isolées à partir d'organismes hôtes recombinants exprimant le peptide présentant cette activité phytase.

L'invention a également pour objet des protéines de fusion, des protéines recombinantes ou des protéines chimères comprenant le peptide selon l'invention.

Les peptides selon la présente invention ont une activité phytase et possèdent la capacité d'hydrolyser la totalité des liaisons phosphate de l'acide phytique.

Selon un mode de réalisation de la présente invention, on utilise un peptide présentant une activité, tel que ci-dessus décrit, pour la préparation d'un additif nutritionnel ou d'un aliment pour animaux en vue de l'hydrolyse du myo-inositol hexakisphosphate en monophosphate inorganique et en myo-inositol libre, ou en vue de l'hydrolyse du myo- inositol 2-monophosphate en monophosphate inorganique et en rayo-inositol libre.

Selon un mode de réalisation de la présente invention, on utilise un peptide ayant une activité phytase comprenant une arginine en position 211 de sa séquence peptidique, pour la préparation d'un additif nutritionnel ou d'un aliment pour animaux, sauf le peptide de SEQ ID NO: 1 et/ou le peptide de SEQ ID NO: 10.

Souche à l'état isolé ou organisme hôte

La présente invention concerne également l'utilisation d'une souche à l'état isolée non modifiée génétiquement ou d'un organisme hôte transformé, produisant une phytase comprenant une arginine en position 21 1 de sa séquence peptidique pour la préparation d'un additif nutritionnel ou d'un aliment pour animaux.

La présente invention concerne également l'utilisation de cette souche ou de cet organisme hôte pour l'hydrolyse du myo-inositol hexakisphosphate en monophosphate inorganique et en myo-inositol libre.

Polvnucléotide

La présente invention concerne également l'utilisation d'une souche à l'état isolée non modifiée génétiquement ou d'un organisme hôte transformé, comprenant un polynucléotide codant pour une phytase comprenant une arginine en position 211 de sa séquence peptidique pour la préparation d'un additif nutritionnel ou d'un aliment pour animaux.

La présente invention concerne en outre l'utilisation d'un organisme hôte transformé, comprenant une cassette d'expression consistant en, dans le sens de la transcription :

- un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte,

- un polynucléotide codant pour une phytase comprenant une arginine en position 211 de sa séquence peptidique, et

- une séquence terminatrice dans le même organisme hôte, pour la préparation d'un additif nutritionnel ou d'un aliment pour animaux.

La présente invention concerne également l'utilisation d'un organisme hôte transformé, comprenant un vecteur comprenant un polynucléotide codant pour une phytase comprenant une arginine en position 211 de sa séquence peptidique pour la préparation d'un additif nutritionnel ou d'un aliment pour animaux.

II est tout à fait envisageable, selon la présente invention de transformer un organisme hôte par intégration dans ledit organisme hôte d'au moins un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur. Le polynucléotide peut être intégré dans le génome de l'organisme hôte ou se répliquer de manière stable dans l'organisme hôte. Les méthodes de transformation des organismes hôtes sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature.

Par "organisme hôte", on entend en particulier selon l'invention tout organisme monocellulaire ou pluricellulaire, inférieur ou supérieur, en particulier choisi parmi les bactéries, les levures, les champignons et les plantes. Par "organisme hôte", on entend un organisme non humain.

A titre indicatif, les levures sont choisies parmi Pichia pastoris,Pichia stipitis, Saccharomyces cerevisae, Yarrowia lipolytica, Schwanniomyces occidentalis, Schwanniomyces castellii et Schizosaccharomyces pombe.

A titre indicatif, les champignons sont choisis parmi les Aspergillus et les Pénicilliums, préférentiellement parmi Pénicillium funiculosum, Trichoderma reesei, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus kawachii et Trichoderma koningii.

Dans un mode de réalisation, l'organisme hôte est une souche de Pénicillium funiculosum dans laquelle on exprime un peptide présentant une activité phytase selon l'invention. Dans un autre mode de réalisation, l'organisme hôte est une souche de

Debaryomyces castellii dans laquelle on exprime ou sur-exprime un peptide présentant une activité phytase selon l'invention.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, l'organisme hôte est une souche de Pichia pastoris ou de Schizosaccharomyces pombe dans laquelle on exprime un peptide présentant une activité phytase selon l'invention.

Les plantes sont par exemple choisies parmi le riz {Oryza satvia L.), le tabac, le soja et le blé.

Les techniques de construction de vecteurs, de transformation d'organismes hôtes et d'expression de protéines hétérologues dans ces organismes sont largement décrites dans la littérature (Ausubel F. M. et al., "Current Protocols in

Molecular Biology" Volumes 1 et 2, Greene Publishing Associates et Wiley -

Interscience, 1989; T.Maniatis, E.F.Fritsch, J.Sambrook, Molecular Cloning: A laboratory Handbook, 1982).

Cassettes d'expression Concernant les cassettes d'expression selon l'invention, tout type de séquence promotrice peut être utilisée. Le choix du promoteur dépendra notamment de l'organisme hôte choisi pour l'expression du gène d'intérêt. Certains promoteurs permettent une expression constitutive alors que d'autres promoteurs sont au contraire inductibles. Parmi les promoteurs fonctionnels dans les champignons, on citera notamment celui de glyceraldehyde-3 -phosphate deshydrogenase d'Aspergillus nidulans (Roberts et al., Current Genêt. 15:177-180, 1989). Parmi les promoteurs fonctionnels dans les bactéries, on citera notamment celui de la RNA polymérase du bacteriophage T7 (Studier et al., Methods in enzymology 185:60-89, 1990). Parmi les promoteurs fonctionnels dans les levures, on citera notamment celui du gène GaIl (Elledge et al., Proc Natl Acad Sciences, USA. 88:1731-1735, 1991) ou les promoteurs GAL4 et ADH de S.cerevisiae. Tous ces promoteurs sont décrits dans la littérature et bien connus de l'homme du métier.

Pour l'expression dans Pénicillium funiculosum, on choisira par exemple des cassettes d'expression comprenant un promoteur histone H4.B, un promoteur acide aspartyl protéase ou un promoteur csll3 (WO 00/68401).

Pour l'expresssion dans la levure Pichia pastoris, on choisira par exemple des cassettes d'expression comprenant le promoteur AOXl inductible par le méthanol (Tschopp, J. F., Sverlow, G., Kosson, R., Craig, W. and Grinna, L. (1987) High-level sécrétion of glycosylated invertase in the methylotrophic yeast, Pichia pastoris. Biotechnology 5, 1305-1308) ou le promoteur constitutif fort GAP (Waterham, H. R., Digan, M. E., Koutz, P. J., Lair, S. V. and Cregg, J. M. (1997) Isolation of the Pichia pastoris glyceraldehyde-3 -phosphate dehydrogenase gène and régulation and use of its promoter. Gène 186, 37-44).

Pour l'expression dans Schizosacchromyces pombe, on choisira par exemple des cassettes d'expression comprenant le promoteur de régulation Nmtl reprimé par la thiamine et actictivé en abscence de thiamine (Maundrell, K., (1989) Nmtl of fission yeast. A highly transcribed gène completely repressed by thiamine. J. Biol. Chem. 265, 10857-10864.)

Les cassettes d'expression, selon la présente invention, peuvent en outre inclure toute autre séquence nécessaire à l'expression des peptides ou des polynucléotides, comme par exemple des éléments de régulation ou des séquences

signal permettant la sécrétion des polypeptides produits par l'organisme hôte. On peut notamment utiliser toute séquence de régulation permettant d'augmenter le niveau d'expression de la séquence codante insérée dans la cassette d'expression. Selon l'invention, on peut notamment utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription ("enhancer").

En outre, les cassettes d'expression, selon la présente invention, peuvent inclure toute autre séquence nécessaire à la sécrétion des polypeptides produits par l'organisme hôte telles que des séquences signal. Pour la sécrétion par Pichia pastoris, on peut par exemple utiliser la séquence du facteur α comme signal de sécrétion.

Une grande variété de séquences terminatrices sont utilisables dans les cassettes d'expression selon l'invention, ces séquences permettent la terminaison de la transcription et la polyadénylation de l'ARNm. Toute séquence terminatrice fonctionnelle dans l'organisme hôte sélectionné peut être utilisée. Pour l'expression dans Pénicillium funiculosum, on choisira par exemple des cassettes d'expression comprenant un terminateur histone H4.B, un terminateur acide aspartyl protease ou un terminateur csll3 (WO 00/68401).

La présente invention a également pour objet un polynucléotide comprenant une cassette d'expression selon l'invention, avantageusement les cassettes d'expression selon la présente invention sont insérées dans un vecteur.

Vecteurs

Les vecteurs de réplication ou d'expression pour la transformation d'un organisme hôte selon la présente comprenent au moins un polynucléotide ou une cassette d'expression telle que ci-dessus définie. Ce vecteur peut notamment être constitué par un plasmide, un cosmide, un bactériophage ou un virus dans lequel est inséré un polynucléotide ou une cassette d'expression selon l'invention. Les techniques de construction de ces vecteurs et d'insertion d'un polynucléotide de l'invention dans ces vecteurs sont connues de l'homme du métier. De manière générale, tout vecteur capable de se maintenir, de s'autorépliquer ou de se propager dans une cellule hôte et notamment afin d'induire l'expression d'un polynucléotide ou d'un polypeptide peut être utilisé. L'homme du métier choisira les vecteurs appropriés notamment en fonction de l'organisme hôte à transformer et en fonction de la technique de transformation mise en œuvre.

Les vecteurs de la présente invention sont notamment utilisés pour transformer un organisme hôte en vue de la réplication du vecteur et/ou de l'expression d'un polypeptide selon l'invention dans l'organisme hôte.

Additifs alimentaires et aliments pour animaux

Par "additif nutritionnel", on entend une substance ajoutée intentionnellement à un aliment, généralement en petites quantités, pour améliorer ses caractéristiques nutritionnelles ou sa digestibilité. Les additifs nutritionnels pour animaux peuvent par exemple contenir des vitamines, des sels minéraux, des acides aminés et des enzymes.

Typiquement, selon l'invention, les additifs nutritionnels pour animaux peuvent comprendre un polypeptide, une souche non génétiquement modifiée, un organisme hôte, un surnageant de culture, un mélange protéique, un moût de fermentation d'un organisme hôte ou d'une souche non génétiquement modifiée selon l'invention. Ainsi, les peptides ayant une activité phytase peuvent être utilisés directement pour la fabrication d'un additif nutritionnel pour animaux. Alternativement, une souche non génétiquement modifiée ou un organisme hôte produisant des phytases selon l'invention peuvent être utilisés directement pour la fabrication d'un additif nutritionnel pour animaux. Dans un mode de réalisation de l'invention, on utilise un surnageant de culture, un mélange protéique ou un moût de fermentation pour la préparation d'un additif nutritionnel ou d'un aliment pour animaux. Selon l'invention, ce mélange protéique, surnageant de culture ou moût de fermentation est susceptible d'être obtenu par une souche à l'état isolé non modifiée génétiquement ou par un organisme hôte produisant un peptide présentant une activité phytase, ce peptide comprenant une arginine en position 211 de sa séquence peptidique, le peptide ayant une activité phytase n'étant pas issu de Schwanniomyces occidentalis . Ce mode de réalisation est particulièrement avantageux lorsque le peptide en question est sécrété dans le milieu extracellulaire par la souche ou l'organisme hôte. Habituellement, ce surnageant de culture est concentré ou lyophilisé pour la fabrication de l'additif nutritionnel.

Ce surnageant de culture, mélange protéique ou moût de fermentation peut ensuite être concentré ou lyophilisé pour la formulation d'un additif alimentaire ou d'un aliment pour animaux. Le procédé peut comprendre des étapes supplémentaires de purification du peptide présentant une activité phytase à partir du surnageant de culture.

Si l'organisme hôte ne secrète pas le peptide dans le milieu de culture, une étape supplémentaire de cassage des cellules et de purification de l'extrait cellulaire peut être nécessaire.

Les additifs nutritionnels de la présente invention comprennent au moins un peptide selon l'invention mais peuvent également comprendre d'autres substances nutritionnelles comme des vitamines, des acides aminés ou des sels minéraux.

Les additifs selon l'invention accroissent la digestibilité des aliments, contribuant ainsi à une meilleure valorisation nutritionnelle des régimes à base de céréales (blé, orge, maïs, avoine, seigle, ...) et de tourteaux oléagineux (soja, tournesol, colza, ...) notamment.

Par "aliment", on entend tout ce qui peut servir à la nourriture des animaux.

Selon un mode de réalisation de la présente invention, les aliments pour animaux comprennent une base nutritionnelle et un additif nutritionnel tel que ci-dessus défini. Ces aliments se présentent habituellement sous la forme de farines ou de granulés dans lesquels sont incorporés les additifs selon l'invention.

Selon un mode de réalisation de la présente invention, les aliments pour animaux comprennent un peptide selon l'invention, une souche non génétiquement modifiée, un organisme hôte selon l'invention, un moût de fermentation, un mélange de protéine, ou un surnageant de culture de cette souche ou de cet organisme hôte.

La présente invention concerne également l'utilisation d'un mélange de peptides présentant une activité phytase, ledit mélange comprenant au moins un peptide présentant une activité phytase, le peptide présentant une arginine en position 211 de sa séquence peptidique pour la préparation d'un additif nutritionnel ou d'un aliment pour animaux.

La présente invention concerne également l'utilisation de ce mélange de peptides pour l'hydrolyse de l'acide phytique en monophosphate inorganique et en myo- inositol libre.

Dans un mode de réalisation de l'invention, les additifs nutritionnels et les aliments pour animaux selon l'invention comprennent une association d'au moins deux peptides présentant des activités complémentaires. Ces additifs et ces aliments comprennent ainsi au moins un peptide présentant une activité phytase telle que ci- dessus définie, ledit peptide étant associé à un autre peptide. Le peptide de l'invention

hydrolyse l'acide phytique en monophosphate inorganique et en myo-inositol libre et n'est pas issu de Schwanniomyces occidentalis . On peut lui associer un peptide présentant une activité phytase, par exemple une activité 3-phytase ou une activité 6- phytase, ou un peptide présentant une activité phytase qui n'hydrolyse pas tous les groupements phosphate.

La phytase associée à la phytase selon l'invention peut être par exemple choisie parmi les phytases des organismes suivants : Pichia pastoris, Pichia stipitis, Escherichia coli, Aspergillus awamori (phytase A et phytase B), Aspergillus niger (phytase A et phytase B), Pénicillium funiculosum, Aspergillus oryzae, Peniophora lycii, Aspergillus ficuum, Aspergillus nidulans, Talaromyces thermophilus, Aspergillus fumigatus et Aspergillus terreus. A titre indicatif, la phytase selon la présente invention est associée à la phytase d 'Aspergillus niger (Ullah, A. H. J and Sethumadhavan, K., (2003) PhyA gène product of Aspergillus ficuum and Peniophora lycii produces dissimilar phytases. Biochemical and Biophysical Research Communications 303 : 463^-68) ou à une phytase d'une souche de Pénicillium funiculosum (WO 03/054199, WO 99/57325).

Pour l'élevage intensif des animaux, les aliments pour animaux comprennent habituellement une base nutritionnelle et des additifs nutritionnels. Par "base nutritionnelle", on entend, ce qui constitue l'essentiel de la ration alimentaire de l'animal, constitué à titre d'exemple par un mélange de céréales, de protéines et de matières grasses d'origine animale et/ou végétale. Les bases nutritionnelles pour animaux sont adaptées à l'alimentation de ces animaux. Habituellement, ces bases nutritionnelles comprennent par exemple du maïs, du blé, du pois et du soja. Ces bases nutritionnelles sont adaptées aux besoins des différentes espèces animales auxquelles elles sont destinées. Ces bases nutritionnelles peuvent déjà contenir des additifs nutritionnels comme des vitamines, des sels minéraux et des acides aminés.

Par "animaux monogastriques", on entend notamment les volailles et les porcs. Les volailles comprennent notamment les poules pondeuses, les poulets de chair, les dindes et les canards. Les porcs comprennent notamment les porcs croissance et finition ainsi que les porcelets.

Figures

Figure 1 : alignement de séquences décrites dans l'état de la technique, alignées par rapport à la séquence de la phytase de D. castellii (SEQ ID NO: 1) comme référence Figure 2 : représentation d'un monomère de la phytase de D. castellii Figure 3 : représentation d'un trimère de la phytase de D. castellii Figure 4 : représentation d'un tétramère de la phytase de D. castellii

Figure 5 : représentation du dimère de la phytase PHOlPp de Pichia pastoris Figure 6 : (A) représentation du monomère de la phytase PHOlPp de Pichia pastoris ; (B) superposition des monomères des phytase PHOlPp de Pichia pastoris et de PhytDc de D. castellii. Figure 7 : Représentation de la superposition des sites actifs des phytases PHOlPp de P. pastoris (gris) et de PhtyDc de D. castellii (noir).

Figure 8 : activité de la phytase de P. pastoris en fonction du pH (pH 3 à 3,5 Tampon glycine 200 mM ; pH 3,5 à 7 Tampon acétate de sodium 200 raM ; pH 7 à 7,5 Tampon Figure 9 : activité de la phytase de P. pastoris en fonction de la température, à pH 3, pendant 20 minutes

Figure 10 : Cinétique d'hydrolyse de l'insP- par la phytase de P. pastoris suivie par RJVIN (17mM d'insP ₆ ; 10 mM de tampon acétate pH3 ; H ₂ O/D ₂ O, 16/84,v/v ; 2,4 mU d'enzyme 600Mhz, 17°C). Figure 11 : Etude de l'effet pH sur l'activité de l'extrait phytasique de P. stipitis CBS6054.

Figure 12 : Etude de l'effet de la température sur l'activité de l'extrait phytasique de P. stipitis CBS6054, pH3,5. Figure 13 : Etude de la libération des phosphates au cours de l'hydrolyse de l'acide phytique par l'extrait phytasique de P. Stipitis CBS 6054.

Figure 14 : cinétiques d'hydrolyse l'InsPό par la phytase native (PhytDc) et la phytase mutée (phytR21 1A) suivies par RMN (1,7 mM InsPό, tampon acétate 1OmM, pH4, H ₂ O/D ₂ O, 16/84 v/v ; 6 μl de phytase soit 6OmU, 600Mhz, 17°C). Figure 15 : Comparaison des profils de pH de la phytase native PhytDCet de la phytase mutée phytR211A. Les valeurs correspondent à la moyenne de 3 expérimentations indépendantes, l'erreur est inférieure à 7%. Les tampons utilisés sont : le tampon glycine HCl 0,2M pour les pH 2 à 3,5, le tampon Tris HcI pour les pH 3,5 à 7.

Exemples

La souche utilisée est répertoriée au Centraal bureau voor Schimmelculture (Delft) sous le nom Debaryomyces castellii CBS 2923.

La phytase de D. castellii a été caractérisée au niveau biochimique et biophysique (demande de brevet PCT7FR2006/001653 déposée le 7 juillet 2006). Cette phytase appartient au groupe des phosphatases de haut poids moléculaire. Elle est caractérisée comme une HAP (phosphatase acide à histidine) et est active dans une large gamme de pH (2 à 6,5), avec un pH optimum d'activité de 4 - 4,5. Elle est stable à 66°C pendant 1 heure, sa température optimale d'activité est de 60°C.

Exemple 1 : Détermination de la structure de la phvtase de D. castellii

Analyse du cristal et traitement des données

Plusieurs cristaux ont été obtenus en utilisant des kits de cristallisations dans différentes conditions. Des tests préliminaires de diffraction des rayons X ont permis déjuger de la qualité diffractante de ces cristaux (résolution, mosaicité...). Les meilleurs cristaux ont été obtenus avec les conditions de cristallisations suivantes : 0,02M CaCI ₂ 0,1 M Na Acétate pH 4.6 15% MPD (2-méthyl-2,4-pentanediol)

Dans de telles conditions, le cristal peut être congelé (vitrifié) dans de l'azote liquide directement sans trempages spécifiques préalables.

Le jeu de données collecté à I'ESRF à 100 ⁰ K a été indexé et intégré par le logiciel MOSFLM (Leslie A.G.W. (1992) Récent changes to the MOSFLM package for processing film and image plate data. Joint CCP4/ESF-EACBM. Newsl. Protein Crystallogr. N°26) puis mis à l'échelle par le logiciel SCALA (CCP4). Le cristal appartient au groupe d'espace P6522 avec une maille de dimensions a=b=121,65 â, c=332,24 â et α=β=90°, γ=120°. La structure a été résolue par remplacement moléculaire (logiciel PHASER, Mac Coy, 2005) en utilisant la structure de la phytase ά'Aspergillus niger (code pdb : IQFX ; Kostrewa D., Wyss M., D'arcy A. et Van Loon A.P.G.M. (1999) Crystal structure of Aspergillus niger pH 2.5 acid phosphatase at 2.4 A resolution. J. Mol. Biol. 288:965- 974) comme modèle. L'étape de construction automatique/affinement de la structure a été conduite par le logiciel ARP (Perrakis A., Morris R. et Lamzin,V.S (1999) Automated protein model building combined with itérative structure refinement.

Nat. Struct. Biol. 6:458-463). Les logiciels REFMAC (Murshudov G.N., Vagin A.A. et Dodson EJ. (1997) Refinement of Macromolecular Structures by the Maximum- Likelihood Method. Acta Cryst. D 53:240-255) et TRUBO-FRODO (Roussel A. et Cambillau C. (1992)TURBO-FRODO. In: Biographies: LCCMB, Marseille, France) ont été utilisés pour raffinement manuel final.

Analyse de la structure du monomère

La structure d'un monomère de phytase est composée de 457 acides aminés. Voir SEQ ID NO:1. Les quatre premiers résidus de la protéine sont trop mobiles pour être résolus par diffraction aux rayons X.

Tel que montré en figure 2, un monomère est composé d'un petit domaine α et d'un large domaine α/β. Le petit domaine α contient 5 hélices α. Le domaine α/β est composé de 6 feuillets β au centre entourés d'un coté par deux longues hélices α et de l'autre par 4 hélices α plus petites.

Les résidus du site catalytique consensus (72RHGERYP78 et 335HD336) sont localisés dans une fente profonde à l'interface du large domaine α/β et du petit domaine α.

Analyse de la structure du dimère

L'unité asymétrique comporte deux monomères comme le suggérait le coefficient de

Mathews (V _m de 3,46 â ³ .Da ^" ') ainsi que le pourcentage de solvant (63%) calculé pour deux molécules dans l'unité asymétrique. L'analyse du contact (surface et nature) entre ces deux monomères montre clairement qu'ils forment un dimère, tel que le montre la figure 3. L'aire de contact entre 2 monomères au sein du dimère est de 2395 â ² ce qui représente 12 % de la surface totale d'un monomère.

Ces deux molécules sont parfaitement superposables mais présentent des différences mineures dans leur composition en résidus N-acétylglucosamine (NAG) et dans le nombre de ponts disulfure.

Pour le monomère A, les 8 résidus cystéines sont impliqués dans des ponts disulfures

Cys62-Cys385, Cys214-Cys435, Cys262-Cys275, Cys405-Cys413. Pour le monomère

B, le pont disulfure Cys62-Cys385 n'est pas formé.

Le monomère A contient 3 résidus NAG, liés à 3 des 9 résidus potentiels de N- glycosylation (Asn 158, 314 et 439). Le monomère B n'en contient que 2 liés aux Asn

314 et 439. Ces résidus correspondent au premier résidu des chaînes N-glycosylées

laissés après l'hydrolyse par l'endoglycosidase H. D'autres résidus NAG sont présents (analyse par protéolyse et masse) sur les autres sites potentiels de glycosylation mais sont trop mobiles pour être résolus.

Analyse de la structure quaternaire

L'empilement cristallin montre que la phytase est un tétramère, confirmant les résultats obtenus par chromatographie d'exclusion. Ce tétramère est constitué de deux dimères strictement identiques reliés par un axe de symétrie dans le cristal. Voir la figure 4. Le tétramère a une forme de bi-pyramide à base carrée. Au niveau du tétramère, l'aire de contact pour un monomère est de 4900 â ² soit 24% la surface totale d'un monomère. Dans la structure tétramérique, les 4 sites actifs sont exposés au solvant et facilement accessibles au substrat.

La structure est accessible sur le site du RCSB Protein Data Bank avec le code pdb suivant : 2GFI.

Exemple 2 : Comparaison à d'autres histidine acide phosphatases

La phytase de D. castellii possédant un domaine α et un domaine α/β, elle peut être classée dans la famille structurale des histidines acide phosphatases (HAP) selon la classification SCOP (Structurale Classification Of Protein, Murzin et al., 1995). Cette famille contient notamment la phosphatase d'A. niger (PAAn), les phytases d'A niger (phytAn), les phytases ά'A. fumigatus (phytAf) et d'E. coli (phytεc).

Par superposition des monomères, trois familles peuvent être définies. La première comprend les monomères de phytDc et PAAn qui sont très semblables. La superposition des monomères de phytAn ou phytAf avec phytDc est moins parfaite. En revanche, les structures de phytAn et phytAf sont très semblables et forment une deuxième famille.

La différence la plus remarquable entre ces deux premières familles se situe au niveau de l'extrémité N-terminale.

Pour les phytases phytAn et phytAf, l'extrémité N-terminale est maintenue accolée à la protéine par un pont disulfure. Pour les protéines phytDc et PAAn, l'extrémité N- terminale (moins contrainte) forme une boucle étendue qui peut aller établir un contact conséquent avec le deuxième monomère. Cette interaction participe fortement à la

stabilité du dimère et par conséquent du tétramère. Ceci explique en partie la structure quaternaire pour phytDc et PAAn (tétrameriques) et monomériques pour phytAf et phytAn

La troisième famille est représentée par la phytase phytEc qui possède une structure plus éloignée de celles des phytases précédemment décrites.

Les différentes structures de la famille HAP ne sont pas absolument superposables. Malgré cette diversité structurale, un fait est remarquable : les 5 résidus du site catalytique, à savoir RHGXPvXP, sont parfaitement superposables.

Exemple 3 : Détermination de Ia structure de la phytase de D. castellii en présence d'acide phvtique

De manière identique à l'exemple 1 , une deuxième structure a été élucidée à partir de cristaux de phytase apo complexés par la suite avec une solution concentrée d'acide phytique.

Une fois la structure résolue, il s'est avéré que l'acide phytique avait été hydrolyse et ne persistaient dans le site actif, que deux phosphates, l'un dans le site réactionnel et l'autre à proximité.

Un modèle du complexe entre la phytase de D. castellii et le myo-inositol 2- monophosphate a été réalisé en plaçant le phosphate de ce dernier dans la position identifiée dans le site réactionnel, suivi d'une exploration de l'espace accessible par rotation le long des deux axes entre le phosphate et le cycle à 6 carbones. Ceci a permi de mettre en évidence un résidu d'arginine en position 211 comme résidu capable de lier le myo-inositol 2-monophosphate, stabilisant ainsi le complexe PhytDC-myo- lnositol 2-monophosphate et facilitant ainsi l'hydrolyse de ce dernier. En outre, il a été montré que la chaîne latérale de l'Arginine 21 1 est stabilisée par un acide aspartique en position 338 (Asp 338).

Exemple 4 : alignement des séquences primaires et capacité d'hydrolyse du mvo- inositol 2-monophosphate

Un alignement de séquences avec d'autres phosphatases/phytases (voir figure 1) montre que 1 1 autres phosphatases/phytases possèdent une arginine en position 21 1, la

position des acides aminés étant définie par rapport à la séquence peptidique de la phytase de Debaryomyces castellii selon SEQ ID NO: 1. Il s'agit des phosphatases/phytases de Schwanniomyces occidentalis (SEQ ID NO : 10) et Pichia pastoris (SEQ ID NO : 28), Candida albicans (SEQ ID NO : 11, 12 et 16), Lodderomyces elongisporus (SEQ ID NO : 46), Pichia stipitis (SEQ ID NO : 17, 19 et 47) et Debaryomyces hansenii (SEQ ID NO : 15 et 20) et Pichia guillermondii (SEQ ID NO : 18). Ces séquences possèdent également un acide aspartique en position 338. Les inventeurs ont précédemment montrés que la phytase de D. castellii est capable d'hydrolyser la totalité des groupements phosphate du phytate jusqu'à la libération du myo-inositol (voir demande de brevet PCT/FR2006/001653).

Les inventeurs ont en outre cherché à savoir si les phytases/phosphatases de S. occidentallis et de P. pastoris hydrolysent ou non l'acide phytique et/ou le myo-inositol

2-monophosphate.

Les cinétiques de libération de phosphates sont réalisées dans du tampon acétate de sodium 250 mM, pH4 ou pH3 (P. pastoris) en présence de 0,08 U/ml de phytase.

Les mesures sont réalisées à 37°C :

- après 30 minutes d'hydrolyse de l'Ins(2)Pl, et - après 240 min d'hydrolyse de l'acide phytique.

Les résultats sont montrés dans le tableau 1 ci-dessous :

% Ins (n) P _n hydrolyse Acide phytique Ins(2)P,

(9 mM) (I mM)

D. castellii 100 84 S. occidentalis 100 88 P. pastoris 100 55 A. niger (PhytA) 69 2

Tableau 1: Hydrolyse de l'acide phytique et de l'ins2Pl par les phytases de D. castellii, S. occidentalis, P. pastoris, A. niger

Ces résultats montrent que les phytases/phosphatases de D. castellii, S. occidentalis et de P. pastoris hydrolysent l'acide phytique et le myo-inositol 2-monophosphate.

La phytase de P. pastoris hydrolyse totalement l'acide phytique en inositol et phosphate inorganique. Elle est capable d'hydrolyser l'ins(2)Pl comme les phytases de D. castellii et de S. occidentalis et contrairement à la phytase A d'A. niger . Ces données constituent un élément important confortant le rôle essentiel de l'arginine du site catalytique dans l'hydrolyse de l'Ins(2)Pl, de l'acide phytique et des phytates.

En outre, les phytases appartenant à la classe des phosphatases acides à histidine (histidine acide phosphatase, HAP), c'est-à-dire les phytases de S. cerevisiae, P. lycii, A. niger A (phytAn), A. Niger B (PAAn), A. Fumigatus (phytAf), E. CoIi (phytEc), qui ne présentent pas d'arginine en position 211 (position déterminée par alignement avec SEQ ID NO: 1, voir figure 1), n'hydrolysent pas totalement l'acide phytique (voit tableau ci-dessus pour la phytase de A. niger). Le myo-inositol 2-monophosphate (Ins(2)Pi) est le produit final. Ces données constituent d'autres éléments allant dans le sens du rôle essentiel de l'arginine du site catalytique dans l'hydrolyse totale de l'acide phytique et des phytates et dans l'hydrolyse de l'Ins(2)Pl.

Exemple 5 : Détermination de la structure de la phytase de P. pastoris

La phytase de P. pastoris (PHOlPp) purifiée a été déglycosylée par l'endoglycosidase H. La pureté de l'échantillon ainsi que la déglycosylation complète ont été vérifiées par électrophorèse SDS-PAGE. Cet échantillon a ensuite été utilisé pour des expériences de cristallogenèse. Les premiers tests de cristallogenèse ont rapidement aboutis à des cristaux diffractant à 2,2 â. La structure de la phytase de P. pastoris a pu être résolue par remplacement moléculaire.

a) Analyse de la structure du monomère et du dimère

L'unité asymétrique comporte deux monomères (figure 5). Ces deux molécules sont parfaitement superposables. Un monomère de la phytase de P. pastoris est représenté sur la figure 6A. La structure d'un monomère de phytase est composée de 415 acides aminés. Les 33 premiers résidus de la protéine sont trop mobiles pour être résolus par diffraction aux rayons X. Un monomère est composé d'un petit domaine α et d'un large domaine α/β. Le petit domaine α contient 5 hélices α. Le domaine α/β est composé de 6 feuillets β au centre entourés d'un côté par deux longues hélices α et de l'autre par 4 hélices α plus petites.

Les résidus du site catalytique consensus (83RHGERYP89 et 345HD346) sont localisés dans une fente profonde à l'interface du large domaine α/β et du petit domaine α.

b) Comparaison avec d'autres phosphatases acides à histidine La phytase de P. pastoris, possédant un domaine α et un domaine α/β, peut être classée dans la famille structurale des phosphatases acides à histidine (HAP) selon la classification SCOP (figure 6A). Cette famille contient notamment la phosphatase d'A. niger (PAAn), les phytases de Debaryomyces castellii (PhytDc), d'A niger (phytAn), d'A. fumigatus (phytAf) et à'E. coli (phytEc). La superposition entre PhytDc et PHOlPp, montre que les monomères sont très semblables (figure 6B). L'extrémité N-terminale (moins contrainte) forme une boucle étendue qui peut aller établir un contact conséquent avec le deuxième monomère. Cette interaction participe fortement à la stabilité du dimère.

c) Hydrolyse des înositols phosphates La caractérisation biochimique de cette phytase a mis en évidence sa capacité à hydrolyser totalement l'InsP ₆ . La superposition des sites actifs de PHOlPp et phytDc montre une grande similitude (figure 7). La phytase PHOlPp (SEQ ID NO :28) possède les deux acides aminés, arginine 220 (correspondant à l'arginine 211 de D. castellii selon SEQ ID No . 1 ) et acide aspartique 348 (correspondant à l'acide aspartique 338 de D. castellii selon SEQ ID No . 1) qui semblent responsables de la capacité de ces phytases à hydrolyser en totalité l'InsP ₆ et en particulier l'Ins( ₂ )Pi. La résolution de la structure de PHOlPp, et la position de l'arginine conforte le rôle de cet acide aminé dans l'hydrolyse totale des phytates.

Exemple 6 : propriétés enzymatiques de Ia phvtase de P. pastoris

5.1. Effet du pH

L'effet du pH sur la phytase est déterminé, en mesurant l'activité enzymatique à 37°C, en présence de différents tampons : pour les pH compris entre 2 et 3,5 (tampon glycine), pour les pH 3,5 à 7 (tampon acétate de sodium) et pour les pH 7 à 7,5 (tampon tris HCl). La phytase est active entre des valeurs de pH de 2,3 à 6, avec un optimum à pH 3 (voir figure 8).

5.2. Effet de la température

La température optimale est déterminée sur la phytase native, en effectuant une mesure de l'activité phytasique à différentes températures : de 10 à 80°C à pH 3. La température optimale de la phytase est de 50 ⁰ C (voir figure 9).

5.3. Etude de la stabilité à la température

Une étude de la dénaturation thermique à diverses températures montre que l'enzyme est stable pendant une heure à 60°C lorsqu'elle est dans du tampon acétate 125 mM, pH 3. Elle est dénaturée au dessus de 65°C, avec une perte d'activité de 30% après 20 min à 65°C.

5.4. Etude de la spécificité

Les constantes cinétiques sont déterminées sur 3 substrats. L'affinité de la phytase est 200 fois plus élevée vis-à-vis du phytate de calcium que de p nitro phenyl phosphate (pNPP) (Tableau 2). Cette caractéristique la classe parmi les phytases. Elle dégrade également Tins (2) P ₁ , (Tableau 2). Son affinité pour ce substrat est cependant plus faible que vis-à-vis de l'InsP ₆ . L'efficacité catalytique (Kcat/Km) est 150 à 250 fois plus élevée pour l'InsP ₆ que pour les deux autres substrats testés.

Tableau 2: Comparaison des paramètres cinétiques de la phytase de P. postons X33 sur différents substrats phosphorylés.

Substrats

Phytase pNPP Ins P ₆ Ins(2)P _!

Km (mM) 3,19 0,0159 7,14

Vm (U/mg) 196 148 87,51

Kcat (s ^{" 1} ) 64,05 48.4 38, 6

Kcat/Km (M ^"1 . s ^"1 ) 20,10 ³ 3,04.10 ⁶ 12,6.10 ³

Cette phytase possède un large spectre d'activité, avec une hydrolyse préférentielle de l'ADP de l'acide D 3-phosphoglycérique, du glucose-6-phosphate. Elle est peu active en présence de fructose 6 phosphate et du phosphoénol pyruvate (Tableau 3).

Tableau 3 : Spécificité de la phytase de P. pastoris X33.

Les cinétiques de libération des phosphates sont réalisées dans du tampon glycine 200 mM, pH 3, à 37°C. Les mesures sont effectuées toutes les 5 minutes pendant 20 minutes.

Concentration

Substrats % Activité (mM)

Acide phytique (témoin) 9 100

Fructose-6-phosphate 4 23

Glucose-6-phosphate 4 103

Adénosine-5 '-monophosphate (AMP) 4 58

Adénosine-5'-diphosphate (ADP) 4 248

L-α-glycérophosphate 4 78 acide D (-) 3-phosphoglycérique 4 152

Phosphoénolpyruvate 4 8

5.5. Etude des cinétiques d'hydrolyse des InsP» par RMN

La cinétique d'hydrolyse de l'InSP ₆ est suivie par RMN. L'échantillon utilisé pour suivre l'hydrolyse par RMN est préparé à partir d'une solution contenant 17mM InsP ₆ dans du tampon glycine 10 mM, pH3, H ₂ O/D ₂ O,16/84 v/v ; 2,4 mU de phytase. A partir des spectres caractéristiques des différents inositols phosphates déterminés précédemment (Ragon et al 2007), leur apparition et disparition peuvent être suivies sur l'ensemble de la cinétique pendant 22 h (Figure 10). La séquence déphosphorylation de l'Ins(l,2,3,4,5,6)P ₆ est I ¹ InS(1 , 2,4,5,6 ou 2,3,4,5,6)P ₅ , l'Ins(l ,2,5,6 ou 2,3,5,6)P ₄ , l'Ins(l,2,6 ou 2,3,6)P ₃ , l'Ins(l, 2 ou 2,3)P ₂ , rins(2)P,, et l'Inositol. Les isomères de position (1 et 3) et (4 et 6) ne sont pas discernables par RMN. Après 48 h le seul

produit restant est l'inositol. La séquence d'hydrolyse peut être résumée sous la forme 3/4/5/6/1/2, c'est donc une 3 phytase.

L'étude de l'hydrolyse de l'acide phytique par la phosphatase (Pholp) de P. pastoris permet de classer cette protéine parmi les 3 phytases. Son affinité vis-à-vis de l'InsP ₆ , 200 fois plus élevé que vis-à-vis du pNPP (substrat des phosphatases) conforte cette appartenance.

Comme la phytase de D. castellii, elle hydrolyse la totalité des groupements phosphates de l'acide phytique. Ce résultat conforte le rôle de l'arginine dans l'hydrolyse de Ins(2)P,.

Exemple 7 : Mise en évidence d'une activité phytase dans un surnageant de culture de Pichia stipitis CBS 6054

La recherche in silico d'homologie de séquences avec la séquence du gène PhytDC codant la phytase de Debaryomyces castellii, a permis de sélectionner 3 séquences de phosphatases de Pichia stipitis CBS 6054 : XPOO13851O8, XP001385026, XP001385109, ayant respectivement 53%, 49%, 56% d'identité avec celle du gène PhytDC. Ces trois séquences décrites par Jeffries et al 2007 (Génome séquence of the lignocellulose-bioconverting and xylose-fermenting yeast Pichia stipitis. Nat. Biotechnol. 25 (3), 319-326), possèdent les deux séquences consensus RHGXRXP et HD caractéristiques des phosphatases acides à histidine (HAP) ainsi qu'une arginine homologue à celle en position 211 de PhytDC. Les deux premières séquences correspondent à des protéines sécrétées.

Dans cette étude, nous avons décrit la production et quelques caractéristiques de ces enzymes en utilisant comme substrat l'acide phytique (InsP ₆ ).

7.1 Organisme La souche utilisée est répertoriée au Centraal bureau voor Schimmelculture (Delft) sous le nom Pichia stipitis CBS 6054.

7.2. Milieux et conditions de culture

a) Culture en Erlenmeyer

Les précultures sont réalisées en présence de YMPG (glucose 10 g/L, yeast extract 3 g/L, bacto peptone 5 g/L, malt extract 3 g/L). Elles sont conduites en milieu aéré sur agitateur va-et-vient (80 oscillations par minute, amplitude 7 cm), à 28°C.

b) Milieu synthétique à faible concentration en phosphate inorganique (MSA)

Glucose (10 g/L) ; Phytate de sodium C ₆ H ₆ O ₂₄ P ₆ Na _I2 (0,4 g/L). Sels minéraux :

(NtU) ₂ SO ₄ (3g/L), MnSO ₄₅ H ₂ O (7,5 mg/L), KCl (0,5 g/L), MgSO ₄ ,7H ₂ O (0,5 g/L),

CaCl ₂ ,2H ₂ O ( 0,1 g/L). Oligo éléments : H ₃ BO ₄ (500 μg/L), CuSO ₄ ,5H ₂ O (40 μg/L), KI (100 μg/L), Na ₂ MoO ₄ ,2H ₂ O (200 μg/L), ZnSO ₄ ,7H ₂ O (400 μg/L), FeCl ₃ ,6H ₂ O (200 μg/L). Vitamines : Pantothénate Ca (2 mg/L), Thyamine (Bl) (2 mg/L), Myo-inositol

(2 mg/L), Pyridoxine (B6) (2 mg/L), Ac. Nicotinique (PP) (0,5 mg/L), Biotine (0,02 mg/L).

7.3. Méthode enzymatique

L'activité phytasique est mesurée en suivant la libération de phosphate inorganique au cours du temps.

L'activité est mesurée en présence de 8 mM de phytate de sodium (Sigma) à différent pH, à 37°C (5 volumes). La réaction est déclenchée par l'addition de l'extrait enzymatique (1 volume). La réaction est stoppée par acidification du milieu avec de l'acide trichloracétique 20% (1 volume de milieu réactionnel + 1 volume d'acide). La quantité de phosphate libéré est déterminée après différents temps d'incubation, 0 à 20 min.

Une unité enzymatique (U) est définie comme la quantité d'enzyme qui libère une μmole de phosphate inorganique en 1 minute.

7.4. Dosage des phosphates

La quantité de phosphate libéré est mesurée par colorimétrie. La solution de révélation, préparée extemporanément, contient du sulfate de fer (380 mM, 1 volume) et de l'heptamolybdate d'ammonium (12 mM, 4 volumes). La mesure de l'absorbance, à 700 nm, se fait après 30 minutes de révélation à température ambiante (1 volume de milieu réactionnel + 1 volume de solution de révélation), à l'aide d'un spectrophotomètre UV/visible (Beckman DU 530).

Une droite d'étalonnage est préalablement établie avec du potassium dihydrogénophosphate.

7.5. Mise en évidence d'une activité phvtasique dans le surnageant de culture de P. stipitis

La production de phytase par P. stipitis est réalisée en Erlenmeyer de 1 L contenant 100 mL de milieu MSA, pauvre en phosphate (cf. 7.2). La seule source de phosphore est le phytate de sodium à 0,4 g/L.

Après 24 h de culture, la production de biomasse est de 4,5 g/L, l'activité phytasique du surnageant est de 23 ,5 U/L.

7.6. Caractérisation de l'activité phvtasique a) Préparation d 'un extrait enzymatique

Le surnageant de culture est concentré (14 fois) et lavé contre de l'eau par ultrafiltration à flux tangentiel (seuil de coupure 10 kDa). L'activité de l'extrait prépurifié est de 1148 U/L mesurée à pH 3,5. b) Effet du pH et de la température sur l 'activité de la phytase

L'effet du pH sur la phytase est déterminé, en mesurant l'activité enzymatique, en présence de différents tampons : pour les pH compris entre 2 et 3 (tampon glycine), pour les pH 3,5 à 6 (tampon acétate de sodium) (Figure 1 1). L'optimum de l'activité se situe à des pH acide, entre pH 2,5 et 4,5. La phytase perd 75 % d'activité à pH 6 et à pH 2.

L'optimum de température de la phytase de P. stipitis est de 60 ⁰ C à pH 3,5 (Figure 12).

7.7. Etudes cinétiques a) Etude des cinétiques d 'hydrolyse de I ' InsP _f ,

L'hydrolyse totale de l'InsP _ό a été suivie pendant 300 min. Le milieu réactionnel est composé de 0,340 mM de phytate de sodium, 0,08 U/mL de phytase, la réaction est effectuée à 5 pH (3- 4- 5,5- 6-6,5) (Figure 13). Les vitesses d'hydrolyse de l' InSP ₆ varient fortement en fonction du pH. Les deux pH les plus favorables sont pH 3 et pH 5,5. 90% à 98 % des phosphates inorganiques potentiels sont libérés. Les 6 liaisons phosphate de l'acide phytique sont donc hydrolysées. Il est curieux de constater qu'à

pH 4, seulement 80% de phosphate sont libérés, correspondant à 5 liaisons phosphate. Il est possible que 2 phytases soient présentes dans le surnageant de culture, avec deux pH optimum différents, pH 3 et 5,5. b) Etude des cinétiques d 'hydrolyse de I ' InsP? Les cinétiques d'hydrolyse sont réalisées dans du tampon acétate à pH 3,5, en présence de 1 mM d'Ins(2)Pi et 0,06 U/mL de phytase. 47% des phosphates potentiels sont libérés en 1 heure. Ceci confirme l'hydrolyse de la position axiale (2) des groupements phosphates de l'acide phytique.

La caractérisation de l'extrait enzymatique de P. stipitis montre que l'acide phytique (InsP ₆ ) est totalement hydrolyse à pH 3 et 5,5. La plage de pH optimum est comprise entre 2,5 et 4,5.

Ces deux éléments peuvent indiquer la présence de deux phytases dans l'extrait étudié.

Comme la phytase de D. castellii, et de P. pastoris, elle hydrolyse la totalité des groupements phosphates de l'acide phytique. Ce résultat conforte le rôle de l'arginine dans l'hydrolyse de Ins(2)Pi.

Exemple 8 : étude de phytases de Debaryomyces castellii mutées

8.1. Construction de protéines mutantes

Le plasmide pPICZαphytDc, résultant de l'insertion du gène phytDc de Debaryomyces castellii CBS 2923 dans le vecteur pPICZαB (vecteur de clonage pour P. pastoris), a été utilisé pour générer les mutations choisies (ref publi2). Deux simples mutants, H73A et R211 A, ont été construits. Mutant H73A : deux fragments d'ADN ont été amplifiés par PCR grâce à la polymérase "Phusion high fidelity DNA polymerase" (FinnZymes). Le premier fragment a été amplifié à l'aide des deux amorces suivantes : amorce sens 5TGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTA3' (SEQ ID NO :34) contenant le site de restriction Xhol, unique sur le vecteur pPICZαphytDc; amorce antisens 5'CTTTCACCAGCTCTGCTGAACAATTGGACTTGCTS' (SEQ ID NO :35) construite pour introduire la mutation choisie. Le deuxième fragment a été amplifié à l'aide des deux amorces suivantes : amorce sens

5'GTTCAGCAGAGCTGGTGAAAGATACCCATCCACTS' (SEQ ID NO :36) construite pour introduire la mutation choisie; amorce antisens

5 'GTACCAGCGTAGATACTGTCAGA 3' (SEQ ID NO :37) contenant le site de restriction EcoRI, unique sur le vecteur pPICZαphytDc. Les 2 fragments obtenus ont été purifiés à l'aide du kit GeneClean Turbo (Q-biogene) et utilisés comme hémimatrices pour générer par PCR l'hétéroduplex final portant la mutation H73A (amorce sens 5'TGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTAS ' (SEQ ID NO :38); amorce antisens 5'GTACCAGCGTAGATACTGTCAGA3'(SEQ ID NO :39). Ce fragment a été purifié à l'aide du kit GeneClean Turbo (Q-biogene) puis inséré dans le vecteur pPICZαphytDc, au niveau des sites Xhol et EcoRI.

Mutant R211A : la mutation a été générée de la même manière en utilisant les amorces suivantes : premier fragment : amorce sens

5'GTGTATCTTGAAAAGGAAACATCACCA3' (SEQ ID NO :40) contenant le site de restriction EcoRI, unique sur le vecteur pPICZαphytDc; amorce antisens 5'AACAACC ATC AGCTGGTGTTAATGAGTTGGC ACCC A3' (SEQ ID NO :41) construite pour introduire la mutation choisie; deuxième fragment : amorce sens 5αCACCAGCTGATGGTTGTTTCAACTACAATG3' (SEQ ID NO :42) construite pour introduire la mutation choisie; amorce antisens

5'CTGAGATGAGTTTTTGTTCTA3' (SEQ ID NO :43) contenant le site de restriction Xbal, unique sur le vecteur pPICZαphytDc; fragment final : amorce sens 5'GAAACATCACCAAAGAATTCT3'(SEQ ID NO :44); amorce antisens 5'CTGAGATGAGTTTTTGTTCTA3'(SEQ ID NO :45). Ce fragment a été purifié à l'aide du kit GeneClean Turbo (Q-biogene) puis inséré dans le vecteur pPICZαphytDc, au niveau des sites EcoRI et Xbal. La présence des mutations a été confirmée par séquençage de F ADN.

8.2. Transformation de Pichia pastoris avec les protéines mutées phvtR211A et phytH73A

Le vecteur pPICZα contenant le gène phytDc muté (15 μg) a été linéarisé par l'enzyme de restriction Sacl. La souche P. pastoris X33 a ensuite été transformée par électroporation (Manuel d'instruction Invitrogen pPICZαA, B et C, version E,

Invitrogen Ltd, UK) L' électroporation est réalisée grâce à un Gène pulseur (Biorad) réglé à 1,5 kV et 25 μF et à un Puise controller (Biorad) réglé à 200 ω. Les transformants R21 IA ont été sélectionnés en utilisant un crible coloré après culture sur milieu synthétique solide (Ragon M., Neugnot-Roux V., Chemardin P., Moulin G., and

Boze H. (2008) Molecular gène cloning and overexpression of the phytase from

Debarγomyces castellii CBS 2923. Protein Express. Purif. {Accepté pour publication) Les transformants H73A multicopies ont été sélectionnés sur milieu YPD solide (1 % extrait de levures, 2 % peptone, 2 % glucose) additionné de zéocine (1 mg/mL). Les transformants sélectionnés sur milieu solide ont été cultivés en bioréacteurs en mode fed-batch sur milieu synthétique en présence de méthanol (Ragon et al 2008). La phytase sécrétée a été purifiée par chromatographie d'interactions hydrophobes selon la méthode décrite par Ragon M ., Aumelas A., Chemardin P., Galvez S., Moulin G., and Boze H., (2007). Complète hydrolysis of wyo-inositol hexakisphosphate by a novel phytase from Debaryomyces castellii CBS 2923. Applied Microbiol. and Biotechnol. (Sous presse) .

8.3. Production de phytR21 IA et de phvtH73A

La production de phytR211A et phytH73A a été réalisée en fermenteur, sur milieu synthétique (Ragon et al 2008). Après trois cultures successives en batch, l'induction est initiée par apport de méthanol. La vitesse d'apport est modulée de façon à avoir un taux de croissance de 0,01 h ^"1 .

Le clone R211A produit, en 177h, 71 U/ml de protéine phytR211A. Le profil électrophorétique obtenu montre que la phytase, bien que majoritaire, est coproduite avec d'autres protéines. Le clone H73A produit une protéine, majoritaire à plus de

95%, de masse molaire apparente 77 KDa correspondant à la masse de la phytase. Cette protéine est inactive en raison de la mutation sur l'histidine catalytique (Tableau 4).

Ces deux protéines migrent à la même taille que la phytase native (77 KDa).

Tableau 4 : Evolution de la biomasse et de la production de phytase au cours des cultures des 2 clones exprimant les protéines mutées phytR21 IA et phytH73A

Mode de culture Clones

R211A H73A

Temps X Activité X Activité

LVgMS (h) (g/L) (U/mL) (g/L) (U/mL)

3 Batchs (glycérol) 30 65 60

Fed batch

1 16 82 28 0,34 102 0 (méthanol)

141 97 57 0,59 94 0

170 115 71 0,61 102 0

8.4. Purification de phyt R21 IA et phvtH73A

Les conditions de purification sont identiques à celles décrites par Ragon et al 2007. Les différentes étapes de purification des phytases modifiées sont résumées dans le tableau 5.

L'extrait est purifié par chromatographie hydrophobe, en une seule étape. Le facteur de purification est de 1,54, l'activité spécifique est de 256,4 U/mg de protéines pour la protéine phytR211A. La présence d'une seule bande protéique sur une électrophorèse SDS-PAGE montre que l'enzyme est pure. Sept mg de protéine pure à homogénéité ont été obtenus et utilisés pour les études biochimiques.

La protéine phytH73A est purifiée selon de la même façon que celle décrite ci-dessus. Cette protéine n'a aucune activité enzymatique en raison de la mutation sur l'histidine catalytique. Seize mg de protéine pure ont été obtenus. Un aliquote (3mg) est déglycosylé selon le protocole décrit par Ragon et al 2007.

Tableau 5 : Bilan des purifications des phytase mutantes phytR21 IA et phytH73A

R211A

Extrait brut 590 0,362 60,1 166,1 1,0

Extrait concentré et 30 5,103 986,3 215,8 1,3 ultrafiltré

Extrait purifié par chromatographie 20 0,370 94,8 256,3 1,5 d'interaction hydrophobe

H73A

Extrait brut 660 ND 0 0

Extrait concentré et 32 ND 0 0 ultrafiltré

Extrait purifié

(5,5) par 2,56 0 0 6,4 chromatographie

d'interaction hydrophobe

ND : Non déterminé

8.5. Caractérisation de phyt R21 1 A

a) Etude des cinétiques d 'hydrolyse des ImP _n par RMN

Les spectres protons ont été enregistrés à 600 MHz sur un spectromètre Avance Bruker équipé d'une cryosonde (IH, 13C et 15N) et de gradients sur l'axe z. Le signal résiduel de l'eau a été supprimé par une présaturation sélective d'une durée de 1 s. Tous les spectres ont été enregistrés à 17 ⁰ C (Ragon et al 2007).

L'échantillon utilisé pour suivre l'hydrolyse par RMN est préparé à partir d'une solution contenant 1 ,7mU InsP ₆ dans du tampon acétate 10 mM, pH4, H ₂ O/D ₂ 0, 16/84 v/v ; 6 μl de phytase, soit 60 mU. A partir des spectres caractéristiques des différents inositols phosphates déterminés précédemment, leur apparition et disparition peuvent être suivies sur l'ensemble de la cinétique pendant 16 h (figure 14) pour les deux protéines, native et mutante. L'apparition et la disparition successives de InsP ₆ , InsP ₅ , InSP ₄ , InsP ₃ , InsP ₂ , InsPi, inositol est observé dans les deux cas, avec cependant des vitesses très différentes. En 12 h, la phytase native PhytDc a hydrolyse la totalité des InsP _n en inositol alors que la phytase mutante phytR21 IA n'a hydrolyse que les InSP ₆ et InsPs pour un même temps. La comparaison des cinétiques d'hydrolyse permet de déduire les temps nécessaires pour atteindre la concentration optimale en chaque produit (tableau 6). Le temps nécessaire à l'obtention de la concentration optimale en InsPs, InsP ₄ et InsP ₃ est au moins 2 fois plus élevé pour la phytase phytR21 IA que pour la phytase native PhytDc. Le décalage des cinétiques est particuliairement accentué pour les InsP ₃ à InsP]. L'apparition de très faible quantité d'inositol (inférieur à 9%) montre toutefois que l'InsP ₂ et InsPi sont faiblement hydrolyses.

Tableau 6 : Comparaison des vitesses de dégradation des divers InsP _n par la phytase native PhtyDc et la phytase mutée phytR21 IA. Les données, déduites de la figure 14, indiquent le temps nécessaire pour atteindre la concentration optimale en chaque produit.

Temps (h)

Phyt DC phytR211A

InsP ₆ 0 0 InsP ₅ 1,5 2 InsP ₄ 3 4,5 InsP ₃ 5,5 13 InsP ₂ 7 >16 InsP, 8 >16 100% Inositol 12-13 »16

b) Comparaison des paramètres cinétiques Km et Vm

La comparaison des constantes cinétiques vis-à-vis de l'InsP ₆ montre une valeur de Km très proche pour les deux enzymes, native PhytDc et mutante phytR211A (tableau 7). L'efficacité catalytique est proche (facteur 2).

Par contre la valeur du Km vis-à-vis de l'Ins(2)Pi est 45 fois plus faible pour la protéine mutante que pour la native. L'efficacité catalytique est 5 fois plus faible pour l'enzyme phytR21 IA que pour la phytase native.

Tableau 7 : Comparaison des paramètres cinétiques des phytases native et mutante

Phytases Substrats

Ins P ₆ Ins(2)Pi pNPP

Phyt DC

Km (mM) 0,532 0,507 2,27

Kcat (s ^"1 ) 51,2 26,1 42,2

Kcat/Km tM-'.s ^"1 ) 0,96. 10 ⁵ 0,51.10 ⁵ 0,19.10 ⁵ phytR211A

Km (mM) 0,413 22,78 4,34

Kcat (s ¹ ) 83,7 201.3 77,12

Kcat/Km (M ^" ' .s ^' ') 2,03.10 ⁵ 0,142.10 ⁵ 0,178.10 ⁵

c) Activité en fonction du pH

La comparaison des courbes d'activité en fonction du pH montre un décalage de la courbe de pH pour la phytase phytR211 A vers les pH plus acide pour les valeurs de pH supérieure à 4. Les pH optimum d'activité sont inchangés (figure 15). Le profil de pH est généralement déterminé par l'ionisation des groupes catalytiques. Il est affecté par de nombreuses interactions liées au micro-environnement de l'enzyme et du substrat. La substitution de l'arginine chargée positivement par une alanine neutre peut affecter indirectement le pKa de l'acide aminé catalytique D336, induisant le shift de pH. La présence d'arginine chargée positivement crée un environnement favorable pour la liaison de substrats chargés négativement tels que les InsP _n et en particulier l'InsP ₆ et l'Ins(2)Pi. La substitution de l'arginine par l'alanine modifie l'affinité de l'enzyme vis- à-vis de l'Ins(2)Pi de façon drastique, alors que l'InSP ₆ ou un autre substrat phosphaté, le pNPP, sont peu touchés. Ces paramètres cinétiques ainsi que le suivi de l'hydrolyse des InsP _n par RMN confirment le rôle essentiel de l'arginine dans l'hydrolyse des phytates.