Titre de l'invention : Phytoecdysones et/ou dérivés de 20-hydroxyecdysone en combinaison avec un principe actif visant à restaurer l’expression SMN pour leur utilisation dans le traitement de l’amyotrophie spinale

Domaine technique de l’invention

[0001 ] L’invention relève de l’utilisation de phytoecdysones et/ou de dérivés hémisynthétiques de 20-hydroxyecdysone, en combinaison avec un principe actif visant la restauration de l’expression de la protéine SMN, pour le traitement de l’amyotrophie spinale.

Technique antérieure

[0002] Les maladies neuromusculaires sont caractérisées par une altération du fonctionnement des unités motrices, composées de motoneurones, jonctions neuromusculaires et muscles squelettiques. Quelle que soit l’origine de la maladie, nerveuse comme dans l’amyotrophie spinale ou la sclérose latérale amyotrophique, ou musculaire, toutes provoquent une altération de la fonction motrice des patients, pouvant aller du handicap à la mort prématurée lorsque des muscles vitaux sont atteints.

[0003] Parmi ces maladies neuromusculaires, deux sont décrites comme affectant spécifiquement les motoneurones : les amyotrophies spinales infantiles (ou SMA), dont les symptômes apparaissent à l’enfance, et la sclérose latérale amyotrophique (ou SLA), dont les symptômes se déclarent à l’âge adulte. Ces deux maladies neurodégénératives, aux causes et aux manifestations cliniques différentes, ont en commun une dénervation musculaire progressive, responsable d’une amyotrophie (Al-Chalabi et Hardiman, 2013 ; Crawford et Pardo, 1996).

[0004] Les amyotrophies spinales représentent la cause la plus commune de mortalité infantile d’origine génétique avec une prévalence de 1/6000 à 1/10000 naissances (Crawford et Pardo, 1996). Trois types principaux de sévérité sont décrits, suivant l’âge d’apparition des symptômes et la progression des atteintes cliniques, allant du type 1 , le plus sévère, au type 3, dont l’espérance de vie peut être supérieure à 40 ans. Les patients atteints de SMA présentent une atteinte symétrique des muscles squelettiques par atrophie de fibres musculaires isolées ou regroupées en fascicules. La quasi-totalité des SMA sont à prédominance proximale, c’est- à-dire touchant les muscles du tronc et proches du tronc. Progressivement, le déficit moteur s’étend, dans un premier temps, aux muscles des membres inférieurs, puis dans un second temps, aux muscles des membres supérieurs, en affectant préférentiellement les muscles extenseurs. Le gène responsable de la SMA a été identifié en 1995 sur le chromosome 5 et a été nommé SMN pour « survival of motor neurons » en terminologie anglo- saxonne (Lefebvre et al., 1995).

[0005] Bien que présentant une grande hétérogénéité clinique, des analyses génétiques ont pu démontrer que toutes les formes de SMA sont causées par l’altération homozygote du gène télomérique SMN1 (Survival Of Motor Neurons), empêchant la production de la protéine Smn, induisant la dégénérescence des neurones moteurs, l’atrophie et la faiblesse musculaires. Dans le génome humain, il existe une copie centromérique inverse de ce gène, le gène SMN2, pouvant être retrouvé en plusieurs copies (Lorson et al., 1998), mais qui ne permet de compenser que partiellement la perte de fonction du gène SMN1 . En effet, SMN2 présente 5 différences nucléotidiques avec SMN1 , dont une au niveau de l’exon 7, favorisant son excision par épissage dans 90% des ARNm produits par le gène SMN2. Cet épissage alternatif conduit à la production d’une protéine SMNA7 tronquée et instable. Ainsi, seuls 10% des protéines produites par le gène SMN2 sont complètes et fonctionnelles (Lefebvre et al., 1997 ; Vitte et al., 2007). Un lien a été démontré entre le nombre de copies du gène SMN2, leur niveau d’expression et la sévérité de la maladie.

[0006] Plusieurs stratégies thérapeutiques, à différents stades de développement, sont explorées dans l’amyotrophie spinale proximale liée à SMN1. Certaines stratégies étudiées ont pour but d’augmenter la quantité de protéine SMN fonctionnelle, soit en modifiant la maturation de l'ARN messager de SMN2 pour qu'il réintègre l’exon 7 manquant (Nusinersen, Risdiplam, Branaplam), soit en apportant le gène SMN1 par thérapie génique (Zolgensma®). [0007] D’autres visent à ralentir l’évolution de la maladie en protégeant les motoneurones ou en améliorant le fonctionnement des jonctions neuromusculaires (Salbutamol, Pyridostigmine), ou les performances musculaires (SRK-015, entrainement physique). Néanmoins, la majorité des approches thérapeutiques testées dans la SMA visent à augmenter les niveaux d’expression de la protéine SMN, soit de manière localisée au niveau du système nerveux central et/ou de façon plus générale aux autres organes, de manière périphérique.

[0008] La thérapie génique pour apporter le gène SMN1 en utilisant des vecteurs viraux adéno-associés (AAV) a montré des effets bénéfiques importants lors des études précliniques chez la souris, et dans les essais cliniques chez l’homme (Mendell et al. 2017 ; Passini et al., 2010 ; Lowes et al., 2018). D’autres approches se concentrant sur la modulation de l’épissage du SMN2 ont également prouvé leur efficacité (Naryshkin et al., 2014 ; Palacino et al., 2015 ; Finkel et al., 2016 ; Finkel et al., 2017). Ces résultats très positifs ont permis l’autorisation règlementaire de certaines molécules.

[0009] Trois traitements sont actuellement disponibles dans la SMA :

- Le premier traitement à avoir été autorisé dans la SMA est le Spinraza® (nusinersen). Ce traitement a reçu l’autorisation de mise sur le marché (AMM) en décembre 2016 aux Etats Unis et en Juin 2017 en Europe. Il s’agit d’un oligonucléotide antisens (ASO) développé dans le but d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle en agissant sur la maturation (l’épissage) du gène SMN2. Les oligonucléotides antisens ne traversant pas la barrière hémato-encéphalique, le nusinersen doit être administré de façon régulière par voie intrathécale, permettant une réexpression de la protéine SMN dans les motoneurones, avec un bénéfice clinique réel, mais d’importance variable selon le type de SMA et l’âge de début du traitement. Des séquences d’oligonucléotides antisens ayant la capacité de modifier l’épissage du gène SMN2 sont données dans les demandes W02007/002390 et WO2018/014041 .

- Plus récemment, le Zolgensma® (Onasemnogène abeparvovec ou AVXS-101 ), un produit de thérapie génique visant à apporter le gène SMN1 à l’aide d’un vecteur viral (AAV) a été autorisé (AMM en Mai 2019 aux Etats-Unis et une AMM conditionnelle en Mai 2020 en Europe). Son administration unique est plus aisée, car elle est réalisée par voie intraveineuse.

- Enfin, l’Evrysdi® (Risdiplam ou R07034067) a été autorisé encore plus récemment (AMM en Août 2020 aux Etats Unis et en Mars 2021 en Europe). Il s’agit d’une petite molécule qui agit sur la maturation du gène SMN2. Son administration se fait de manière quotidienne par voie orale ou par sonde d’alimentation.

[0010] Bien que la restauration du gène SMN ait permis une amélioration sans précédent au niveau des mesures fonctionnelles chez les patients ainsi que leur fonction motrice, d’importants déficits persistent chez les patients atteints de SMA après le traitement, et ce, même si l’intervention est précoce (Mercuri et al., 2018 ; Finkel et al., 2017 ; Baranello et al., 2018).

[001 1 ] Les études précliniques ont montré que ces déficits post-traitement se retrouvaient dans les modèles de souris SMA, où les animaux traités présentaient une espérance de vie réduite, un déficit au niveau du poids corporel et de la masse et de la fonction musculaires par rapport aux animaux sains (Passini et al., 2010 ; Hua et al, 2010, 201 1 ; Feng et al., 2016).

[0012] De plus, il subsiste malgré tout d’autres limites et des préoccupations importantes concernant ces traitements. Par exemple, le nusinersen doit être administré par injection intrathécale, très invasive, plusieurs fois par an. Ce mode d’administration est très difficile et parfois impossible pour des patients ayant subi des chirurgies pour des scolioses, ce qui exclut le nusinersen comme option thérapeutique pour ces patients. De plus, l’administration intrathécale permet une distribution spécifique au niveau du système nerveux central, ce qui signifie que tous les symptômes ne peuvent pas être entièrement couverts. Sur ce dernier aspect, l’onasemnogène bénéficie d’un avantage, car il est administré de manière intraveineuse, et permet une distribution systémique. Néanmoins, la question de la biodisponibilité du sérotype AAV9 est toujours ouverte, ainsi que le fait que l’expression transgénique à long terme devrait être limitée aux cellules postmitotiques comme les neurones (Chaytow et al., 2021 ). Bien que l’onasemnogène soit annoncé comme une thérapie ne nécessitant qu’une seule injection, il reste à savoir si le traitement durera tout au long de la vie des patients, ou si des rappels seront nécessaires.

[0013] Le risdiplam, quant à lui, est une thérapie systémique, moins invasive, par administration orale quotidienne. Cependant, dans la mesure où le risdiplam cible la machinerie d’épissage, il peut également affecter d’autres transcriptions, entraînant des effets secondaires non ciblés inconnus et incontrôlables. En effet, il a été décrit que le risdiplam semblait avoir un effet sur un régulateur de la division cellulaire à des concentrations élevées, faisant craindre des effets secondaires oncogéniques (Ratni et al., 2018).

[0014] Les phytoecdysones représentent une importante famille de stérols polyhydroxylés. Ces molécules sont produites pas diverses espèces de plantes (fougères, gymnospermes, angiospermes) et participent à leur défense contre les insectes ravageurs. La phytoecdysone majoritaire du règne végétal est la 20-hydroxyecdysone.

[0015] Le brevet FR 3 021 318 divulgue que les phytoecdysones, et plus particulièrement la 20-hydroxyecdysone (20E), ont fait l'objet de nombreuses études pharmacologiques. Ces études ont mis en avant les propriétés antidiabétiques et anabolisantes de cette molécule. Ses effets stimulants sur les synthèses protéiques dans les muscles sont observés chez le rat in vivo (Syrov et al., 2000 ; Tôth et al., 2008 ; Lawrence et al., 2012) et sur des myotubes murins C2C12 in vitro (Gorelick-Feldman et al., 2008). Certains des effets décrits ci-dessus dans des modèles animaux ont été retrouvés dans des études cliniques, encore peu nombreuses. Ainsi, la 20E favorise l’augmentation de la masse musculaire chez de jeunes sportifs (Simakin et al., 1988).

[0016] Enfin, le brevet français FR 19 02726 décrit en outre l’utilisation de phytoecdysones et de dérivés hémi-synthétiques de celles-ci pour le traitement de maladies neuromusculaires en particulier l’amyotrophie spinale infantile et la sclérose latérale amyotrophique (Latil et al., 2020).

[0017] Les éléments ci-dessus indiquent que, même si les thérapies qui augmentent l’expression de la protéine SMN peuvent avoir des effets importants sur l’évolution de la maladie et la qualité de vie des patients, il reste utile de trouver des approches thérapeutiques complémentaires qui permettraient de réduire les doses d’administration des traitements déjà autorisés, ou leur fréquence d’administration ou enfin d’améliorer les gains fonctionnels afin de réduire davantage le fardeau de la maladie.

Présentation de l'invention

[0018] La présente invention a pour objectif de fournir un traitement de l’amyotrophie spinale, ledit traitement étant amélioré par rapport aux traitements existants.

[0019] Les inventeurs ont découvert de manière inattendue que les phytoecdysones (notamment la 20E et des dérivés hémi-synthétiques de celle-ci) avaient un effet bénéfique et synergique lorsqu’ils sont utilisés en thérapie combinée avec un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle, chez des mammifères atteints d’une amyotrophie spinale. En effet, l’utilisation de phytoecdysones et/ou d’au moins un dérivé hémi-synthétique de la 20-hydroxyecdysone, en combinaison avec un traitement utilisant un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle, améliore par synergie de ces éléments les performances motrices et fonctionnelles ainsi que la survie et le poids d’animaux atteints d’amyotrophie spinale (SMA).

[0020] A cet effet, la présente invention vise au moins une phytoecdysone et/ou au moins un dérivé hémi-synthétique de 20-hydroxyecdysone, et au moins un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle, pour leur utilisation en thérapie combinée dans le traitement de l’amyotrophie spinale.

[0021 ] Dans des modes de réalisation particuliers de la présente invention, l’invention vise au moins une phytoecdysone et/ou au moins un dérivé hémisynthétique de 20-hydroxyecdysone, et au moins un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle, pour leur utilisation en thérapie combinée dans le traitement d’une affection des motoneurones, ladite affection participant à la SMA.

[0022] Dans le contexte de la présente demande, le terme "thérapie combinée" désigne la co-administration d’au moins deux agents biologiquement actifs. Dans le cas de la présente invention, un premier agent actif est choisi parmi les phytoecdysones ou les dérivés hémi-synthétiques de 20- hydroxyecdysone ou est une composition comprenant au moins une phytoecdysones et/ou au moins un dérivé hémi-synthétique de 20- hydroxyecdysone, un deuxième agent actif étant le principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle. La thérapie combinée peut comprendre une seule formulation ou plusieurs formulations. La co-administration peut être effectuée de façon simultanée ou séquentielle. La co-administration peut être effectuée par la même voie d’administration ou par des voies d’administration différentes. Elle est considérée comme une thérapie combinée tant que les effets des deux (ou plus) agents se chevauchent chez le sujet pour obtenir des effets cliniques supplémentaires, additifs ou synergiques.

[0023] Dans des modes particuliers de réalisation, l’invention répond en outre aux caractéristiques suivantes, mises en oeuvre séparément ou en chacune de leurs combinaisons techniquement opérantes.

[0024] Dans des modes de réalisations particuliers, ladite au moins une phytoecdysone et/ou ledit au moins un dérivé hémi-synthétique de 20- hydroxyecdysone, et ledit au moins un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle sont coadministrés.

[0025] Dans des modes de réalisations particuliers, ladite au moins une phytoecdysone et/ou ledit au moins un dérivé hémi-synthétique de 20- hydroxyecdysone, et ledit au moins un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle sont coadministrés au sein d’une même composition.

[0026] Dans des modes de réalisations particuliers, ladite au moins une phytoecdysone et/ou ledit au moins un dérivé hémi-synthétique de 20- hydroxyecdysone sont administrés par voie orale ou systémique au mammifère, et ledit au moins un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle est administré au mammifère par voie orale et/ou intrathécale et/ou intraveineuse.

[0027] Pour les administrations par voie orale, ladite au moins une phytoecdysone et/ou ledit au moins un dérivé hémi-synthétique de 20-hydroxyecdysone et/ou le principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle, est de préférence incorporée à une formulation pharmaceutique acceptable pouvant être administrée par voie orale.

[0028] L’augmentation de la production de protéine SMN peut être obtenue par thérapie génique ou par thérapie du gène. Selon un mode de mise en oeuvre de thérapie génique, le principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN vise à apporter le gène SMN1 . Selon un mode de mise en oeuvre d’une thérapie du gène le principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN est soit une petite molécule qui agit sur la maturation du gène SMN2, ou un oligonucléotide antisens (ASO) développé dans le but d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle en agissant sur l’épissage (maturation) du gène SMN2. Dans ce dernier cas, l’ASO vient moduler l’épissage de SMN2 ce qui permet d’augmenter l’inclusion de l’exon 7 dans l’ARNm de SMN2 et ainsi permet d’augmenter le nombre de protéines SMN générées ayant les acides aminés correspondant à l’exon 7 et correspondant donc à une protéine SMN fonctionnelle.

[0029] Ainsi, dans des modes de réalisation particuliers de la présente invention, le principe actif a la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle par thérapie génique ou par thérapie du gène.

[0030] Dans des modes de réalisation particuliers de la présente invention, le principe actif a la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle par apport du gène SMN1 .

[0031 ] Dans des modes de réalisation particuliers de la présente invention, le principe actif a la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle par action sur la maturation du gène SMN2.

[0032] Dans des modes de réalisations particuliers, le principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle est un oligonucléotide antisens (ASO). Cet ASO a de préférence une séquence de 10 à 30 nucléotides, encore de préférence de 12 à 30 nucléotides, préférentiellement 12 à 25 nucléotides ou encore préférentiellement 15 à 20 nucléotides. Selon des modes de réalisation préférés de la présente invention, l’ASO a une séquence de 18 nucléotides. [0033] Dans des modes de réalisation particulier de la présente invention, l’ASO a la capacité d’induire l’inclusion de l’exon 7 dans la séquence du gène SMN2.

[0034] Dans des modes de réalisation particulier de la présente invention, l’ASO est complémentaire à au moins 50%, de préférence au moins 60%, préférentiellement au moins 70%, encore de préférence à au moins 80%, de manière préférée à au moins 90%, de préférence au moins 95%, de manière préférée 98%, préférentiellement 100%, de la séquence de l’acide nucléique codant pour le pré-ARNm du gène humain SMN2.

[0035] Dans des modes de réalisation particulier de la présente invention, l’ASO est complémentaire à au moins 50%, de préférence au moins 60%, préférentiellement au moins 70%, encore de préférence à au moins 80%, de manière préférée à au moins 90%, de préférence au moins 95%, de manière préférée 98%, préférentiellement 100%, d’une séquence appartenant à l’intron 6, à l’intron 7 ou à une partie de l’exon 7 et une partie d’un intron adjacent à l’exon 7, de l’acide nucléique codant pour le pré- ARNm du gène humain SMN2. De cette manière l’exon 7 est inclus dans l’ARNm de SMN2 ce qui permet l’obtention d’une protéine SMN fonctionnelle.

[0036] La séquence de l’acide nucléique codant pour le pré-ARNm du gène humain SMN2 est disponible sur Genbank sous la référence NG_008728, version NG_008728.1.

[0037] Dans des modes de réalisation particuliers, l’ASO est une séquence identique ou similaire à au moins 50% avec la séquence SEQ ID NO : 1 donnée dans le listage de séquence déposé avec la présente demande (5'-TCACTTTCATAATGCTGG-3'), de préférence identique ou similaire à au moins 60%, préférentiellement au moins 70%, encore de préférence à au moins 80%, de manière préférée à au moins 90% et de préférence identique ou similaire à 100%. La séquence SEQ ID NO : 1 est complémentaire à 18 bases de l’intron 7 (bases 10 à 27) du gène SMN2.

[0038] Dans des modes de réalisation particuliers, l’ASO a une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 1 1 , SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 21 , SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO : 28, SEQ ID NO : 29. Ces séquences permettent à l’ASO de cibler l’intron 7 du gène SMN2.

[0039] Lorsque la séquence de l’ASO présente un pourcentage d’identité ou similarité inférieur à 100 % par rapport à une des séquences listées ci- avant, elle peut présenter des insertions, délétions et/ou substitutions par rapport à cette séquence de référence.

[0040] Le pourcentage d’identité entre deux séquences d’ASO est déterminé en comparant les deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison. La partie de la séquence d’un ASO dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence de manière à obtenir un alignement optimal entre les deux séquences.

[0041 ] Le pourcentage d’identité est calculé en déterminant le nombre de positions pour lesquelles une base nucléique est identique dans les deux séquences comparées, puis en divisant ce nombre de positions par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, le nombre obtenu étant multiplié par cent.

[0042] L’ASO est de préférence composé d’un squelette phosphodiester. Il peut posséder diverses modifications au niveau de son squelette et/ou de sa structure chimique afin d’augmenter sa stabilité et/ou son affinité pour l’ARN et/ou de présenter un avantage significatif en termes de pharmacocinétique.

[0043] Dans des modes de réalisation particuliers, l’ASO comporte au moins une modification choisie parmi :

- une modification au niveau du groupement phosphate tel qu’un phosphorothioate, ou un méthylphosphanate, ou un phosphoroamidate,

- une modification chimique en position 2’ du ribose, tel qu’un 2’0-méthyl (2’OMe) ou un 2’0-méthoxyéthyl (2’MOE) ou un 2’ Fluoro (2’ F),

- au moins une modification de nucléobases telle que la méthylation de pyrimidine de type 5’ methylcytosine, 5-methyluridine/ribothymidine, ou « G-clamp », - au moins un changement substantiel dans la structure du sucre, conduisant à une variété de molécules, telles que les morpholinos (PMO pour « phosphoroamidate morpholino oligomer » en terminologie anglosaxonne) ou les acides nucléiques peptidiques (PNA pour « Peptide nucleic acid » en terminologie anglosaxonne) ou les oligonucléotides de type contraint (LNA pour « locked nucleic acid » en terminologie anglosaxonne ou cEt pour « 2’-4’-constrained ethyl » en terminologie anglosaxonne ou les tc-DNA pour tricyclo-ADN).

[0044] Dans des modes de réalisation particuliers, l’ASO est de séquence identique ou similaire à au moins 50% avec la séquence SEQ ID NO : 23, de préférence identique ou similaire à au moins 60%, préférentiellement au moins 70%, encore de préférence à au moins 80%, de manière préférée à au moins 90% et de préférence identique ou similaire à 100%. La séquence SEQ ID NO : 23 correspond à la séquence SEQ ID NO :1 avec 2'-O- méthoxyéthyl sur l’atome de carbone 2’ du désoxyribose pour chaque base, avec un squelette phosphorothioate, et avec des 5-méthyl cytosines à la place des cytosines. Le squelette phosphothioate améliore avantageusement la stabilité de l’ASO, les 5-méthyl cytosines permettent avantageusement de rendre l’ASO moins sensible aux nucléases et le 2'- O-méthoxyéthyl sur l’atome de carbone 2’ du désoxyribose permet de manière avantageuse de diminuer la réponse immune induite par l’administration de l’ASO.

[0045] Dans des modes de réalisation particuliers de la présente invention, l’ASO est administré à une dose comprise entre 0,01 et 10 mg par kilogramme chez l’humain. De préférence cette dose est administrée par jour ou par semaine.

[0046] Pour leur utilisation dans la présente invention, les phytoecdysones et les dérivés hémi-synthétiques de 20-hydroxyecdysone sont avantageusement purifiés au grade pharmaceutique.

[0047] Une phytoecdysone utilisable selon l’invention est par exemple la 20- hydroxyecdysone.

[0048] À cet effet, selon des modes particuliers de réalisation de la présente invention, ladite au moins une phytoecdysone est la 20-hydroxyecdysone. [0049] La 20-hydroxyecdysone et ses dérivés hémi-synthétiques sont avantageusement purifiés au grade pharmaceutique.

[0050] La 20-hydroxyecdysone utilisée est de préférence sous forme d’un extrait de végétaux riches en 20-hydroxyecdysone ou d’une composition comportant à titre d’agent actif la 20-hydroxyecdysone. Des extraits de végétaux riches en 20-hydroxyecdysone sont par exemple des extraits de Stemmacantha carthamoides (aussi appelée Leuzea carthamoides), Cyanotis arachnoidea et Cyanotis vaga.

[0051 ] Les extraits obtenus sont de préférence purifiés au grade pharmaceutique.

[0052] Dans un mode de réalisation la 20-hydroxyecdysone est sous forme d’extrait de plante ou d’une partie de plante, ledit extrait comportant au moins 95%, et de préférence au moins 97%, de 20-hydroxyecdysone. Ladite plante est de préférence choisie parmi les végétaux contenant au moins 0,5% de 20-hydroxyecdysone en poids sec dudit végétal. Ledit extrait est de préférence purifié au grade pharmaceutique.

[0053] Ledit extrait est appelé par la suite BIO101 . Il comporte de façon remarquable entre 0 et 0.5 %, en poids sec de l’extrait, d’impuretés, comme des composés mineurs, susceptibles d’affecter l’innocuité, la disponibilité ou l’efficacité d’une application pharmaceutique dudit extrait.

[0054] La plante à partir de laquelle est produit BIO101 est de préférence choisie parmi Stemmacantha carthamoides, Cyanotis arachnoidea et Cyanotis vaga.

[0055] Les dérivés hémi-synthétiques de 20-hydroxyecdysone sont obtenus par hémisynthèse et peuvent notamment être obtenus de la façon décrite dans la demande de brevet européenne n° EP 15732785.9.

[0056] Dans un mode de réalisation particulier, les phytoecdysones sont administrées à une dose comprise entre 3 et 15 milligrammes par kilogramme par jour chez l’humain. On entend ici par phytoecdysones, aussi bien les phytoecdysones de manière générale que la 20- hydroxyecdysone (notamment sous forme d’extrait) et ses dérivés hémisynthétiques.

[0057] De préférence, les phytoecdysones sont administrées à une dose de 200 à 1000 mg/jour, en une ou plusieurs prises, chez un humain adulte, et une dose de 5 à 350 mg/jour, en une ou plusieurs prises, chez l’humain enfant ou le nourrisson. On entend ici par phytoecdysone, aussi bien les phytoecdysones de manière générale que la 20-hydroxyecdysone (notamment sous forme d’extrait) et ses dérivés hémi-synthétiques.

[0058] Dans des modes de réalisation particuliers de la présente invention, ledit au moins un dérivé hémi-synthétique de 20-hydroxyecdysone est choisi parmi : - un composé de formule générale (I) :

[Chem. 1 ] dans laquelle :

R ¹ est choisi parmi : un groupement (Ci-C6)W(Ci-Ce) ; un groupement (Ci-C6)W(Ci-C6)W(Ci-C6) ; un groupement (Ci-C6)W(Ci-Ce)CO2(Ci- Ce); un groupement (Ci-Ce)A, A représentant un hétérocycle éventuellement substitué par un groupement de type OH, OMe, (Ci-Ce), N(Ci-Ce), CO2(Ci-Ce) ; un groupement CH2Br ;

W étant un hétéroatome choisi parmi N, O et S, de préférence O et encore plus préférentiellement S ; et,

- un composé étant de formule (II) :

[Chem. 2]

[0059] Dans le cadre de la présente invention on entend par « (Ci-Ce) », tout groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbones, linéaire ou ramifié, en particulier, les groupes méthyle, éthyle, n-propyle, iso-propyle, n-butyle, iso- butyle, sec-butyle, t-butyle, n-pentyle, n-hexyle. Avantageusement il s’agit d’un groupe méthyle, éthyle, iso-propyle ou t-butyle, en particulier d'un groupe méthyle ou éthyle, plus particulièrement d’un groupe méthyle.

[0060] Dans le cadre de la présente invention on entend par hétérocycle de préférence un cycle comprenant 5 ou 6 atomes dont un ou deux hétéroatomes (O, S ou N), les atomes restants étant des atomes de carbone.

[0061 ] Dans un mode de réalisation préféré de la présente invention, dans la formule générale (I) :

R ¹ est choisi parmi : un groupement (Ci-C6)W(Ci-Ce) ; un groupement (Ci- C6)W(Ci-C6)W(Ci-C6) ; un groupement (Ci-C6)W(Ci-C6)CO2(Ci-C6); un groupement (Ci-Ce)A, A représentant un hétérocycle éventuellement substitué par un groupement de type OH, OMe, (Ci-Ce), N(Ci-Ce), CO2(Ci- C ₆ ) ;

W étant un hétéroatome choisi parmi N, O et S, de préférence O et de préférence encore S.

[0062] Dans des modes particuliers de réalisation de la présente invention ledit au moins un dérivé hémi-synthétique de 20-hydroxyecdysone est un composé choisi parmi les composés suivants : n° 1 : (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihydroxy-10,13-diméthyl -17- (2-morpholinoacétyl)-2,3,4,5,9,1 1 ,12,15,16,17-décahydro-1 H- cyclopenta[a]phénanthrèn-6-one, n° 2 : (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihydroxy-17-[2-(3- hydroxypyrrolidin-1 -yl)acétyl]- 10,13-diméthyl-2,3,4,5,9,11 ,12,15,16,17- décahydro-1 H-cyclopenta[a]phénanthrèn-6-one; n° 3 : (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihydroxy-17-[2-(4-hydrox y-1 - pi péridyl)acétyl]-10,13-diméthyl-2,3,4,5,9,1 1 ,12,15,16,17-décahydro-1 H- cyclopenta[a]phénanthrèn-6-one; n° 4 : (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihydroxy-17-[2-[4-(2- hydroxyéthyl)-1 -pipéridyl]acétyl]- 10,13-diméthyl-2,3,4,5,9,1 1 ,12,15,16,17- décahydro-1 H-cyclopenta[a]phénanthrèn-6-one; n° 5 : (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-17-[2-(3-diméthylaminopropyl (méthyl)amino)acétyl]-2,3,14-trihydroxy-10,13-diméthyl-

2, 3, 4, 5, 9,11 ,12,15,16,17-décahydro-1 H-cyclopenta[a]phénanthrèn-6-one; n° 6 : 2-[2-oxo-2-[(2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihydroxy-10, 13- diméthyl-6-oxo-2,3,4,5,9,1 1 ,12,15,16,17-décahydro-1 H- cyclopenta[a]phénanthrèn-17-yl]éthyl]sulfanylacétate d’éthyle; n° 7 : (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-17-(2-éthylsulfanylacétyl)-2,3, 14- trihydroxy-10,13-diméthyl-2,3,4,5,9,11 ,12,15,16,17-décahydro-1 H- cyclopenta[a]phénanthrèn-6-one; n° 8 : (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihydroxy-17-[2-(2- hydroxyéthylsulfanyl)acétyl]-10,13-diméthyl-2,3,4,5,9,1 1 ,12,15,16,17- décahydro-1 H cyclopenta[a]phénanthrèn-6-one.

[0063] Selon un autre aspect, la présente invention vise une composition comprenant :

- au moins une phytoecdysone et/ou au moins un dérivé hémi-synthétique de 20-hydroxyecdysone,

- au moins un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle, pour son utilisation dans le traitement d’une maladie neuromusculaire chez le mammifère, notamment une amyotrophie spinale.

[0064] Cette utilisation de la composition peut répondre à l’une ou plusieurs des caractéristiques décrites ci-avant en référence à l’utilisation en thérapie combinée de ladite au moins une phytoecdysone et/ou d’au moins un dérivé hémi-synthétique de 20-hydroxyecdysone, et dudit au moins un principe actif ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN fonctionnelle.

[0065] Dans des modes de réalisation la composition est incorporée à une formulation pharmaceutique acceptable pouvant être administrée par voie orale ou par voie intrathécale ou par voie systémique.

[0066] Dans le cadre de la présente invention on entend par « pharmaceutique acceptable >> ce qui est utile dans la préparation d'une composition pharmaceutique, qui est généralement sûr, non toxique et qui est acceptable pour une utilisation vétérinaire de même que pharmaceutique humaine.

Brève description des figures

[0067] L’invention sera mieux comprise à la lecture de la description suivante, donnée à titre d’exemple nullement limitatif, et faite en se référant aux figures qui représentent :

[0068] [Fig. 1 ] la Figure 1 représente la courbe de l’évolution pondérale de souris SMA (Smn ^A7/A7 ; huSMN2 ^+/_ ) traitées avec BIO101 seul ou avec un ASO mismatch ou avec un ASO 10-27 seul, ou avec une combinaison ASO 10- 27 + BIO101 , à partir de la naissance (PO) jusqu’à la mort des souris. Ici et dans la suite de la description, P correspond au nombre de jours après la naissance (post natal) ;

[0069] [Fig. 2] la figure 2 est une représentation de Kaplan-Meier des courbes de survie des souris SMA (Smn ^A7/A7 ; huSMN2 ^+/_ ) traitées avec BIO101 seul ou avec un ASO mismatch ou avec un ASO 10-27 seul, ou avec une combinaison ASO 10-27 + BIO101 , à partir de la naissance (PO) ;

[0070] [Fig. 3] la figure 3 représente les performances motrices (capacités de déplacement) évaluées par le test open field des souris SMA (Smn ^A7/A7 ; huSMN2 ^+/_ ) traitées avec BIO101 seul ou avec un ASO mismatch ou avec un ASO 10-27 seul, ou avec une combinaison ASO 10-27 + BIO101 , à partir de la naissance (PO) ;

[0071 ] [Fig. 4] la figure 4 représente les performances motrices (fatigabilité musculaire) évaluées par le grip-test des souris SMA (Smn ^A7/A7 ; huSMN2 ^+/_ ) traitées avec BIO101 seul ou avec un ASO mismatch ou avec un ASO 10- 27 seul, ou avec une combinaison ASO 10-27 + BIO101 , à partir de la naissance (PO).

[0072] Pour chacune des figures, les résultats sont présentés en moyenne ± SEM avec *p<0.05, **p<0.01 , ***p<0.001 et ****p<0.0001 .

[0073] Dans la suite de la description, n correspond à la taille de l’échantillon et p correspond à la « p-valeur >> utilisée pour quantifier la significativité statistique d’un résultat. De plus, p=ns indique la non-significativité de la p- valeur.

Description des modes de réalisation

[0074] L’invention sera décrite ci-après dans le contexte particulier d’un de ses domaines d’application préférés, non limitatif.

[0075] 1 . Description et injection de l’oligonucléotide antisens (ASO)

[0076] L’oligonucléotide antisens (ASO) de séquence SEQ ID NO : 23 (5'- TCACTTTCATAATGCTGG-3'), de référence ISIS 396443, aussi connu sous le nom ISIS-SMNRx, et appelé dans la suite de la description ASO 10- 27, complémentaire à 18 bases (bases 10 à 27) de l’intron 7 du gène SMN2 (ciblant un site de l’intron 7, appelé ISS-N1 , qui réprime l’inclusion de l’exon 7 de l’ARN pré-messager (pré-ARNm) du gène SMN2) possédant des nucléotides modifiés 2'-0-methoxyethyl sur l’atome de carbone 2’ du désoxyribose pour chaque base, avec un squelette phosphorothioate et des 5-methyl cytosines et l’ASO contrôle (noté mismatch) de séquence SEQ ID NO : 24 (5'-TTAGTTTAATCACGCTCG-3') (Singh et al. 2006 ; Williams et al. 2009), ont été synthétisés et purifiés tel que décrit précédemment (Baker et al. 1997, Hua et al. 2008 ; Passini et al., 201 1 ). Les oligonucléotides sont re-suspendus à la concentration de 8pg/uL dans du NaCI 0,9% et conservés à -20°C.

[0077] Le jour de l’injection, la solution stock d’ASO est diluée à la concentration de 2pg/pL dans du NaCI 0,9%. Du bleu de méthylène 0,04% est ajouté dans la solution comme témoin d’injection. Les souriceaux SMA nouveau-nés reçoivent une dose unique d’ASO 10-27 ou d’ASO mismatch de 8pg au 1 ^er jour postnatal (PO) par injection intra-cérébro-ventriculaire unilatérale à l’aide d’une seringue Hamilton et d’une aiguille 32G. Le site d’injection est situé à 1 mm de la suture sagittale, entre bregma et lambda, points de repères visibles à travers la peau à PO. L’aiguille est positionnée perpendiculairement au site d’injection à la surface de la peau et insérée à environ 3mm de profondeur pour atteindre le ventricule latéral.

[0078] 2. Co-administration de BIO1 Q1

[0079] Le traitement complémentaire BIO101 complexé à la cyclodextrine est administré quotidiennement aux souriceaux dès le premier jour post-natal (PO) par voie orale à la dose de 50mg/kg à l’aide d’une pipette.

[0080] 3. Activité biologique de BIO1 Q1 en combinaison avec l’ASO

[0081 ] a. Analyse des effets du traitement combiné ASO 10-27 + BIO101 sur le poids et la survie

[0082] Un modèle de souris SMA sévère a été utilisé sur fond génétique FVB/NRj, caractérisé par l’invalidation de l’exon 7 du gène murin Smn et exprimant deux copies du transgène humain SMN2 (Smn ^A7/A7 ; huSMN2- ^/+ ) (Hsieh et al., 2000). Les souris issues de ces croisements ayant le génotype « FVB/NRj-Smn ^A7/A7 huSMN2 ⁷⁺ 2 copies >> sont décrites comme « SMA >> (Hsieh ét al., 2000). Les souris SMA ont été traitées soit avec BIO101 seul ou un ASO mismatch ou un ASO 10-27 seul, ou avec un traitement combiné ASO 10-27 + BIO101 à partir de PO. La survie (Figure 1 ) et le poids (Figure 2) des souris ont été analysés quotidiennement.

[0083] La durée de vie moyenne des souriceaux (Figure 1 ) traités avec BIO101 seul (1 1 jours) est sensiblement identique à celle des souriceaux traités avec l’ASO mismatch (13 jours). Tel que décrit en 201 1 par Passini et al., le traitement avec l’ASO 10-27 seul à la dose de 8pg augmente significativement la durée de vie moyenne des souriceaux SMA, avec une médiane de survie de 18 jours (amélioration de 38% de la survie des animaux), contre une médiane de survie de 13 jours dans le groupe contrôle ASO mismatch. Lorsque le traitement BIO101 est administré en combinaison avec l’ASO 10-27 la médiane de survie augmente à 22,5 jours, soit une amélioration de 73% de la survie des animaux.

[0084] Le poids des souriceaux (Figure 2) traités avec BIO101 seul est comparable à celui des souriceaux traités avec l’ASO mismatch tout au long de leur vie.

[0085] Le traitement avec l’ASO 10-27 seul n’augmente pas le poids moyen des souriceaux SMA par rapport au traitement contrôle avec l’ASO mismatch à P7, mais il l’augmente significativement de 9,9% à P8 et 13,9% à P9. La combinaison ASO 10-27 + BIO101 induit un effet synergique sur le poids des souriceaux SMA avec une augmentation significative de 1 1 ,3% à P7, 16,5% à P8 et 24,9% à P9.

[0086] A P10, le traitement avec l’ASO 10-27 seul augmente significativement le poids moyen des souriceaux SMA (+16%) par rapport au traitement contrôle avec l’ASO mismatch. En combinaison avec l’ASO 10-27, BIO101 induit un effet synergique sur le poids des souriceaux SMA avec une augmentation significative de +30,9% à P10 (p<0.05), soit quasiment 2 fois plus élevée que celle observée avec l’ASO 10-27 seul.

[0087] Cette augmentation du poids corporel des souriceaux traités avec l’ASO 10- 27 + BIO101 par rapport à celui des souriceaux traités avec l’ASO 10-27 seul continue jusqu’à leur mort, avec notamment une augmentation significative de 33% à P15 (p<0.05), de 49,4% à P20 (p<0.05), de 57,6% à P25 (p<0.01 ).

[0088] b. Analyse des effets fonctionnels du traitement combiné ASO 10-27 + BIO101

[0089] Nous avons effectué des analyses phénotypiques des souris SMA sévère de type 2 traitées avec BIO101 seul ou un ASO mismatch ou un ASO 10- 27 seul, ou avec un traitement combiné ASO 10-27 + BIO101 à partir de PO. Nous avons effectué un suivi longitudinal des capacités motrices des souris. Nous avons, d’une part, évalué les capacités de déplacement par le test open-field (Figure 3), ainsi que la fatigabilité musculaire par grip-test (Figure 4), tels que décrits précédemment (Biondi et al., 2008 ; Branchu et al., 2013 ; Chali et al., 2016).

[0090] Le dispositif utilisé pour test en open-field est constitué d'une boîte en plastique de 28 x 28 x 5 cm avec un quadrillage du champ divisé en 16 carreaux de 7 cm x 7 cm. Les souris ont été testées individuellement et le dispositif d’évaluation a été lavé après chaque session. Chaque souris initialement placée au centre du champ a pu se déplacer librement pendant 5 minutes avec une stimulation par pincement de la queue toutes les 15 secondes. Les mesures comportementales sont enregistrées par l'expérimentateur pendant ces 5 minutes et le nombre total de carreaux croisés a été relevé. [0091 ] Le traitement BIO101 , qu’il soit administré seul ou en combinaison avec l’ASO 10-27, accélère l’acquisition de la marche avec une tendance à l’augmentation du déplacement des souriceaux à P15 (1 10±18 carreaux soit +58% avec le traitement BIO101 seul, et 100±19 carreaux soit + 44% avec le traitement ASO 10-27 + BIO101 ) par rapport aux souriceaux traités avec l’ASO 10-27 seul (70±20 carreaux).

[0092] À partir de P23, les capacités de déplacement des souriceaux traités avec l’ASO 10-27 + BIO101 tendent à être augmentées par rapport à celles des souriceaux traités avec l’ASO 10-27 seul (+51 ,3%, p=ns), et sont significativement augmentées à P25 (+38,4%, p<0.05), ou encore à P27 (+44,9%, p<0.01 ) (Figure 3).

[0093] Pour évaluer la fatigabilité musculaire, la force de préhension des pattes antérieures des souris a été testée. Les souris sont suspendues par leurs pattes antérieures à une fine tige métallique suspendue en l’air, de manière horizontale. Le temps passé à s'accrocher est relevé. Chaque souris a été soumise à cinq tentatives successives avec une période de repos d’une minute entre deux tests. Seul le meilleur essai est conservé pour l’évaluation des fonctions musculaires.

[0094] A P7 la résistance à la fatigue des souriceaux traités avec l’ASO 10-27 seul n’est pas améliorée par rapport à celle des souriceaux traités avec l’ASO mismatch. La résistance à la fatigue des souriceaux traités avec BIO101 seul est quant à elle améliorée de 19,3%. A P15 les résistances à la fatigue des souriceaux traités avec l’ASO 10-27 seul et avec BIO 101 seul sont toutes les deux supérieures (+7,7%) à celle des souriceaux traités avec l’ASO mismatch. De manière étonnante et avantageuse, une synergie opère entre BIO101 et l’ASO 10-27 lors du traitement combiné de sorte que la résistance à la fatigue des animaux SMA traités augmente de 26,3% à P7 et de 21 ,2% à P15.

[0095] A partir de P19, la résistance à la fatigue des souriceaux traités avec l’ASO 10-27 + BIO101 tend à augmenter par rapport à celle des souriceaux traités avec l’ASO 10-27 seul. Cette différence devient évidente à partir de P21 (+54% dans le groupe traité avec la combinaison ASO 10-27 + BIO101 par rapport à l’ASO 10-27 seul, p=ns), puis à P23 (+159,2%, p<0,05), à P25 (+337,7%, p<0.05) ou encore à P27 (+296,7%, p=0,07). Ces différences importantes sont maintenues jusqu’à P35. A partir de P39, ces différences sont moins marquées mais le groupe de souris traitées en combinaison ASO 10-27 + BIO101 conserve néanmoins une résistance à la fatigue supérieure à celle observée dans le groupe traité à l’ASO 10-27 seul (Figure 4).

[0096] 4. Conclusion

[0097] Ces résultats démontrent l’intérêt de l’utilisation du traitement BIO101 , en combinaison avec un principe actif visant à restaurer l’expression de la protéine SMN, en particulier grâce à une approche thérapeutique à l’aide d’ASOs ayant pour effet de restaurer l’expression de la protéine SMN.

[0098] En effet, cette thérapie combinée montre des effets bénéfiques importants dans un modèle murin de SMA, en particulier au niveau du poids des animaux, et de manière encore plus importante, au niveau des performances physiques de ces animaux, qu’il s’agisse des capacités de déplacement ou de la résistance à la fatigue de l’animal.

[0099] La combinaison de traitement ASO 10-27 + BIO101 , au-delà d’améliorer les performances obtenues par le traitement d’un ASO 10-27 en monothérapie, possèdent incontestablement un effet synergique.

[00100] De manière plus générale, il est à noter que les modes de mise en oeuvre et de réalisation de l’invention considérés ci-dessus ont été décrits à titre d’exemples non limitatifs et que d’autres variantes sont par conséquent envisageables.

[00101 ] Notamment, l’invention a été décrite en considérant principalement l’ASO 10-27 de séquence SEQ ID NO : 23. Rien n’exclut cependant, dans d’autres types de réalisation, de considérer d’autres principes actifs ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN comme d’autres ASO ayant la capacité d’augmenter la production de protéine SMN. De tels ASO sont par exemple les ASO de séquence choisie parmi : SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 1 1 , SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 21 , SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO : 28, SEQ ID NO : 29. [00102] Ces séquences sont notamment données dans le tableau 1 ci-dessous :

[Table 1]

[00103] Bibliographie

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