MEMORIA DESCRIPTIVA

CAMPO TÉCNICO

La invención apunta a un bioestimulante, promotor del crecimiento vegetal formulado en base a la bacteria Pseudomonas rhodesiae cepa A20, depósito RGM 3341, que es resistente a ambientes de alta concentración salina y de boro.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los bioproductos son insumos biológicos agrícolas derivados de fuentes variadas, tales como microorganismos, extractos vegetales, y otras materias orgánicas de origen biológico. Se desarrollan para mejorar la nutrición, crecimiento y productividad de las plantas, actividad bioestimulante; así como para controlar plagas y enfermedades en los cultivos, actividad biocontroladora de fitopatógenos o plaguicida.

Se ha descrito, de manera general, que la actividad biológica de los microorganismos usados como bioestimulantes, se limita a ambientes similares a aquellos en el que dicho microorganismo se aisló, por lo que éste se desarrollará óptimamente en cultivos que se mantienen bajo parámetros ambientales similares. Por este motivo, las formulaciones comerciales de bioestimulantes que actualmente están disponibles en el mercado muestran resultados erráticos cuando son empleadas en cultivos mantenidos en ambientes de alta concentración salino-bórica (por ejemplo, cultivos desarrollados en climas desérticos como en la Región de Arica y Parinacota, Chile).

Además, este fenómeno cobra mayor importancia al considerar el aumento de los procesos de salinización de los suelos agrícolas por fenómenos naturales y antropogénicos y el creciente fenómeno de desertificación. Todo lo anterior revela la necesidad de desarrollar bioproductos agrícolas activos y funcionales para ambientes salino-bóricos, ya que actualmente, esta especificidad no existe en el mercado. Para resolver este problema técnico, los inventores desarrollaron un bioestimulante basado en la bacteria Pseudomonas rhodesiae cepa A20, que fue aislada desde muestras ambientales obtenidas de las Lagunas de Amuyo (agrupación de 3 lagunas coloreadas que poseen altos niveles de sales, boro y arsénico, las que se localizan en el altiplano de la Región de Arica y Parinacota, Chile). Sorprendentemente, esta cepa ha demostrado tener propiedades promotoras del crecimiento vegetal tanto en presencia como ausencia de condiciones salino-bóricas.

Los inventores estudiaron numerosos microorganismos antes de dar con la cepa de la invención, incluso algunos del mismo género bacteriano, pero sólo la bacteria Pseudomonas rhodesiae cepa A20 fue capaz de promover el crecimiento vegetal en las condiciones de estrés salino-bórico evaluadas.

En el estado de la técnica existen documentos donde se divulgan otras cepas de la especie de la cepa de la invención, no obstante, ninguno de ellos apunta a mejorar el rendimiento de cultivos en suelos salino-bóricos, como sí lo hace la cepa de la invención.

Por ejemplo, encontramos la solicitud US2019124917A1, que divulga una composición para promover el crecimiento vegetal, donde la composición incluye distintas bacterias, entre las que se nombra, sin ejemplo asociado, una cepa de P. rhodesiae. De este modo se entiende que la especie Pseudomonas rhodesiae podría tener propiedades de promoción del crecimiento vegetal, no obstante, el documento no menciona resistencia a condiciones salino-bóricas. En este mismo sentido, la publicación de Romero (Research in microbiology 167.3 (2016): 222-233) estudia bacterias de hojas de tomate como biocontroladores y bioestimuladores, donde una de las bacterias es de la especie P. rhodesiae. No obstante, la publicación no evalúa una posible resistencia frente a boro o a sales. De hecho, para el experto en la técnica será evidente que la capacidad de promover el crecimiento vegetal en condiciones salió bóricas es inusual, y no es una habilidad de una especie bacteriana, sino que de algunas cepas en particular, como la cepa de la presente invención. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a un bioestimulante basado en la bacteria Pseudomonas rhodesiae cepa A20 para su uso agrícola, en especial en ambientes salino-bóricos. El producto se puede desarrollar como formulación sólida y/o líquida de Pseudomonas rhodesiae cepa A20 (depósito RGM 3341) y un medio de soporte apropiado para la agricultura. Donde la bacteria Pseudomonas rhodesiae cepa A20, tiene la capacidad de producir las enzimas proteasas, lipasas y celulasas, que le permitirían degradar materia orgánica proveniente de proteínas, lípidos y celulosa, respectivamente. Además, produce auxinas, y posee la capacidad de sol ubil iza r fosfatos y fijar nitrógeno in vitro. Esto revelaría su potencial bioestimulador del crecimiento vegetal, tanto en presencia como ausencia de condiciones salino-bóricas.

El bioestimulante de la invención corresponde a formulaciones (líquida y/o sólida) basadas en la bacteria Pseudomonas rhodesiae cepa A20 la cual, como ya hemos indicado, fue aislada de las Lagunas de Amuyo (Región de Arica y Parinacota, Chile).

La bacteria se puede cultivar en condiciones de laboratorio tanto en matraz como en biorreactor, en medios de cultivo adecuados. El microorganismo producido en cualquiera de estos dos sistemas permite obtener directamente una formulación líquida, la que puede aplicarse directamente sobre los cultivos.

Para la aplicación agrícola, puede ser conveniente también la aplicación de una formulación sólida, ya sea en polvo o gránulos dispersadles, para lo cual se requiere mezclar las bacterias deshidratadas con un medio de soporte que contiene coadyuvantes, tales como acarreadores, tensoactivos, estabilizantes, dispersantes u otros, todos agronómicamente apropiados. El cultivo líquido obtenido en el cultivo de matraz o biorreactor se puede deshidratar, por ejemplo, en un secador en spray para la generación de una formulación sólida, en polvo, la que convenientemente puede combinarse con un acarreador, como por ejemplo, caolinita, diatomita, bentonita, talco, maltodextrina o almidón; y con agente tensoactivo y estabilizante carboximetilcelulosa, por ejemplo, o cualquier acarreador o tensoactivo apropiado para la agricultura disponible en la técnica. Los inventores han demostrado que la bacteria Pseudomonas rhodesiae cepa A20 tiene la capacidad, in vitro, de producir auxinas, fijar nitrógeno y solubilizar fosfatos (propiedades promotoras del crecimiento), además de estimular el crecimiento de la parte aérea de plantas, tales como tomate.

Como se indicó, el bioestimulante de la invención se puede desarrollar en formulaciones líquidas y sólidas. En este último caso como polvos mojables con los acarreadores descritos, que son no tóxicos e incluso con calidad alimentaria o cosmética, compatibles con la industria agrícola. Además, el proceso de producción no emplea reactivos tóxicos. La bacteria Pseudomonas rhodesiae cepa A20 es capaz de crecer en ambientes salino-bóricos y conserva sus propiedades de bioestimulación promotoras del crecimiento vegetal tanto en presencia de sales de sodio y boro como en ausencia de estos.

El proceso de producción del bioestimulante de la invención es relativamente simple, tecnológicamente viable y económicamente atractivo. Los insumos que se requieren en la producción de la formulación sólida son accesibles y baratos.

La opción de formulación sólida (suspensión bacteriana en acarreadores sólidos) permite mantener al microorganismo viable por un período de tiempo suficiente para permitir un proceso de transporte y comercialización superior a las formulaciones líquidas

De este modo la invención apunta a un bioestimulante promotor del crecimiento vegetal con tolerancia a ambientes salino-bóricos, el que comprende bacteria Pseudomonas rhodesiae cepa A20 (depósito RGM 3341).

En una realización, la invención apunta a un bioestimulante para promover el crecimiento vegetal con propiedades tolerante a sal y boro el que comprende la cepa A20 de Pseudomonas rhodesiae y un medio de soporte apropiado para la agricultura; el que se escoge entre agua, soluciones acuosas, sustrato suspensiones espesas, gránulos y polvo. En una realización preferida, el soporte es gránulo o polvo y el acarreador se escoge entre caolinita, diatomita, bentonita carboximetilcelulosa, almidón, talco y/o maltodextrina. Convenientemente, el bioestimulante comprende una suspensión de Pseudomonas rhodesiae cepa A20 (depósito RGM 3341) en una concentración entre lxl0 ⁴ y lxlO ⁸ unidades formadoras de colonia por mL (UFC/mL), en especial entre lxlO ⁵ y lxlO ⁸ UFC/mL, y más especialmente entrelxlO ⁶ y lxlO ⁸ UFC/mL o por UFC/g en el caso de los sólidos. En una realización esta suspensión se deshidrata antes de la aplicación y se mezcla con los portadores sólidos y opcionalmente agentes coadyuvantes.

En una realización opcional, la suspensión, deshidratada o no, se mezcla con otros aditivos seleccionados de fertilizante, nematicida, sustancias tensoactivas, sistemas de protección UV y mezclas de los mismos.

Agentes coadyuvantes tensoactivos apropiados para el bioestimulate de la invención se escogen entre carboximetilcelulosa, detergentes no iónicos (tales como Tween 20, Tween 80, Tritón X-100), aceites de origen vegetal, alginato de sodio, polieti lenglicol (300-8000), entre otros.

En un segundo aspecto, la invención apunta a un método para promover el crecimiento vegetal que comprende contactar,, aplicar o inocular, cultivos, semillas, plántulas, almácigos, plantas, fertilizantes, soluciones nutritivas o agua de riego, con el bioestimulante de la invención. Donde la semilla, plántula o almácigo o planta corresponde a hortalizas, plantas forrajeras o plantas ornamentales, como flores. En especial la semilla, plántula o almácigo, o planta se escoge de una de las siguientes especies agronómicas: maíz, trigo, arroz, zanahoria, cebolla, arveja, tomate, pimentón, ají, pepino, berenjena, poroto, betarraga, papa, camote, maní, colza / canola, algodón, cebada, sorgo, soja, lechuga, manzana, girasol, frutilla, clavel, gerbera, gladiolo, gypsophila, alstroemeria. Donde convenientemente los cultivos, semillas, plántulas, almácigos o plantas se encuentran en ambientes salino-bóricos.

A continuación, se describe un modo preferente de realización de la invención propuesta, sin que ello limite las variantes técnicas que un experto en la materia pueda incorporar o modificar, y que quedan dentro del alcance del concepto inventivo que reivindicamos en esta solicitud. EJEMPLOS

1. Obtención del Pseudomonas rhodesiae

El microorganismo fue aislado desde muestras ambientales obtenidas de las Lagunas de Amuyo (agrupación de 3 lagunas coloreadas que poseen altos niveles de sales, boro y arsénico, las que se localizan en el altiplano de la Región de Arica y Parinacota, Chile).

Las muestras se colectaron asépticamente utilizando una pala metálica desinfectada con etanol 70%, y se almacenaron en bolsas estériles de plástico. Las muestras se mantuvieron a 4°C en un refrigerador y se transportaron inmediatamente al laboratorio para su procesamiento.

Las muestras ambientales se colocaron en placas de medio King's B que contenía (por litro): 20 g de peptona, 10 mi de glicerol, 1,5 g de K2HPO4, 1,5 g de MgSO4x7H ₂ O y 15 g de agar-agar (pH 7,0). Las placas fueron incubadas a temperatura ambiente durante 1 semana o hasta observar crecimiento microbiano. Las bacterias de cultivos enriquecidos se aislaron mediante dilución seriada en medio líquido King's B y sembrando en placas del mismo medio suplementado con agar-agar de 15 g/L. Las incubaciones se realizaron a temperatura ambiente. Las colonias aisladas se transfirieron a medio líquido. Estos procedimientos se repitieron hasta que se observó una morfología única y homogénea, tanto macroscópica como microscópicamente.

Una vez aislada se procedió a su identificación. El ADN genómico de la bacteria se obtuvo usando el kit DNeasy UltraClean Microbial (QIAGEN) de acuerdo con el procedimiento descrito por el fabricante. El gen 16S rRNA se amplificó por PCR utilizando los cebadores específicos para bacterias 27F y 1492R. Los resultados de la secuenciación indicaron que la cepa aislada corresponde a Pseudomonas rhodesiae, se asignó el número de identificación interno A20 fue depositada en la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos (Av. Vicente Méndez 515, Chillón, Chile), con fecha 13 de junio de 2022 y recibió el número de registro RGM 3341.

2. Caracterización de Pseudomonas rhodesiae cepa A20

Una vez aislada e identificada la cepa se procedió a evaluar su capacidad en diferentes actividades promotoras del crecimiento vegetal (PGP) in vitro, específicamente su capacidad en Producción de auxinas (PA), Solubilización de fosfato (SF), y Fijación de Nitrógeno (FN). 2.1 Producción de auxinas (PA): la producción de ácido indol-3-acético (IAA) se determinó por el método colorimétrico de Salkowski. El sobrenadante bacteriano se mezcló con el reactivo de Salkowski (0,5 M FeCI ₃ en HCIO ₄ al 35%) en una proporción 1:2 (sobrenadante:reactivo de Salkowski). Un cambio de color de amarillo a rojo fue indicativo de la producción de IAA.

2.2 Producción de sideróforos (PS): la producción de sideróforos se detectó mediante el método Chrome Azurol S (CAS) descrito por Schwynand y Neilands, en el que se mezclaron 500 pL de sobrenadante bacteriano con 500 pL de solución de CAS. Un cambio de color de azul a naranja indica la producción de sideróforos. La reacción fue negativa.

2.3 Solubilización de fosfato (SF): se utilizó medio sólido Pikovskaya (PVK) para determinar la solubilización de fosfato inorgánico. El medio PKV contiene (por litro): 10 g glucosa, 0,5 g extracto de levadura, 0,5 g (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 0,1 g MgSO ₄ x7H ₂ O, 5 g Ca ₃ (PO ₄ ) ₂ , 0,2 g KCI, 0,002 g MnSO ₄ x2H ₂ O, 0,002 g FeSO ₄ x7H ₂ O y 15 g agar-agar. La aparición de un halo transparente alrededor de las colonias bacterianas después de la incubación es indicativa de solubilización de fosfato.

2.4 Fijación de nitrógeno (FN): se utilizó el medio semisólido NFb para detectar la capacidad de fijar nitrógeno. Medio NFb contiene (por litro): 5 g ácido DL-málico, 0,5 g K ₂ HPO ₄ , 0,2 g MgSO ₄ x7H ₂ O, 0,1 g NaCI, 0,02 g CaCI ₂ x2H ₂ O, 0,5 g de agar-agar, 2 mL de solución de micronutrientes, 2 mL de solución de azul de bromotimol (0,5% en KOH 0,2 N), 4 mL de Fe (lll)-EDTA (1,64%) y 1 mL de solución de vitaminas. El pH se ajustó a 6,8. La solución de micronutrientes contenía (por litro): 0,4 g CUSO ₄ X5H ₂ O, 0,12 g ZnSO ₄ x7H ₂ O, 1,4 g H ₃ BO ₃ , 1,0 g Na ₂ MoO ₄ x2H ₂ O y 1,5 g MnSO ₄ xH ₂ O. La solución de vitamina contenía (por litro): 100 mg biotina y 200 mg piridoxal HCI. La fijación de nitrógeno se determina mediante la formación de una película blanquecina sub-superficial 'similar a un velo' después de la incubación.

Los resultados muestran que el aislado A20 pertenece al género bacteriano Pseudomonas y posee una identidad del 99,37% con la bacteria Pseudomonas rhodesiae a nivel del gen que codifica para el rRNA 16S. Posee la capacidad de producir las enzimas proteasas, lipasas y celulasas, que le permitirían degradar materia orgánica proveniente de proteínas, lípidos y celulosa, respectivamente. Además, produce auxinas, y posee la capacidad de solubilizar fosfatos y fijar nitrógeno in vitro. Esto revelaría su potencial bioestimulador del crecimiento vegetal. Estos resultados se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1. Resumen de las propiedades estimulantes del crecimiento (PGP), in vitro, de la bacteria Pseudomonas rhodesiae cepa A20. 3. Tolerancia in vitro a condiciones salino-bóricas

Para establecer la tolerancia de la bacteria A20 al estrés salino bórico, la cepa fue crecida en medio de cultivo suplementado con NaCI y/o ácido bórico (H3BO3).

Se evaluó si la bacteria candidata era capaz de crecer en presencia de distintas concentraciones de NaCI (8 g/L, 15 g/L y 30 g/L) o H3BO3 (10 ppm, 100 ppm y 300 ppm). Además, se determinó la tolerancia de la bacteria a de agua de riego de Lluta: 14,64 mmol/L de sodio y 20 ppm de boro, normal y concentrada. Se registró crecimiento bacteriano a las distintas concentraciones ensayadas. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2. Crecimiento de la bacteria Pseudomonas rhodesiae cepa A20 en presencia de NaCI o H3BO3.

El crecimiento fue comparado con las condiciones estándar (medio KB sin NaCI o ácido bórico), el cual fue definido como ++.

El crecimiento es similar a las condiciones estándar, cuando la bacteria fue crecida en 8 g/L NaCI; 10 y 100 ppm de ácido bórico; y en medio de cultivo suplementado con estos compuestos a concentraciones 4 veces superior al agua de riego de Lluta.

El crecimiento se vio estimulado (+++) empleando 15 y 30 g/L de NaCI; y en concentraciones similares al agua de riego de Lluta concentrada IX y 2X.

Una reducción en el crecimiento (+) fue observada al emplear 300 ppm de ácido bórico; a 8X agua de riego de Lluta; y en medio de cultivo preparado con agua del río Lluta.

Estos resultados sugieren que el microorganismo A20 posee una tolerancia salino bórica compatible con las condiciones de cultivo de la Región de Arica y Parinacota.

4. Aplicación del bioestimulante de la invención sobre plantas de cultivo

4.1 Tomate Poncho negro, Solanum lycopersicum var.RGM 3341,

Plantas de tomate cv. Poncho Negro se trataron una vez por semana con el bioestimulante de la invención, que consiste en lxlO ⁸ UFC de Pseudomonas rhodesiae cepa A20 en un acarreador acuoso, el que se aplicó en la base del tallo. Como control se utilizaron plantas de tomate cv. Poncho Negro tratadas sólo con medio de cultivo (en el cual fue cultivada la bacteria) estéril y sin inocular. Las plantas fueron regadas diariamente con agua de riego del valle de Azapa, agua naturalmente salino bórica, donde la concentración de sodio alcanza los 4,09 mmol/L y la de boro 1,03 ppm. Los ensayos se llevaron a cabo por quintuplicado. Luego de 4 semanas de inoculación (4 aplicaciones), las plantas se removieron del sustrato, se lavaron y se determinó la longitud del tallo, peso húmedo y seco de las raíces y de la parte aérea de forma separada, lo cual permitió determinar el porcentaje respecto al control sin tratar, lo que se expresa como factor, por ejemplo si el control y la planta tratada son ¡guales el factor es 1, si hay un aumento el factor es mayor a 1, y si disminuye el factor sería inferior a 1. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3. Efecto del bioestimulante de la invención sobre plantas de tomate, en condiciones salino bóricas

4.2 Maíz cv. Lluteño, Zea mays var.

Plantas de maíz cv. Lluteño se trataron una vez por semana con el bioestimulante de la invención, que consiste en lxlO ⁸ UFC de Pseudomonas rhodesiae cepa A20 en un acarreador acuoso, el que se aplicó en la base del tallo. Como control se utilizaron plantas maíz cv. Lluteño tratadas sólo con medio de cultivo (en el cual fue cultivada la bacteria) estéril y sin inocular. Las plantas fueron regadas diariamente con agua de riego del valle de Azapa, agua naturalmente salino-bórica, donde la concentración de sodio alcanza los 4,09 mmol/L y la de boro 1,03 ppm. Los ensayos se llevaron a cabo por quintuplicado. Luego de 4 semanas de inoculación (4 aplicaciones), las plantas se removieron del sustrato, se lavaron y se determinó la longitud del tallo, peso húmedo y seco de las raíces y de la parte aérea de forma separada, lo cual permitió determinar el porcentaje respecto al control sin tratar, lo que se expresa como factor, por ejemplo, si el control y la planta tratada son ¡guales el factor es 1, si hay un aumento el factor es mayor a 1, y si disminuye el factor sería inferior a 1. Los resultados se muestran en la Tabla 4, donde destaca el aumento en peso seco de las hojas de la planta.

Tabla 4. Efecto del bioestimulante de la invención sobre plantas de maíz, en condiciones salino- bóricas

De estos datos se puede concluir que el bioestimulante de la invención, que comprende la bacteria Pseudomonas rhodesiae cepa A20, estimula el crecimiento y la ganancia en peso fresco/seco de plantas de tomate y de maíz, y que no tiene efectos nocivos sobre la planta, en condiciones salino- bóricas.

Estos ejemplos deben considerarse como ilustrativos y no limitativos de la presente invención, la que se define completamente en las reivindicaciones adjuntas.