CE PQLYI.1BQ2YKE.

La présente invention concerne une séquence nucléotidique dite "polyribozyme ¹ * apte à conférer, aux lante!?, ne résistance aux virus, -ainsi qu'un procédé pour rendre les plantes résistantes. L'invention vise également les plantes exprimant le polyribccyme.

Pl si urs approches ont été développées pour conférer, aux plantes cul i es, une résis ance aux virus, en intégrant dans le génome des plantes des séquences d'acides nucléiques virales : le gène de la protéine de capside, les gènes de protéines non structurales, des séquences d'_ARN viral en antisens, et des ARN de virus satellites (voir par exemple, Cuozzp et al, 1988, Bio/Technoloçy 6, 549-557 ? Rezaian et al, 1988, Plant. Mot:—Biol., H-—463-471 ; Harrison et al, 1987, Nature 328, 797-802).

Ces travaux rapportent l'obtention de résistances partielles ou de tolérances. Néanmoins, il s'agit dans la plupart des cas de retard de symptômes, de symptômes atténués mais pas de résistance totale.

En outre, certaines de ces techniques, par exemple les ARN de virus satellites, peuvent donner lieu à de nouveaux problèmes-. Par exemple, un ARN satellite réduisant les symptômes sur une espèce peut devenir léthal sur une autre espèce. De plus, des mutations sur les séquences nucléotidiques du virus satellite introduites dans les plantes peuvent auq βnter la sévérité de l'infection au lieu de la diminuer _*

De même, l'utilisation dé la prot ine ^~ ae capside pour conférer une résistance présente des

inconvénients. Par exemple, la protéine de capside d'une souche particulière du —virus ne protège pas nécessairement la plante contre une infection par une autre souche de viru3. ïl es difficile d'utiliser le degré d'homologie de la séquence en acides aminés de la protéine de capside entre différents virus ou entre différentes souches pour prédire le niveau de tolérance permis par l'expression de la protéine. De plus, l'expression de protéines de capside pour protéger 1'infection virale—présente le risque d'induire des hétéroencapsida ions entre la protéine de capside exprimée dans la plante et d'autres virus infectant la plante transgénique. Bien qu'elle n'ait jamais été démontrée pour des— lantes transgéniques, cette hétéroencapsida iσn a déjà été observée entre deux souches de BYDV et entre le 25YMV et le PRSV.

L'utilisation de ribozymes a égalemen été envisagée pour conférer, aux plantes, une résistance aux virus. Les ribozymes sont des molécules d'ARN qui agissent comme des enzymes en catalysant spécifi uement le clivage de l'ARN cible _* Les premières expériences avec des ribozymes dans des cellules végétales ont été décrites dans la demande de brevet EP-A-321021 _* Depuis, -plusieurs auteurs ont tenté d'optimiser la structure du ribozyme et les conditions opératoires, pour obtenir un clivage efficace de l'ARN viral.

Par exemple, La b et Hay_jJ _* Ccn. Virol-, 1990, 71 s 2257-2264) ont démontré le clivage, in vitro, par des mono-riboïîymes, de l'ARN du Virus de l'Enroulement de la Pomme de Terre (PLRV) dans des régions codant pour la RNA-polymêrase et la protéine de capside. Ceci étant, la réaction de clivage in vitro n ^J a fonctionné qu'à 40*C ? auc ne réaction n'a pu être observée * 0 ^β c. Or les plantes sont généralement cultivées entre

10 et 30*C, selon l'espèce. I-amb—et—H y suggèrent donc, pour une utilisation in ivo, ^" d'augmenter la longueur des bras complémentaires. -Ceci étant, une taille de bras trop importante peut conduire à la formation de duplex stable entre l'ARN cible et le ribozyme, empêchant la dissociât-ion du ribozyme et le rendant incapable de catalyser-mne autre réaction_jie clivage. En outre, le ribozyme lui-même, en fonction de la longueur et de la séquence des bras complémentaires peut former des structures secondaires qui diminuent son activité de clivage.

Edington et Nelson ("Gène Régulation : biolσgy of Antisense RNA and DNA : Ed. ERICKSON ET IZANT, Raven Press Ltû, New-York, 1992) ont déσrit l'utilisation in vitro et in vivo de mono-ribozymes p-βur-inactiver le gène de la polymérase du Virus de la Mosaïque du Tabac (TMV) . Ils ont constaté que les ribozymes avaient un comportement très différent selon qu'ils étaient in vitro ou in vivo. L'activité d'-un ribozyme in vitro ne peut donc pas être utilisée pour prévoir l'activité du même ribozyme In vivo. Par exemple, le clivage in vitro apparaît )peu efficace et nécessite une concentration en ribozyme 20 : fois -supérieure ^~ a la concentration d'ARN géno ique du TMV. Par contre, dans un expérience in vivo utilisant des protoplastes de tabac infectés par du TMV le ibG3-yme-sup rime—90 % de la multiplication de l'ARN viral. Il es intéressant de noter q e l'ARN antisens utilisé comme témpin n'inhibe que de 20 % la multiplication virale- Cef» auteurs font également référence à des travaux de Gerlach et al qui mettent en , oeuvre un polyribssyflie ciblé contre le gène de la jpolymérαse du TMV. ce polyribozy e n'a pas fo c ion é in vitro en raison de la longueur du duplex formé entre le -ribosy e et -l'ARN cible. En revanche, in vivo, ee polyriboayme a clivé

le substrat. Des plantes transgéniques -de tabac exprimant, soit le monoribozyme, soit le polyribozyme ont montré, après infection ^ le TMV, un retard de symptômes ₄ Une résistance , totale, c'es -à~ ir<≥ l'absence définitive de symptômes, n'est pas décrite. Les auteurs concluent que les paramètres comme la longueur optimale des bras complémentaires, le choix de la séquenu« cible et le choix du promoteur permettant de surmonter d'éventuels problèmes de "compartimentaiisa on" des ^{^} ribozymes doivent être déterminés par l'expérience.

ËP-A-0421376 décrit des ribozymes dirigés contre une séquence d'ARN non codante du CMV. O-A-9213090 décrit 1'inactivation de l'ARN de la protéine de capside du CMV par l'introduction, au sein de la séquence, d'une séquence hétérologue, en utilisant un monoribozyme du type "Groupe i intron". Aucun de ces documents ne décrit l'obtention d'une résistance totale contre 1Û CMV.

Le problème technique que se propose de résoudre la présente invention est de fournir un moyen fiable et dépourvu d'inconvénients, de. conférer aux plantes , une rccictance aux virus.

Les présents inventeurs ont résolu ce -problème par la conception et la mise en oeuvre ^"" a.'un polyribozyme dirigé contre la protéine de capside d'un virus. Ce polyribozyme est capable d'inaσtiver le gêne codant pour cet e protéine, et de conférer ainsi une résistance totale aux virus _*

L'efficacité du polyribozymâ de l'invention est surprenante au vu des résultats médiocres obtenus dans l'art antérieur avec les séq nces an ise s j. gène d<≥ la protéine de capside, chacune de ces techniques impliquant une inactivation de l'ARN correspondant. En outre, plusieurs auteurs ,-r=avaient déconseillé

l'utilisation de polyribozymes -_agis-sa:nt-en----brans parce que les ribozymes ne pouvaient pas fonctionner indépendamment les uns des autres et parce que les régions catalytiques ayant dès séquences identiques avaient parfois tendance à s'hybrider entre elles, ce qui conduisait à des structures Inactives (voir par exemple, Tair , HFSP Worksho —sîKNA-Εditing - Plant Mitochondria", Abstract Book, Berlin, September 15-20, 1992) . Les résultats btenus ^'" selon ^" T ^r nve tion sont inattendus compte tenu, d'une part, do 1-a cible choisie, c'est-à-dire la protéine de capeide et, d'autre part, de lθ s-éthode utilisée pour inactiver la cible, c'est-à-dire un polyribozyme.

Outre l'efficacité de l'inactivation, les polyribozymes de l'invention -présentent un certain nombre d'avantages par rapport au* techniques connues :

- Les ribozymes fonctionnent comme des enzymes, catalysent spécifiquement le clivage de plusieurs ARN viraux sans modification de -structure. Ce clivage enzymatique conduit à la destruction de tous les ARN viraux alors que l' xpression_ de la protéine „_de capside qui inhibe 1'iïifection_vii"ale fonctionne comme un inhibiteur de la multiplication du virus.

- Les ribozymes sont des molécules d'ARN non codantes qui ne peuvent induire des hêtérσencapsidations ou générer de nouvelles souches virales.

- Alors que la spécificité de la tolérance induite par la protéine de capside est difficilement prévisible, les ribozymes peuvent être construits pour cliver spécifiquement une ou plusieurs souches virales, ou plusieurs virus apparantéβ si ^~~ les bras complémentaires correspondent aux zones d'homologies

conservées entre les différentes souches ou entre les différents virus apparentés.

Pour avoir une σompr-éhanεion complète de l'invention, il est utile de préciser quelques informations concernant les ribσsymsε—en gênerai ^" ; un ribozyme est une molécule d'ARN gui, en raison de sa séquence et de sa structure secondaire, possède une activité 'endoribonuσléase lui permettant, lorsqu'il s'hybride avec une deuxième moiώσule d'ARN complémentaire, de cliver ce deuxième ARN. Ce dernier est donc un "substrat" pour 1© ribozyme.

Le ribozyme a deux parties essentielles :

(i) une séquence, qui sera appelée dans ce qui suit "séquence complémentaire"-,—et qui est choisie de manière à ce qu'elle soit complémentaire du substrat que l'on veut cliver, ce qui permet l'hybridation des d ux molécules ;

(ii) et une région catalytique qui a une séquence conservée indépendamment du substrat choisi et gui ne participe pas à l'hybridation avec le substrat en raison de sa structure secondaire en forme de "boucle".

Normalement, la région au sein de la séquence complémentaire, une partie de la séquence complémentaire se trouvan donc en 5' de la région σatalytique, et l'autre partie en 3'. Ces fragments de séquence complémentaire de chaque côté de la région catalytique sont souvent appelés "bras hybridants".

L'objet de la présente invention est un polyribozyme. Plus particulièrement, il s'agit d'une séquence d'acide nucléique, dite '--polyribozyme", ayant une activité d'endoribonucléase et étant capable d ¹ inactiver le gène de la protéine de capside d'un virus, caractérisée en ce qu'elle comprend :

i) ne séquence complémentaire d'une partie, au moins, du gène ou de so transcrit ou de ses intermédiaires de réplication et, incluses à des endroits distincts de cette séquence complémentaire : ii) une pluralité de - —régions catalytiques provenant de ribozymes ? iii) et, éventuellement, une ou plusieurs séquences non complémentaires du transcrit dudit gène, ladite ou lesdites séquences non complémentaires étant insérées entre 2 bas s consécutives de la séquence complémentaire•

Le terme "polyribozyme" dans le contexte de la présente invention signifie-r=_une molécule d'ARN constituée d'un enchaînement,—en -tête-à-queue, de ribozymes, le ribozyme étant donc le motif unitaire du polyribozyme. En d'autres termes, il s'agit d'une série de régions catalytiques reliées entre elles par des bras hybridants, l'ensemble de ces bras constituant la séquence complémentaire. Le polyribozyme agit normalement comme une "uni-molécule" contre un seul transcrit, c•eèt-à-dire que les sites de clivage de chacune des régions catalytiques se trouvent sur un même transcrit -: la protéine ^" de capside. Le polyribozyme de l'invention peut également comprendre, outre les 2 partiûβ -essentielles [(i), séquence complémentaire] et f (ii) , régions catalytiques] décrites ci-dessus, -une ou plusieurs séquences (iii) non complément-aires du substrat. La nature et la fonction de ces séquences non complémentaires seront décrites en détail plus loin.

Parmi les 2 parties essentielles ^~ -du polyribozyme, la séquence complémentaire es -celle qui détermine le substrat. Dans le cas de la -présente invention, il s'agit d'une séquence complémentaire du gène de la protéine de capside d'un virus;-ou d'un fragment de ce

gène. Lorsqu'il s'agit d'un virus -a AR C+) , dont les gènes servent directement <ie mAKN, la séquence comp menta re est réellement complémentaire du gène. D ns d'autres cas, elle st complémentaire u transcrit du gène. Elle -peut également être complémentaire d'un intermédiaire de réplication.

La séquence complémentaire peut s'hybrider avec la totalité du gène de capside. Dans ce cas, la longueur totale de la séquence-complémentaire varie en fonction de la longueur du gène de capside en question. En revanche, la séquence complémentaire peut s'hybrider seulement avec un fragment du gène. Le fragment en question doit être suffisamment long pour pouvoir inclure, dans la séquence correspondante du polyribozyme , au moins deux régions catalytiques. De manière générale, la longueur de la séquence complémentaire, sans compter les régions catalytiques (c'est-à-dire la somme des :fc>ras h br-L-dants) peut varier d'environ 40 à 2000 bases. Une longueur de 00 à 1000 est préférée, de nombreux virus ayant un gêne de la protéine de capside d'environ 1000 bases (par exemple, CMV, PLRV) .

Le terme "complémentaire" dans le contexte de 1 -invention signifie un degré de complémentarité suffisamment élevé pour permettre l'hybridation stable entre le polyribozyme et ce substrat, et le clivage efficace du substrat. Lorsque le polyribozyme ne contient pas de séquence du type (iii), c'est-à-dire "non complémentaire", le degré de complémentarité est normalement de 100 %. La présence d'un certain nombre de mésappariements, par exemple jusqu'à 10 , dans la séquence peut être tolérée à condition que cela n'empêche pas l'hybridation et le clivage du substrat.

La partie (ii) du polyribozyme, c'est-à-dire la région catalytique, provient e n'importe quel type de

θ ribozyme approprié, par exemple "Tête de Marteau", "Hairpin", OU "Group ï intron". Un même polyribozyme peut contenir des régions cattalyt ques provenant de différents types de ribozymes,-—par exemple "Tête de Marteau" et "Epingle à cheveux". De préférence, il s'agit de régions catalytiques--provenant de ribozymes du type "Tête de Marteau" (Hamaerhead) et dont la structure consensus est illustrée dans les figures 1A, B, C et D. Ces ribozymes sont décrits en détail dans la demanda du brevet EP-A-321021 et WO-A-91197B9.

Bien que les régions catalyttqu-ÇER -il ustrées dans la figure 1 aient une structure et une séquence conservées, il a été constaté que certains nucléotides peuvent être délétés, insérés, _substitués ou modifiés sans nuire à l'activité d — -c o^y e, -^.'invention comprend l'utilisation, dans le polyribozyme, de ces régions catalytiques modifiées à condition que leur activité catalytique soit conservée. Cette activité peut être vérifiée en appliquant les tests décrits plus loin.

Par exemple, un ou plusieurs nucléotides de la région catalytique II ill stre -dans la figure ^~ IA peuvent être remplacés par des nucléotides contenant des bases telles que l'adénine, la guanine, la σytosine, la méthyl cytosine, ' l'uraçile, ^" la thymine, la xanthine, 1•hypσxanthine, l'inosine ou d'autres bases méthyléeε. Les bases "conservées" C-G qui, ensemble, forment, la première: paire appariée de la boucle catalytique, peuvent être remplacées par ϋ-A (Koizumi et al, FEDS Letts. 330, 3, 339^330, 1988) ,

Les nucléotides e là région catalytique illustrée dans la figur 1 vent aussi êtpe-modifiés chimiquement, Les nucléotides sont composés d'une base, d'un glucide et d'un groupement monophosphate» Chacun de ces groupements peut donc être modifié. De

10 telles modifications sont décrit-as dέfns "Principleε of Nucleic Acid Structure (Ed. Wolfram Sanger, Springer Verlag, New York, 1984). Par exemple, les bases peuvent porter des substituants tels que des groupements halogènes, hydrox , amin , ^" aïkyl, azido, nitro, phényl, etc. La partie glucide des nuelèotide peut aussi subir des modifications telles que le remplacement des groupements hydrcxyl secondaires par des groupements halo, a ino ou -e.zi.ic—o encore la S' ώthylation.

Le groupement phosphate des nucléotides peut être modifié par le remplacement d'un oxygène par N, S ou C donnant lieu respectivement à un phosphoramidate, phosphorothioate et phosphonate• Oes derniers peuvent présenter des propriétés pharmacokinétiques intéressantes.

Les bases et/ou les nucléotides de la région catalytique peuvent aussi porter des substituants tels que des acides aminés, par exemple 3a tyrosine ou l'hiatidin .

Il a également été constaté que des nucléotides supplémentaires pouvaient être insérés à certains endroits de la région catalytique "sans nuire a l'activité du ribozyme. par exemple, une base supplémentaire choisie par ie .h,—G C—ou U peut être insérée après A ¹ dans la figure 1A ou 1B.

Selon une variante Je l'invention, le polyribθ2yme peut comprendre, comme région catalytique, une ou plusieurs structures ^{" "} telles qu'illustrées dans la figure 1D. Cette structure, appelée "minizyme", est décrite -dans la demande de brevet international W0-A-91197S9. Elle représente une région catalytique du type "Tête de Marteau" dont _l a "boucle" a été remplacée par; un groupa •?". p peut être une liaison covalente entre G et A, n ou

F€T/FRM/Oûlïό

11 plusieurs nucléotides (RNA ou DNA-, -ou tnj__-mél-ange, ou encore des dérivés décrits ci-dessus) ou tout atome ou groupement d'atomes autre qu'un nucléotide, qui n'affecte pas l'activité catalytique. Lorsque p représente une pluralité de nucléotides, elle peut contenir des appariements internes. La séquence et le nombre de nucléotides constituant le groupe "P" n'est pas critique et peut aller de 1 à 20 nucléotides par exemple, et de préférence de 1^ 6. Il est préférable de choisir une séquence dépourvue d' ppariements internes du type wateon-Criox.

L'activité catalytique des -polyribozy es de l'invention peut être vérifiée in vitro par la mise en contact du polyriboiaymc, ou d'Une séquence gui, après transcription, donnera lieu y polyribozyme, avec le substrat suivie de la mise en évidence du clivage. Les conditions opératoires pour l ^-réaction de clivage j _» a vitro sont les suivantes ; une température comprise entre 4 et 60" C, de préférence entre 20 et 55"C, un pH compris entre 7.0 et 9.0 enviro , en présence de métaux divalents, tels que Mg ² *, à une concentration de 1 à 100 mM (de préférence 1 à 20-mm) . Le polyribozyme est en général présent dans une proportion éguimolaire avec le substrat, ou en excès. Les réactions de clivage in vitro se déroulent avantageusement selon le protocole décrit par (J. Gen _* Virol. 1990, 71, 2257-2264) . Cet article décrit également les conditions appropriées pour in vitro pour la production de ribozymeS--a— artir d'oligodéoxy- ribonucléotides insérés dans des plas ides.

Tn vivo, les conditions Δe. clivage sont celles existant naturellement dans la .cellule.

Les ribozymes "Tête de Marteau" clivent le substrat immédiatement en aval d'un -site "cible" XXX, de préférence XUX, dans lequel-X représente l'une des

4 bases A, C, G, u et u représentent l'uracyl, Une séquence cible particulièrement préférée est XUY dans laquelle Y représente A, C ou U ^~ et X est souvent G, par exemple GϋCt D'autres sites cibles sont possibles, mais moins efficaces, par exemple CAC, UAC, et AAC. Pour les ribozymes du type "Epingle à chevfîux", une séquence cible préférée est Aïϋ .

Ces séquences cibles sont -importantes dans la construction et le fonctionnement des polyribozymes, non seulement parce qu'elles indiquent les positions de clivage du substrat, mais aussi parce qu'ils déterminent la position à - -laquelle la région catalytique doit être insérée lans la séquence complémentaire, an effet, chaque région catalytique du polyribozyme doit se trouver ^" Ά un -endroit, dans la séquence complémentaire, qui côïxespαnd à un site XUX du transcrit. Par exemple, si OTΩSlte XUX se trouve à la position 10S du gène de la protéine de capside et un autre à la position 205, une région"catalytique est insérée à la position correspondant à 108 dans la séquence complémentaire et un -autre à la 205.

Le motif XUX est un motif gui:—se ressent très fréquemment dans les séquences d'ARU» Par exemple, il existe en moyenne un motif G{JC toutes les 64 bases dans une séquence ayant un —répartition de bases aléatoire et égale, ceci signifie que le substrat contient norm leme t e pluralité de sites de clivage

XUX, comme indiqué ei-de^aus, lçs régions catalytiques du polyribozyme se situent à des positions de la séquence complémentaire .qui correspondent aux sites XUX. Ceci étant, il n'-ast pas nécessaire, pour obtenir un -clivage efficace selon l'invention, d'inclure une région catalytique pour chaque séquence cible XU rrdU substrat. Selon l'invention, un clivage efficace est obtenu lorsque le

polyribozyme contient au moins,2 régions catalytiques. Le nombre total de régions catalytiques incluses dans la séquence complémentaire est égal ou inférieur au nombre total de sites XUX présents dans le gène. Le polyribozyme de l'invention peut donc contenir un nombre très variable de régions catalytiques. Par exemple, pour le CMV, le polyrifoozyme peut contenir de 2 à 11 ou 12 régions catalytiques environ, lorsque la séquence cible est GUC. Dans je cas où il est décidé d'inclure dans la séquence complémentaire, un nombre de régions catalytiques inférieur au nombre de sites XUX dans le substrat, le choix d s sites retenus peut se faire en respectant les critères suivants :

a) la distance entre 2 sites—XUX ciblés et, par conséquent, entre 2 régions catalytiques dans le poly ibozyme, doit être suffisamment longue pour permettre aux bras hybridants du polyribozyme situés entre les .-.régions catalytiques correspondantes, de s'hybrider avec le substrat de manière stable et pour-éviter que les régions catalytiques ne s'hybrident entre elles, une distance d'au moins 8 bases, et de préférence d'au moins 14 bases, par exemple 20 bases environ est particulièrement avantageuse. Bien entendu, ce critère ne doit être pris en considération que lorsque le substrat contient des sites ^" XU très rapprochés. Autrement, si les sites ^" XUX du substrat sont éloignés les uns des autres de plus de S à 20 bases, ce critère de choix n'a pas ci -importanc .

b) les sites XUX ciblés se trouvent de préférence dans une partie du gène de la protéine de capside qui n'a pas de structure secondaire importante.

Ceci facilite l'accès du polyribozyme au substrat et. augmente son efficacité-

c) les sites XUX ciblés peuvent faire partie des zon s d'homologie conservée entre les différentes souches d'un même virus _t ou entre différents virus apparentés. Les polyriboxymss construits en respectant ce critère peuvent cliver spécifiquement plusieurs —souches virales ou plusieurs virus apparentée. ^~ Pss exemple, la région centrale du gène d la protéine de capside du PLRV est hautement conservée par rapport aux séquences des protéines 'de capside des virus apparentés BWYV et BYDW Les--citas XUX, et particulièrement GUX au -sein de cette région centrale constituent donc .des-sites préférés pour un polyribosymc selon , cette variante de l'invention.

Egalement à titre d'exemple, l'eîtfcrémité 5' (sur environ 100 bases) de la séquence de la protéine de capside du CMV est hautement conservée entre les souches I17F, FNY, M; I, Oτ—Y, D—et C. Au sein de cette séquence conservée, à la position 84, il existe un site GtIC-conservé dans toutes ces souches.

Selon cette variante —àe l'invention, un polyribozyme capable d'inactiver plusieurs souches du CMV comprend, parmi ses régions catalytiques, une région catalytique qui se trouve à l'endroit de la complémentaire correspondant à la position 84 (voir exemples ci-dessous) -,

d) un autre critère de choix des sites XUX ciblés est l'absence d'homologie avec des gènes

endogènes de la plante à ^: a sformer. En effet, bien qu'ils soient rares, certains virus possèdent des séquences qui trouvent un homologue dans le génome de plantes Il—est important donc d'éviter des sites XUX se trouvant au sein d'une tellΛ séque ce.

Selon un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, le polyribozyme peut comprendre, outre les 2 parties essentielles (i) et (ii) décrites ci-dessus, un 3ème constituant (iii) qui est une ou plusieurs séquences -non complémentaires du gène de protéine de capside—du virus. Comme les régions catalytiques, ces séquences non complémentaires sont insérées à des endroits distincts de la séquence complémentaire,- l a complémentarité étant interrompue par 1'insertion. De manière s re e _/ il a été constaté par les inventeurs que la présence de telles séquences non complémentaires au sein des bras hybridants du polyribozyme n'empêche pas l'hybridation du polyribozyme. avec le substrat, et dans certains cas, pouvait même améliorer l'efficacité de la réaction de clivage.

Ces séquences non complémentaires sont insérées entre 2 bases consécutives de la séquence complémentaire, la séquence non complémentaire formant ainsi une insertion colinéaire avec i-a séquence complémentaire. Dans ce cas,, le polyribozyme a la structure ;

_{( (b} ras hybridant - réqion catalytitjue - bras hybridant) (séquence non complémentaire)^) _p aπK laquelle n ≈ 0 ou 1, et p > 1. comme exemple de ce mode de réalisation de l'invention, on peut citer un—polyribozyme composé d'un enchaînement de ribozymes, dont les bras

FHJΓLLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26),

hybridants sont complémentaires à des fragments distincts, consécutifs et contigπs du substrat et qui sont reliés entre eux par des séquences non complémentaires. En d'autres tara-âs, dans une telle structure, l'ensemble des bras hybridants reconstituent la séquence complémentaire du gè e de la protéine Pc σapeide.

La présence de séquences non compi-sménτ ires dans le polyribozyme signifie que "la cfistance entre deux régions catalytiques du polyriboay c— on plus qrande que la distance entre les -deux sites GUC correspondants dans le substrat. Selon cette variante de l'invention, la longueur des bras hybridants ee trouvant de chaque côté d'une région cata tique doit être d'au moins 4 bases, de référenc d'au moins 8 bases de chaque côté et peut aller jusqu'à 800 à 1000 base t

La nature de la ou—des séquences non complémentaires peut être très variable selon sa fonction. Il eut s'agir de séquences ayant une fonction de "remplissage", c'est-à-dire servant à augmenter la distance entre deux régions catalytiques du pûlyribûzyïûe, lorsque les deux siteà XUX correspondants du substrat sont relativement proches l'un de l'autre- De cette façon, la formation de duplex inactifs entre deux régions catalytiques voisines peut être évitée. Il_est également possible d'utiliser, comme séquences non complémentaires, des séquences ayant une structure—secondaire déterminée, ce qui peut avoir pour —effet d' ^" ëiapêcher un polyribozyme de longueur impartante, par exemple de plus de 800 bases, de se replier sur lui-même dans une structure secondaire inactive. Comme exemple de ce type de structure, on peut citer la région catalytique d'un ribozyme rendu inactive par la élétion d'une ou

de plusieurs bases essentielles, X.e mode de réalisation de l'invention est exemplifié par ^" le polyribozyme 136 décrit dans les exemples ci-dessous.

La séque ce o complémentaire du polyribozyme peut aussi avoir une fonction-précise, par exemple, elle pe être constituée d'une séq e c codante qui sert dans la sélection des transformants ÛU encore un séquence contenant un ribozyme agissant sur un substrat autre que là protéine--de capside ou agissant en cis sur une partie du po]y ib02ym . De manière générale, la séquence non complémentaire ne code pas pour une protéine. Elle peut -également contenir des multisites de clonage. La séquence non complémentaire a normalement une longueur comprise entre 2 et SOQ bases, par exemple 20 à 100 bases. -Lorsqu'il y a une pluralité de séquences complémentaires, elles peuvent constituer ensemble jusqu'à —S0 % environ de la longueur du polyriboayme, par exemple 50 % _*

Le polyribozyme de 1'invention est normalement constitué d'ARN. Il est possible, néanmoins. de remplacer, par de l'ADN, —certaines parties du polyribozyme, par exemple les -iaras hybridants ou des parties de ces bras, ou encore une partie de la région catalytique, en particulier la "boucle", à condition que l'activité catalytique soit maintenue (voir, par exemple, la substitution de 1 'KOH par âe l'ADN décrite dans la demande de brevet interna ional ^" Q-giigyssi) .

Le polyribozyme de l'invention peut être construit pour inactiver n'importe quelle protéine de capside virale. La protéine de ^" sapc-iάe est. une sous- unitc protόique codée par le génome viral et destinée à être incorporée dans la structure polymérique de la capside. En effet, la capsid —es constituée par la succession de sous-unités protéiques, identiques entre elles, qui s'accrochent le lonq—de l aσide nucléique-,

Le groupement des sous-unités capεidiques peut entraîner une architecture hélicoïdale ou icosaédrique selon les virus. L'invention -ris des polyribozymes dirigés contre les protéines de capsides de virus soit à particules hélicoïdales,-:—soit à particules icosaédriques ainsi que de virus à enveloppe. L'enveloppe est une membrane lipidoprotéique entourant l a n clέoώ-άp&.dg... comme exemple de virus approprié, on peut citer un virus choisi parmi les -groupes suivants t les Cauli ovirus, par exemple le virus de la Mosaïque du Chou-Fleur (CaMV) ; les Geminivirus, par exemple le virus du Strea du Maïs (MSV) ,* les Reoviridae, par exemple le virus des Tumeurs de Blessures (WTV) ,* les Rhabdoviridae, par exemple le Potato Yellow warf Virus (PYDV) , le Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) , le virus de la Maladie Bronzée de la Tomate ; les Tobamovirus, par exemple le virus de la Mosaïque du Tabac (TMV) ; les Potexvirus, pa -exemple -le virus X de la Pomme de Terre (PVX) ; les Potyvirus, par exemple le virus Y de la Pomme de Terre fPVY) ; les carlavirus, par exemple le virue Latent de l'oeillet (CLV) ; les Closterovirus , par ^" exem te jtp virus -de la Jaunisse de la Betterave (BYV) ? les Tobravirμs, par exemple le virus du Rattle du Tabac (TRV) ; 1-es Hordeiviruε, par exemple le ^-Virus de la Mosaïque Striée de l'Orge ; les Tymoviru j, par exemple le virus de la Mosaïque Jaune du Navet XTY-MV) ; les Lutéovirus, par exemple le virus de la- Jaunisse Nanisante de l'Orge (BYDV) ou le Virus de 1*Enroulement de la Pomme de Terre (P RV) ; les Tombusvi-ra , par exemple le Tomato Bushy Stunt Virus (TBSV) ; les Sobemovirus , par exemple le Southern Bean Mosaïc Virus (SBMV) ; le Virus de la Nécrose du Tabac__iTNV) ; les Népovirus, par exemple le Virus des Taches en anneaux du tabac

(TRSV) ,* les Co ovirus, par exemple, le Virus de la Mosaïque du Vigna (CPMV) ; le Virus de la Mosaïque Enation du Pois (PEMV) ; les Cueumovirus, par exemple le Virus de la Mosaïque du ^: concombre (CMV) ; les Bromovirus, par exemple le Virus de la Mosaïque du Brome (BMV) ; les Ilarvirus, par exemple le Virus du Streak du Tabac (TSV) . Les séquences de ces protéines sont connues (voir par exemple, les nombreuses références bibliographiques citées dans l'oeuvre : "Eléments de Virologie Végétale" _r —Pierre—Cornuet, I.N.R.A. Paris, 1987, ISBN : 2^8-5-340-808-6) .

Selon une variante particulièrement préférée, la protéine de capside est celle LdrrNirus de la Mosaïque du Concombre (CMV) . Le Virμs de la Mosaïque du Concombre est un virus appartenant au groupe des Cucumovirus d'une grande importance agronomique car plus de 75o espèces de plantes peuvent- tre infectées par le CMV. Le CMV est un viruïr ^~ a plusieurs composants formé de particules icosaédriq es renfermant troι ^" s ^" ARN génomiques (ARN 1 à 3) et un ARN εubgénomique (ARN 4) . L'ARN 3 contient une copie du gène -de la protéine de capside, cependant l'ARN4 subgénomique qui dérive de l'ARN3 sert de matrice pour la;-synthèse de la protéine de capside. Les différentes souches de CMV se répartissent en deux groupes :

* le sous-groupe I qui comprend les souches C, D, FNY, y, I17F et Chi ;

* le sous-groupe II auxquels appartiennent les souches Q et WL.

La comparaison des séquences en acides aminés des protéines de capside du CMV -entre les souches d'un même sous-groupe montre une homologie de 9î %, Entre les sous-groupes I et U, les homologies de séquence sont moins importantes, de l'ordre de 80 %.

Les polyribozymes de 1 ^• invention dirigés contre la protéine de capside du CMV (souche I17F) se sont révélés extrêmement efficaces , dans 1'inactivation des différentes souches du virus φ V- ₇ —et $n -θbΦU i -à une résistance totale des plantes transformées. outre les polyribozymes, l'invention vise également un procédé pour rendre une plante .résistante à un virus, caractérisé par 1'introdxiction dans la plante d'un polyribozyme ou d'une, -séquence_codant pour un polyribozyme tel que décrit--ci-dessus.

Normalement, 1•introductxon„jdu— olyribozyme dans la plante s'effectue par transformation génétique, une séquence d'ADN codant pour le--polyribozyme étant donc intégrée de manière stable -dans le génome de la plante.

Tous les moyens connus pour introduire de l'ADN étranger dans des plantes peuvent être utilisés, par exemple Agrobacterium, électroporation, fusion de protoplastes , bombardement avec canon à particules, ou pénétration d'ADN dans des cellules comme le pollen, le microspore, la graine et l'embryon immature, vecteurs viraux tels que les Ge inivirus ou les virus satellites» Agrobacteriu tumefaciens is rhjaoqβnes constituent le moyen préféré. Dans ce cas, la séquence codant pour le polyribozyme est introduite dans un vecteur approprié avec toutes les séquences régulatrices nécessaires telles que promoteurs, ter inateurε, etc.. ainsi quα toute séquence nécessaire pour sélectionner les transformants.

L'invention vise éqalement les plantes transgéniques obtenues par le procédé _* Plus particulièrement, elle vise d plantes transgéniques résistantes à un virus, caractérisées en ce qu'elles contiennent, dans leur génome,) une séquence qui donne

lieu, après la transcription, -à—un-polyriJbozyme selon 1 'invention.

Dans le contexte de l'invention, les termes "résistance totale" signifient qu'il y a absence totale de symptômes ; "tolérance" signifie que la plante est infectée, c'est-à-dire -qu'elle manifeste des symptômes, mais qu'ensuite, elle récupère. Le terme "sensible" signifie que Ta plante présente des symptômes et réplique le virue. L'expression "Type résistance" correspond â 1- somme des plantes totalement résistantes et des pi-aήtes ^' tolérante .

La nature "résistante" des plantes transgéniques de 1'invention peut être testée de la manière suivante : une autoféeondation, ou un croisement avec un génotype non transformé, —«s effectuée sur un descendant primaire pour obtenir T.-. Ensuite, T- _j est inoculé avec le virus en question-.—Selon l'invention, après autoféeondation, 75 % dea— lantes < _\ sont totalement résistantes. Dans jie- cas --d'un croisement avec un génotype non transforme, 50 % des plantes sont totalement résistantes (ces chiffres sont obtenus, selon l'invention, en testan -une population entière de plantes ayant fait l'objet d'un procédé de transformation et de régénération. Il est à noter que seulement 75 % de ces plantes sont transformées) .

La nature transformée â'J-ime -plante peut être vérifiée en effectuant une - nalys "Southern" et l'expression de la séquence introduite par la transformation est vérifiée en—effectuant une analyse "Northern". Ces analyses sont décrites dans les exemples s iva te. es méthodes de trans ormation et de régénération de plantes connues dans l'art se prêtent parfaitement à la production de plantes transgéniques protégées par le polyribozyme de l'invention."-Comme exemple, on peut

citer la méthode de transformation et de régénération du melon décrit dans la demande de brevet n* Eï>- A-0412312.

Les plantes transgéniques^ résistantes âiT ^' ci sont particulièrement préférées, par exemple le melon, le concombre, la courgette, la tomate, le poivron, le haricot.

Différents aspects de 1 ^• invention—«ont illustrés dans les figures :

- la figure 1 montre les structures préférées des régions catalytiques du polyriboayme de l'invention, ces régions étant entourées, de chaque côté, d'une séquence complémentaire d'une partie de la protéine de capside d'un virus : fi) dans la figure 1A t représente A, G, C ou ϋ ; chaque X étant identique ou différent î n + n* ≥ 6, n et n' étant identiques ou différents r (*) représente une liaison d'hydrogène entre ribonucléotides complémentaires ; X' et X' ' représentent des oligoribonucléotides qui sont complémentaires l'un de l'autre sur au moins une partie de leur longueur et qui peuvent éventuellement être reliés l'un à l'autre par au moins un nuσléotide, ce qui-forme ainsi une boucle. Un nucléotide supplémentaire A, G, C ou U peut être inséré --après A ¹ . La région catalytique du ribozyme est représentée par la partie (II) de la figure 1A, et les bras hybridants par la partie (I) .

(ii) dans la figure 1B : X, {*)., n, n' et A ¹ ont la même signification que dans la figure LA, M et M' ≥ 1 et sont identiques ou différents. B représente une liaison, uhe paire de bases, un ribonucléαtide ou un oligotibonucléotide contenant au moins 2 ribonucléotides. :

(iii) la figure 1C représente un modèle préféré de ribozymes (Haseloff et Cerlach, 1998) » L'ARN substrat peut avoir toute -séquence (X)- autour du site de clivage GUC complémentaire du ribozyme- La flèche indique le site e—clivage. Les bases conservées apparaissent en noir.

(iv) la figure 1D représente la structure d'un ribozyme (dit "minizyme") ^: -dont _la boucle de la région catalytique est remplacée par un élément "P". P peut être 1 nucléotide au—moins (ribonucléo¬ tides, désoxyribonucléotideε, dérivés ou un mélange) , à condition que,—-lorsque les séquences (X') _n et (X) _n . et P sont constituées exclusivement de ribonucléotides, les riinaruacléotides du groupe "P" ne soient pas appariés entre eux par des liaisons " atson et Criσk".: "Eu—peut aussi être une liaison ou tout atome ou .gr-ouperoent d'atomes qui n'affecte pas l'activité catalytique du ribozyme. X a la même signification que dans la figure 1A.

- la figure 2 montre la séquence -de la protéine de capside du CMV (I17F) , ^: ._les sites GϋC étant soulignés.

la figure 3 présente les structures des oligodéosryribonucléotides A, B, C, B utilisé» pour les expériences de mutagénèse dirigée dans ip but d'introduire le si e catalytique du TobRSV en différents endroits de la séquence de la protéine_-de capside du CMV (représentés :*n hybridation avec la séquence d'ADN matrice).

- la figure 4 illustre la structure ..des ..gènes construits pour induite une résistance au CMV :

(i) protéine de capside ;

(ii) polyribozyme 136 : séquence complémentaire de la protéine de capside portant 2 ribozymes ;

(iii) polyribozyme 161 : séquence complémentaire de la protéine de capside portant .3 ribozymes ;

(iv) polyribozyme 163 : fragment complémentaire de la protéine de capside portant 3 ribozymes t

(v) polyribozyme 165 : séquence ώoïφléraentaire de la protéine de capside portant—4 ribozymes.

- la figure 5 montre l'analyse Northern des plantes de melon transgéniques (transformants primaires, descendants Tl et ' ^~ T2 dans certains cas) exprimant le polyribozyme 136 :

TO : transformant primaire j

Tl : descendant Tl ;

T2 : descendant T2 ;

A : lignée 141.1 ;

NT : témoin non transformé.

la figure 6 montre 1'analyse Southern des plantes de melon transgéniques (transformants primaires, descendants Tl et "T2 dans certains cas) exprimant le polyribozyme 136 t

TO : transformant primaire i

Tl ; descendant Tl ;

T2 ; descendant T2 ;

NT : témoin non transformé.

- la figure ? montre l ⁴ analyse Southern des plantes de melon transgéniques (transformants primaires, descendants Tl et . T2 dans certains cas) exprimant le gène de la protéine -de capside :

TO i transformant primaire i Tl : descendant Tl ; T2 ; des endan T2 ; A : lignée 88 _* 105 ;

B : lignée 159.8 ;

C : lignée 164.23 ;

NT : témoin non transformé.

- la figure s montre :l'analyse Western des plantes de melon transgéniques (transformants rimaires) r nsformées avec pBIOS135 :

A, B, C, D et E : transformants primaires de 5 lignées ;

NT : témoin non transformé ;

R : reconstruction avec 20 ng de CMV.

la figure 9 montre | le—développement des symptômes du CMV au cours du -temps dans des lignées transformées avec pBIOS 135 i

I ; lante» sans symptômes ; |; t plantes tolérantes Ï : plantes sensibles.

la figure lo montre le développement des symptômes du CMV au cours du feûβps -dans des lignées transformées avec pBIOS 136 ï J i jour t

| : plantes sans aymptôtté≤» ? î la s tolé antes ? Ï plantes sensibles.

EXEMPLES

Les exemples suivants décrivent- la construction de 4 polyribozymes contenant 3—ou 4 ribozymes composés de la structure consensus Hammerhead de 24 bases (Figure 1) et de bras, complémentaires de la séquence de la protéine de capside du CMV (souche

T17F) de tailles différentes. - a-riumé ϋttOn" de la séquence nucléotidigue de la protéine de capside présentée dans ces exemples-.—correspond à celles utilisées dans la demande de brevet E1P-A-04l29l2.>

Chacun de ces ribozymes coupe une séquence GUC différente le long de la séquence du gène de la protéine de capside du CMV» La- structure de ces construits est illustrée dans la ^~ jgure 4 ;

- Le polyribozyme 136, long ^{' "} Se 1074 basée, contient les ribozymes A (position 84) et B (position 108) et le ribozyme C* (position 204) dont un G et un A (positions 20 et 21) ont été délétés, -les ribozymes étant entourés par des bras complémentaireε longc-de :

. 82 nucléotides de l'extrémité 5-!—au ribozyme

A ;

. 22 nucléotides entre le ^" ribozymes A et B ;

. 94 nucléotides entre les ribρ?yφes B e C* ; _t et 803 nucléotides du rifoosysie c* à l'extrémité

3'.

- Le polyribozyme 161, long de 1076 bases, est identique au bolyriboayme 13$ à la seule différence que le ribpz îae c position 204 possède le G et le A délétés dans le ribosyme C*.

- Le polyribozyme 163, long de 426 nucléotides, contient les 3 ribozymes A (position 84) , B (position 108) et C (position 204) entourés par des bras compléMe tai es longs ds :

„ 82 nucléotides de l'extrémité 5 * au ribozyme

A ;

_* 22 nucléotides entre les-ribx-Tsyroes A et B ;

. 94 nucléotides entre les ribozymes B et C ;

. et 153 nucléotides du ribozyme C à l'extrémité

3'.

- Le polyribozyme 165, long de 1099 nucléotides, contient les 4 ribozymes A (position 84), B (position

108) , C (position 204) et E (position 608) qui—sont entourés par des bras complémentaires longs de :

82 nucléotides de 1'extrémité- 5' au ribozyme

A ;

22 nucléotides entre lès ribozymes ^" A ët.-B ; 5 nucléotides entre les ribozymes ^" C et E f

. 399 nucléotides du ribozyme E à l'extrémité 3'.

Les polyribozymes ne contiennent- pas^- es signaux nécessaires à leur expression et ά leur intégration dans le génome des plantes. Un promoteur constitutif ou non constitutif ( ar exem le un-promo eur viral ou bactérien, tel que NOS, ou de plante, tel que celui de la ubisco et celui de l'ubig itine) doit être placé en 5" du polyribozyme et une - séquence poly (A) doit être placée en 3' » Plusieurs promoteurs qui fonctionnent chez les plantes -sont utilisables ; les inventeurs ont choisi le promoteur 35S dérivé du virus de la mosaïque du chou-fleur ^' (CaMV) réputé comme le plus fort promoteur constitutif. Le —signal de polyadénylation poly(A) peut être celui du gène 35S du CaHV, celui de gènes isolés de plantes, de l'octopine synthase ; les inventeurs ont choisi le signal poly (A) dérivé du gène de la nopaline synthase (tnos) . Les cassettes d'expression construites ont été introduites dans le vecteur de transformation pBIOS 4 dérivant du vecteur pBI 121 contenant le gène de résistance à la kanamycine (gène néo codant pour la néo ycine phosphotransf rase) et le gêné iud A codant pour la glucuronidase. Le protocole -de transformation génétique de cotylédons de melbn et de régénération de plantes transgéniques de melon est identique à ce _l ui décrit dans le brevet "melon transgénique" ' EP- A-0412912 au nom dθ J-UOSEM.

EXEMPLE 1 : CONSTRUCTION D'UN iîIB02YM_3 DIRIGE CONTRE LE GENE DE LA PROTEINE DE CAPSIDE-Du CUCUMBER MOSAlC VIRUS, DOUCHE 1177 :

Le phagémide blUSSCribe -pBSIISK' (STRATAGENE) contenant de l'ADN complémentaire de__l ^, AEN4 du CMV souche I17P appelé pBIOS li3,. dont la procédure d'obtention est décrite dans ._!* demande de brevet européen EP-A-0412912, a servi de poirΛ de départ à la construction des différents ribozymes utilisés pour obtenir des melons transgéniques résistants à différentes souches de CMV.

Le site catalytique du satellite TobRV (Tobacco Ringspot Virus) a été introduit à différentes positions de la séquence du gène de la protéine de capside. La séquence de l'ADN complémentaire à l'ARN 4 du CMV, souche I17F longue de 1007 bp est présente dans la figure 3 du EP-A-0 12912 ,• la partie codant pour la protéine de capside est présentée avec la séquence en acides aminé*..

Comme le ribozyme de type "Hamroerhead" décrit par Haselhoff et Gerlach coupe préférentiellement après le C des motifs GUC, 4 positions sur la séquence codante de la protéine de. capside ont été retenues ^' (Figure 2 ) Ï

* Position A, nucléotide 84,

* Position B, nucléotide ÎOS,

* Position C, nucléotide 204,

* Position E, nucléotide 608»

Afin d'introduire les £4 bases du ribozyme communément appelé «hammerhead^ (tête—de-marteau en français) à ces positions là, il a été décidé d*utiliser ±a méthode de mut^g nèse sur ADN simple brin développée par KϋN EL reα?—Nat. Acad, Sci 82 ; 488-492) faisant appel à des -oligodésσxyribo-

2y nucléotides de synthèse qui i-ybrldent partiellement avec l'ADN que l'on doit mutagénéiser et qui servent d•amorce à leur extrémité 3 ^! "pour "une "synthèse complémentaire à l'aide d'une DNA polymérase. Les quatre oligonucléotides suivants ont été commandés à la société EURÙGENTEC :

O igù A i

5 ' TCGACGGTTACCTC3ATGACSTCCGTGAGC5ACÛAAACCAGCACTGGTTG 3 *

Olig B !

5 ' CGGGAACCACCTGATGAGTCCGTGAGGACGΛAACGCGGACGACG 3 •

Oligo C :

5 ' GTTAATAGTTGCTGATGAGTCCGTGAG0ACGAAAGGACCAGCTGC 3 '

Oligo E :

5 - GAATACACGAGCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGGCGTACTTTC 3 '

Grâce à ces 4 oligonucléotides et au kit de mutagénese dirigée, acheté u ès—lé. -BIORAD (ref 170-3576), de 1*ADN simple brin produit à partir du phagémide pBIOS 113 a été mutagénéisé. La figure 3 présente l'hybridation des 4 oligonucléotides sur l'ADN simple brin cible et les flèches matérialisent l'action de la DNA polymérase synthétisant le brin complémentaire. L'analyse des quelques clones recombinant≥ obtenus après traï^arforma ion d'E. coli a tout d'abord été faite par digestion avec des enzymes de restriction pour détecter un accroissement de taille de certains fragments. Un des clones, pBIOS 116 ₁ qui contenait apparemment—3 sites catalytiques a été séquence, à l'aide du kit "sequenaee R" version II de la société United States Bipαhcmisal-s, -en utilisant un oligonucléotide de 22 bases, oligo n'13 (position 53 à 74). Les résultats ont révélé l'insertion

0 parfait*-, df-n sites catalytiques A et B et l'insertion imparfaite du site catalytique C. Une délétion des deux bases à la position 20 e 21 (G et A) du site catalytique a eu lieu. Bien que ce site ne puisse être fonctionnel pour le clivage, Comme—-démontré par Lamb et Hay (Journal of General =virology, 1990, 71 : 2257-2264) , il a été décidé -4e σlσner le fragment d'ADN d'environ 1100 pb (1007 bp + 21 bp x 2 + 19 bp + séquences adjacentes en 5' et 3» du polylinker) en orientations inverses dans le vecteur d'expression pBIOS 3 (Ferez et al, Plant. Moi. Biology 1989, 13 : 365-373), afin d'étudier l'effet de la présence de séquences non complémentaires dépourvues d'activité ribozymique, dans le polyribozyme _* Pour cela, le fragment Kpn I - Xba I de pBIOS 113 a été clone aux sites Kpn-Xba I du plasmide pG£H7 2 (+) obtenu auprès de la société PROMEGA BIOTEÇK f σcoi dans le but d'av ir des sites Ba HI de part et d'autre de la séquence de la protéine de capside contenant- les sites catalytiques. Le plasmide résultant pBIOS 151 a ensuite été digéré par Ba HI et le fragment considéré (polyribozyme 136, figure 4) a été introduit dans le site BajnHI de pBIOS 3. Un clone recombinant contenant le fragment en orientation antisens, sous le contrôle du promoteur constitutif fort 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur et du terminateur du gène de la nopaline synthétase, a été retenu et appelé pBIOS 125. Le fragment EcoRI de ce plasmide contenant le ribozyme (fragment complémentaire avec deux sites catalytiques fonctionnels et—un délété) , sous le contrôle des séquences de régulation transcriptionnelle citées ci-dessus, a été clone au site EcoRI du vecteur binaire pBIOS 4. Ce dernier dérive du vecteur pBI 121 (Jefferson et al, 1987 ; EMBO Journal 6 : 3901-3907) qui a_-é±.-â_jn--idiJié par la

suppression du site EcoRI situé en 3' du gène codant pour la _j S-glucuronidase et la création d'un site EcoRI situé en 5' de ce même gène _* Le vecteur binaire résultant, pBIOS 136, a servi aux différentes expériences de transformation a cès conjugaison triparentale dans la souche d'Agrobacterium tumefaciens désarmée RCSB'J, qui dérive de la souche C58'3 (Mullineaux et al, Plant Science 63 : 237-245 1989) et est en fait un mutant spontané résistant à la ri£a-mpicine.

EXEMPLE 2 i CONSTRUCTION DE DIFFERENTS RIBOZYMES DIRIGES CONTRE LE GENE DE LA PROTEINE OE CAPSIDE W CTJCUMBER MOSAlC VIRUS, SOUCHE II7F :

Etant donné que le polyribcsyme 136 (figur — ) décrit dans l'exemple 1 ne contenait pas le site catalytique dirigé contre la position 608 ^' et que celui dirigé contre la position 20 était incomplet, de nouvelles expériences de mutagénese dirigée ont été initiées. Pour cela, le fragment EcoRI du plasmide pBIOS 125 a été clone dans le phage M 13 p 18 digéré par EcoRI, obtenu auprès de la société PHARMACIA. Un phage recombinant permettant '__d*encapsider 1-e brin codant du gène de la protéine de capside contenant les deux sites catalytiques corrects a pu être-caracté isé et il a servi de matrice pour les nouvelles expériences de mutagénese utilisant les oligodésoxyribonucléotides C —et E (ensemble ou séparément) . Ces dernières ont été conduites comme celle présentée dans l'exemple- précédent, excepté que le rendement en matrice simple _: ^~ brin.--ast -beaucoup plus favorable car le matériau de départ était un phage. Différents clones recombinants ont été séquences en utilisant l'oligonucléotide n*13 et un oligonucléotide

de 19 mers (position 694 à position 676) , ce dernier permettant de séquencer le site catalytique introduit à la position 608. Les clones contenant des sites catalytiques conformes ont servis—à la—eons-tructioh des vecteurs binaires pBIOS 161 pBIOS 163 et pBIOS 165 (voir figure 4) . Le vecteuirbin ir-e pBIOS 161 est identique à pBIOS 136 excepté que pBIOS 161 contient le site catalytique c non dώlété.

Dans le cas de gènes codant pour les ribozymes hybridant avec la totalité de la séquence du gène de la protéine de capside et contenant 3 sites catalytiques fonctionnels ABC _ αas de pBIOS 161) ou quatre sites catalytiques fonctionnels -A, ^~ B, ^~ C, ^~ E (cas de pBIOS 165), le clonage au-citό—-EcoRI du vecteur binaire pBIOS 4 s'est effectue directemen —après purification du fragment EcoRI-comprenant lo promoteur 3SS, le ribozyme, le tertt nateur—NOS. Dans le cas du ribozyme contenant 3 sites catalytiques A, B, C et hybridant avec seulement lés ^' 360 premières -bases de l'extrémité 5' de l'ARN 4 du CMV (cas de pBIOS 163), une délétion de la partie 3• restante a été f ite après digestion avec l'enzyme--de restriction HindIII (positions 361 dans la séquence du gène de la protéine de capside et du site HindIII situé à la bordure 3' de cette séquence et provenant d'un polylinker) . Ensuite le fragment EcoRI du plasmide ainsi άélété a été clone au site EcoRI du vecteur binaire pBIOS 4.

Transformation e régénération--de melons exprimant les pσlyriboy.ymes :

Les 3 derniers vecteurs binaires ont été introduits dans Aqxobaotarium et utilisés en transformation comme décrit dans la demande de brevet EF-A- ₀₄ 1 ₂₉₁ 2.

33 EXEMPLE 3 : ANALYSE MOLECULAIRE DES PLANTES TRANSGENIQUES :

* Analyses Northern :

Les plantes de melons -obtenues après transformation avec pBIOS 136 ont—été analysées par Northern blot (figure 5) . Les ARN totaux ont été extraits à partir de eunes feuilles de plantes transgéniques et non transgéniques cultivées e serre, selon 3e protocole de Chandler ret al (Plant Physiology

(1983) 74_ : 47-54) .

Ils ont été soumis à une électrophorèse en gel d'agarose 1 % dénaturant, transférés sur Hybond C et hybrides â la sonde constituée ^: des fragments résultant d'une triple digestion du r—fragment BamHI, qui correspond au fragment complet--complément re du gène de la protéine de capside, porteur des 3 ribozymes dont deux fonctionnels (polyrihosyme 136) . La triple digestion favorise l'hybridation entre séquences homologues et permet d'obtenir x»n_45igna-l plus intense.

L'homogénéité des quantités d'ARN totaux déposés sur le gel et la qualité des ^; ARNs—ont—été vérifiées par coloration de la membrane au bleu de méthylène. Les résultats obtenus au niveau transcriptionnel pour les transformants primaires, les ^~~ descendances Tl et T2 correspondantes, sont illustrés par la figure 2 et montrent que :

- un transcrit majeur de taille 1,45 K est observé dans tous les échantillons provenant de plantes transformées et ne 1'est pas dans le témoin négatif ?

- le nombre de transcrits varié considérablement selon les transformants primaires _* ceci peut s ¹ expliquer par des intégrations du T-DNA ou de

fragments de T-DNA dans des loci différents du génome végétal et donc par des effets environnementaux :

- aucune corrélation n'existe entre les niveaux transcriptionnels des transformants primaires et ceux de leurs descendances Tl et T2.

* AnalγHκ;S Southern :

Les plantes de m lons obtenues après transformation avec pBIOS 136 ou pBIOS 135 ont été analysées par Southern blot (figures 6 et 7) • Les ADN totaux ont été extraits à partir-de jeunes feuilles de plantes transgéniques (transformants primaires, descendants Tl et T2 dans 'certains cas) et non transgéniques cultivées en serre, selon le protocole ^de Dβl.laporta et al (Plant Molecular Biology Reporter (1983) l : 19-21). Ils ont été hydrolyses par .EcoRI (site de clonage de la cassette—d*exρression_du gène d'intérêt dans pBI0S4) , soumis à l'électrophorèse en gel d'agarose 0,8 %, transférés sur Hybond N+ et hybrides avec les trois sondes _. gène npt II, polyribozyme 136 triplement digéré (Cf analyse Northern) et gène gus.

Les résultats obtenus pou — 5-" événements de transformation avec pBIOS 136 (Figure 6) montrent que :

- ignées 146.42 i

Dans le cas du trans ormant _; rimaire 146.42, de son descendant Tl et de deux descendants T2, les profils d'hybridation avep les 3 sondes sont identiques, ce qui n'indiqué -aucune ségrégation des fragments du T-DNA et probablement un seul locus. Le polyribozyme 136 est présent en plusieurs copies dans le génome végétal• -—En effet, 4 bandes d'hybridation de taille 1,75 Kb ? 4,4 Kb ; 8,3 Kb et 8,8 Kb sont visibles. La bande de 1,75 Kb

correspond à la bande de taille -théorique attendue avec le couple (EcoRI, polyri-boay-no ^" 136)- _* —La bande de 4,4 Kb s* ybride à la fois au polyribozyme 136 et au gène npt II. De plus, l'analyse avec le couple EeoRl/npt II ne permet pas de déceler cette bande, ce qui indique la présence d'une seule copie du gène npt II dans le génome végétal. Les bandes de 8,3 Kb et de s,8 Kb s'hybrident au polyribozyme 136 et au gène gus, seules ces deux bandes sont détectées par le couple EcoRI/gus, ce gui révèle la présence de deux copies du gène et/ou partie du gène gus. L'hybridation des 3 sondes aux ADN des plantes TO, Tl et T2 digérés par Xba I permet également de supposer la présence .d'un seul locus. » Lignées 146.34 :

Dans le cas du transformant primaire 146.34 et de son descendant Tl, seulnas -yrertaines bandes d'hybridation du transformant—primaire subsistent chez l'individu Tl, ce qui souligne une élimination de certains fragments du T*=DNA _* —pou _î analyse du couple EcoRl/polyriboayme 136, 3 bandes de taille 1,75 Kb, 3 Kb et 5,3 Kb sont communes aux plantes TO et Tl et 3 bandes supplémentaires de taille 7,3 Kb, 6,8 Kb et 4,25 Kb caractérisent la plante TO. Ceci indigue la présence d-Αu moins 3 et 6 copies du polyribozyme 136 respectivement dans les plantes Tl e TO. En hybridation ήpfii; les deux bandes EcoRI de 3 Kb et 5,3 Kb sont détectées ^" dans les plantes TO, ce qui montre la présence de deux copies du gène et/ou partie du gène npt II. Seule la bande Eoαî-il de 3 Kb est-visible dans la plante Tl, ce qui dénote la présence d'une seule copie du gène npt II. En hybridation gus, les 3 bandes EcoRI de taille 4,25 Kb ; 5, Kbr-et—6,8 Kb sont trouvées dans la plante TO tandis que seule la bande de 5,3

.3fi Kb est présente dans le descendant Tl. Ceci révèle la présence de 3 copies et d'une copie du qène et/ou partie du gène gus s les plantes TO et Tl respectivement. Par ailleurs, l'hybridation des 3 sondes aux ADNs des plantes TO et Tl digérés par Xba I permet de supposer l'existence de 2 loci.

- ignόβά 146.3Û fit 146.28 ;

Dans le cas des transformants primaires 1-46.30 et

146,28 ainsi que de leurs descendants Tl respectifs, des observations similaires sont réalisées

« Lignée 141.1 ;

Dans le cas du transformant primaire 141-1 et de son descendant, les profils d'hybridation sont semblables. Des bandes EcoRI de 1,75 Kb ; 10 Kb et

10 Kb sont révélées avec les sondes polyribozyme

136, npt II et gus respectivement";—Ceci montre la présence d'une seule copie du T-DNA intègre dans le génome végétal.

En conclusion, la stabilité génétique est observée dans le cas du transformant 146.42 et de sa descendance (Tl et T2) et dans.—celui du transformant 141.1 et de son descendant Tl. Un nombre élevé de copies du T-DNA ou fragments du T-DNA caracterip.fi. 4 des lignées étudiées tandis que la lignée 141.1 ne possède qu'une copie intègre dtf ^~ T-DNA.

Par ailleurs, la présence d'une copie du T-DNA et/ou portion ou T-DNA est également à noter chez les lignées transformées avec pBIOS 135 (Figure 7) .

* Analyses Western (analyse comparative) :

Les plantes de melons transgéniques transformées avec pBIOS 4 contenant la cassette d'expression du gène de la protéine de capside ont été analysées par

37 Western blot. La demande de -brevet EP-A-0412912 du 11.08.1989 au nom de BIOSEM -relate la méthodologie employée et les résultats obtenus. Cependant, il est à souligner que le * d'expression du gène de la protéine de capside varie de_0,001 -- et 0 % des protéines totales, La figure 6 illustre par—quelques exemples cette variation du taux—d*expression, qui dépend de l'âge de la feuille et—probablement d'effets environnementaux du génome végétal.

EXEMPLE 4 ? TESTS DE RESI8TAN03—AU CMV DES MELONS TRANSFORMES AVEC ï-% POLYRIBOZYME 13-6 ET LA PROTEINE DE CAPPIPB {TBt-T COMPARATIF) :

Les plantes de melon (génotype—TEZIER 10) transgéniques exprimant le gène de la protéine de capside ou le polyribozyme 136 ont été autofécondées ou croisées avec des plantes dû génotype TEZIER 10 non transformées. Les graines issues de ces autofécondâtions (génération Tl) et d ^» autofécondations ultérieures (génération T2, etc) ont été semées en phytotron (enceinte climatisée-avec photopériode de 16 h lumière) .

Ay stade 2 à 4 feuilles, 23 plantes issues de la descendance ont été inoculées mécaniquement avec un broyât de feuilles fraîches infectées -par du CMV souche TL2S.

Après 16 jours d'infection (période optimale), les symptômes (mosaïque, --gaufrage du limbe, jaunissement) ont été évalués. Les plantes infectées se classent en trois catégories t

- les plantes résistantes (R) qui n'ont aucun fiymptôme ; les plantes sensibles (S) .qui ont. des symptômes ;

38

- les plantes tolérantes (T) , qui sont sont les plantes qui "récupèrent", c"-est-à-dire que les feuilles naissantes se d velopρent pan? symptôme tandis que les feuilles âgées présentent des symptômes.

Plusieurs c cles de "récupération ¹ ' peuvent avoir lieu. L'évolution des feuilles naissantes__saines en feuilles infectées ou non .dépend des conditions climatiques.

Les plantes de "type résistant" comprennent à la fois les plantes sans symptôme et les plantes tolérantes.

Les témoins utilisés dans le test dé résistance au CMV sont :

- témoins sensibles i TE2IER 10 et Vedrantais ;

- témoins résistants possédant _au moins trois gènes récessifs du CMV, Virgos et Pree Cucumber.

* Résistance au _ι CMV souche TL ^: 2-Q—de lignées..de melon en génération Tl exprimant le ^L -gène de la protéine de ÇflPffjde ;

Les résultats obtenus pour 20 lignées sont donnés dans le tableau 1 et montrent que :

- L'infection avec TL 28 conduit à l'obtention de 3 à 30 % de plantes Tl sans symptôme. Le témoin non transformé TEZIE 10, inoculé avec TL 28 présente 0 % de plantes sans symptômes. Les témoins résistants Virgos et Pree Cucumber possèdent 92 et 100 % de plantes sans symptômes respectivement et ne présentent aucun phénomène de tolérance»

- Le phénomène de récupération existe à une forte proportion. Quatorze des lignées étudiées montrent un pourcentage non négligeable (22 à. Ss_ ) de -plantes Tl tolérantes.

39

- Le ou cen age de plantes Tl résistantes et tolérantes n'est pas corrélé au -taux d'expression de la protéine de capside. En effet, les lignées 159.8 et 164.2, par exemple, qui ont un -taux d ⁴ xpression de la protéine de capside identique ζ-O^-C—%) présentent des niveaux de résistance différents _* Les individus Tl de la lignée 159.8 sont tous sensibles tandis que ceux de la lignée 164.2 sont sans symptôme à 26 % et tolérants à 48 .

- la plupart des lignées exprimant le gène de la protéine de capside ont été obtenues par autoféeondation. La fréquence théorique attendue du gène de la protéine de capside est de 75 % dans les plantes Tl inoculées avec le pCMV. Le pourcentage de plantes de type résistant (sans symptôme et tolérants) varient entre 25 et 82 selon les lignées transgéniques.

TABLEAU 1

RESISTANCE AU CMV SOUCHE TL28 DE PLANTES DE

MELON EN GENERATION Tl EXPRIMANT LE GENE

DE LA PROTEINE DE CAPSIDE

LEGENDE :

I : a iofécondarion

BC : croisement avec le génotype TEZIER H) non transformé

% CP : taux d'expression de la protéine de capside par rapport aux protéines totales solubles

% R : pourcentage de plantes résistantes ou sans symptômes

% T : pourcentage de planies tolérantes

% S : pourcentage de plantes sensibles

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26)

41

* Résistance au CMV souche TL 18 de lignées -dé melon en génération Tl exprimant le polyribozyme 136 :

T-ea résultats obtenus pour 13 lignées Tl, sont assem l es dans le tableau 2 et indiquent que ;

- après infection avec TL 2Θ, 30 à 87 % des individus Tl sont sans symptôme dans le cas de 10 lignées ;

- le phénomène de "récupération" est peu présent. Seules 4 lignées présentent de 3 i 26 % de plantes Tl tolérantes.

La plupart des lignées exprimant le polyribozyme 136 ont été obtenues par croisement avec la lignée TZ 10 non transformée. La fréquence théorique attendue du polyribozyme 136 est de 50 % dans les plantes Tl inoculées avec le CMV _* Le pourcentage de plantes de "type résistant" varie entre 30 et 65 % selon les lignées transgéniques.

En conclusion, pour la stratégie "ribozyme", un plus grand nombre de lignées * a génération Tl sont sans symptôme et possèdent très peu de plantes tolérantes.

42

TABLEAU %

RESISTANCE AU CMV SOUCHE TL28 DE PLANTES DE MELON EN GENERATION Tl EXPRIMANT LE POLYRIBOZYME 136

LEGENDE :

I ; amofécondarion

BC : croisemeni avec le génotype TEZIER 10 non transformé

% R : pourcentage de plantes résistantes ou sans symptômes

% T : pou-α-cnlâiic de plantes tolérantes

% S : pourcentage de plantes sensibles

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26)

* Résumé des tests de résistance au CMV—souche TL 28 et de l'évaluation de la ségrégation par test GUS pour --.--rtaines lignées :

Les résultats mentionnés dans le tableau 3 montrent :

- l'obtention de deux lignées-de type résistantes (plantes sans symptôme et —plantes tolérantes) exprimant le gène de la protéine de capside (lignées 88.105 et 153.8), d'une lignée totalement résistante (plantes sans .symptôme) exprimant le polyribozyme 136 (lignée 146.42) .

- l'obtention dft deux lignées tolérante-? (plantes tolérantes) exprimant le polyribo2yιαe 136 (lignées 141,1 et 146.28) .

TABLEAU 3

46 ) Etudώ gβnώtiquΛ das lignées : e taux d'expression du ^' gène guc permet de déterminer le type de ségrégation et l'état d'iiomozygoties.

Pour les deux lignées 88.105 et 153.8, le taux d'expression du gêne GUS est—de—(?0—% «t 73 % respectivement en génération Tl obtenue par autoféeondation. ceci indique une ségrégation .de-type mendelien d'un gène d minan (3 ï 1) avec l'intégration du T-DNA en un seul locus. Des analyses moléculaires ont montré la présence d'uni» .seule copie intègre du T-DNA dans le génome végé l.

Par ailleurs, le taux d'expression du gène gus est de 100 % en génération T2 ûur lem deux lignées, ce gui souligne l'état d'ho ozy otie du gène intégré.

Pour la lignée 146.42, le taux d'expression du gène gus est de 77 % en génération Tl obtenue par autofécondation ce gui montre une ségrégation de type mendelien d'un gène dominant a ec intégration du T-DNA en un seul locus. Des analyses moléculaires ont montré la présence de plusieurs T- DNA et/ou fragments de T~ DNA en un seul locus du génome Végétal.

Par ailleurs, le taux d'expression du gène gus étant de yu % en génération T2 Jsoûligné que ia iiqnée testée n'est pas homozygote pour ce gène intégré (tableau 3) . L'homozygotie a été obfe nuo—on T3 pour la lignée 146.42. Pour la lignée 141.1 le taux d'expression du qène gus est de 57 % en génération TEZIER 10 non transformé, Ceci correspond encore à une ségrégation de type mendelien d-"un gène dominant (1 ; 1) avec une intégration du T-DNÂ en un seul locus. Des analyses moléculaires ont montre la présence d'un seul T-DNA intègre dans le génome végétal.

Pour la lignée 146,28, le taux d'expression du gêne gus est de 73 % en génération Tl obtenue après

FEUILLE DE REMPLACEMENT {RÈGLE 26)

croisement avec le génotype TEZÏER 10 non transformé- Ceci indigue une ségrégation des gènes dominants avec intégration du T-DNA en plusieurs _loci. Des analyses moléculaires ont montré la présence de plusieurs T-DNA et ou fragments de T-DNA en '-deux loci de génome végétal.

2) comportement vis à vis du virus Î

Toutes les plantes de type -résistant expriment le gène SUS. Parmi les plantes ¹ —sensibles certaines Expriment le gène GUS (tableau 3) .

Pour la lignée 88.105, 25 _% de plantes de type résistant et 75 % de plantes sensibles ont été o ten es en génération Tl résultant 'une autofécondation. Ceci montre une ségrégation de type mendelien du gène récessif (l . 3) pour le gène de résistance*.

Pour la lignée 153,8, 55 --S de plantes de type résistant et 45 % de plantes sensibles ont été obtenues en génération Tl résultant d'une autofécondation. Il est difficile de conclure quant au comportement du gène de résistance. pour la lignée 141.1, 40 % de plantes tolérantes et 60 % de plantas sensibles; ont—été -obtenues en qénération Tl par croisement avec le génotype TEZIER 10 non transformé. Ceci indique une—ség-eégation de type mendelien d'un gène dominant ( 1 : 1) pour le gène de résistance. Le comportement du polyribozyme 136 est donc similaire à celui du gène gus.

Pour la lignée 1 6. 2, ^~ -% de pl-aπt-aa _S ^ns symptôme ** 21 % des plantes sensibles ont été obtenues en génération Ti résultant d'une autofécondation. Ceci implique une ségrégation de type mendelien d'un gène dominant (3 : 1) pour -le gène de

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26)

48 résistance. Le comportement du, ribozyme 136 est donc similaire â celui du y«ne. gus.

3} Evaluation des quantités de virua :

Les quantités de virus détectées par test ELISA sont peu élevées dans les plantes sans symptôme mais néanmoins supérieures à celles du témoin résistant Free cucumber (Tabli≥Λii 1Ω),

Les plantes tolérantes renferment des quantités de virus non négliyt±rililes.

Les plantes sensibles possèdent des quantités" e vi uϋ .ïKH élevées.

Les plantes exprimant les polyribosymee (liqnées 146.42, T2 et T3) contiennent une quantité moins importante de virus que les plantes de types résistants exprimant la protéine de oapside (lignée 153.8 T2) .

Il apparaît que les quantitόe -de virus détectées sont relativement bien corrélées à la sévérité des symptôme...

4) Développement des symptômes—du CMV au cours du temps :

Dos plantes Tl des lignées mentionnées dans les figures 1 et 2 ont été infectées avec du CMV souche TL 28. Les symptômes ont été comptabilisés β , S, 12, 14, 16 et xs jours après inoculation. Les résultats sont présentés dans les histogrammes ^ ig es 9 et 10).

Les valeurs obtenues après J16 ne varient .-plu . Dans le cas d s lignées "protéine de capside", il est à noter une diminution plus ou -moins rapide.-du nombre de plantes sans symptôme, au profit de l'apparition de plantes avec symptômes. Pour les lignées R8- 05 et

153-S en génération Tl, à J16 et J14 respectivement il se développe des plantes tolérantes caractérisées par

FEUILLE DE REMPLACEMENT REGLE 26)

le phénomène de "récupération^. De plus, chez la lignée 88-105 en génération T2, 100—% des plantes sans symptôme à J8 se convertissent en 100 % de plantes tolérantes gui subsistent jusg 'À .J19 _χfigure 9).

Ce changement brutal des plantes sans symptôme en plantes tolérantes peut s'expliquer par un fort effet des co di io s liiïi i ut-i'-..

Chez la lignée 153.8 en génération T2, il est à noter une apparition progressive de plantes tolérantes. A partir de J16, SO^-άes plantes T2 sont sans symptôme et 50 % sont tolérantes.

Dans le cas des lignées "polyribozyme", il est à souligner une diminution du nombre de plantes Tl sans symptôme au profit des plantes avec -symptômes chez les lignées 141.1 et 146.2S (figure iû)-.

De plus, pour 141.1 il est à noter la présence de 40 % de plantes Tl tolérantes à partir ^" dfë -3 er. aïïΞ ^— l lignée 146-28, des plantes' TU tolérantes se développent à partir de J14 pour atteindre " --e % en

J16.

Par ailleurs, dans la lignée 146.42, les plantes Tl sans symptôme représentent 80 % en J6 et restent presque stables au cours du temps (78 % en J8, J12 et J 14, 79 % dès J16) .

Les plantes T2 de la lignée 146 _* 42 ont un comportement similaire. Ce résultat montre un très bon niveau de résistance de cette lignée et une stabilité du gène de résistance dans la descendance.

En conclusion, deux lignées e "type résistantes" exprimant le gène de la protéine .de capside et une lignée totalement résistante, exprimant le polyribozyme 136 ont été obtenues. Pour les deux lignées exprimant le gène de la_protéine de capside la résistance observée s'apparente. p]ns h une tolérance qu'à une résistance totale. -=En e-££e_t-, certaines

plantes infectées par le virus qui présentent de forts symptômes, peuvent dans certaines conditions développer de nouvelles feuilles-__-aines.

Pour la lignée totalement résistante exprimant le polyribû-jyme 136 aucun phénomène de tolérance n'est observé. Pour ces 2 lignées exprimant la protéine _d e capside, des quantités de virus relativement élevées ont été observées dans les plantes résistantes, "alors que dans les plantes résistantes exprimant _l e polyribozyme 136, la quantité de virus est presque égale au té uiπ résistant Free cucumber.

EXEMPLE S ! RESISTANCE A L'INFECTION PAR LE CMV SOUCHE TL ZB Pfi LIGNEES DE MELON EN GENERATION Tl EXPRIMANT LE OLYRIB02ÏME 165 I

Les résultats obtenus pour 13 lignées Tl, exprimant le polyribozyme 165, sont rassemblés dans le tableau 4 et indiquent que i

- après infection avec φL2S, 15 à 100% des individus Tl sont sans symptôme dans le cas de ₁₂ lignées ;

- le phénomène de "récupération" est_peu présent. Seules 5 lignées présentent de 6-_à 60% de plantes T _l tolérantes.

La plupart des lignées exprimant le polyribozyme 165 ont été obtenues par autoféconriat-ion. La fréquence théorique attendue du polyribozyme 165 est de 75% dans les plantes Tl inoculées avec le CMV. Le pourcentage de plantes de "type résistant" varie entre 15 et 100% selon les lignée.» l.rrtnsg n q es

En conclusion, comme dans le cas des lignées exprimant le pnlyribozyme 136, un grand nombre de li née Kfc rlm<-ιrτt- le polyribozyme 16b sont sans symptôme et possèdent peu de plantes tolérantes. Le

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26)

polyribozyme 165 diffère du polyribozyme 136 par 2 ribozymes fonctionnels supplémentaires. Les 2 constructions conduisent à l'obtention de résultats similaires pour la résistance -_A l'infection par le CMV.

FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26)

TABLEAU 4

RESISTANCE AU CMV SOUCHE TL28 DE PLANTES DE MELON EN GENERATION Tl EXPRIMANT LE POLYRIBOZYME 165

LIGNEES CROISEMENT %R -fol %s

10.2 100 -=0 0 203.6 BC 0 0 100 205.1 50 s 205.3 66 -D 34 206.1 94 o 0 207.3 1 0 39 207.5 80 0 20 207.7 64 _0 36 207.8 69 22 207.9 100 0 21 1.1 15 -0 85 212.1 87 13 0 215.1 20 60 20

VEDRANTAIS U 0 100

VIRGOS 100 -J) 0

FREE 100 _0 0

CUCUM _Ë EK

LEGENDE :

I : au ι.ι...V.Cι-ιn dation

RC : croisement avec le Génotype TEZDER 10 non transformé

% R : pourcentage de plantes résistantes ou sans symptômes

% T : pourcenuiijt- de plantes tolérantes

Ψ _c S : pumci-niacc de plantes sensibles

FEUILIE DE REMPLACEMENT TSÊGLE 26)