以下、本発明の実施の形態について詳細� ��説明する。

 図1は本発明の実施例を示すPDMS装置のマ� �クロチャンバーを有するマイクロチャネル� �概念図である。図2はその平面脂質二重膜で� ��ールされているマイクロチャンバーを示す� ��である。

 これらの図において、1はPDMS(Polydimethylsilo xane)装置、2はPDMS装置1に形成されたマイクロ� ��ャネル、3はマイクロチャネル2の両側部に� �互に開口を有するマイクロチャンバーであ� �。ここでは、マイクロチャネル2の両側部と� ��ては、マイクロチャネルの横壁である両側� ��を例に挙げているが、マイクロチャネル2の 両側部は、マイクロチャネルの縦壁である天 井壁と床壁であってもよい。ここで、各マイ クロチャネル2の高さは7μmであり、各マイク� ��チャンバー3の寸法は、例えば、幅17μm、高� ��19μmである。

 ここで、後述するがマイクロチャンバー3 の開口部に形成される平面脂質二重膜5の膜� �積は小さいほど膜自体は安定化するが、比� �積が大きすぎるとPDMS装置1が有機溶媒により 大きく膨潤することになり、問題が生じる。 例えば、マイクロチャンバー3の幅が7μmの場� ��、上記した膨潤によりマイクロチャンバー3 が閉じてしまった。また、10μmの場合でもマ� ��クロチャンバー3が変形し、平面脂質二重膜 の形成を妨げる要因になってしまった。そこ で、マイクロチャンバー3の幅は17μmに最適化 した。

 また、マイクロチャネル2の高さは、平面 脂質二重膜5の安定化のために、マイクロチ� �ネル2の間隔80μmに比べて7μmと低くなってお� ��、PDMS装置1の構造が潰れてしまうという課� �が存在するが、これに対しては、マイクロ� �ャネル2の両側部に交互に開口を有するマイ� ��ロチャンバーを配置する構成としたので、� ��インマイクロチャネルの中心にはPDMSの柱4� �整列しており、PDMS装置1の構造を堅牢にして マイクロチャネルの構造が潰れるのを防止す るようにした。

 また、このPDMS装置1は並列に構成された� �大な数のマイクロチャンバーをセットする� �とができる。

 さらに、この各マイクロチャンバー3の開 口部は平面脂質二重膜5でシールされており� �その平面脂質二重膜5に存在するナノ孔〔α-H emolysinモノマーが七量体化(heptamerizes)された� �に形成された〕6を通じた蛍光分子の移動が� ��光顕微鏡下で蛍光密度の変化として計測さ� ��る。

 なお、上記したアレイ材料としてはPDMSが 好適であるが、このPDMSに限定されることな� �、ガラス、SU-8、シリコン、アクリル樹脂、P ETなど無機やプラスチック材料を用いるよう� ��してもよい。

 この装置は、携帯性、分析時間の短縮、� ��められる試薬の少量化、及び高い再現性の� ��行自動化を図ることができる。

 図3は本発明の実施例を示すマイクロチャ ンバーへ平面脂質二重膜を形成する方法を示 す図であり、図3(a)はPDMS装置を水に浸漬して� ��和させる様子、図3(b)は膜タンパク質(α-Hemol ysin)及び蛍光物質(Calcein:カルセイン)入りの緩 衝液(バッファ液)を注入する様子、図3(c)は脂 質溶液〔phosphatidycoline(PC)入りの有機溶媒(hexad ecane:ヘキサデカン)〕を注入する様子、図3(d)� ��溶解物を含まない緩衝液をマイクロチャネ� ��に注入する(フラッシュする)様子、図3(e),(f) は平面脂質二重膜が形成されたマイクロチャ ンバーを示す図、図3(g)はマイクロチャンバ� �に形成された脂質二重膜の拡大図である。� �お、上記した有機溶媒のヘキサデカンに代� �て、有機溶媒のsqualene(スクワレン)を用いる� ��ともでき、その応用を広げることができる� ��

 まず、図3(a)に示すように、シャーレ11に� ��った水12にPDMS装置13を12時間以上浸漬して飽 和させる。これは実施中、水がPDMS装置13へ吸 収されるのを防ぐためである。次いで、図3(b )に示すように、水で飽和されたPDMS装置13の� �イクロチャネル14及びマイクロチャンバー15� ��膜タンパク質(α-Hemolysin)及び蛍光物質(Calcein :カルセイン)入りのリン酸緩衝液(バッファ液 )16を注入する。次いで、図3(c)に示すように� �リン酸緩衝液(バッファ液)16が充填されてい� ��マイクロチャンバー15内に脂質溶液〔phosphat idycoline(PC)入りの有機溶媒(hexadecane:ヘキサデ� �ン)〕17を注入する。次いで、図3(d)に示すよ� ��に、溶解物を含まない緩衝液18をマイクロ� �ャネル14に注入する。すると、図3(e)及び(f)� �示すように、緩衝液18の流れと有機溶媒がPDM S装置に吸収されることにより、マイクロチ� �ンバー15を覆っている有機溶媒の膜は薄くな り、マイクロチャンバー15の開口部が平面脂� ��二重膜19でシールされる。なお、図3(d)にお� ��ては、平面脂質二重膜が破れたものも示さ� ��ている。

 このように、本発明によれば、平面脂質� ��重膜19が容易に作製され、膜タンパク質の� �析を迅速、かつ的確に行うことができる。

 図4は本発明の実施例を示す膜タンパク質 (α-Hemolysin)が形成したナノ孔を通じてマイク� ��チャネルへ蛍光物質(カルセイン)が分散す� �ためにマイクロチャンバー内の蛍光密度が� �激に減少する様子を示す図である。

 図5(a)はマイクロチャンバー内の蛍光強度 の経過を示す図であり、膜タンパク質(α-Hemol ysin)がない場合、蛍光強度の減少は光退色に� ��るものだけである。一方、膜タンパク質(α- Hemolysin)がある場合には、形成されたナノ孔� �ら蛍光物質が分散していくため、その減少� �急速であることが分かる。

 図5(b)は図5(a)に基づいて計算した移動比k� ��示す図である。ここで、(df/dt=-kf)、つまり� �移動比kは含まれる膜タンパク質(α-Hemolysin)� �数に比例する。

 このように、イオンチャネル、ポンプ、� ��容体(レセプター)、輸送体(トランスポータ) のような膜タンパク質を操作することができ る。

 図6は本発明の実施例を示す送液口からマ イクロ流体による平面脂質二重膜アレイ(PDMS� ��置)までの構造を示す模式図、図7は実験シ� �テムを示す図である。

 図3に示した溶解物を含まない緩衝液18の� ��速が大きい場合、マイクロチャンバーの開� ��部に残った脂質を含んだ有機溶媒(脂質溶液 17)の膜に、緩衝液18の流れによる過度の力学� ��ストレスがかかり、平面膜質二重膜が作製� ��れる前に割れてしまうといった問題が生じ� ��。これを防止するために、図6に示すように 、送液口21から液体を注入する時の流路22,23,2 4,25を並列化することにより、低速度の送液� �可能とした。流速を低減させることで、脂� �を含む有機溶媒膜に緩衝液18の流れにより加 わる力学的ストレスを減少させるようにした 。これにより、平面脂質二重膜の作製前に割 れてしまう確率を抑えることができた。

 次に、実験システムについて説明する。

 本発明において平面脂質二重膜の作製方� ��を行う場合には、上記したように、緩衝液/ 脂質溶液/溶解物を含まない緩衝液が混ざる� �となく、かつ連続してマイクロチャネル内� �送液されねばならない。しかし、溶液ごと� �シリンジを入れ替えていては、空気の混入� �どでミセル状の汚れが大量に発生するとい� �問題があった。

 本発明では、一本のシリンジを用いて、� ��つのチューブに連続して溶液を充填するこ� ��で、間に空気が入ることなくそれぞれのプ� ��セスを行えるようにした。

 なお、上記実施例では、送液のためには� ��リンジが好適であるが、これに限定される� ��のではなく、他のポンプやピペットを用い� ��手操作で送液を行うことも可能である。

 図7において、31はマイクロシリンジ、32� �このマイクロシリンジ31に接続されるチュー ブである。このチューブ32には溶解物を含ま� ��い緩衝液(バッファ液)33と脂質溶液34と蛍光� ��質(Calcein:カルセイン)及び膜タンパク質(α-He molysin)を含むリン酸緩衝液(バッファ液)35が入 れられている。36は上述したPDMS(Polydimethylsilox ane)装置(膜タンパク質分析用平面脂質二重膜� ��レイ)である。

 このように構成することにより、一本の� ��イクロシリンジ31を用いて、一つのチュー� �32に連続してリン酸緩衝液35/脂質溶液34/溶解 物を含まない緩衝液33の液体を充填すること� ��でき、間に空気が入ることなく、平面脂質� ��重膜の作製プロセスを実施することができ� ��。

 図8は本発明の平面脂質二重膜を用いたリ ポソームの形成による膜透過を計測する様子 を示す図である。

 まず、水で飽和されたPDMSを数時間大気中 に放置した後、図8(a)に示すように、α-ヘモ� �シン無しで平面脂質二重膜を形成した。次� �で、図8(b)に示すように、PDMSへ緩衝液が吸収 されると、平面脂質二重膜がチャンバー内に 引き込まれ、図8(c)に示すように、リポソー� �が得られる。図8(d)に示すように、α-ヘモリ� ��ン及びcalcein(蛍光材料)を含む緩衝液が導入� ��れると、図8(e)に示すように、リポソーム内 にcalceinが分散される。図8(f)に示すように、� ��部緩衝液が交換されると、calceinがα-ヘモリ シンを通じてリポソームの外へと分散される 。そのことは、図8(g)に示すように、リポソ� �ム内の蛍光強度が減ることで観察できた。

 このように、上記した方法によって作製� ��れた平面脂質二重膜を変形させ、リポソー� ��を形成し、そのリポソームにヘモリシンを� ��入して平面脂質二重膜の透過の度合を計測� ��ることができる。

 これにより、膜タンパク質の分析を行う� ��とができる。

 本発明によれば、上記したように、
 (1)実施中に水がPDMSへ吸収されるのを防ぐた めに、水中にPDMS装置(脂質二重膜アレイ)を12� ��間以上漬け、飽和しておくようにした。

 (2)膨大な数のマイクロチャンバーを有す� ��マイクロチャネル内に順次リン酸緩衝液/脂 質溶液/溶解物を含まない緩衝液を注入する� �とで、簡便に脂質二重膜を形成することが� �き、各マイクロチャンバーは膜タンパク質� �含む平面脂質二重膜によってシールされる� �そのマイクロチャンバー(2pl)は小さい容積で あるため、蛍光密度の変化を良好に観察して 、蛍光分子の膜透過を観察することができる 。つまり、膜タンパク質(α-Hemolysin)が形成し� ��ナノ孔を通じて蛍光物質(Calcein:カルセイン) の透過の量的測定を良好に行うことができる 。

 また、一分子レベルで、定量的な膜タン� ��ク質の解析実験を可能にした。

 すなわち、並列マイクロチャネルに沿っ� ��、マイクロチャンバーが高密度に配列され� ��構造とした高集積化により、一視野に多数� ��マイクロチャンバー(20倍光学レンズで176個) が測定可能になるため、膨大な数の定量的な 生化学実験解析が可能になった。

 また、マイクロチャンバーを利用するこ� ��で、一分子レベルでの膜タンパク質の活性� ��系のパラメータに大きな変化(蛍光輝度変化 )を及ぼすため精確な検出が可能になった。

 なお、平面脂質二重膜を張って、膜タン� ��ク質なしで計測を行うこともできる。例え� ��、平面脂質二重膜に蛍光分子を入れて、そ� ��光具合で環境の汚染度を計測することがで� ��る。また、膜タンパク質を使わなくても、� ��度応答性の平面脂質二重膜を使用すること� ��より、物質を通過したり、止めたりするこ� ��もできる。

 また、本発明は上記実施例に限定される� ��のではなく、本発明の趣旨に基づき種々の� ��形が可能であり、これらを本発明の範囲か� ��排除するものではない。

 本発明によれば、以下のような効果を奏� ��ることができる。

 (1)携帯性、分析時間の短縮、求められる� ��薬の少量化、及び高い再現性をもつ並行自� ��化などの利点を有する。

 (2)並列に構成された膨大な数のマイクロ� ��ャンバーをセットすることができ、膜タン� ��ク質の分析を迅速、かつ的確に行うことが� ��きる。