及作为药物 /基因载体的应用

技术领域

本发明属于肿瘤靶向递送与缓释给药系统载体 技术领域。 具体是聚乙二醇 -聚乳 酸羟基乙酸-聚 -L-赖氨酸 （PEG-PLGA-PLL) 阳离子聚合物为载体的药物基因递送系 统、 制备方法及其在医药中的用途。

发明背景

临床上应用化疗药物治疗恶性肿瘤在许多情况 下获得了一定的成功， 但是， 同时 也存在着一些严重的问题。一个主要的问题是 化疗药物普遍缺乏选择性， 导致严重的 剂量依赖性毒副作用的产生， 极大地限制了化疗药物的临床治疗效果。另一 个问题是 肿瘤细胞抗药性的快速出现。 因此， 对于能特异性靶向肿瘤细胞并造成正常细胞最 小 损伤的治疗方法的开发， 具有非常重要的意义和广阔的应用前景。

近几十年来， 靶向递送载体由于其独特的优势， 能有效的提高治疗效果， 而备受 国内外关注。尤其以可生物降解的聚合物为载 体的递送系统得到的迅速的发展， 靶向 递送载体可以有效的降低药物的毒副作用， 延迟药物在体内的代谢， 改善治疗效果。 许多像聚乳酸、 聚乳酸-羟基乙酸等生物降解材料巳经广泛的� �用做药物、 基因和成 像试剂的递送载体， 取得了一定的效果。

多数纳米载体在体内未到达靶目标前即被巨噬 细胞识别吞噬， 而达不到治疗效 果； 由此国内外许多学者， 将聚乙二醇单甲醚 （mPEG) 附着在载体的表面， mPEG 的长链能使纳米载体有效的逃避网状内皮系统 的吞噬， 从而达到长循环的目的， 并且 取得了较好的治疗效果。可降解聚合物聚乳酸 羟基乙酸（PLGA), 在体内可以缓慢降 解， 可以使药物随材料的降解被缓慢释放出来， 从而达到较长时间的治疗效果， 这种 材料已获得美国 FDA批准。 阳离子多聚物聚左旋赖氨酸 PLL， 生物相容性好， 降解产 物为人体所必需的氨基酸。 多聚左旋赖氨酸复合物仍带正电荷， 其结构灵活、 稳定、 易调整其分子量， 可以通过引入侧链和特异靶向性基团来修饰多 聚物骨架， 进而调整 和改善载体的性能， 达到缓释药物的目的。 将 PLGA和 PLL结合可以发挥两者的优点。

确认本 — — 因此以聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚 -L-赖氨酸 （mPEG-PLGA-PLL) 阳离子聚 合物为骨架的纳米给药系统是一种非常优异的 缓释药物载体。

给药系统的靶向能力是将活性物质准确递送至 靶点的关键， 以聚乙二醇单甲醚- 聚乳酸羟基乙酸-聚 -L-赖氨酸 （mPEG-PLGA-PLL) 阳离子聚合物为骨架的纳米给药 系统可以很好的解决这个问题。研制的纳米载 体系统直径可保持在 lnm-ΙΟ μ。因为正 常组织周围的血管没有缝隙， 而肿瘤组织周围的血管有 100纳米左右的缝隙， 所以纳 米粒子就会从这些缝隙中渗透出来， 并利用增强的渗透保留效应聚集于肿瘤部位， 然 后攻击癌细胞， 但不会损害正常细胞， 从而达到被动靶向的效果。 将纳米粒采用靶向 基团修饰后， 靶向基团可以与靶点特异性结合， 具有受体介导的靶向给药系统形成的 主动靶向效应， 使抗肿瘤药物比较准确送到肿瘤细胞中， 实现恶性肿瘤的靶向治疗。 采用本发明所设计的以聚乙二醇单甲醚-聚乳� �羟基乙酸-聚 -L-赖氨酸 (mPEG-PLGA-PLL) 阳离子聚合物为骨架的纳米给药系统， 可以同时连接靶向基团 和包裹两种以上的活性物质从而达到靶向递送 、 多重治疗方式结合的目的。 发明内容

本发明的目的是提供一种以聚乙二醇-聚乳酸� �基乙酸-聚 -L-赖氨酸 (PEG-PLGA-PLL) 阳离子聚合物为骨架的纳米给药载体系统， PEG有长循环功效， 聚乳酸羟基乙酸 PLGA可生物降解有缓控释功效， 聚左旋赖氨酸 PLL带正电荷可以 介导与负电荷的基因结合。通过控制载体粒径 大小可使载体具有被动靶向的功能。通 过引入侧链和特异靶向性基团来修饰多聚物骨 架， 进而调整和改善载体的性能， 可使 载体具有主动靶向的功能。这种载体材料还具 有运送活性物质、肿瘤治疗与诊断、超 声显影、 逆转或降低耐药等功能。

本发明所要解决的技术问题在于合成合适的载 体，使不同的靶向基团能有效地嫁 接在载体上， 并且包载活性物质， 从而有效的靶向递送活性物质到靶点。

本发明所述的阳离子聚合物 mPEG-PLGA-PLL为一系列不同分子量、不同单体比 例的材料， 其 mPEG-PLGA-PLL聚合物分子量为 1. O X 10 ³ - 9. OX 10 ⁸ 道尔顿； 所述的 聚乙二醇 /聚乳酸羟基乙酸摩尔比为 1-50: 100-1； 所述的聚乳酸羟基乙酸 PLGA中丙 交酯 /乙交酯即 LA/GA的摩尔比为 1-100: 100-1; 所述的聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸 / 聚 -L-赖氨酸摩尔比为 1-50 : 100-1; 所述的聚乙二醇 /聚乳酸羟基乙酸 /聚 (L-赖氨酸） 摩尔比为 0. 1-30:0. 1-80: 1-100。 本发明所述的聚合物材料 mPEG-PLGA-PLL的合成方法是开环聚合法。合成所� � 的催化剂包括辛酸亚锡、 乳酸锌、 氯化亚锡或对甲苯磺酸等。 本发明所述的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙� �-聚 -L-赖氨酸（mPEG-PLGA-PLL) 的 合成方法具有如下 5个步骤。

( 1 )聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸（mPEG-PLGA) 的制备：

在抽真封管中、 100~250°C和催化剂存在下， 聚乙二醇单甲醚、 丙交酯和乙交酯 在反应 2~100小时， 所述的丙交酯和乙交酯的摩尔比为 1~100:100~1， 聚乙二醇单甲 醚占原料总量质量百分比为 1°/ 50。/。， 所述的聚乙二醇单甲醚分子量为 350~20000, 催化剂占原料总质量的百分比为 0.0001~1%催化剂， 所述的催化剂是辛酸亚锡、 乳酸 锌、 氯化亚锡或对甲苯磺酸；

(2)聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸 -[ (N-叔丁氧羰基） -L-苯丙氨酸]的制备: 在有机溶剂中、 氮气保护和室温下， 步骤（1 ) 的产物、 叔丁氧基羰基 -L-苯丙氨酸、 N，N-二环己基碳二亚胺和 4-二甲氨基吡啶反应 0.5~5天； 所述的步骤（1 ) 的产物、 N-叔丁氧羰基 -L-苯丙氨酸、 Ν,Ν-二环己基碳二亚胺和 4-二甲氨基吡啶的摩尔比为 1: 0.01-30： 0.01-30： 0.01-30；

(3)聚乙二醇单甲魅-聚乳酸羟基乙酸 -L-苯丙氨酸的制备

在有机溶剂中、 氮气保护和 -20 > 0Γ温度下， 步骤 （2) 的产物和三氟乙酸反 应 0.1~24小时， 所述的步骤（2) 的产物和三氟乙酸的摩尔比为 1: 0.01~30；

(4)聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸 -[(N-苄氧羧基) >聚 -赖氨酸]的制备 有机溶剂中、 氮气保护和室温下， 步骤（4) 的产物和氨基酸环内酸酐反应 1 天， 所述的骤 （4) 的产物和氨基酸环内酸酐的摩尔比为 1: 0.01-100；

(5)聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚 (L-赖氨酸)的制备

步骤（4)的产物和定量 33%的氢溴酸-冰乙酸溶液在 O'C反应 0.1-24h; 所述的步 骤（4 -冰乙酸溶液的摩尔比为 1 : 0.01-100；

本发明所述的聚合物 mPEG-PLGA-PLL是优良的药物载体，利用这种材料� �裹药 物， 在机械搅拌、 超声、 高压乳匀机作用下制备缓释纳米粒， 粒径在 lnm-ΙΟ μ ηι以 下可控 （优选为 10nm-1000nm)， 表面光滑， 均匀度好， 颗粒规则无粘连， 再分散性 好， 载药量和包封率高， 可用于制备静脉或肌肉注射或口服给药的缓释 纳米粒。制备 的纳米粒可以分散在固体、半固体或溶液中。 优选的是制成注射给药的药物制剂形式， 尤其是供静脉注射用。

本发明所述的与可以与聚合物 mPEG-PLGA-PLL连接的靶向基团，包括肿瘤血管 生成抑制肽； 抗肿瘤血管生成的因子如成纤维生长因子 （FGFs：)、 血管内皮生长因子

(VEGF); 以及多肽、 叶酸、 抗体、 转铁蛋白、 糖、 聚山梨酯等活性基团， 甘草酸、 甘草次酸、 胆酸、 低密度脂蛋白 （LDL)、 激素、 核酸等所有具有可用于修饰的适宜 官能团的靶向基团及其衍生物。 所用的 RGD肽是含精氨酸 -甘氨酸-天冬氨酸序列的 任何直链或环状多肽片段， 包括含 RGD序列的三肽、 四肽、 五肽、 六肽、 七肽、 八 肽、 九肽和十肽， 或含 RGD类似物 (RGDm) 的直链或环状多肽片段； 所用的抗体 包裹 EGFR等多种抗体； 糖类包括半乳糖、 壳聚糖、甘露聚糖、胶淀粉、 支链淀粉和 葡萄聚糖等； 靶向基团的接枝率为 0.0001%·50%。

本发明所述的包载的活性物质包括药物、基因 、诊断用显影剂、微泡内容性气体、 探针。药物包括任何适合制成纳米粒给药系统 的抗肿瘤药物， 可为有机药物、 水溶性 药物或水不溶性药物抗癌药， 如抗叶酸类（如甲氨蝶呤）、 抗嘌呤类（如巯嘌呤）、 抗 嘧啶类（如氟尿嘧啶、 替加氟)、 核苷酸还原酶抑制药（如羟基脲)、 脱氧核糖核苷酸 多聚酶抑制药 （如环胞苷）、 直接影响和破坏 DNA结构及其功能的药物 （如氮芥、 环磷酰胺、 氮甲、 顺铂、 丝裂霉素、 喜树碱）、 抑制蛋白质合成的药（如阿霉素、 L 一门冬酰胺酶、柔红霉素、光辉霉素)、影响� �管蛋白质组装和纺锤丝形成的药物（长 春新碱、 依托泊苷）和用于核磁成像、 超声或 CT等成像仪器所用的显影剂活性药物 或诊断试剂， 诊断试剂分为用于超声、 核磁共振、 CT和 PET的诊断试剂。 基因包括 SiR A、 自杀基因、抑癌基因、 反义核酸等用于治疗的基因； 微泡内容性气体包括空 气、 氟碳气体、 六氟化硫等用于超声微泡显影剂。

本发明所述的聚合物载体包载微泡内容性气体 后可用于超声显影，实体肿瘤定位 并且通过超声空化效应辅助肿瘤治疗。

本发明所述的以聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基� �酸-聚 -L-赖氨酸 (mPEG-PLGA-PLL)聚合物为骨架的纳米给药系统， 可以同时连接至少一种或一种 以上的不同靶向基团修饰或 /和载至少一种或一种以上的不同的活性物质� �而达到靶 向递送、 药物和基因的共治疗、 多重治疗方式结合的目的。

本发明所述的 PEG-PLGA-PLL聚合物为骨架的载药微纳米粒系统， 可以通过以 下制备方法制备- 复乳法： 将合成得到的多肽修饰的聚合物溶于乙酸乙酯 、二氯甲烷或二氯甲烷和 丙酮混合的有机溶剂中， 加入药物水溶液， 超声或高压乳匀得到初乳， 再加入水分散 介质， 乳化得到复乳后， 搅拌或旋转蒸发除去有机相， 即得纳米粒混悬液。

共沉淀法：将合成得到的多肽修饰的聚合物和 药物一起溶于丙酮中， 搅拌条件下 滴加到水分散介质中， 搅拌挥尽有机溶剂， 即得纳米粒混悬液。

乳化溶剂扩散法： 将合成得到的多肽修饰的聚合物和药物溶于丙 酮 /二氯甲垸混 合溶剂中，加入到水分散介质中，超声或高压 乳勾乳化，乳液在室温下挥尽有机溶剂， 即得纳米粒混悬液。

本发明所述的 PEG-PLGA-PLL聚合物纳米给药载体系统的制备方法 ， 其特征在 于所述的分散介质为右旋糖苷 40， 右旋糖苷 70， 普朗尼克 F68或聚乙烯醇 PVA等各 种适合于制备纳米粒的表面活性剂， 其分散介质浓度为 0.1〜20% (w/v

本发明所述的制备纳米粒制备中的有机溶剂包 括乙酸乙酯、二氯甲烷、 丙酮、 乙 醇等各种适合于制备纳米粒的有机溶剂。

本发明所述的 PEG-PLGA-PLL聚合物纳米给药载体系统， 其特征是在药物载体 方面的应用包括对药物的递送、长循环、可生 物降解、缓控释、被动靶向、主动靶向、 运送活性物质、 肿瘤治疗与诊断、超声显影、逆转肿瘤细胞的 耐药特性及对疾病的诊 断和治疗。所述的给药系统在制备治疗相应疾 病药品中的给药途径包括： 注射、 口服 和粘膜给药。

本发明所述的 PEG-PLGA-PLL聚合物纳米给药载体系统的制备方法 ， 其特征在 于可以制备成冻干剂保存和应用， 冻干支架剂包括海藻糖、 葡萄糖、 乳糖、 蔗糖、 右 旋糖苷、 山梨醇、 甘露醇和聚乙二醇等。 支架剂含量为 0.01-20% (w/v

本发明纳米给药系统制备方法简便，适于大规 模生产，特别适应于制备肿瘤靶向 的抗肿瘤药纳米粒给药系统。

本发明所述的 mPEG-PLGA-PLL聚合物为骨架的纳米给药系统，所� �备的载药纳 米粒对肿瘤耐药具有逆转或者降低耐药的功能 。 附图说明

图 1 mPEG-PLGA- PLL的核磁谱图， DMS0为二甲亚砜。 （实施例 1 )

图 2 纳米粒粒径分布图。粒径为横坐标，强度为纵 坐标。（A) mPEG-PLGA-PLL-RGD纳 米粒粒径分布图； （B ) mPEG-PLGA-PLL-RGD载米托蒽醌的纳米粒粒径分布图 (NicompTM-380ZLS粒度测定仪） （实施例 2)

图 3 mPEG-PLGA-PLL载 siRNA纳米粒形貌原子力显微镜观察。 图中白点是纳米颗粒 的形貌（实施例 5)

图 4 mPEG-PLGA-PLL细胞毒性实验（实施例 9 )。

图 5 mPEG-PLGA-PL载药纳米粒促进耐药细胞 MCF-7/MIT的药物摄取实验（实施例

10)。

图 6 超声 /微泡促进 RPE-J细胞摄取载 cy3-siRNA纳米粒（实施例 14)

7 药物在动物体内组织的分布图， 尾静脉注射 Mitoxantrone- loaded mPEG-PLGA- PLL-RGD纳米粒后， 分别在 4小时、 28小时和 51小时测定载药纳 米粒在动物体内组织的分布（实施例 16)

图 8 载药纳米粒抑制动物肿瘤生长的图。 将生理盐水组， 游离的米托蒽醌 ( Mitoxantrone ) 药物， Mitoxantrone- loaded mPEG- PLGA- PLL 纳米粒， Mitoxantrone- loaded mPEG- PLGA- PLL- RGD纳米粒每 4天通过尾静脉给药一次， 之后测量肿瘤体积， 治疗周期为 36天。 A是肿瘤体积的生长曲线， B是治疗后肿 瘤的照片 （实施例 16) 符号说明

图 4中， Nanoparticles concentration表示纳米粒的浓度； Live rate表示细胞存活 率； cell viablity表示细胞存活率， 以（％)表示的。 HepG2表示 HepG2肝癌细胞用 MTT法检测细胞存活率， PLC MTT表示 PLC肝癌细胞用 ΝΠΤ法检测细胞存活率。

MDA-MB-231表示 L腺癌细胞。

图 5中， Mitoxantrone表示米托蒽敏； Mitoxantrone- loaded mPEG— PLGA- PLL纳米 粒表示 mPEG-PLGA-PLL包载米托蒽醌的纳米粒；游离的 Mitoxantrone表示未用材料包 栽的米托蒽 δ¾药物。 MCF7是乳腺癌细胞； MCF7/MIT表示 MCF7的米托蒽醌耐药细 胞。

图 6中， NPs alone为仅有纳米粒组； NPs+US表示纳米粒加超声组； NPs+MBs表示纳 米粒加微泡组； NPs+UTMD表示纳米粒加微泡和超声实验组。

图 7中， Heart表示心； Lung表示肺； Liver表示肝； Spleen表示脾； Kidney 表示肾； Tumor表示肿瘤。 Mitoxantone Contents表示米托蒽醌含量. 4h表示 4小时 的时候动物体内组织中的米托蒽醌量 ; 28h表示 28小时的时候动物体内组织中米托蒽 醌的量； 51小时表示 51小时的时候动物体内组织中米托蒽醌的量。

图 8 中， Saline 表示生理盐水； Mitoxantrone 表示米托蒽醌抗癌药；

Mitoxantrone-loaded mPEG-PLGA- PLL Nanoparticles表示 mPEG- PLGA- PLL包载米托 蒽醌纳米粒； Mitoxantrone-loaded mPEG- PLGA- PLL- RGD Nanoparticles 表示 mPEG-PLGA-PLL-RGD包载米托蒽醌纳米粒。 （A) 天数为横坐标， 肿瘤体积为纵坐标。

Days表示天。 · 具体实施方式

本发明描述了用于药物 /基因递送载体以及制备方法和应用。 本发明并不限于本文 所公开的具体的构型、方法步骤和物质， 因为这样的构型、方法和物质可以多少发生 变化。 本文所使用的术语仅仅是用于描述具体实施方 案的目的并且并不打算进行限 制， 因为本发明的范围将仅仅受到所附权利要求及 其等同内容的限制。

说明书和所附权利要求书， 除非上下文另外清楚地加以描述， 单数形式的 "一种" 和 "所述"均包括复数的相应内容。

下面以实施例对本发明加以进一步的说明， 但是不限制本发明的内容。 实施例 1、聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚 -L-赖氨酸（mPEG~PLGA-PLL)的合 成

(1)聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸（mPEG-PLGA)� ��制备： 抽真空加热干燥耐 热玻璃管， 加入 17.28g丙交酯与 3.48 _g 乙交酯原料（摩尔比为 8: 2), 加入占原料总 量质量百分比为 10%、 分子量为 2K的 mPEG, 再加入乳酸锌催化剂， 通氮气， 加热 溶解抽真空， 冷却固化抽真空 2小时后封管， 150Γ反应 40小时。

抽真空加热干燥耐热玻璃管，加入 30.24g丙交酯与 10.44g乙交酯原料（摩尔比 为 7: 3 )， 加入占原料总量质量百分比为 20%、 分子量为 5K的 mPEG, 再加入乳酸 锌催化剂， 通氮气， 加热溶解抽真空， 冷却固化抽真空 2小时后封管， 120°C反应 5 天。 ( 2 ) 聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸 -叔丁氧羰基 -L-苯丙氨酸的制备： 6g mPEG-PLGA溶于干燥有机溶剂，搅拌加入 1.06g叔丁氧羰基 -L-苯丙氨酸、 0.83g 1,3- 二环己基碳二亚胺， 0.08g 4-二甲氨基吡啶， 氮气保护， 室温搅拌 2天， 过滤， 饱和 碳酸氢钠溶液和水各洗涤 3次， 收集有机相， 无水硫酸镁干燥， 浓縮， 加冰乙醚沉淀 出产物， 过滤， 真空干燥。

(3)聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸 -叔丁氧氨基 -L-苯丙氨酸的制备： 取 2.6g上述 (2)产物溶于干燥有机溶剂中， 氮气保护， 搅拌滴加 5.2ml干燥的三氟乙酸， 滴 加 30分钟， 继续反应 2小时， 旋蒸去除溶剂与未反应三氟乙酸， 残渣溶于有机溶剂， 饱和碳酸氢钠溶液和水各洗涤 3次， 收集有机相， 无水硫酸镁干燥， 浓缩， 冰乙醚沉 淀， 过滤， 真空干燥。 -

(4)聚乙二醇单甲醚 -聚乳酸羟基乙酸-带保护基的聚 -L-赖氨酸的制备：取 2g上述 (3) 产物溶于干燥有机溶剂中， 加入 1.6g氨基酸环内酸酐（NCA), 氮气保护， 室温反应 3天， 浓缩， 冰乙醚沉淀， 过滤， 真空干燥。

(5) mPEG-PLGA-PLL的制备： 取 lg上述（4) 的产物溶于 3ml三氟乙酸中， 加入 5ml体积分数为 33%的氢溴酸（HBr)醋酸溶液， 0°C反应 1小时，冰乙醚沉淀，过滤， 真空干燥。 核磁表征见附图 1。

(6)含精氨酸 -甘氨酸-天冬氨酸（cRGD)环肽的接枝： 取 400mg mPEG-PLGA-PLL 溶于二甲亚砜中， 随后加入 46mg cRGD和 27m _g N，N"-羰基二咪唑（CDI), 氮气保护 下室温搅拌反应 4小时。 反应结束后将溶液置于透析袋中透析 24小时， 随后冻干保 存。

叶酸的接枝： 将 28mg叶酸溶于二甲亚砜中， 加入 O.lg共聚物 mPEG-PLGA-PLL， 再 加入 30mg l-(3-二甲氨基丙基 )-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC) ,搅拌反应 4小时。去 离子水透析， 冻干， 密封、 备用。

抗体的接枝：将 5mg抗体溶于二甲亚砜中，加入 15mg EDC和 lOmg N-羟基琥珀酰亚 胺（ HS)搅拌， 然后加入 O.lg共聚物 mPEG-PLGA-PLL, 搅拌反应 4小时， 之后透 析， 然后冻干， 密封、 备用。

转铁蛋白的接枝：将 2mg转铁蛋白溶于二甲亚砜中，加入 lOmg EDC和 lOmg N-羟基 琥珀酰亚胺（NHS)搅拌，然后加入共聚物 0.1g mPEG-PLGA-PLL，搅拌反应 4小时， 之后透析， 然后冻干， 密封、 备用。

实施例 2、 包载盐酸米托蒽醌药物的 mPEG-PLGA-PLL纳米粒的制备

采用乳化蒸发法制备： 取 8mg mPEG-PLGA-PLL溶于 400μί二氯甲垸， 加入 40μί 浓度为 lOmg mL的盐酸米托蒽醌水溶液，超声乳化后，再加� �� 4.4mL lwt%的泊洛沙姆 F68水溶液中， 再次超声。 然后室温下搅拌 3h除去有机相， 即得纳米粒混悬液。上述 制得的纳米粒粒径控制在 10-1000 nm。

采用薄膜乳化法制备： 取 8mg mPEG-PLGA-PLL和 0.4mg 盐酸米托蒽醌溶于 40(^L丙酮溶剂中， 旋转蒸发成膜， 随后加入 4mL水溶液， 室温下搅拌 3h， 即得纳米 粒混悬液。 上述制得的纳米粒粒径控制在 10-1000 nm。

采用透析法制备： 取: 8mgmPEG-PLGA-PLL溶于 3mL二甲亚砜溶剂中， 加入 0.4mg盐酸米托蒽醌， 搅拌均匀； 随后将有机溶液在搅拌的条件下滴入水中， 之后将 溶液装入透析袋中透析 48小时， 除去有机溶剂； 即得纳米粒混悬液。上述制得的纳米 粒粒径控制在 10-1000 nm之间。

采用界面沉淀法制备： 取: 8mg mPEG-PLGA-PLL和 0.4mg 盐酸米托蒽醌溶于 40(^L丙酮溶剂中， 在一定搅拌速度下， 将上述溶液注入 4mL浓度为 2wt%聚乙烯醇 (PVA)溶液， 加压挥发去除丙酮， 即得纳米粒混悬液。 上述制得的纳米粒粒径控制 在 10-1000 nm。 （附图 2) 实施例 3、 包载 DNA的 mPEG-PLGA-PLL纳米粒的制备

采用乳化蒸发法制备： 取 8mg mPEG-PLGA-PLL溶于 400μί二氯甲垸中， 加入 4.4mL 1^/。的？68水溶液中超声。 然后室温下搅拌 3小时 除去有机相， 得 mPEG-PLGA-PLL纳米粒溶液。 将适量的 mPEG-PLGA-PLL纳米粒溶液在充分搅拌下 逐滴加入等体积的质粒 DNA溶液中， 低温孵育 30 min, 即得到载 DNA基因的纳米粒。

复乳-液中干燥法亦称溶剂挥发法， 即将基因溶解于水作为内水相， 8mg mPEG-PLGA-PLL溶解于 400μί二氯甲垸作为油相， 两者超声后， 形成油包水 (W/O) 的初乳， 然后倒入 4mL浓度为 2wt%聚乙烯醇水溶液， 再次乳化成水包油包水的复乳 (W/0/W), 搅拌蒸去有机溶剂固化微球， 离心洗涤， 真空干燥后以 60Co辐照灭菌。 实施例 4、 包载基因和药物的 mPEG-PLGA-PLL纳米粒的制备

采用乳化蒸发法制备： 取 8mg mPEG-PLGA-PLL溶于 400μί二氯甲垸中， 加入 40μ 浓度为 lOmg/mL的盐酸米托蒽醌的水溶液， 超声乳化后， 再加入 4.4mL 1^/。的？68水溶 液中， 再次超声。 然后室温下搅拌 3小时， 除去有机相， 即得纳米粒混悬液。 将适量的 mPEG-PLGA-PLL纳米粒溶液在充分搅拌下逐滴加入� �体积的质粒 DNA溶液中，低温孵 育 30分钟， 即得到载基因和药物的纳米粒。 实施例 5 包载 siR A (小干扰 RNA) 的制备

称取 8mg的 mPEG-PLGA-PLL-RGD溶于 40C^L二氯甲烷中构成有机相，以 50μΙ^浓度 为 20nmoi L的 siR A-Cy3 (荧光 cy3标记的 siRNA)溶液为水相， 混合有机相与水相， 超 声形成初乳。 将初乳倾入 4.4mL含 0.5wt% F68乳化剂的外水相中， 继续超声得到复乳 液后旋转蒸发挥尽有机溶剂得纳米粒分散体系 mPEG-PLGA-PLL-siR A-Cy3。 （附图 3 )

实施例 6、 包载微泡内容性气体的 mPEG^PLGA-PLL纳米粒的制备

采用双乳化法， 将 12mg mPEG-PLGA-PLL溶于 lmL二氯甲垸中， 充分搅拌至其完 全溶解 (作连续相)，然后在其中加入 200nL双蒸水 (为分散相)，超声后，成乳白色乳化液 (W/ 0微球)，将乳化液 (分散相)倒入 4mL2wt%PVA溶液中 (连续相)，均质机均质 (W/ O/ W微球)。 然后加入 4mL异丙醇溶液中， 高温下搅拌， 使微球表面固化、 二氯甲烷尽量 自然挥发， 再经多次双蒸水与正己垸洗涤、 离心 (去除二氯甲垸)， 收集微球， 待其室温 干燥后加入适量双蒸水混匀， 置 真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥 48小时， 然后停 止抽气， 将全氟丙烷气体缓慢充入冷冻干燥室内至大气 压， 关闭冷冻干燥机气阓并保 持 8 h即得 mPEG-PLGA-PLL微泡超声造影剂。 实施例 7、 叶酸修饰 mPEG-PLGA-PLL包载米托蒽醌药物的纳米粒的制备

9mg叶酸修饰 mPEG-PLGA-PLL溶于 400μί二氯甲垸中， 加入 40[iL浓度为 lOmg mL 的盐酸米托蒽醌的水溶液， 超声乳化后， 再加入 4.4mL lwt%F68水溶液中， 再次超声。 然后室温下搅拌 3h除去有机相， 即得纳米粒混悬液。 上述制得的纳米粒粒径控制在 10-1000 nm。 实施例 8、 EGFR抗体修饰 mPEG-PLGA-PLL包载米托蒽醌药物的纳米粒的制备 取 8mg mPEG-PLGA-PLL溶于 400 L二氯甲垸中， 加入 40μ浓度为 10mg mL的盐酸 米托蒽醌的水溶液， 超声乳化后， 再加入 4.4mL lwt»/t^F68水溶液中， 再次超声。然后 室温下搅拌 3h除去有机相， 即得纳米粒混悬液； 随后将 10mg EDC和 5mg NHS加入到 纳米粒溶液中， 搅拌 2小时， 之后将表皮生长因子受体（EGFR)抗体加入到溶� ��中， 然后搅 #4h， 得 EGFR抗体修饰的纳米粒。

实施例 9 mPEG-PLGA-PLL细胞毒性研究

HepG2和 PLC肝癌细胞铺 96孔板， 每孔细胞的密度为 5 X 104/ml个， 在 37°C， 二氧化碳体积分数为 5%的细胞培养箱中培养过夜。分别将纳米粒的� ��在 0.05-200 μ g 范围的 mPEG-PLGA-PLL纳米粒加入到 96孔板中 （只加培养液的细胞组为阴性对照 组）， 每个实验条件设置 4个复孔。 在培养 24 h加入 3- (4,5-二甲基噻唑 -2) -2,5-二 苯基氮唑溴盐， 商品名噻唑蓝， ΜΊΤ) (5 mg/mL) 溶液 20 ， 继续培养 4小时， 之后吸取培养液， 加二甲亚砜 DMSO 100 L溶解后， 在酶标仪 490 nm处， 记录数 值按照公式计算细胞的存活率， 每个实验条件设置 4个复孔。

通过 MTT实验证明， HepG2与 PLC肝癌细胞在 mPEG-PLGA-PLL的浓度在

0.2mg ml时细胞的成活率较高， 都达到 85%以上， 并且 mPEG-PLGA-PLL材料对这 两种肝癌细胞的细胞毒性呈现一致性。 材料细胞毒性小 （附图 4)

同样的方法观察乳腺癌细胞 MDA-MB-231的生长作用。 （附图 4) 实施例 10、 纳米给药系统促进耐药细胞 MCF-7/ΜΓΓ的药物摄取实验

乳腺癌 MCF- 7细胞和盐酸米托蒽醌 （MIT)耐药细胞株（MCF-7/MIT) 由上海市肿瘤研 究所癌基因与相关基因国家重点实验室惠赠。 MCF-7细胞和 MCF- 7/MIT细胞铺 24孔板， 每孔 80000个细胞， 0. 5 ml培液， 在 37 °C， 5% C02的细胞培养箱中培养过夜， 待细胞 贴壁后，分别换成含有游离盐酸米托蒽醌或盐 酸米托蒽醌载药纳米粒的培液 0. 5 ml (盐 酸米托蒽醌浓度为 20 ug/ml ) ， 继续培养 1小时， 弃去培液， 加磷酸缓冲液洗 2次， 然 后加细胞裂解液裂解细胞， 收集裂解液分为两部分， 一部分检测 610nm处紫外吸光值 并计算盐酸米托蒽醌含量， 一部分用二羧基二喹啉或二辛可宁酸（Bicinchon inic acid; BCA)蛋白定量试剂盒测定蛋白含量， 最后计算细胞内药物含量并用蛋白含量 进行标定。 每个条件设置 3复孔。

实验结果表明：相同药物浓度的游离药物与载 药纳米粒作用 1小时后，在 MCF-7 细胞内， 药物摄取量分别为每 ug蛋白 29.28 ±0.45ug和 55.21 ±0.95ug, (P<0.05)， 后者约为前者的 1.9倍； 在 MCF-7 MIT细胞内， 药物摄取量分别为每 ug蛋白 37.48 ±2.50ug和 87.30±2.97ug， （P<0.05)，后者约为前者的 2.4倍。 (附图 5 ) 实旄例 11 肝癌细胞摄取 mPEG-PLGA-PLL栽 cy3-siRNA纳米粒实验 实验方法：取对数生长期的 HepG2和 PLC肝癌细胞铺激光共聚焦培养皿， HepG2 与 PLC肝癌细胞每皿 2 X 10 ⁴ 个细胞， 0.3ml培液，在 37°C， 5% C02的细胞培养箱中 培养过夜。 待细胞贴壁后， 加入包被 Cy3-siRNA的 mPEG-PLGA-PLL纳米粒，每孔 60μ1，使 mPEG-PLGA- PLL纳米粒的终浓度为 0.2mg ml，混合均匀， 37 Ό， 5% C02 的细胞培养箱中培养 4 吸取工作液， 4Ό磷酸缓冲液洗涤 3次， 加入 4%多聚甲醛， 固定 30^磷酸缓冲液洗涤 3次， 然后加入 4',6-二脒基 -2-苯基吲哚（DAPI) 染核， 5~10min,磷酸缓冲液洗涤 3次， 每孔加入 ΙΟΟμΙ磷酸缓冲液， 激光共聚焦检测。

实验结果表明: HepG2与 PLC肝癌细胞在与 mPEG-PLGA-PLL纳米粒共孵育 4 小时后都能较好的摄取纳米粒， 并且 PLC组较 HepG2组的摄取有较明显的增加。 实施例 12 PC-3, RPE-J, QGY-7701细胞摄取载 cy3-siR A纳米粒实验 实施例 11相同的实验方法， 观察 PC-3， RPE-J, QGY-7701细胞摄取载 cy3-siRNA纳 米粒实验。 研究表明： 上述几种细胞都能摄取纳米粒。

注： PC- 3为前列腺癌细胞， RPE-J为大鼠视网膜色素上皮细胞， QGY-7701为人肝癌 细胞。 实施例 13 RPE-J细胞不同时间点摄取栽 cy3-siRNA纳米粒实验

实施例 11相同的实验方法， 不同时间点观察 RPE-J细胞摄取载 _C y3-siR A纳米粒实 验研究表明： 高浓度纳米粒子在 RPE-J细胞中的内化速度明显高于低浓度组。 实施例 14 超声 /微泡促进 RPE-J细胞摄取载 cy3-siRNA纳米粒

RPE-J细胞在 5%C02恒温孵育箱中培养， 以每孔 1 X 10 ⁵ 个细胞的密度隔行隔孔 种植于 24孔培养板， 过夜使细胞贴壁生长。 每两个孔为一组， 接受相同实验参数， 两个孔的细胞消化后收集于一起， 作为一个样本处理。 每个实验重复三次到五次。

美国 Chattanooga公司的 Topteam 161型超声治疗仪， 探头横断面积 25mm2， 频 率 ΙΜΗζ, 脉冲重复频率 100Hz。 固定超声探头、 表面涂耦合剂 2〜3mm厚度、 培养 板放置于探头上， 构成探头-耦合剂-细胞板 -细胞的超声通路。

意大利 Bracco公司的商品化 SonoVue®, 由磷脂外壳包裹六氟化硫气体构成。 按 照使用说明书要求， 无菌注射器抽取生理盐水 5ml, 稀释 SonoVue®粉剂， 手动震荡， 充分均匀混合。 微泡平均直径 2.5μιη, 浓度 (2~5 X 10 ⁸ )个微泡 /ml。

根据实验设计， RPE-J细胞孔内首先加入纳米粒， 在 5%C02恒温孵育箱内静置 孵育 10min， 然后加入微泡， 立即进行超声照射。超声照射结束，将细胞置 于 5%C02 恒温孵育箱中培养 24小时。 弃去实验培养基， 磷酸缓冲液 PBS洗脱三次， 加入新鲜 培养基 300μ1保持细胞生长环境，倒置荧光显微镜（Axi overt S 100，德国 ZEISS公司） 观察 RPE-J细胞的荧光摄取。 弃去培养基， 加 0.25%胰蛋白酶 0.3〜0.5ml,消化、 收集 细胞， 然后离心（Centrifiige 5810R, 德国 Eppendorf公司） 450g、 5分钟。 流式细胞 仪（Facs Calibur, 美国 Becton Dickeinson公司）检测 RPE-J细胞的摄取率和荧光强 度。

24小时后，流式细胞仪证实超声 /微泡可以有效将 Cy3标记的 mPEG-PLGA-PLL 载基因纳米粒递送到 RPE细胞内。 （附图 6) 实施例 15 mPEG-PLGA-PLL载 cy5-siRNA纳米粒动物体内组织分布 裸鼠若干只， 分别静脉注射载有 Cy5-siRNA的 mPEG-PLGA-PLL纳米粒，每只裸 鼠给予 O.lnmd,不同时间点观察体内组织分布情况。

结果表明： mPEG-PLGA-PLL纳米粒在裸鼠体内主要分布在肝脏� � 肺脏与肿瘤， mPEG-PLGA-PLL 纳米粒对于肝脏、 肺脏有较好的被动靶向效果， 肿瘤部位有 mPEG-PLGA-PLL纳米粒的浓集且在 72小时时呈现较好的浓集效果。 具有组织器官 靶向性， 同时具有缓释功能。

实验结果提示： 控制纳米粒粒径的大小， 可以靶向目标组织。 实施例 16、 载米托蒽敏纳 在荷 MDA-MB-231乳腺癌小鼠体内分布 及其治疗的研究

将 MDA-MB-231乳腺癌细胞（2xl0 /0.2ml)注入裸鼠的前肢腋部皮下， 2周后， 肿瘤建模成功。随后将荷人乳腺癌细胞（MDA-MB -231 )乳腺癌小鼠随机分为 3组（每 组 4只），随后注入 mPEG-PLGA-PLL-RGD- loaded Mitoxantrone纳米粒，之后相应的分 别在 2小时、 4小时和 51小时处死动物。 取出心、 肝、 脾、 肺、 肾和肿瘤组织。 之后将 组织称重研磨提取组织内药物， 按下列高效液相条件进行测试色谱柱： Kromasil 100-5Ci ₈ (250mmx4.6mm ID), 保护柱： AUTO Science C.270A, 柱温： 30°C， 流动相： 甲醇： O. mol.I/ ¹ 乙酸铵缓冲液 (PH2.7) (48:52),流速： 1.0ml'min-〗，检测波长： 599nm, 进样量： 10μ1 _ο 从实验结果可以看出， 动物的心、 肝、 肺等组织浓度较低， 说明纳米 粒具有较好的生物相容性， 能有效的逃离网状内皮系统的吞噬。但肿瘤组 织的药物浓 度显著的高于其他脏器组织， 尽管肿瘤组织的药物浓度随着时间延长有一定 的降低， 但是仍维持在一个较高的水平。表明 mPEG-PLGA-PLL-RGD载米托蒽醌纳米粒能有效 的靶向肿瘤组织。 （附图 7)

在治疗实验中， 每 4天相应的将生理盐水， 游离的米托蒽醌（Mitoxantrone) 药 物， mPEG-PLGA-PLL载药纳米粒和 mPEG-PLGA-PLL-RGD载药纳米粒通过尾静脉 给药一次， 随之测量肿瘤体积， 治疗周期为 36天。 实验结果发现， 随着治疗时间的 延长， mPEG-PLGA-PLL-RGD载药纳米粒组的肿瘤体积则明显� ��低于游离的米托蒽 醌（Mitoxantrone)药物组和 mPEG-PLGA-PLL载药纳米粒组； mPEG-PLGA-PLL-RGD 载药纳米粒组的抑瘤率 （91.27%)显著的高于游离的米托蒽醌 （Mitoxantrone) 药物 组 （10.32% ) 和 mPEG-PLGA-PLL 载药纳米粒组 （42.06% ) 的抑瘤率， 表明 mPEG-PLGA-PLL-RGD载药纳米粒对荷 MDA-MB-231乳腺癌小鼠具有显著的抑瘤效 果。 见附图 8。