本发明涉及的是一种生物医药技术领域的方法 及质粒， 具体涉及质粒及利用质粒提 高链霉菌抗生素产量的方法。

背景技术

随着细胞生物学以及生物工程技术在微生物尤 其是抗生素育种领域的应用， 基因工 程育种技术已成为主要的菌种改良手段， 并且在改良工业生产菌种方面已获得巨大的成 功。 生物工程育种技术在一定范围内克服了传统育 种技术的随机性和盲目性， 可以借助 对微生物次级代谢生物合成途径的认识， 利用基因工程技术构建抗生素高产菌株， 有助 于次级代谢产物的工业生产。

在微生物菌种选育领域中， 通过基因工程技术将目的基因与载体在体外连 接然后转 入受体细胞， 使外源基因在受体中稳定表达遗传。 主要途径包括有： ①通过调节基因的 加倍或失活、 提高抗生素的主动外排效率等来提高抗生素的 产量； ②在宿主细胞中引入 增加前体物和辅因子的供给的外源基因， 提高活性物质的生物^ ~成量； ③通过激活或抑 制支路代谢以改变生物活性分子的活性成分或 比例， 提高最佳活性组分的积累、 降低或 消除低活性次级组分的积累。

AdpA是广泛存在于链霉菌中的一个全局性正调� �因子， 是 A-因子调控网络的中心 转录调控因子， 可激活形态分化和次级代谢产物所需基因的表 达。 在天蓝色链霉菌 ( Streptomyces coelicolor)、 变铅青链霉菌 i Streptomyces lividans) ^ 抗生链霉菌 ( Streptomyces antibioticus)和阿维链霉菌 ( Streptomyces a verwi til is) 中， AdpA 正调节黑色素的生物合成。 目前还没有文献报道 ao^I基因在抗生素产生菌株里的表达 对其抗生素产量的影响。

透明颤菌（ z' ireosci a)是一种专性好氧的丝状革兰氏阴性细菌， ^ 基因编码的 透明颤菌的血红蛋白具有结合氧的特性可以促 进微生物细胞内氧的传输， 提高氧的利用 率。 对许多在溶氧不足的情况下， Vgb表达会促进宿主的生长， 蛋白的分泌， 代谢物的 产生以及增强抗压性。

将透明颤菌血红蛋白基因整合到异源宿主菌中 可以增加重组蛋白产量和发酵物产 量。 经过对现有技术的检索发现， 在抗生素生产中， Wb基因可明显促进肉桂地链霉菌 的菌体生长和抗生素莫能菌素合成 （文莹， 宋渊. 透明颤菌血红蛋白在肉桂地链霉菌

{ Streptomyces cinnamonensis^ 中的表达对其细胞生长及抗生素合成的影响. 生物 工程学报， 2001， 17 (1 ) : 24-28 )。 基因的表达 使红霉素的产量提高 60% (Brunker, P. Genetic engineering of an industrial strain of Saccharopolyspora erythraea for stabl e expression of the Vi treoscill hemoglobin gene (vhb ) . Microbiology 1998， 144 (9)： 2441-2448 )。

S-腺苷甲硫氨酸 （S- adenosylmethionine, 简称 SAM) ， 由三磷酸腺苷和 L-甲硫氨 酸经 SAM合成酶催化反应合成。 作为生物合成过程中的重要中间代谢物质， SAM合成酶 基因 ^i/r在很多链霉菌中的高效表达都能够有效提� �其代谢物的产生。 在天蓝色链霉 菌 Streptomyces coelicolor) 里， SAM合成酶基因/ ffe 的高效表达能够大大提高放 线紫红素的产量 ( Okamoto S ， Lezhava A. Enhanced expressi on of S- Adenosylmethionine synthetase causes overproduct ion of act inorhodin in Streptomyces coelicolor k?> (2 ) . J Bacteriol , 2003， 185 (2)： 601 - 609 ) ； 在 Saccharopolyspora erythraea中异源表达 S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因可以提高红霉素 A的产量 (Wang Y, Wang YG. Improved producti on of erythromycin A by expression of a heterologous gene encoding S- adenosylmethionine synthetase. Appl Microbiol Biotechnol , 2007, 75 (4) : 837-842 )； Streptomyces actuosus Φ SAM 成酶基因 ffiei r的高效表达促进了那西肽的合成 （Zhang XC, Fen MQ. Overexpression of yeast S-adenosylmethionine synthetase metK in Streptomyces ac tuosus leads to increased product ion of nosiheptide. Appl Microbiol Biotechnol , 2008， 78 (6)： 991 - 995 )。 '

但是上述现有技术仅是单一基因在某些微生物 菌株中的表达， 其对代谢产物的影响 作用还是有限的， 对于整个代谢工程仍是非常不充分的。 微生物菌株自身复杂的代谢途 径以及细胞循环中复杂的调节方式及其特异性 ， 决定了对其代谢流中的某个反应进行定 向改变依然是不够的， 对微生物代谢途径的生化改造可以多步进行， 最大限度的增加代 谢产物的积累。 近年来， 由于 DNA重组技术的发展， 使得用基因技术改造代谢途径成为 可能。 本发明根据上述技术的不足， 设计了一个全新的提高链霉菌抗生素产量的方 法及 质粒，将多个与抗生素合成相关的具有广泛正 调控作用的基因构建在一个载体上同时表 达， 构建的质粒可以在不同链霉菌菌株中进行表达 ， 有效提高各种抗生素的产量。 发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足， 提供一种全新的提高链霉菌抗生素产量的 方法以及使用到的质粒。 本发明提供了质粒及利用质粒提高链霉菌抗生 素产量的方法， 通过对抗生素的生物合成有广泛促进作用的 3个基因中的一个或者几个采取在一个载体 上同时进行表达的方式， 利用接合转移转入链霉菌中进行高效表达以提 高抗生素的产 量。

第一方面， 本发明提供了一种提高链霉菌 i Streptomyces 抗生素产量的方法， 包 括如下步骤： 将整合表达质粒转入链霉菌中， 进而实现链霉菌抗生素产量提高； 所述整 合表达质粒为 ^ZAS"基因与常规载体构建而得， 或者为 ζτ^ί/Γ和 b5 "基因与常规载体构 建而得，或者为 和 ac^-c基因与常规载体构建而得，或者为 metK、 和 ad _P A-c 基因与常规载体构建而得。

优选地， 所述提高链霉菌 treptomyces 抗生素产量的方法包括如下步骤：

(a)构建整合表达质粒；

(b)将整合表达质粒转入链霉菌中；

(c)发酵 (b)步获得的链霉菌， 获得抗生素。

优选地， 所述链霉菌为链霉菌 i Streptomyces sp. ) ZYJ- 6 CGMCC NO. 2394。

优选地， 所述常规载体为 PIB139载体。

优选地， 所述 zz/ei 基因的碱基序列如 SEQ ID NO. 1所示。

优选地， 所述 基因的碱基序列如 SEQ ID NO. 2所示。

优选地， 所述 ac^l- c基因的碱基序列如 SEQ ID NO. 3所示。

第二方面， 本发明还涉及一种由 ^/^基因与常规载体构建而得的整合表达质粒 pFVgb o

优选地， 所述常规载体为 PIB139载体。

进一步， 本发明还涉及前述整合表达质粒 pFVgb的构建方法， 包括如下步骤： (a)质粒 pJTU4405含有全基因合成 vgbS, 在基因 wb5"两端分别引入了 Ndel和 EcoRI酶切位点；

(b)用 Ndel和 EcoRI双酶切带有透明颤菌（ Vitreoscilla) 基因的 pJTU4405 ;

(c)将 wb5"基因插入含有红霉素抗性基因强启动子 PermE*的链霉菌整合型载体 PIB139的对应位点， 得到质粒 pFVgb。

第三方面， 本发明还涉及一种由 fflei 和 "基因与常规载体构建而得的整合表达 质粒 pFMV。

优选地， 所述常规载体为 PIB139载体。

进一步， 本发明还涉及一种如权利要求 11所述的整合表达质粒 pFMV的构建方法， 包括如下步骤： 制备质粒 pFMetK质粒； 之后用 Ndel和 EcoRI将 vgbS } pJTU4405上切 下插入 pJTU968的相应酶切位点， 再用 Muni和 EcoRI将带有红霉素强启动子的 b5基 因片段插入到 pFMetK质粒的 EcoRI位点， 得到质粒 pFMV。

优选地， 所述制备质粒 pFMetK质粒包括如下步骤：

(a)在天蓝色链霉菌 Streptomyces coelicolor) 的 metK 基因内部设计引物 metKF2/metKR, 在 ATG密码子处加入了一个 Ndel酶切位点；

引物 metKF的序列为： 5， - CAGGGAGCCATATGTCCCGT-3 ' ，

引物 metKR的序列为： 5 ' -TCGCAAAGGCCACTGACAACA-3 ' ；

(b)将扩增到的不带原始启动子的 1334bp的 metK基因插入 pBlueScriptll SK (+) 的 EcoRV位点构建 4292bp的克隆 pJTU2524;

(c)用 Ndel和 EcoRI将无启动子的 metK基因片段从 pJTU2524上切下插入到含有红 霉素抗性基因强启动子 PermE*的 pIB139载体中， 得到质粒 pFMetK。

第四方面， 本发明还涉及一种由 ζ^ί/Γ和 _SC / 4- _C 基因与常规载体构建而得的整合表 达质粒 pFMA。

优选地， 所述常规载体为 PIB139载体。

进一步地， 本发明还涉及前述整合表达质粒 pFMA的构建方法， 包括如下步骤： 用 Ndel和 EcoRI将 ad _P A-c从 pJTU2520上切下插入到带有红霉素启动子的质粒 pJTU968 的相应位点， 再用 Muni 和 EcoRI 将带有红霉素强启动子的 adpA-c基因片段插入到 pFMetK质粒的 EcoRI位点， 构建质粒 pFMA。

第五方面， 本发明还涉及一种由 ei r、 ^和 atp/i-c基因与常规载体构建而的整 合表达质粒 pFMVA。

优选地， 所述常规载体为 PIB139载体。

进一步地， 本发明还涉及前述整合表达质粒 pFMVA的构建方法， 包括如下步骤： 用 Muni和 EcoRI将带有红霉素启动子的 adpA- c从 pJTU2522上切下插入到 pFMV的 EcoRI 位点， 得到质粒 pFMVA。

本发明具有如下的有益效果： 本发明提供了质粒及利用质粒提高链霉菌抗生 素产量 的方法，通过对抗生素的生物合成有广泛促进 作用的 3个基因中的一个或者几个采取在 . 一个载体上同时进行表达的方式，利用接合转 移转入链霉菌中进行高效表达以提高抗生 素的产量。

本发明涉及的链霉菌 CGMCC NO. 2394 ZYJ-6已提交中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心， 其保藏登记编号为. CGMCC N0. 2394； 保藏地址为北京市朝阳区北辰西 路 1号院 3号， 中国科学院微生物研究所。 所述链霉菌 CGMCC NO. 2394 ZYJ-6已经公开 于 ((Zhou YJ， Li JL, Zhu J, Chen S, Bai LQ， Zhou XF， Wu HM, Deng ZX. Incomplete β -Ketone Processing as a Mechanism for Polyene Structural Variation in the FR-008/Candicidin Complex. Chemi stry & Biology, 2008, 15 : 629-638》 。 所述链 霉菌 CGMCC NO. 2394 ZYJ-6定向生产杀念菌素单一组份 FR-008- III， 其产量是野生型菌 株该组份产量的 120-130 %，而 FR- 008-ΠΙ是杀念菌素 3个主要组分中最具药用价值的 成份， 通过该工程菌可以大规模生产高纯度的杀念菌 素有效组份， 具有显著的工业应用 价值。

所述 PIB139记载于《 11 :^50：1 CJ， Hughes- Thoraas ZA, Martin CJ，Bohm L Mironenko T， Deacon M， Wheatcroft M， Wirtz G， Staunton J , Leadlay PF. Increasing the efficiency of heterologous promoters in actinomycetes. J Mol Microb Biotech, 2002, 4 (4)： 417-426》。

所述的菌株 PJTU4405记载于中国专利申请 201010148837. 2， 公开号 CN 101805742 A, 公开日 2010- 8- 18的发明专利文献 《透明颤菌血红蛋白 vgbS核苷酸序列及其质粒和制备 方法》 中。 所述的菌株 PJTU4405通过以下方式制备得到： 将 ^b基因在链霉菌中使用频 率不高的密码子改为在链霉菌中使用频率最高 的密码子， 保持氨基酸序列不变， 产生新 的基因 Wb5"。 在基因 wb5M端分别引入 Ndel和 EcoRI的酶切位点， 其中在 ^b5t亥苷酸序 列的 5 ' 端添加 7个核苷酸， 形成限制性内切酶 Ndel位点和保护碱基， 在 ^/λ5核苷酸序列 的 3 ' 端添加 8个核苷酸， 形成限制性内切酶 EcoRI位点和保护碱基。 将;^ 5"全基因合成， 全长 456bp。 合成的 456bp的 b ¾DNA被插在载体 pGH的 Smal位点， 产生质粒 pJTU4405， 测序证明合成无误。

所述大肠杆菌 ET12567/pUZ8002公开于《Paget， M. S. , Chamberl in, L.， Atrih, A. , Foster , S. J. , and Buttner , M. J. . Evidence that the extracytoplasmic function sigma factor σ E is required for normal cell wall structure in Streptomyces coelicolor A3 (2 ) . J. Bacteriol , 1999 , 181 : 204 - 211》 。

附图说明 图 1为表达质粒的构建图。

图 2为菌株 ZYJ- 6/pFMetK， ZYJ-6/pFMV, ZYJ-6/pFMA, ZYJ- 6/pFMVA中 »ei 基因 的 PCR验证。

图 3为菌株 ZYJ-6/pFVgb, ZYJ-6/pFMV, ZYJ-6/pF VA菌株中 wb5"基因的 PCR验证。 图 4 为菌株 ZYJ- 6/pFAdpA， ZYJ-6/pFMA, ZYJ-6/pFMVA中 a p I- c基因的 PCR验证。 图 5 为分光光度法分析菌株 ZYJ- 6和 ZYJ- 6/pFMetK， ZYJ-6/pFVgb, ZYJ-6/pFAdpA,

ZYJ-6/pFMV, ZYJ-6/pF A, ZYJ- 6/pFMVA中杀念菌素 FR- 008- III在不同培养时间的产量 变化。

图 6为定量分析出发菌株 ZYJ-6和高产菌株 ZYJ-6/pFMVA中杀念菌素 FR- 008-ΙΠ 的产量变化。

具体实施方式

下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 这些实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规 条件， 例如 Sambrook 等分子克隆： 实验室手册 （New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 ) 中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。

实施例 1、 提高链霉菌抗生素产量的整合表达质粒的构建

本实施例涉及的基因表达载体 PIB139是一个含有红霉素抗性基因强启动子 PermE* 的链霉菌整合型载体， 可以通过大肠杆菌和链霉菌之间的两亲本接合 转移进入链霉菌， 发生位点特异性重组后整合在链霉菌的染色体 上， 随着染色体一起复制和遗传。 图 1为 本实施例中涉及的所有表达质粒构建图。

1. 1质粒 pFMetK的构建

PCR扩增天蓝色链霉菌 M145中不带原始启动子的 /^ί 基因， 具体步骤包括： 在天 蓝色链霉菌的 ffei 基因内部设计引物 metKF2/metKR，在 ATG密码子处加入了一个 Ndel 酶切位点；将扩增到的不带原始启动子的 1334bp的/^ i/r基因插入 _P BlueS _C riptn SK(+) 的 EcoRV位点构建 4292bp的克隆 pJTU2524; 用 Ndel和 EcoRI将无启动子的 7?ei r基因 片段从 PJTU2524上切下插入到含有红霉素抗性基因强启� ��子 PermE*的 pIB139载体中， 得到质粒 pFMetK。

所述的引物 metKF2/metKR的序列为：

met F (5， -CAGGGAGCCATATGTCCCGT-3 ' )；

raetKR (5' - TCGCAAAGGCCACTGACAACA-3， )<, 1. 2质粒 pFVgb的构建

质粒 PJTU4405含有全基因合成 wb5"，长度 456bp，在基因 两端分别引入了 Ndel 和 EcoRI酶切位点。 用 Ndel和 EcoRI双酶切带有透明颤菌 基因的 pJTU4405。 将

"基因 （441bp ) 插入含有红霉素抗性基因强启动子 PermE*的链霉菌整合型载体 PIB139的对应位点， 得到质粒 pFVgb。

1. 3质粒 pFMV的构建

PCR 扩增天蓝色链霉菌中的 adpA-c基因， 具体步骤包括： 设计引物 adpAc2F/ adpAclR， 在 ATG密码子处加入了一个 Ndel酶切位点； 将 1556bp的 ao^!-c扩增片段插 入到 pBlueScriptl l SK (+ ) 的 EcoRV位点， 得到质粒 pJTU2520 ; 再用 Ndel和 EcoRI将 adpA-c从 _P JTU2520上切下插入到带有红霉素启动子的� �粒 pIB139的相应位点，得到质 粒 pFAdpA。

所述的引物 adpAc2F/ adpAc lR '的序列为：

adpAc2F ( 5 ' -GGCTTAGCCATATGAGCCAC- 3 ' )；

adpAclR (5 ' - CGTTCATGCGGGCCACTTTA- 3， )。

1. 4含有 metK和 ^bS"两个基因的质粒 pFMV的构建

用 Ndel和 EcoRI将 vgbS PJTU4405上切下插入 pJTU968的相应酶切位点， 再用 Muni和 EcoRI将带有红霉素强启动子的 w^S"基因片段插入到 pFMetK质粒的 EcoRI位点， 得到质粒 pFMV。

1. 5含有膨卿 adpA-c两个基因的质粒 pFMA的构建

用 Ndel和 Eco PI将 adpA_c从 pJTU2520上切下插入到带有红霉素启动子的质粒 PJTU968的相应位点， 再用 Muni和 Eco^将带有红霉素强启动子的 atp - c基因片段插 入到 pFMetK质粒的 EcoRI位点， 构建质粒 pFMA。

1. 6含有 metJ、 和 c的质粒 pFMVA 的构建

用 Muni和 EcoRI将带有红霉素启动子的 ac/^-c从 _P JTU2522上切下插入到 pFMV的 EcoRI位点， 得到质粒 pFMVA。

实施例 2、 把质粒转入链霉菌宿主以及接合转移子的筛选 和验证

将构建的质粒转入大肠杆菌 ET12567/pUZ8002中， 挑转化子在液体 LB培养基中培 养携带有转移质粒的大肠杆菌 ET12567/pUZ8002， 该液体 LB培养基内存在有终浓度为 25 μ g/ μ L的氯霉素， 50 μ g/ μ L的卡那霉素和 30 μ g/ μ L的阿泊拉霉素。

37°C培养 8小时后收集菌体， 用新鲜 LB培养基洗涤菌体 3次备用。 将链霉菌孢子悬浮于 5ml TES缓冲液中，该缓冲液浓度为 0. 05 mol/L, pH值为 8. 0。 然后在 55 °C水浴中热激. 10 min， 冷却至室温后， 按 10 ⁸ ： 10 ⁸ 与大肠杆菌细胞等量 混合后涂在 SFM培养基平板上， 该培养基平板组分为： 2 %琼脂糖 （m/v )， 2 % 甘露醇 (m/v ) , 2 % 黄豆饼粉 （m/v)， 培养平板 pH值为 7. 2〜7. 5， 吹干后放在 30°C培养箱中 进行培养。

12小时后用含萘啶酮酸和阿泊拉霉素的 1 ml无菌水覆盖平板， 平板上萘啶酮酸的 终浓度为 50 ng/mL, 阿泊拉霉素为 30 ng/mL, 置 30Ό培养 3天后即可看到转移接合子。

从覆盖板上挑选单个接合转移子接种到阿泊拉 霉素抗性平板上进一步确认抗性。 以 备选菌株的总 DNA作为 PCR模板， pFMetK, pFMA, pFMV ， pFMVA四个质粒中都含有 y7?ei r 基因， 质粒经转化获得的 ZYJ-6/pFMetK， ZYJ-6/pFMV, ZYJ-6/pFMA, ZYJ- 6/pFMVA菌株 用 PCR验证使用的引物为 metKTF/metKTR, PCR产物为 986 bp (见图 2 ) 。 图 2中 1为 marker , 2、 3、 4、 5分别为菌株 ZYJ- 6/pFMetK， ZYJ-6/pFMV, ZYJ-6/pFMA, ZYJ-6/pFMVA 的染色体为模板可以扩增得到 986 bp扩增带。

pFVgb , pFMV, pFMVA三个质粒中都含有 gZ^基因，质粒经转化获得的 ZYJ_6/pFVgb， ZYJ-6/pFMV, ZYJ- 6/pFMVA菌株用 PCR验证使用的引物为 vgbTF/vgbTR, PCR产物为 436 bp (见图 3 ) 。 图 3中 1为 marker, 2、 3、 4分别为菌株 ZYJ-6/pFVgb , ZYJ-6/pFMV, ZYJ-6/pFMVA的染色体为模板可以扩增得到 436 bp扩增带。

pFAdpA , pFMA , pFMVA 三个质粒中都含有 adpA 基因， 质粒经转化获得的 ZYJ-6/pFAdpA, ZYJ-6/pF A, ZYJ6-/pFMVA菌株用 PCR验证使用的引物为 adpATF/adpATR, PCR产物为 620 bp (见图 4 ) 。 图 4中 1为 marker , 2、 3、 4分别为菌株 ZYJ- 6/pFAdpA， ZYJ-6/pFMA, ZYJ- 6/pFMVA的染色体为模板可以扩增得到 620 bp扩增带。

引物序列 ：

metKTF: 5' GAACAGACCCACGGGCTCGG 3'

metKTR: 5' TGTCCCGTCGCCTGTTCACC 3'

vgbTF: 5' GTGGACCAGCAGACCATCAA 3'

vgbTR: 5' ACTCGACCGCCTGGGCGTAC 3'

adpATF: 5' CGCAGGGACTGGAGGCGATC 3'

adpATR: 5' CACCCGCTGGGTGATCAGCC 3' PCR反应体系： 0. 1 μ _β 模板 DNA, 引物各 50 pmol , 4 μΐ DMSO, 4 μΐ dNTP， 5 μΐ PCR缓冲液和 1个单位 Tag DNA聚合酶， 该聚合酶为日本 T0Y0B0公司产品， 加纯水到

PCR反应的循环条件为： 94°C， 5 min; 94 °C , 30 s; 57 °C , 30 s; 72°C， 80 s (30 个循环） ； 72°C延伸 5 min, 4°C结束反应。

实施例 3、 菌株发酵以及抗生素的提取和检测

将出发菌株 ZYJ-6和获得的 ZYJ - 6/pFMetK, ZYJ-6/pFVgb, ZYJ-6/pFAdpA, ZYJ-6/ pFMV, ZYJ-6/pFMA, ZYJ-6/pFMVA六个菌株依次进行液体发酵及抗生素� ��测。以菌株 ZYJ - 6 作为宿主， 以 FR-008 III组分的产量作 ¾检测标准。

首先将菌株在 SFM平板上活化， 30 培养 3天。然后接种在 25 ml液体培养基 TSBY ( 10. 3%蔗糖） 中， 其中液体培养基 TSBY的制备方法为： 胰蛋白胨 （TSB) 30 g， Difco 酵母粉 5 g， 蔗糖 340 g (34 %) 或 103 g ( 10. 3 %) ， 定容至 1000 ml , 分装灭菌。

30°C摇床培养 24小时， 取样， 离心， 收菌体， 烘干， 称干重， 确定各菌种之间菌 体密度的差异， 调整到一致。 按大约 1/100体积比接种到 50 ml液体培养基 YEME中， 30°C摇床培养 84小时。

液体培养基 YEME的制备方法为： 取 Difco酵母粉 3 g， Difco蛋白胨 5 g， Oxoid 麦芽粉 3 g， 蔗糖 103 g， 葡萄糖 10 g， 然后定容至 1000 ml， 灭菌， 使用前补加 2 ml 的 无菌 2. 5 M MgCl ₂ · 6 0溶液。

在不同的培养时间取发酵液进行抗生素的提取 和检测。 分别在 36 h， 48 h， 60 h, 72 h和 84 h取发酵液， 然后加入 2倍体积的正丁醇， 振荡萃取， 离心取上清， 重复三 次， 将菌液中的抗生素萃取出来， 合并萃取液， 在波长 380 nm处用分光光度计检测 (PerkinElmer®) ， 同时以链霉菌 FR-008的不产抗生素的突变株 HJ- 5 (Yirong Zhang, Linquan Bai and Zixin Deng. Functional characterization of the first two actinomycete 4'- amino- 4- deoxychorismate lyase genes. Microbiology, 2009, 155 : 2450 - 2459) 的发酵液作为空白对照。 实验重复三次。

图 5为菌株 ZYJ-6和构建的六个菌株 ZYJ- 6/pFMetK， ZYJ-6/pFVgb, ZYJ-6/pFAdpA, ZYJ-6/pFMV, ZYJ-6/pFMA, ZYJ-6/pFMVA产生的杀念菌素的产量分析。

六个菌株与出发菌株同时进行平行发酵检测， 结果表明， 前五个菌株使杀念菌素的 产量依次提高了 90% (pFMetK)、 130% (pFVgb)、 80% (pFAdpA)、 130% (pFMV) 、 150% (pFMA) (见图 5 ) ; 图 6表示三个基因的整合型质粒 pFMVA在 ZYJ-6中的表达最终将 杀念菌素的产量提高了 2. 1倍， 产量从 424ug/ml (ZYJ-6 ) 提高到 1301ug/ml

(ZYJ-6/pFMVA) 。

综上所述， 本发明提供了质粒及利用质粒提高链霉菌抗生 素产量的方法， 通过对抗 生素的生物合成有广泛促进作用的 3个基因中的一个或者几个采取在一个载体上� �时进 行表达的方式， 利用接合转移转入链霉菌中进行高效表达以提 高抗生素的产量。