ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, и касается состава биологически активного вещества (БАВ) полифармакологического действия из растительного сырья, содержащего соединения агликонов флавоноидов, флавоноидные гликозиды и вспомогательные вещества. БАВ может использоваться для получения лекарственных средств для лечения и профилактики вирусных заболеваний, вызванных вирусами герпеса, гриппа, гепатитов В и С, а также вирусиндуцированных иммунодефицитов.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В последние годы все больше внимания уделяется противовирусным средствам из растительного сырья, в которых идентифицированы вещества, действующие непосредственно на вирусный агент. Известной молекулой, которая оказывает антивирусное, в широком спектре, действие есть такое флавоноидное соединение как трицин (tricin) (5,7,4 - тригидрокси-3 ', 5'-диметоксифлавон).

Известно, что трицин эффективен против вируса гриппа, цитомегаловируса и вируса простого герпеса (Пат. Японии Р 2010 - 254649 А, Публ. И Л 1.2010 г; Пат. Японии Р 2006 - 265248 А, Публ. 05.10.2006 г.). Установлено, что концентрация трицина, полученного из Sasa albo-marginata, которая ингибирует на 50% развитие цитомегаловирусной инфекции на клеточном уровне (антивирусное действие) составляет более 0,42 мкМ (или 0,139 мкг / мл) (Antiviral Research 91 (2011), 296- 303), а антивирусное действие синтетического трицина на вирус гриппа группы A (H1N1) наступает при концентрациях, равных и больших 3,3 мкМ (или 1,09 мкг / мл) (Противовирусная химия и химиотерапия 2011 , 22: 1-11; Joi 103851 / MP 1782).

Химически чистые агликоны трицина или комплексные соединения трицина в сочетании с соединениями апигенина и / или лютеолина и / или кверцетина получают из растительного сырья: листьев бамбука (Bamboo leaves), Sasa, листьев риса. Химически чистые флавоноидные соединения быстро окисляются и являются гидрофобными, поэтому их использование ограничено сферой научных исследований на клеточном уровне. (Microbes and Infection. 2012 p. V.14. Is. 12. p 1086-1092). Комплексные соединения: гликозиды агликонов трицина, апигенина, лютеолина, кверцетина и их комплексы являются гидрофильными и на уровне целостного организма комплексам разномолекулярних флавоноидных соединений свойственно синергическое действие и повышение биодоступности по сравнению с действием отдельных чистых веществ. (In vivo 201 1, 25 (5), 757-762, Journal of Food. Vol. 13, Xs 1, p. 140-150).

Наиболее близким по химическому составу и происхождению к предлагаемому изобретению является биологически активное вещество (БАВ) из растительного сырья для лечения и профилактики патологических состояний, полученое способом, приведеным в патенте UA N° 54362 7МПК А61К 35/78 от 17.02.2003 г. Бюл. jNo 2. В качестве растительного сырья используют смесь растений рода Calamagrostis Adans и рода Deschampsia Beauv, которые собраны в период после выбрасывания стеблей и до окончания цветения колосков.

Такое БАВ характеризуется достаточно низкой токсичностью, обеспечивает широкий спектр фармакологического воздействия на организм человека, но отсутствует определение конкретного состава действующих веществ и не определена активность в отношении конкретных вирусов, отсутствуют рекомендованные дозировки для создании лекарственных форм.

Была поставлена задача усовершенствования БАВ с определением конкретных составов действующих компонентов БАВ, их физико-химических, биологических свойств, определение его оптимального состава для антивирусного действия на конкретные вирусы, дозировок при создании лекарственных форм при сохранении низкой токсичности БАВ.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Поставленная задача решается тем, что биологически активное вещество полифармакологического действия, полученное из зеленых частей и колосков злаковых растений семейства Gramineae, рода Calamagrostis Adans и / или рода Deshampsia Beauv, содержит флавоноиды, в частности, агликоны флавоноидов трицина (tricin), апигенина, лютеолина, кверцетина, рамназина и / или флавоноидные гликозиды трицина, апигенина, лютеолина, кверцетина, рамназина, вспомогательные вещества и имеет следующий состав, мас%: агликон флавоноида трицина и / или его флавоноидные гликозиды от 0,016 до 2,062%; агликон флавоноида апигенина и / или его флавоноидные гликозиды от 0,010 до 1,393%; агликон флавоноида лютеолина и / или его флавоноидные гликозиды от 0,01 до 4,979%; агликон флавоноида кверцетина и / или его флавоноидные гликозиды от 0,001 до 0,771%; агликон флавоноида рамназина и / или его флавоноидные гликозиды от 0,104 до 0,203%; вспомогательные вещества от 99,868 до 90,592%.

Предпочтительнее, когда биологически активное вещество в качестве вспомогательных веществ содержит углеводородные соединения, аминокислоты, хлорофиллы.

Предпочтительнее, когда биологически активное вещество получено из Вейника наземного (Calamagrostis epigeios L. рода Calamagrostis Adans) и / или Щучки дернистой (Deshampsia caespitosa L. рода Deshampsia Beanu).

Предпочтительнее, когда в биологически активном веществе содержание О- гликозидных форм флавоноидов составляет (53,545 + 86,422)%, а С-гликозидных форм флавоноидов составляет (43,293 4,910)% от общего количества флавоноидных соединений, остальное - агликоны флавоноидов.

Для установления причинно-следственной связи между конкретными действующими компонентами и свойствами БАВ, его оптимального состава были проведены исследования с помощью стандартных методик (В. А. Миронов, С. Янковский. Спектроскопия в органической химии. Москва «Химия» 1985 г . - 230 с. .С. Сенчев «Практическое руководство по жидкостной хроматографии. Москва.« Техносфера », 2010 г. - 272 с). Когда агликоны флавоноидов находятся в форме О- и / или С-гликозидов, то при этом увеличивается растворимость БАВ в водных средах а также обеспечивается синергизм действия и биодоступность смеси флавоноидных гликозидов на уровне целостного организма.

Было изготовлено пять серий модельных экстрактов из трав разных сезонов сбора. Серия модельных экстрактов состояла из суммарных экстрактов: смеси трав Вейника наземного и Щучки дернистой, взятых в соотношении 1 : 1 , и из каждой травы отдельно при весовом соотношении сырье: спирт этиловый в диапазоне от 1 :10 до 3: 1. Пять серий экстрактов задействованы с целью получения границ диапазона колебаний содержания исследуемых веществ и определения их средних значений. Модельные экстракты получали известными способами извлечения, а именно: мацерации, перколяции, ультразвуковой экстракции и сочетанием указанных методов, (Инновационные технологии и оборудование фармацевтического производства (под редакцией Н.В.Меншутиной) т.2 (стр. 33-88) Москва: « Бином »2013 г. - 480 с), причем в процессе экстрагирования проводили периодический контроль показателя сухого остатка. В экстрактах с весовым соотношением сырья к спирту 1 :10 процесс экстракции завершали при достижении показателем сухого остатка значения 0,5% (среднее значение плотности 0,8010 г / мл), при весовом соотношении сырья к спирту 1: 2 экстракцию завершали при достижении показателем сухого остатка значения 1,2% (среднее значение плотности 0,8100 г / мл), а при весовом соотношении сырья к спирту 3: 1 экстракцию завершали при достижении показателем сухого остатка значения 2,5% (среднее значение плотности 0,8250 г / мл).

Сначала определяли состав агликонов флавоноидов, флавоноидных гликозидов в суммарном экстракте, который производили при соотношении сырья к спирту 1 : 2.

Определение состава БАВ проводили методами инструментальной аналитической физической химии, а именно: высокоэффективной скоростной жидкостной хроматографии с диодноматричным детектированием (ВЭЖХ, UPLC-PDA); газовой хроматомасс - спектрометрии с ионизацией электронным ударом (ГХ-МС); жидкостной высокоэффективной хроматографии с масс -детектором при ионизации электронным спреем (UPLC-MC / МС); методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР). После идентификации и определения веществ в суммарном экстракте определяли качественное и количественное содержание БАВ в модельных экстрактах, полученных из каждой травы отдельно.

Для определения специфического действия проводили сравнительное изучение БАВ суммарного экстракта и экстрактов из каждой травы отдельно.

БАВ содержится в растениях в следовых количествах на фоне макрокомпонентов: хлорофиллов, растительной клетчатки, поэтому первым этапом, при выделении БАВ является удаление макрокомпонентов. Хлорофильную (жирорастворимую) фракцию, которая является гидрофобной, удаляют органическим растворителем, например гексаном или хлороформом.

Углеводороды в растительном сырье представлены моно- и полисахарами как в свободном состоянии, так и в сочетании с агликонами, которые имеют гидроксильную группу. Свободные углеводороды, которым свойственны гидрофильные свойства, удаляют экстракционным методом, то есть агликоны экстрагируют, а углеводороды остаются в водной фазе. Поскольку агликоны флавоноидов в растениях присутствуют как в свободном состоянии, так и в виде гликозидных форм, поэтому, после удаления хлорофильных фракции, для проведения качественного и количественного определения необходимо все агликоны (свободные и гликозидные) перевести в одну аналитическую форму - агликоны без углеводородных фрагментов. Эта задача решается путем кислотного гидролиза: в результате действия водородных ионов на гликозидные формы флавоноидов происходит отщепление углеводородных фрагментов.

Химическая структура флавоноловых и флавоновых гликозидных соединений устанавливается путем изучения продуктов гидролиза спектрофотометрическими, хроматографическими, (ВЭЖХ, ГХ с различными детекторами) методами. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Суть изобретения иллюстрируют фигуры, на которых изображено:

Фиг.1. ВЭЖХ, UPLC-PDA хроматограмма суммарного экстракта и спектры поглощения выделенных соединений. б

Фиг.2. ВЭЖХ, UPLC-PDA хроматограмма суммарного экстракта после гидролиза и спектры поглощения выделенных соединений.

Фиг.З. ВЭЖХ, UPLC-PDA хроматограмма препаративно выделенных соединений доминирующего агликона трицина и его спектры поглощения. Фиг.4. ГХ-МС хроматограмма TMS дериватов соединений доминирующего агликона трицина (спектр ионного состава).

Фиг.5. ГХ-МС хроматограмма TMS дериватов соединений доминирующего агликона трицина (время удержания иона с массой 531,00).

Фиг.6. Ή-ЯМР спектр трицина, полученного из суммарного экстракта. Фиг.7. ¹³ С-ЯМР спектр трицина, полученного из суммарного экстракта.

Фиг.8. Доминирующие агликоны БАВ и их названия.

Фиг.9. Схема образования О-гликозидов и С-гликозидов.

Фиг.10. Калибровочный график зависимости площади пика массы 271 от концентрации.

Фиг.11. Калибровочный график зависимости площади пика массы 331 от концентрации. Фиг.12. Калибровочный график зависимости площади пика массы 415 416 от

концентрации.

Фиг. 13. Калибровочный график зависимости площади пика массы 465 от концентрации.

Фиг. 14. Влияние концентрации водородных ионов (количество молей НС1) на устойчивость гиперозида и витексина при нагревании растворов в течение 120 мин на кипящей водяной бане.

Фиг. 15.UPLC-MC / МС. Где:

1 - PDA хроматограмма суммарного экстракта;

2 - суммарная масс-хроматограмма при сканировании по массам отдельных ионов; Фиг. 16. .UPLC-MC / МС. Где: 3 - сканирование по массе 331, определение площадей хроматографических пиков;

4 - хроматограмма сканирования по массе 331. Фиг. 17. UPLC-MC / МС. Где:

1 - PDA хроматограмма суммарного экстракта после гидролиза; 2 - суммарная масс-хроматограмма при сканировании по массам отдельных ионов; Фиг. 18. UPLC-MC / МС. Где:

3 - сканирование по массе 331, определение площадей хроматографических пиков;

4 - хроматограмма сканирования по массе 331.

.Фиг.19. ВЭЖХ, UPLC-PDA хроматографа и спектры поглощения хроматографических пиков этанольного экстракта Вейника наземного.

Фиг.20. ВЭЖХ, UPLC-PDA хроматографа и спектры поглощения хроматографических пиков этанольного экстракта Щучки дернистой.

Фиг.21. Влияние БАВ на рост клеток Jurkat.

Фиг.22. Содержание гиподиплоидных клеток (в процентах) в культуре Jurkat после инкубации с БАВ.

Фиг.23. Содержание гиподиплоидних клеток в культуре Jurkat после инкубации с БАВ в течение 2 суток и последующей индукцей апоптоза вепезидом.

Фиг.24.Влияние БАВ на скорость генерирования супероксидрадикала клетками МТ-4.

Фиг.25.Влияние БАВ на скорость генерирования супероксидрадикала клетками Namalwa. Фиг.26.Влияние БАВ на скорость генерирования супероксидрадикала гомогенатом клеток МТ-4.

Фиг.27.Влияние БАВ на хемиолюминисценцию клеток МТ-4, индуцированную пероксидом водорода. Из-за большого количества графического материала, для лучшего понимания смысла, названия фигур проставлены также и рядом с ними.

Типичная хроматограмма соединений суммарного (весовое соотношение сырье: спирт этиловый равно 1 : 2) экстракта разбавленного этанолом 96% в соотношении 1 : 1, полученная с помощью ВЭЖХ с диодно -матричным детектором предоставлена на Фиг. 1. Анализ выполнен с помощью хроматографа UPLC Waters колонка ACQUITY ВЕНС 18, 1,7 мкм, 2, 1 х 150 мм при следующих условиях: объем введенной пробы 1 мкл, температура термостата 30°С, скорость подвижной фазы 0,3 мкл / мин., детектирование при 350 нм. Подвижная фаза, это (вода: ацетонитрил) = (60: 40) в градиентном режиме, вода при рН 2,2 (ортофосфорная кислота). На Фиг.1 предоставлены также спектры поглощения хроматографически выделенных соединений суммарного экстракта (Spectrum Index Fraction Plot).

Спектры поглощения хроматографически выделенных соединений (Фиг.1) со временем удержания в интервале от 5,0 минут (мин.) до 10 мин. указывают на наличие в растворе набора соединений одного класса соединений - флавоноидов, которые имеют одинаковый «скелет» молекулы. Разница в спектрах обусловлена природой заместителей в составе молекулы. Для идентификации молекул используют кислотный гидролиз, который в случае О-гликозидов позволяет выделить (высвободить) агликоны. Кислотный гидролиз проводился следующим образом: к экстракту добавляют соляную кислоту до получения раствора с рН - около 2 (по 2 Молярной хлористо-водородной кислоте), колбу с раствором, подсоединенную к обратному холодильнику, выдерживают в течение 2-х часов в водяной бане при кипении, охлаждают, выделяют прогидролизованые агликоны и гликозидные формы этилацетатом, удаляют органический растворитель под вакуумом, а остаток растворяют в этаноле (9: 1) и анализируют.

На хроматограмме (Фиг. 1) (ВЭЖХ с PDA детектором), полученной до гидролиза, наблюдаются три раздельные группы соединений со временем удержания: 5 - 7 мин (соединения группы 1), 8-9,0 мин (соединения группы 2) и соединения после девятой мин (соединения группы 3). Хроматограмма, полученная после гидролиза (Фиг. 2), показывает, что соединения группы 1 остались, соединения группы 2 выросли и увеличилось количество соединений группы 3. Соединение из группы 2, которое является доминирующим и имеет типичный спектр флавона, было выделено с помощью препаративной ВЭЖХ «Waters» XBridgeTM prep CI 8 ΙΟμηι OBD™ 19 x 250 mm в режиме обратно фазной хроматографии (Подвижная фаза: метанол - вода (1 : 9), скорость потока 15 мл / мин.) при многократном введении и очищении хроматографических фракций. В результате выделено 1 1 мг агликона (ВЭЖХ хроматограмма на Фиг. 3). Для определения брутто - формулы и структуры молекулы агликона был использован метод ГХ с масс-спектрометрическим детектором. Поскольку флавоноидные соединения в своей структуре содержат гидроксильные группы, которые противодействуют их летучести, поэтому для введения образца в ГХ необходимо проводить их дериватизацию. В качестве реагента использовали N, Ν-триметилсилил- трифторацетамид (TMS дериватизация). Хроматограмма деривата агликона (Фиг.4,Фиг.5.) указывает на то, что масса агликона при исключении массы фрагментов составляет 330 . По библиотеке масс-спектров это трицин или рамназин. Для уточнения структуры молекулы использован метод ЯМР на протонных и углеродных ядрах. Получены следующие характеристики спектров ЯМР (Фиг. 6, Фиг. 7): 13С (ДМСО- б, 100 МГц): δ = 56.33 (СНЗ х 2), 94.13 (С-8), 98.78 (С-6), 103.49 (С-3) , 103.59 (С-10), 104.28 (С-2 '+ С-6 "), 120.27 (С-Г), 139.75 (С-4 '), 148.06 (С-3' + С-5 '), 157.20 (С-5), 161.25 (С-Г), 163.48 (С-9), 164.14 (С-2), 181.60 (С-4) м.д. (магнитной девиации).

1Н (ДМСО- 16, 400 МГц): δ = 3.88 (6Н, с, СНЗ х 2), 6.20 (Ш, д, J = 2.0 Гц, Н-6), 6.56 (1Н, д, J = 2.0 Гц, Н-8), 7.00 (Ш, с, Н-3), 7.33 (2Н, с, Н-2 '+ Н-6 "), 12.98 (Ш, с, ОН-5) м. д.

Сигнал при 12.98 м.д. обусловлен наличием водородной связи между атомом водорода гидроксильной группы и атомом кислорода карбонильной группы. Все другие гидроксильные группы (ОН-7 и ОН-4 ') в спектре ЯМР не проявляются из-за их обмена с водой.

Анализ полученных данных спектров ЯМР окончательно подтверждает подлинность трицина как основной составляющей соединения 2. (Tricin / Трицин или 5,7-Dihydroxy-2- (4- hydroxy-3,5 dimethoxyphenyl) -4H-chromen-4-one или 5,7-Дигидрокси-2-(4-гидрокси-3,5- диметоксифенил)-4Н-хромен-4-он).

Обнаруженная структура доминирующего агликона (молекулы трицина) подтверждена методами ЯМР с использованием стандарта трицина (Hangzhou Dayangchem Co., LTD. CAS Na: 520-32-1 Purity: 98,5%), а также сравнением выделенного трицина с трицином, выделенным из листьев бамбука по методике китайских исследователей (J. Agric. Chem. 2007,55,10086-10092). По вышеуказанной методике, в составе суммарного экстракта определено наличие и проведена идентификация (кроме трицина) следующих агликонов флавоноидов: флавоны - апигенин, лютеолин; флавонолы - кверцетин, рамназин (Фиг. 8). Агликоны флавоноидов, по известным литературным данным, например (Патент США N° US 2008/0171708 от 17.06.2006 г.), и нашим исследованиям, в растительном сырье и экстрактах, полученных из него, содержатся чаще всего в виде О-и / или С-гликозидов, (Фиг. 9), а также отдельные агликоны могут быть в виде О- и С-гликозидов одновременно.

Для раздельного определения качественного и количественного состава О- и С- гликозидов сначала определяют и идентифицируют имеющиеся в экстракте углеводороды с помощью ГХ с масс-детектором (используя TMS дериватизацию а также с помощью ВЭЖХ с масс - спектрофотометрическим детектором при ионизации электроспреем (этот метод позволяет определить наиболее интенсивный фрагмент, который соответствует молекулярному иону (m / z). Соединения углеводородов в модельных экстрактах, которые были идентифицированы (название; молекулярный вес) приведены в Таблице 1.

Таблица 1.

Идентифицированные соединения углеводородов в модельных екстрактах Вейника наземного и Щучки дернистой.

JV. Название Мол. вес. п/п

1 2 3

1 Глюкоза (маноза) 180

2 1 ,6-ангидро- - -глюкоза 162

3 Арабиноза 150

4 Ксилоза 150

5 Рибоза 150

6 Рамноза 164

7 Глюкофуноза 180

8 Глюкуроновая кислота 196

9 D- сахарная кислота 210

10 Сорбоза 180

11 З-Оксипропионовая кислота 90 12 4-Оксипентановая кислота 118

13 1 -Пропен- 1 ,2, 3 -трикарбоновая кислота 174

14 З-Гидрокси-бутановая кислота 104

15 2-Бутанен 72

16 Сукциновая кислота 118

17 Фумаровая кислота 116

18 Азелаиновая кислота 188

19 3-Метокси^4-гидроксибензойная кислота 168

20 3,4-Диметоксибензойная кислота 182

21 Бензойная кислота 122

22 4- Гидроксибензойная кислота 138

23 3,4-Дигидроксибензойная кислота 154

24 2-Карбокси^1-гидроксибензойная кислота 182

25 Сиреневая кислота 198

26 Коричная кислота 118

27 Кофейная кислота 180

28 Феруловая кислота (4-гидроксил-З-метоксил-коричная кислота) 194

29 Синаловая 224

30 Диметоксилкоричная 208

31 Альфа конидендрин 356

32 Аконитиновая кислота 174

33 3-(4-гидрокси-3-метоксифенил) метиловый эфир 2-пропановой 208

кислоты

После определения состава углеводородов необходимо определить условия, при которых можно различить О- и С-гликозиды, брутто-формулы которых одинаковы, в результате чего их оптические и хроматографические характеристики мало отличаются. Наиболее классическим является определение динамики высвобождения агликонов из гликозидных форм при их деструкции под действием различных концентраций водородных ионов. Кислотный гидролиз проводят описанным выше методом при различных концентрациях соляной кислоты. Осадок после удаления этилацетата растворяют в этиловом спирте (9: 1) и анализируют. Гидролизаты, полученные при различных концентрациях водородных ионов анализируют методом масс - спектрометрии UPLS - МС / МС. Количественное определение агликонов и / или гликозидов по массам отдельных ионов проводят с использованием калибровочных графиков по стандартам: трицина, апигенина, лютеолина, кверцетина, рамназина, витексина, гиперозида. На Фиг. 10, 11, 12, 13 приведены примеры калибровочных графиков агликонов трицина, апигенина а также гиперозида (О-гликозида) и 1,6-Ангидро-р- D- гликозида витексина (С-гликозид).

Содержание агликонов в экстракте и динамика высвобождения агликонов из гликозидных форм в зависимости от концентрации водородных ионов приведена в Таблице 2.

Таблица 2

Влияние концентрации водородных ионов на выход агликонов

1 -при отсутствии бутилгидроксианизола (ВНА).

2 - в присутствии ВНА.

Наиболее оптимальными условиями для количественного определения О-и С- гликозидов является концентрация водородных ионов 0,08 Моль по соляной кислоте (НС1). При таких условиях полностью разрушаются О-гликозиды, а С-гликозиды остаются (на 83%). (Динамика разрушения О- и С-гликозидов на примере витексина и гиперозида показана на Фиг. 14). Так что для получения информации о количественном содержании агликонов, О- и С-гликозидных форм агликонов анализируют результаты исследований экстракта и продукта после гидролиза в среде 0,08 Моль НС1 методом ВЭЖХ, UPLC-MC / МС . На Фиг. 15 приведен пример PDA хроматограммы (1) и суммарной масс- хроматограммы (2) при сканировании по отдельным ионам (время удержания на приборе UPLC МС / МС немного меньше по сравнению с временем удержания на приборе Waters UPLS - PDA при одной и той же колонке) суммарного экстракта до гидролиза. Также на Фиг.16. приведен пример сканирования по массе 331 (трицин) с определением площадей хроматографических пиков (3) и PDA хроматограммы сканирования по массе 331 (4). На Фиг. 17и Фиг. 18 приведен пример сканирования суммарного экстракта и пример сканирования по массе 331 суммарного экстракта после гидролиза.

Для вычисления количества О-гликозидов сравнивали результаты анализа суммарного экстракта и результаты, полученные после гидролиза: отсутствие или уменьшение пика после гидролиза указывает на присутствие О-гликозида, который может присутствовать как самостоятельно (отдельный хроматографический пик), так и в составе комплекса соединений (уменьшение хроматографического пика, который содержит несколько соединений после гидролиза). Для расчетов использовали теоретическое значение массы ионов гликозидных соединений с учетом масс экстрагированных агликонов, которые приведены в Таблице 3, и идентифицированных углеводов (Таблица 1).

Таблица 3

Теоретически расчитанные гликозиды исследуемых агликонов

Мол. Ксилоза 1,6-

Время Глюкурон

масса М Глюкоза (рибоза, Ангидро- Рамн

Агликон удержани овая

+1 (сорбоза) арабиноза β-D- оза я (мин.) кислота

(М) ) глюкоза

Апигенин 7,56 270 271 433 403 415 447 417

Лютеоли

6,9 286 287 449 419 431 463 433 н

Кверцети

7,15 302 303 465 435 447 479 449 н

Трицин

7,82

(Рамнази 330 331 493 463 475 507 477

(9,02)

н) При этом учитывались те обстоятельства, что в случае О-гликозида (например, гиперозид) в результате действия электроспрея при масс-спектрометрии происходит отрыв молекулы агликона от углеводорода и соотношение между агликоном и исходным гликозидом составляет 100 : 1. В случае С-гликозида (например, витексин) происходит отрыв от молекулы исходного гликозида фрагмента ОН + 1 , то есть массы 18, и соотношение площадей пиков исходного гликозида и продукта его деструкции (тоже гликозида) равно 3,23. По результатам исследований выявлены возможные соединения, которые появляются в исследуемых масс-спектрах и образуются в результате деструкции С-гликозидов (Таблица 4)·

Таблица 4

Продукты преобразования С-гликозидов флавоноидов при проведении мас- спектрометрического анализа

Агликон Исходный гликозид М + 1 Продукт преобразования М + 1

Трицин 8-С-гликозид трицина 493 Ангидро С-гликозид 475

С-гликозид с рамнозой 477 Ангидро С-гликозид 459

Рамназин 8-С-ксилозид 463 Ангидро С-гликозид 448 рамназина

Апигенин 8-С-гликозид 433 8-С-(1,6-ангидро)-Р-Д-гликозид 415 апигенина 403 апигенина 385

8-С-ксилозид 417 Ангидро С-гликозид 399 апигенина Ангидро С-гликозид

С-гликозид с рамнозой

Лютеолин 8-С-гликозид 449 8-С-(1,6-ангидро)-Р-Д-гликозид 431 лютеолина 419 лютеолина 401

С-гликозид с ксилозой 433 Ангидро С-гликозид 415

8-С-гликозид Ангидро С-гликозид

лютеолина

верцетин 8-С-гликозид 465 8-С-глюкоронид апигенина 447 кверцетина 435 Ангидро С-гликозид 417

С-гликозид с ксилозой 449 Ангидро С-гликозид 431

С-гликозид с рамнозой Таблица 5.

Содержание О - гликозидов (мг/л) в пересчете на гиперозид в суммарном екстракте из смеси трав (1:1) при весовом соотношении сырье: спирт этиловый в диапазоне от 1:10 до 3:1

Время Весовое соотношение сырье: спирт

m/z Соединения удержания,мин (сухой остаток %, плотность г/мл)

1:10 1:2 3:1

1 2 4

(0,5;0,8010) (1,2;0,8100) (2,5;0,8250)

7-О-гликозид

4,9 11,23 84,20 140,50

лютеолина

449

З-О-рамнозид 7,86 0,58 4,35 10,80

кверцетина

5,02 2,98 14,90 37,25 7-О-ксилозид

463

5,86 1,52 7,80 19,50 рамназина

7-О-ксилозид

403 9,0 0,91 6,80 17,60

апигенина

5,44 1,28 9,60 24,20 7-О-глюкозид

493

5,74 5,19 38,90 97,25 трицина

7-0-(1,6-ангидро)-|3-

431 4,9 17,70 125,00 210,20

Д-гликозид лютеолина

7-0-( 1 ,5 -ангидро)-Р~

5,50 6,18 46,30 115,75

Д-ксилозид трицина

445 7-0-

5,03 18,00 135,00 247,50 ангидроглюкоронид лютеолина

7-О-ксилозид

419 5,5 3,76 28,20 70,50

лютеолина

7,9 3,44 25,80 46,40 З-О-гликоронид

479

8,13 4,35 32,60 65,20 кверцетина

З-О-глюкозид

465 4,94 1,66 12,40 31,00 кверцетина З-О-ксилозид

5,41 3,93 15,70 37,70

кверцетина

8,92 0,07 0,30 0,75 7-О-рамнозид кверцетина

З-О-глюкозид, 7-О-

582 4,91 15,24 114,30 244,30

рамнозид лютеолина

З-О-глюкозид, 7-О-

639 5,74 7,24 54,30 119,45

рамнозид трицина

5,92 1,23 4,90 12,25

3-0-(4- 6,26 8,16 40,80 102,00

689 гидроксибензоил)

6,45 5,27 26,10 65,25

ксилозид кверцетина

7,03 2,85 11,40 28,50

Всего, О

гликозидов 122,75 842,95 1726,25

(мг/л)

Таблица 6

Содержание С - гликозидов (мг/л) в пересчете на гиперозид в суммарном экстракте из смеси трав (1:1) при весовом соотношении сырье: спирт этиловый в диапазоне от 1:10 до 3:1

Время Весовое соотношение сырье : спирт

m/z Соединения удержания,мин. (сухой остаток %, плотность г/мл)

1:10 1:2 3:1

1 2 4

(0,5;0,8010) (1,2;0,8100) (2,5;0,8250)

4,94 0,36 2,02 4,95

5,29 0,28 2,23 5,58

5,51 0,12 1,00 2,48 8-С-глюкозид

465

5,51 0,11 1,06 2,43 кверцетина

9,12 1,24 8,60 19,78

9,12 1,89 11,30 27,69 Время Весовое соотношение сырье : спирт

m/z Соединения удержания, мин. (сухой остаток %, плотность г/мл)

1:10 1:2 3:1

1 2 4

(0,5;0,8010) (1,2;0,8100) (2,5;0,8250)

9,0 10,26 66,75 166,87 8-С-гликозид

403

9,0 0,32 1,83 4,09 апигенина

5,02 1,15 6,90 17,25

8-С-ксилозид

5,35 1,20 9,00 24,30

трицина

5,47 1,80 11,70 28,08

463

5,47 0,02 0,09 0,22

8-С-глюкуронид

5,57 0,98 6,86 16,81

лютеолина

9,15 1,65 10,00 23,70

5,75 1,08 7,00 17,50

8-С-глюкозид

5,97 2,12 15,90 36,57

трицина

493 5,97 1,54 10,00 23,17

9,16 0,68 4,15 10,17 8-С-глюкозид

9,11 4,94 34,60 89,96 рамназина

8,95 0,11 0,65 1,69 8-С-глюкуронид

507

9,08 1,44 10,0 24,51 трицина

8-С-(1,6 ангидро)-Р~

415 9,16 1,78 10,50 25,73 Д-глюкозид апигенина

5,47 0,38 2,30 5,64

8-С-глюкуронид

447 5,65 2,02 13,10 31,40

апигенина

7,89 0,64 3,20 7,36

4,86 0,31 1,85 4,45

4,86 0,24 1,08 2,82

5,33 1,98 12,70 31,12 8-С-глюкозид

433

5,33 3,04 18,40 44,20 апигенина

9,06 3,85 27,20 62,56

9,06 1,56 8,40 17,82 Время Весовое соотношение сырье : спирт

m/z Соединения

удер ания,мин. (сухой остаток , плотность г/мл)

1:10 1:2 3:1

1 2 4

(0,5;0,8010) (1,2;0,8100) (2,5;0,8250)

7,22 0,12 0,70 1,75

7,89 0,97 6,80 15,23

8-С-глюкуронид

479 8,09 0,85 6,15 15,98

кверцетина 9,0 0,72 4,40 9,94

9,14 0,73 4,60 8,75

4,9 3,12 20,30 56,35

5,02 4,95 37,10 89,04

5,02 3,12 20,30 49,74

8-С-глюкозид

449 7,86 1,54 10,70 23,84

лютеолина 8,01 не визнач. 0,041 0,09

8,06 2,46 16,05 40,43

9,12 2,60 14,50 35,67

4,9 8,04 56,30 129,50 7-0-(1,6-ангидро)-р-

431 5,33 4,27 25,60 62,72 Д глюкозид

9,06 4,5 27,80 63,94 лютеолина

5,62 0,24 1,60 4,00 8-С-(синапоил)-

671

9,08 0,63 4,10 9,27 глюкозид кверцетина

Всего, С-гликозидов

87,6 5 577,36 1395,71

(мг/л)

Таким образом, на примере анализа суммарного экстракта выполнено качественное и количественное определение содержания свободных агликонов (Таблица 2), а также гликозидных форм агликонов: О-гликозидов (Таблица 5); С-гликозидов (Таблица 6).

Соединения группы 1 (Фиг. 1) на хроматограмме ВЭЖХ, с наименьшим временем удержания, как наиболее гидрофильные, являются смесью О- и С-гликозидов, выделенных выше агликонов, из которых доминирующими являются трицин, лютеолин, апигенин. Соединения группы 2 ( Фиг. 1) представляют собой смесь свободных агликонов. Соединения группы 3 это ацилированные формы О-, С-, и би-гликозидов.

Изложенные выше результаты определения качественного и количественного состава агликонов и их гликозидов в экстракте из смеси трав, для которого изучена биологическая активность, дают возможность сравнить состав и биологическую активность экстрактов из каждой травы отдельно. Модельные экстракты из каждой травы отдельно, с целью определения различий в составе и для проведения сравнительных исследований специфического биологического действия, изготавливали с калиброванным содержанием суммы флавоноидов и их гликозидов, равным 0,22 мг / мл, при весовом соотношении сырья к спирту 1 : 4, 5 и при достижении показателем сухого остатка значения, равного 0,7% (среднее значение плотности 0,8080 г / мл). Типичные ВЭЖХ хроматограммы (детектирование при 350 нм) в условиях хроматографирования, приведенных выше по тексту, и спектры поглощения соединений этанольных экстрактов из трав Вейника наземного и Щучки дернистой представлены на Фиг. 19 и Фиг. 20 соответственно.

Из приведенных хроматограмм видно, что качественный состав экстрактов подобный. Различия в составе этанольных экстрактов заключаются в разном количественном содержании отдельных молекул флавоноидов и их О- и С-гликозидов.

Таблица 7

Сравнительный состав и границы отклонений содержания (мг/л) свободных агликонов, О- и С- гликозидов в модельных экстрактах из смеси трав (1:1) и из каждой травы отдельно при весовом соотношении сырье: спирт этиловый в диапазоне от 1:10 до 3:1.

Экстракт из смеси Экстракт Вейника Экстракт Щучки трав (1:1) наземного дернистой

Весовое соотношение сырье: спирт этиловый (сухой остаток %;плотность

Соедин

п/ (г/мл))

ения

п 1:10 1:2 3:1 1:10 1:2 3:1 1:10 1:2 3:1

0,5;0, 1,2;0, 2,5;0,8 ,5;0, 1,2;0, 2,5;0,8 0,5;0,8 1,2;0,8 2,5;0, 8010 8100 250 8010 8100 250 010 100 8250

1 Трицин 4,000 37,260 95,000 0,900 9,450 24,00 0,600 6,800 14,000

Лютеол

2 0,100 1,500 3,600 0,004 0,040 0,010 0,100 1,250 3,200 ин Апиген

0,080 0,840 1,800 0,020 0,200 0,600 0,010 0,150 0,500 ин

Кверцет

0,060 0,600 1,400 0,030 0,300 0,800 0,010 0,100 0,500 ин

Рамнази

0,010 0,070 0,140 0,010 0,020 0,080 0,010 0,020 0,080 н

Всего,

свободн

101,94

ых 4,250 40,270 0,964 10,010 25,490 0,730 8,320 18,280

0

агликон

ов

О

гликози

19,92 149,10 356,65 1,00 10,0 21,00 1,00 10,5 21,00 ды

трицина

С

гликози

10,44 71,15 173,07 0,20 6,2 11,00 1,00 10,0 22,00 ДИ

трицина

О

гликози

ДИ 0,91 6,80 17,60 0,60 8,9 22,00 1,00 11,35 24,00 апигени

на

С

гликози

ды 26,38 167,30 402,63 0,05 0,53 1,20 0,04 3,70 9,00 апигени

на

О

гликози 65,93 486,70 913,00 0,01 2,36 6,80 4,00 41,6 120,0 ды лютеол

ина

С

гликози

ДЫ 36,95 245,60 592,05 0,02 0,22 0,06 0,50 6,95 21,00 лютеол

ина

О

гликози

ДЫ 31,49 177,65 399,85 0,01 0,16 0,04 0,02 0,18 0,40 кверцет

ина

С

гликози

ДЫ 8,26 54,56 127,83 0,02 0,22 0,70 0,02 0,18 0,70 кверцет

ина

О

гликози

ДЫ 4,50 22,70 56,75 6,50 67,5 180,00 10,00 108,0 260,00 рамнази

на

С

гликози

ДЫ 5,62 38,75 100,13 0,01 0,08 0,12 0,01 0,12 0,36 рамнази

на

Всего,

0- 1726,2

122,75 842,95 8,31 70,02 227,84 16,02 171,63 454,40 гликози 5

ДОВ

Всего, 87,65 577,36 1395,7 0,60 7,25 13,08 2,57 20,95 53,06 8 C- 1

гликози

ДОВ

Пользуясь методиками, которые были задействованы для определения суммарного экстракта с использованием ВЭЖХ-МС / МС, определяют качественный и количественный состав экстрактов из каждой травы отдельно.

Как видно из Таблицы 7 содержание свободных агликонов в экстрактах Вейника наземного составляет от 9,5% до 11,5%, а в экстрактах Щучки дернистой составляет от 3,8% до 4,2% от суммарного количества флавоноидных соединений и практически не зависит от соотношения сырье: экстрагент в указанном диапазоне. Приведенные данные свидетельствуют о постоянстве состава экстрагируемых веществ в модельных экстрактах.

Наибольший процент (концентрацию) смеси флавоноидных соединений (агликонов и их О-и / или С-гликозидов) содержит экстракт из смеси трав (1 : 1) при весовом соотношении сырье: экстрагент равном 3: 1, равный 9,408% (3223, 9 мг / л) от величины сухого остатка: 30300 мг / л. Наименьшее количество флавоноидных соединений (0,132% или 9,870 мг / л при сухом остатке, равном 6240 мг / л) содержит экстракт Вейника наземного при соотношении сырье: экстрагент, равном 1 : 10.

При соотношении сырья к экстрагенту, которое меньше 1 :10, флавоноидные соединения лютеолина, апигенина и кверцетина не экстрагируются и вещество теряет свою антивирусную активность. При увеличении соотношения сырье: экстрагент величины 3: 1 количество экстрагируемых О- и / или С-гликозидов не увеличивается, экстракты теряют антивирусное действие, поскольку нестабильны во времени из-за выпадения коагуляционного осадка.

Сравнительные испытания биологической активности проводились параллельно и одновременно для суммарного экстракта из смеси трав (1 : 1) и отдельных экстрактов, полученных из Вейника наземного и из Щучки дернистой с калиброванным содержанием суммы флавоноидов, равной 0,22 мг / мл. Приведенные примеры иллюстрируют свойства БАВ, но не ограничивают действие патента. Обнаруженные свойства отражены в таблицах JVoNs 1-16 и на Фиг. Фиг. 1-27.

Термины, используемые в заявке и их сокращенные версии, методики исследований являются официально принятыми (Доклинические исследования лекарственных средств (методические рекомендации). Под редакцией член-корреспондента АМН Украины О.В.Стефанова -К.: Авиценна, 2001 г., - 528с .).

ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пример 1.

Изучение антигерпетической активности модельных экстрактов в опытах in vitro. Для изучения антивирусной активности экстрактов использовали перевиваемую культуру клеток Vero (клетки почки обезьяны). Клетки выращивали в плашках на среде RPMI-1640 + 10% фетальной сыворотки (Nunclon, Surface, Denmark) при температуре 37°С в термостате с подачей С0 ₂ .

Использовали вирус герпеса 2-го типа, штамм ВН (ВПГ), инфекционный титр: 5,0 -г 7,0 lg ТЦД50 / ОД мл (ТЦД50 - тканевая цитопатогеная доза вируса, вызывает поражение 50% монослоя клеток). Для изучения антивирусной активности использовали суточные культуры клеток Vero со сплошным монослоем клеток. Среду роста удаляли и на монослой клеток наносили экстракты в разных концентрациях. Спустя один час после контактирования добавляли вирус герпеса в дозе 100 ТЦД ₅₀ и в лунки вносили поддерживающую среду (питательная среда без сыворотки).

Культуры инкубировали в термостате с подачей СОг в течение 5 суток, ежедневно контролируя с помощью микроскопа и отмечая репродукцию вируса по цитопатическому действию ВПГ на клетки Vero по сравнению с контрольными культурами, где монослой не подвергали обработке экстрактами (контроль вируса).

Цитопатическое действие ВПГ на клетки морфологически проявляется в образовании симпластов или округлых клеток в сочетании с пролиферацией и гигантскими многоядерными клетками.

Через 3 дня собирали культуральную среду из лунок плашек и определяли инфекционный титр в каждой пробе при введении различных доз модельных экстрактов. Результаты репродукции ВПГ-2 представлены в Таблице 8.

Таблица 8 Результаты влияния экспериментальных экстрактов на репродукцию ВПГ-2 в культуре клеток Vero и определение минимально активной концентрации (МАК)

В Таблице 9 приведены показатели максимально переносимой концентрации (МПК), минимально активной концентрации (МАК) и химиотерапевтического индекса (ХТИ).

Таблица 9.

Результаты определения МПК, МАК, ХТИ модельных экстрактов при их действии на вирус герпеса второго типа в культуре клеток Vero.

Исследуемые экстракты эффективно подавляют вирус герпеса 2-го типа. Минимально активная концентрация, при которой подавляется развитие вирус-специфического действия на 2,0 - 3,0 lg ТЦД50, для экстракта Щучки дернистой составила 0,017 мкг / мл, что в два раза меньше значения минимально активной концентрации (0,034 мкг / мл) для суммарного экстракта и экстракта Вейником наземного. ХТИ всех экстрактов составлял приблизительно 160.

Пример 2 Определение антигриппозной активности экстрактов в опытах in vitro.

Использовали вирус гриппа, штамм А / FM / 1/47 (H1N1), инфекционный титр алантоисной культуры - 6,0 lg EID50 / 0,2 мл.

Для определения антивирусной активности экстрактов в условиях in vitro использовали суточную перевиваемую культуру клеток MDC (клетки почки собаки) со сплошным слоем. Клетки выращивали в плашках на среде RPMI-1640 + 10% фетальной сыворотки (Nunclon, Surface, Denmark) при температуре 37 ^° С в термостате с подачей С0 ₂ . Для повышения чувствительности клеток к заражению их вирусом гриппа проводили обработку трипсином. Маточный раствор трипсина готовили добавляя до 3 г навески фермента в 3 мл питательной среды DMEM. Клетки трижды промывали этим раствором по 50 мл на лунку.

Среду роста сливали, к клеткам добавляли модельные экстракты в разных концентрациях и вносили вирус гриппа в дозе 100 ТЦЦ50.

Культуры инкубировали в термостате с подачей С0 ₂ в течение 3 суток, ежедневно контролируя с помощью микроскопа.

Через 72 часа инкубации клеток культуральную жидкость собирали и в ней определяли инфекционный титр вируса гриппа титрованием в культуре клеток. В Таблице 10 представлены результаты изучения влияния модельных экстрактов на вирус гриппа. Согласно полученным данным модельные экстракты в различных концентрациях подавляют репродукцию вируса гриппа

на 2,0 - 3,0 lg ID50, что свидетельствует об антигриппозном действии веществ как суммарного экстракта, так и экстрактов из каждой травы отдельно.

Таблица 10

Результаты влияния экспериментальных экстрактов на репродукцию вируса гриппа в культуре клеток MDCK и определение минимальной активной концентрации (МАК)

Названия экстрактов и их влияние на инфекционные титры

Концентрация суммы

вируса гриппа в lg ID50

флавоноидов в разведенных

Суммарный Экстракт Экстракт экстрактах мкг/мл

экстракт (1 :1) Вейника наземного Щучки дернистой

0,055 3,0 4,0 3,0

0,0275 2,0 4,0 3,0

0,0137 3,0 7,0 3,0 0,0068 3,0 6,0 2,0

0,0034 5,0 6,0 3,0

0,0017 5,0 6,0 7,0

Контроль вируса. 6,0 6,0 6,0

Химиотерапевтический индекс (ХТИ) модельных экстрактов по отношению к вирусу гриппа определяли путем установления соотношения максимально переносимой концентрации (МПК) в минимальной активной концентрации (МАК), при которой подавляется развитие вирус-специфического цитопатического действия на 2,0 - 3,0 lg IDso (Таблица 11).

Таблица 1 1

Результаты определения МПК, МАК и ХТИ модельных экстрактов при их действии на вирус гриппа в культуре клеток MDCK.

Все модельные экстракты являются эффективными против вируса гриппа. Инфекционной титр вируса гриппа понижается больше всего (на 3,0 lg ID50) при концентрации БАВ, равной 0,0034 мкг / мл, под действием экстракта Щучки дернистой. Наибольшая селективность действия на вирус гриппа присуща сумарному экстракту, для которого ХТИ = 808.

Пример 3.

Изучение активности экстрактов против вируса гепатита С (ВГС).

В качестве суррогатного вируса ВГС использовали вирус бычей вирусной диареи (ВБВД), который является тест-моделью вируса гепатита С.

Антивирусную активность изучали в культуре МДВК, которую обрабатывали разными разведениями экстрактов и добавляли ВБВД в дозе 100 ТЦД50. Культуры инкубировали в термостате до возникновения специфического цитопатического действия вируса в контроле, а затем в культуральной среде определяли инфекционный титр вируса. Результаты представлены в таблице 12.

Таблица 12

Результаты влияния экспериментальных экстрактов на репродукцию вируса бычей вирусной диареи и определение минимально-активной концентрации (МАК) на культуре клеток МДВК.

Анализируя полученные результаты, следует отметить, что экстракты угнетают репродукцию суррогатного вируса гепатита С на 3-2 lg ID50.

Результаты определения МПК, МАК, ХТИ при действии суммарного экстракта, экстрактов Щучки дернистой, Вейника наземного по отношению к вирусу ВБВД в культуре клеток МДВК, представлены в таблице 13.

Таблица 13

Результаты определения МПК, МАК и ХТИ экстрактов по отношению к ВБВД в культуре клеток МДВК.

Показатели МПК, МАК и ХТИ для модельных экстрактов

Показатели Суммарный экстракт Экстракт Щучки Экстракт Вейника

(1:1) дернистой наземного

МПК 5,5 2,7 5,5

МАК 0,034 0,034 0,034

ХТИ 161,7 79,4 161,7 По результатам исследований устанавливлено, что модельные экстракты являются эффективными ингибиторами суррогатного вируса гепатита С (ВБВД) с высоким показателем ХТИ.

Все экстракты подавляют вирус бычей диареи (тест-модель вируса гепатита С) на 4,0 - 5,0 lg ID50 при концентрациях, которые равны 0,0034 мкг / мл.

Пример 4.

Интерфероногенная активность модельных экстрактов in vivo.

Интерфероногенная активность была изучена в эксперименте in vivo на белых беспородных мышах, которым модельные экстракты вводили внутрибрюшинно (по 0,1 мл) в концентрации 55,5 мкг / кг. Через 24 часа мышей выводили из эксперимента путем эвтаназии и определяли интерферон (ИФН) в сыворотках крови по общепринятой методике подавления цитопатогенного действия (ЦПД) вируса везикулярного стоматита (ВВС) в гомологической культуре тканей L929. По маркеру кислоточувствительности определяли тип ИФНа. Для этой цели сыворотку крови делили на две равные части. В одной из них рН жидкости при помощи 4 N НС1 доводили до 2,0, оставляли при 4 ° С на 24 часа, а затем восстанавливали рН жидкости при помощи 4 N NaOH до 7,2.

Результаты проведенного эксперимента представлены в таблице 14.

Таблица 14

Уровни интерферона в сыроватках крови мышей, которым вводили модельные экстракты.

Poly I:Poly С - эталонный индуктор ИФН (Calbiocheus, USA)

По Маркеру чувствительности к рН было определено, что все три экстракта индуцируют γ-интерферон. Все экстракты обладают свойством индуцировать иммунный γ-интерферон. Экстракт Вейника наземного индуцирует интерферон на уровне эталонного индуктора Poly I: Poly С, а суммарный экстракт и экстракт Щучки дернистой индуцируют интерферон на уровне 25% от уровня индукции интерферона эталонным индуктором.

Пример 5

Определение апоптогенной и апоптоз-модулирующей активности БАВ.

Известно, что флавоноидные вещества достаточно активно исследуются в плане индукции апоптоза и влияния на дифференцирование клетки, поскольку они обладают избирательным действием на лейкозные и нормальные клетки.

Нами было проведено изучение цитотоксичности БАВ, способности его к индукции апоптоза и взаимодействия БАВ с цитотоксическим апоптоз-индуцирующим препаратом вепезид в системе злокачественных лимфоидных клеток человека Jurkat.

Исследования проводили на перевиваемой линии клеток Т-клеточного лимфобластного лейкоза человека Jurkat. Клетки культивировали общепринятым методом. Для исследований БАВ вносили в культуры в начале логарифмической фазы их роста.

Для анализа цитотоксичности, индукции апоптоза и распределения по фазам цикла БАВ вносили в культуральную среду суспензионных культур в указанной ниже по тексту концентрации. Жизнеспособность клеток определяли по окраске трипановым синим. По окончании инкубации с соответствующими веществами цитоцентрифугированные препараты клеток окрашивали по Паппенгейму.

Перед проведением цитометрического анализа клетки инкубировали в растворе пропидия йодида (50 мкг / мл) с 0,1% цитрата натрия и 0,1% тритона Х- 100. Флуоресценцию клеток оценивали, используя проточный цитофлуориметр FACScan фирмы "Becton Dickinson" (США). Апоптотический индекс (АИ) рассчитывали по формуле: (количество апоптичних клеток / общее количество клеток) х 100).

Распределение по фазам клеточного цикла изучали в клетках, окрашенных пропидия йодидом, с помощью проточной цитометрии.

После проведения проточной цитометрии результаты анализировали с помощью компьютерных программ ModFit LT 2.0 ("Verity Software House", Topsham, ME, США) и CELLQuest ("BD Biosciences Pharmingen»). Влияние флавоноидных веществ суммарного экстракта на рост клеток Jurkat исследовали в концентрациях 5,5 и 55 мкг / мл. Результаты приведены на Фиг. 21.

Как видно из данных кинетики роста, исследуемое вещество является малотоксичным. Эти данные совпадают с относительной нетоксичностью экстрактов на других, как суспензионных, так и монослойных культурах клеток, использованных при изучении антивирусного действия.

Следует отметить, что значительное торможение роста клеток при воздействии флавоноидных веществ экстракта в концентрации 55 мкг / мл практически не сопровождалось массовой гибелью клеток, даже при полной задержке дальнейшего роста.

Представляло интерес определить вклад апоптогенных компонентов в эффекты торможения роста клеток. Как видно из данных, приведенных на Фиг. 22 длительное (3 суток) культивирование с флавоноидными веществами экстракта, даже в дозе 5,5 мкг / мл, сопровождается небольшим увеличением процента гииодиплоидных клеток в популяции, по данным проточной цитометрии (в дополнение к спонтанному апоптозу, заметному в контрольных культурах на поздних этапах культивирования). Содержание гиподиплоидних клеток значительно увеличивается при увеличении в 10 раз концентрации флавоноидных веществ. Уже на второй день количество апоптотических клеток по сравнению со спонтанным апоптозом увеличивается на 20%.

Полученные данные свидетельствуют, что БАВ вызывает проапоптическое, а при увеличении концентрации - апоптическое действие.

Для определения возможного модифицирующего действия флавоноидных веществ на индукцию апоптоза клеток Jurkat вепезидом клетки сначала инкубировали с БАВ, а затем через 2 или 3 суток в клетки вносили вепезид в дозе 1 мкмоль / л на 1 сутки, то есть вепезид использовали в условиях достаточных, но не чрезмерных, для индукции апоптоза. Результаты приведены на Фиг.23.

Как видим, инкубация с БАВ в нетоксичных дозах приводит к значительному повышению чувствительности клеток Jurkat к действию типичного индуктора апоптоза вепезида. Практически в таких условиях достигается аддитивный эффект в отношении выхода гиподиплоидних клеток при последовательном воздействии БАВ и вепезида.

Приведенные результаты исследований указывают на то, что БАВ имеет апоптозмодулирующее воздействие. Пример 6.

Определение действия БАВ на антиоксидантный статус клеток.

Результаты известных исследований, касающихся биологических и фармакологических эффектов флавоноидов в различных экспериментальных моделях, указывают на то, что одним из механизмов биологического действия может быть их влияние на антиоксидантную систему клеток и организма, в частности, интенсивность образования и элиминации радикальных форм кислорода.

В качестве объекта исследования использовали культуры перевиваемых линий злокачественных лимфоидных клеток человека Namalwa и МТ-4, инкубированные с препаратом в течение 2, 4 или 24 часов до взятия образца. Концентрация БАВ была подобрана при антивирусных исследованиях и составляла в большинстве экспериментов 2,75 мкг / мл по гликозиду кверцетина. По окончании инкубации с БАВ, контролировали жизнеспособность клеток окрашиванием препаратов трипановым синим. Для дальнейших экспериментов по анализу антиоксидантных свойств БАВ использовали только те образцы, в которых жизнеспособность клеток по окончании инкубации составляла не менее 90%. Для изучения влияния препарата на про-антиоксидантный статус исследуемых клеток использовали методы ЭПР-спектрометрии (электронно-парамагнитной резонансной спектрометрии) и хемилюминесценции.

Скорость генерации супероксидного радикала определяли на ЭПР-спектрометре с использованием спиновой ловушки 2,2,6, 6-тетраметилпиперидина-К-оксида (TEMPO), образующей с короткоживущим супероксидом стабильный ТЕМРО-радикал. Реакция накопления стабильных ТЕМРО-радикалов в кювете спектрометра ЭПР после введения в суспензию клеток ловушки протекала линейно в течение 5-6 мин. Спектры регистрировали с минутными интервалами. По величине амплитуд второй компоненты спектра ЭПР TEMPO - радикала регистрировали скорость накопления ТЕМРО-радикала, которая соответствует скорости генерирования супероксидного радикала аниона.

Рабочий объем кюветы составлял 170 мкл. Исследования проводились при комнатной температуре. В кювету вводили или нативные (целые) клетки, или гомогенизированные на ледяной бане непосредственно перед внесением в кювету спектрометра. Дополнительно исследовали клетки, или предварительно прогретые (5 мин., 60°С), или после экспозиции при 0-10 С с целью инактивации или ингибирования ферментов, которые участвуют в цепи переноса электронов. Все растворы готовились ex tempore из перекристаллизированных реактивов марки "ч.д.а. (чистые для анализов)" и дистиллированной воды.

Нативные клетки контрольной культуры МТ-4 при комнатной температуре генерировали супероксидрадикал-анион со скоростью в среднем 0.53 нмоль / 100 тыс. клеток в 1 мин. (Фиг.. 24). После температурной обработки (60°С и 0°С) ЭПР сигнал образования ТЕМРО-комплекса отсутствовал, что свидетельствует об участии термолабильных компонентов в процессах генерации активного кислорода и об отсутствии влияния неучитываемых субстанций на результаты опыта.

При инкубации клеток МТ-4 в присутствии БАВ скорость генерации супероксидрадикала-аниона снижалась на 20-30% после 2-х часов инкубации, и больше чем на половину после 4-х часовой инкубации. Через 24 часа инкубации скорость генерирования этого радикала была близка к нулю.

Активность генерации этого радикала клетками линии Namalwa была несколько ниже чем клетками МТ-4 (в среднем 0.33 нмоль / 100 тыс. клеток в 1 мин). При этом в этих клетках отмечалось практически полное гашение генерации радикала после инкубации с БАВ во все сроки наблюдения (Фиг. 25).

Проведенные испытания БАВ свидетельствуют о наличии антиоксидантных свойств, а именно, подтверждена дозозависимая кинетика подавления генерации супероксидрадикала -аниона, а также угнетение интенсивности свободнорадикальных процессов индуцированных пероксидом водорода.

Проведено исследование влияния БАВ на интенсивность свободнорадикальных процессов, индуцированных пероксидом водорода (Н2О2).

Интенсивность свободнорадикальных процессов изучали хемилюминесцентным методом при комнатной температуре. В качестве индуктора генерации радикальных форм кислорода использовали пероксид водорода, который вводили в ячейку хемилюминометра из расчета 0,5 мл 3% Н ₂ О ₂ на 1 мл суспензии клеток после предварительной регистрации базового уровня свечения клеток при открытой шторке ФЭУ (фотоэлектронного умножителя). Клетки, отмытые от культуральной среды, вводили в концентрации от 1 до 8 млн. / мл. Инкубация клеток МТ-4 с БАВ значительно меняла интенсивность хемилюминесценции клеток, атакованных Н2О2. Типичные хемилюминограммы приведены на Фиг. 27. Для образцов клеток, инкубированных в присутствии БАВ, оказалось характерным снижение хемилюминесценции в первые секунды после атаки Н ₂ 0 ₂ , в 2.2 раза по сравнению со свечением клеток контрольной культуры. Максимум свечения контрольных клеток регистрировался на 90-180 секундах, после чего реакция переходила в стационарную фазу с амплитудой свечения 62-75 у.е. (условные единицы). В образцах клеток, инкубированных с БАВ, развитие свободнорадикальных реакций носило вялотекущий характер - максимум свечения наступал на 270-300 секундах, а стационарный уровень - на 560-600 секундах (Фиг. 26).

Выявлено, что исследуемая БАВ проявляет антирадикальные свойства, то есть повышает устойчивость клеток к свободно-радикальному стрессу, вызванному воздействием Н ₂ 0 ₂ .

Приведенные примеры специфического действия БАВ свидетельствуют, что БАВ является веществом полифармакологического действия. Биологический спектр действия БАВ, полученного из смеси трав Вейника наземного и Щучки дернистой (1: 1), и спектр действия БАВ, полученных из каждой травы отдельно, одинаков и зависит только от концентрации веществ в пересчете на суммарное количество флавоноидных соединений.

Таким образом усовершенствование БАВ с определением конкретных составов действующих веществ БАВ, их физико-химических, биологических свойств приводит к изобретению его оптимального состава для антивирусного действия для конкретных вирусов, дозировок при создании лекарственных форм. Кроме того, определено, что БАВ является индуктором эндогенного интерферона типа (у), имеет апоптозмодулирующее действие, обладает антиоксидантными свойствами и повышает устойчивость клеток к свободнорадикальному стрессу. Антивирусное действие для конкретных вирусов определялось как антивирусное действие по отношению к вирусу простого герпеса типа 2, вирусу гриппа, вирусу бычьей диареи (вирусу гепатита С).

Соединения, которые входят в состав БАВ, обладают способностью блокировать развитие как ДНК, так и РНК-содержащих вирусов.

Исследуемые экстракты эффективно подавляют вирус герпеса 2-го типа. Минимально активная концентрация, при которой подавляется развитие вирус-специфического действия на 2,0 - 3,0 lg ТЦД50, для экстракта Щучки дернистой составила 0,017 мкг / мл, что в два раза меньше значения минимально активной концентрации (0,034 мкг / мл) для суммарного экстракта и экстракта Вейника наземного. ХТИ всех экстрактов составлял приблизительно 160.

Все модельные экстракты эффективны против вируса гриппа. Инфекционный титр вируса гриппа снижается больше всего (на 3,0 lg ID50) при концентрации БАВ, равной 0,0034 мкг / мл под действием экстракта Щучки дернистой. Наибольшая селективность воздействия на вирус гриппа присуща суммарному экстракту, для которого ХТИ = 808. Результаты исследований показывают, что модельные экстракты являются эффективными ингибиторами суррогатного вируса гепатита С (ВБВД) с высокими показателями ХТИ.

Все экстракты подавляют вирус бычьей диареи (тест-модель вируса гепатита С) на 4,0 - 5,0 lg ID50 при концентрациях БАВ, которые равны 0,0034 мкг / мл.

Концентрация БАВ для получения антивирусного действия 0,017 -г 0,068 мкг / мл значительно меньше таковой для синтетических веществ.

Все экстракты имеют свойство индуцировать иммунный γ-интерферон. Экстракт

Вейника наземного индуцирует интерферон на уровне эталонного индуктора Poly I: Poly С, а суммарный экстракт и экстракт Щучки дернистой индуцируют интерферон на уровне 25% от уровня индукции интерферона эталонным индуктором.

Приведенные результаты исследований указывают на то, что БАВ оказывает апоптозмодулирующее действие.

Проведенные испытания БАВ свидетельствуют о наличии антиоксидантньгх свойств, а именно подтверждена дозозависимая кинетика подавления генерации супероксидрадикала аниона, а также угнетение интенсивности свободнорадикальных процессов, индуцированных пероксидом водорода.

К тому же, предложенный БАВ не имеет недостатков, присущих синтетическим антивирусным препаратам, предоставляет возможность создания лекарственных форм с точной дозировкой и целенаправленным фармако динамическим действием.