Potentielle Anwendungsfelder betreffen eine Vielzahl von molekularbiologisch arbeitenden Laboratorien in den Bereichen der medizinischen Diagnostik, forensischen Diagnostik und Lebensmitteldiagnostik sowie alle anderen angrenzenden Forschungsgebiete.

Die Analyse von Nukleinsäuren (RNA und DNA) gewinnt immer stärker an Bedeutung.

Dies betrifft alle Bereiche der molekularen biotechnologisch geprägten Forschung. Ein Schwerpunkt der molekularen Nukleinsäureanalytik in der medizinischen Forschung ist der Nachweis von Sequenzveränderungen in medizinisch interessanten Genen, welche in einem kausalen Zusammenhang mit pathologischen Prozessen betrachtet werden.

Auf Grund der großen Mengen an zu untersuchenden Tragetsequenzen, setzen sich dabei mehr und mehr die"high-throughput-Anwendungen" (Hochdurchsatzapplikationen) durch.

Unter den potentiellen Hochdurchsatzapplikationen finden dabei die auf DNA-Chips (DNA-arrays) basierenden Verfahrenslösungen mehr und mehr Einzug in die experimentelle Nukleinsäureanalytik.

Das Prinzip dieser Technologien besteht darin, dass eine unterschiedlich hohe Anzahl von Oligonukleotiden (Sonden) adressiert an feste Phasen gekoppelt bzw. de novo an festen Phasen synthetisiert werden. Die erzeugten DNA-Chips werden dann entsprechend jeweiliger Fragestellungen mit der zu analysierenden Probennukleinsäure inkubiert. Als zu analysierende Probennukleinsäure wurden bisher markierte total RNA zur Untersuchung von Expressionsprofilen sowie markierte via PCR erzeugte DNA-Fragmente zur Sequenzbestimmung (und Sequenzabweichung) eingesetzt. (US 5837832, US 6027880) Das bedeutet, dass jeweils entsprechend einer vorliegenden Fragestellung DNA Chips mit spezifischen Oligonukleotidsonden belegt werden und nachfolgend mit der Probennukleinsäure hybridisiert werden. Das Hybridisierungsergebnis wird mittels Fluoreszenzdetektion ausgelesen und ausgewertet und liefert somit die detaillierte Information zur vorliegenden Nukleinsäuresequenz.

Mittels dieser Technologie ist es möglich, eine Vielzahl von Sequenzinformation zu analysieren. Nachteilig sind die extrem hohen Kosten sowie die Problematik einer exakten

Qualitätskontrolle der auf einem Chip adressierten Oligonukleotidsonden bezüglich ihrer Sequenzidentität.

Ein weiterer großer Nachteil des Verfahrens besteht darin, dass für die Analyse von Nukleinsäuretargets hinsichtlich eines Sequenznachweises, die zu untersuchenden Targets zur Verfügung gestellt werden müssen. Diese Notwendigkeit schließt ein, aus einer relevanten Probe i. R. Nukleinsäure zu isolieren und nachfolgend die zu untersuchenden Targetsequenzen mittels PCR zu amplifizieren. Erst mit amplifizierten Targetsequenzen kann dann ein definiert mit Oligonukleotiden adressierter Chip hybridisiert werden.

Aus GB 2,274,409 A sind Membranen bekannt, die strukturierte negativ und positiv geladene Bereiche aufweisen. Das heißt, dass positiv und negativ geladene Areale vorhanden sind, die räumlich voneinander abgegrenzt sind. Solche Membranen werden als Trennmedien vielfältig in klassischen Filtrationsverfahren eingesetzt. Diese Membranen sind jedoch für einen komplexen Ablauf in der Nukleinsäuremanipulation und-analytik ungeeignet, da eine Reinigung, Bindung sowie Detektion der Nukleinsäuren aufgrund der räumlichen Trennung von positiv und negativ geladenen Gebieten nicht an einem Ort stattfinden kann.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es deshalb, neue Trägermaterialien für eine neuartige Plattformtechnologie zur komplexen Nukleinsäuremanipulation und Nukleinsäureanalytik bereitzustellen.

Dies wird erfindungsgemäß dadurch erreicht, dass bisher verfolgt Chip-basierende Technologien von ihrem Funktionsprinzip umgekehrt werden. Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten. Die Erfindung betrifft eine bi-oder mehrfach funktionalisierte Oberfläche, an welcher alle bisher für eine Nukleinsäureanalytik (z. B. zur Sequenzbestimmung) notwendigen Prozesse realisiert werden.

Das erfindungsgemäße Trägermaterial ist dadurch gekennzeichnet, dass sich auf der Oberfläche mindestens eine kovalent gebundene Schicht befindet, die mindestens zwei verschiedene funktionelle Gruppen trägt, die statistisch verteilt auf der Oberfläche vorliegen, wobei mindestens eine der funktionellen Gruppen negativ geladen ist, mindestens eine weitere funktionelle Gruppe positiv geladen oder chemisch reaktiv ist oder beide Eigenschaften besitzt.

Unter einer statistischen Verteilung der funktionellen Gruppen versteht man im Sinne der Erfindung, dass diese Gruppen nicht räumlich voneinander isoliert vorliegen, sondern sich

gleichmäßig verteilt an der Trägeroberfläche befinden. Das hat den großen Vorteil, dass alle Verfahrensschritte räumlich an einem Ort des Trägermaterials stattfinden können.

Charakteristisch für die bi-oder multifunktionelle feste Phase ist eine chemische Modifizierung der festen Phase (des Substrat-oder Trägermaterials) mit mindestens zwei unterschiedlich geladenen, meist ionischen, funktionellen Gruppen oder einer negativ oder positiv geladenen funktionellen Gruppe zusammen mit einer chemisch reaktiven Gruppe, wobei letztere es ermöglicht, nach erfolgter Aufreinigung das Zielmolekül kovalent zu binden. Der genutzte Prozess der chemischen Modifizierung ermöglicht es, das Verhältnis der sich auf der entsprechenden Oberfläche befindlichen funktionellen Gruppen (kationische, anionische, zum Aufbau einer kovalenten Bindung befähigte) variabel einzustellen und damit exakt zu definieren. Das wichtigste Merkmal der Erfindung ist die Kombination einer negativ geladenen funktionellen Gruppe mit einer anderen, positiv geladenen und/oder chemisch reaktiven funktionellen Gruppe, die es ermöglicht, das Zielmolekül kovalent zu binden und alle an dem Zielmolekül durchzuführenden Extraktions-, Modifikations-und Detektionsschritte am gleichen Trägermaterial zu realisieren. Die erfindungsgemäße Modifi-zierung der Trägermaterialien wird durch die im folgenden beschriebene Behandlung erreicht.

Die Funktionalitäten auf dem erfindungsgemäßen Trägermaterial werden gleichzeitig oder nacheinander in beliebiger Reihenfolge durch das im folgenden beschriebene Verfahren generiert.

1. Erzeugung der negativ geladenen funktionellen Gruppen und anschließende weitere Modifizierung mit kationischen funktionellen Gruppen (ohne thermisch oder photochemisch labile funktionelle Gruppen) 2. Gleichzeitige Erzeugung der negativ geladenen funktionellen Gruppen zusammen mit den kationischen Funktionalitäten (ohne thermisch oder photochemisch labile Gruppen) 3. Erzeugung der negativ geladenen funktionellen Gruppen und anschließende weitere Modifizierung mit kationischen funktionellen Gruppen und sequentiell im dritten Schritt folgende Funktionalisierung mit thermisch oder photochemisch labilen funktionellen Gruppen 4. Gleichzeitige Erzeugung der negativ geladenen funktionellen Gruppen zusammen mit den kationischen Funktionalitäten und anschließende Modifizierung mit thermisch oder photochemisch labilen Gruppen 5. Gleichzeitiges Funktionalisieren mit allen (anionisch, kationisch und thermisch/ photochemisch aktivierbare) funktionelle Gruppen 6. Erzeugung der negativ geladenen funktionellen Gruppen und anschließende weitere Modifizierung thermisch oder photochemisch labile funktionelle Gruppen

Das Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Trägers wird im folgenden näher erläutert.

Zur Erzeugung der stark negativen funktionellen Gruppen wird in einer ersten Prozeßstufe ein beliebiges Trägermaterial für die Dauer von einer Minute bis zwei Stunden, vorzugsweise für eine Stunde, bei Raumtemperatur in eine Lösung von 0,1 g bis 500 g Ätznatron, Ätzkali oder eines anderen stark basischen Stoffes pro 1000 g eines Alkohols, vorzugsweise i-Propanol getaucht. Anschließend wird das der alkoholischen Lösung entnommene Trägermaterial so lange vorzugsweise mit Wasser gewaschen, bis die Waschlösung neutral ist, und getrocknet, vorzugsweise 30 Minuten bei 100°C.

In der sich anschließenden zweiten Prozessstufe wird der vorbehandelte Träger mit einem Photoinitiator beschichtet. Als Lösungsmittel für den Initiator kommen Ketone, Alkohole, Ester und Ether in Frage. Die Konzentration des Initiators beträgt dabei bevorzugt 0,01 g 1 'bis 0,5 g í-'.

Das vorbehandelte und mit Initiator beladene Trägermaterial wird in eine Monomerlösung getaucht, aus der Monomerlösung genommen und im feuchten Zustand belichtet. Als Monomere sind polymerisationsfähige Carbonsäure-, Sulfonsäure-und Phosphorsäure- Derivate geeignet, insbesondere die Derivate der Acrylsäure, der Methacrylsäure, der Styrolsulfonsäure und-phosphorsäure bzw. auch deren Gemische. Als Lösungsmittel für die Monomeren kommen Alkohole, Ketone, Ester, Ether und insbesondere Wasser sowie Gemische derselben zum Einsatz. Die Konzentration des Monomeren beträgt vorzugsweise I g !''bis 200 g 1-', besonders geeignet sind Lösungen mit einem Monomergehalt von 50 g 1-'.

Als Belichtungsquellen werden vorzugsweise Quecksilberdampflampen, Quecksilberhoch- und-höchstdrucklampen, Halogenlampen, Wolframlampen und Laser mit Emissionen im Bereich der Initiatorabsorption verwendet. Die Belichtungszeit hängt von der Intensität der Strahlungsquelle ab und beträgt je nach deren Leistung einen Bruchteil einer Sekunde bis zu Stunden.

Nach der Belichtung wird das Trägermaterial gewaschen. Als Waschflüssigkeit sind insbesondere die Lösungsmittel geeignet, die für die Herstellung der Monomerlösung eingesetzt wurden. Die präparierten Träger werden abschließend getrocknet.

Zur Erzeugung von schwach negativen funktionellen Gruppen kann der erste Schritt stark verkürzt werden bzw. entfallen.

In einem folgenden dritten Schritt wird der vormodifizierte Träger wiederum mit einem Photoinitiator beschichtet. Als Lösungsmittel für den Initiator kommen Ketone, Alkohole, Ester und Ether in Frage. Die Konzentration des Initiators beträgt dabei bevorzugt 0,01 g I-

'bis 0,5 g 1-'. Das vormodifizierte und mit Initiator beladene Trägermaterial wird in eine Monomerlösung getaucht, aus der Monomerlösung genommen und im feuchten Zustand belichtet. Als Monomere sind polymerisationsfähige Ammonium-, Sulfonium-und Phosphonium-Derivate geeignet, insbesondere die Derivate der Acrylsäure, der Methacrylsäure, des Styrols und-Vinylverbindungen bzw. auch deren Gemische. Als Lösungsmittel für die Monomeren kommen Alkohole, Ketone, Ester, Ether und insbesondere Wasser sowie Gemische derselben zum Einsatz. Die Konzentration des Monomeren beträgt vorzugsweise I g !''bis 200 g 1-', besonders geeignet sind Lösungen mit einem Monomergehalt von 50 g 1-'.

Als Belichtungsquellen werden vorzugsweise Quecksilberdampflampen, Quecksilberhoch- und-höchstdrucklampen, Halogenlampen, Wolframlampen und Laser mit Emissionen im Bereich der Initiatorabsorption verwendet. Die Belichtungszeit hängt von der Intensität der Strahlungsquelle ab und beträgt je nach deren Leistung einen Bruchteil einer Sekunde bis zu Stunden.

Nach der Belichtung wird das Trägermaterial gewaschen. Als Waschflüssigkeit sind insbesondere die Lösungsmittel geeignet, die für die Herstellung der Monomerlösung eingesetzt wurden. Die präparierten Träger werden abschließend getrocknet.

In einer anderen Ausführungsvariante werden bei der photochemischen Modifizierung bereits Gemische von kationischen und anionischen Monomeren eingesetzt und gleichzeitig polymerisiert. Dazu wird der im ersten Schritt vorbehandelte Träger oder ein unvorbehandelter Träger mit einem Photoinitiator beschichtet. Als Lösungsmittel für den Initiator kommen Ketone, Alkohole, Ester und Ether in Frage. Die Konzentration des Initiators beträgt dabei bevorzugt 0,01 g l~'bis 0,5 g 1~'.

Das vorbehandelte oder auch das unvorbehandelte und mit Initiator beladene Trägermaterial wird in eine Monomerengemisch-Lösung getaucht, aus der Lösung genommen und im feuchten Zustand belichtet. Als Monomere sind polymerisationsfähige Carbonsäure-, Sulfonsäure-und Phosphorsäure-Derivate geeignet, insbesondere die Derivate der Acrylsäure, der Methacrylsäure, der Styrolsulfonsäure und-phosphorsäure bzw. auch deren Gemische im Gemisch mit polymerisationsfähigen Ammonium-, Sulfonium-und Phosphonium-Derivaten.

Als Monomere kommen auch bi-oder polyfunktionelle Monomere in Frage.

Als Lösungsmittel für die Monomeren kommen Alkohole, Ketone, Ester, Ether und insbesondere Wasser sowie Gemische derselben zum Einsatz. Die Konzentration des Monomeren beträgt vorzugsweise I g 1-'bis 200 g 1-', besonders geeignet sind Lösungen mit einem Monomergehalt von 50 g 1-'.

Als Belichtungsquellen werden vorzugsweise Quecksilberdampflampen, Quecksilberhoch- und-höchstdrucklampen, Halogenlampen, Wolframlampen und Laser mit Emissionen im Bereich der Initiatorabsorption verwendet. Die Belichtungszeit hängt von der Intensität der Strahlungsquelle ab und beträgt je nach deren Leistung einen Bruchteil einer Sekunde bis zu Stunden.

Nach der Belichtung wird das Trägermaterial gewaschen. Als Waschflüssigkeit sind insbesondere die Lösungsmittel geeignet, die für die Herstellung der Monomerlösung eingesetzt wurden. Die präparierten Träger werden abschließend getrocknet.

Das Aufbringen der photolabilen oder der thermisch labilen funktionellen Gruppen erfolgt entweder als letzter Schritt nach Abschluß der vorangegangenen Funktionalisierungen mit negativen und positiven funktionellen Gruppen oder sofort nach der Modifizierung mit der negativen Funktionalität oder zusammen mit negativer oder/und positiver funktioneller Gruppe. Dazu wird das Substrat (der Träger) mit einem Photoinitiator beschichtet. Als Lösungsmittel für den Initiator kommen Ketone, Alkohole, Ester und Ether in Frage. Die Konzentration des Initiators beträgt dabei bevorzugt 0,01 g 1-'bis 0,5 g I-'. Das vorbehandelte oder auch das unvorbehandelte und mit Initiator beladene Trägermaterial wird in eine Monomerengemisch-Lösung getaucht, aus der Lösung genommen und im feuchten Zustand belichtet.

Als Monomere sind polymerisationsfähige Radikalgeneratoren (Azide, Oniumsalze, Peroxide, Nitroverbindungen, Ketone) bzw. auch deren Gemische geeignet, insbesondere aromatische Bisazide oder Benzophenonderivate, die photochemisch bei geeigneter Wellenlänge bzw. thermisch Radikale und somit eine kovalente Bindung zur bereits ionisch gebundenen Nukleinsäure erzeugen.

Als Lösungsmittel für die Monomeren kommen Alkohole, Ketone, Ester, Ether und insbesondere Wasser sowie Gemische derselben zum Einsatz. Die Konzentration des Monomeren beträgt vorzugsweise l g 1~'bis 200 g 1~', besonders geeignet sind Lösungen mit einem Monomergehalt von 50 g 1-'.

Als Belichtungsquellen werden vorzugsweise Quecksilberdampflampen, Quecksilberhoch- und-höchstdrucklampen, Halogenlampen, Wolframlampen und Laser mit Emissionen im Bereich der Initiatorabsorption verwendet. Die Belichtungszeit hängt von der Intensität der Strahlungsquelle ab und beträgt je nach deren Leistung einen Bruchteil einer Sekunde bis zu Stunden.

Nach der Belichtung wird das Trägermaterial gewaschen. Als Waschflüssigkeit sind insbesondere die Lösungsmittel geeignet, die für die Herstellung der Monomerlösung eingesetzt wurden. Die präparierten Träger werden abschließend getrocknet.

Durch diese auf der Oberfläche befindliche Schicht, die insbesondere durch Modifizierung der Oberfläche auf dem Wege einer an der Oberfläche initiierten radikalischen Polymerisation hergestellt wird, wobei die Funktionalitäten gleichzeitig oder in beliebiger Reihenfolge erzeugt und kovalent auf der Oberfläche gebunden werden, sind die entsprechend funktionalisierten Trägermaterialien für die Verwendung zur komplexen Nukleinsäureanalytik hervorragend geeignet.

Die erfindungsgemäßen Trägermaterialien ermöglichen die komplexen Prozesse von Probenvorbereitung, ggf. spezifische Amplifikation, ggf. spezifische Manipulation und die zur Sequenzbestimmung notwendige Hybridisierungsreaktionen sowie finale Detektion räumlich fixiert an nur einer Reaktionsoberfläche ablaufen zu lassen. Das ist ein wesentlicher Vorteil gegenüber der bisher angewandten Technologie der komplexen Nukleinsäureanalytik, denn bei den bisherigen Chip-Verfahren laufen alle notwendigen Prozesse der Probenvorbereitung, Amplifikation und ggf. Manipulation immer räumlich getrennt ab.

Die Umkehrung der bisherigen Chip-Technologien basiert darauf, dass im Gegensatz zum Stand der Technik keine DNA-Chips generiert werden, sondern das erfindungsgemäße Mittel als feste Phase die zu untersuchende Probennukleinsäure immobilisiert.

Dies wird dadurch erreicht, das eine klinisch relevante Probe mit einem Lysepuffersystem und der festen Phase inkubiert wird und nach erfolgter Lyse des Ausgangsmaterials ggf. unter Zusatz eines weiteren Puffers die Nukleinsäure der Zelle an die negativen funktionellen Gruppen der festen Phase gebunden wird. Danach wird die feste Phase mit der gebundenen Nukleinsäure gewaschen und potentielle Inhibitoren für nachfolgende Prozesse effektiv entfernt. Im weiteren Verfahrensablauf erfolgt nun die kovalente Immobilisierung der Probennukleinsäure durch Ablösung der Nukleinsäure von den negativen funktionellen Gruppen über die Inkubation der festen Phase mit einem Niedrigsalzpuffersystem (z. B. 10 mM Tris HCI). Dies hat zur Folge, dass die von der negativen Ladung abgetrennte Nukleinsäure ihrerseits auf Grund der vorliegenden Negativität mit den positiven funktionellen Gruppen der festen Phase in Wechselwirkung gelangen. Die letztlich erreichte kovalente Bindung erfolgt unter chemischer oder photochemischer Generierung von Radikalen auf der Oberfläche, die ihrerseits durch H- Abstraktion kovalente Bindungen knüpfen.

Die jetzt kovalent immobilisierte Nukleinsäure kann nachfolgend in beliebiger Form manipuliert werden. In einer Ausführungsvariante werden z. B. durch alkalische Denaturierung DNA-Einzelstränge erzeugt und über dem Fachmann bekannte Hybridisierungsverfahren mit spezifischen Oligonukleotidsonden ein Targetnachweis durchgeführt, wobei das Hybridisierungsergebnis mit nach dem Stand der Technik bekannten Verfahren bestimmt wird.

Durch den Einsatz von multiplen Sonden mit verschiedenen Nachweismarkern kann dann z. B. sehr einfach eine Vielzahl von Sequenzinformation bestimmt werden. Weiterhin besteht auch die Möglichkeit über hochstringente Waschschritte Sonden wieder zu entfernen, um nachfolgend das Verfahren zum Nachweis anderer Targetsequenzen in der Nukleinsäureprobe erneut zu beginnen.

Aus diesem Beispiel wird deutlich, dass prinzipiell jede Manipulation von Nukleinsäuren, die für eine Nukleinsäueanalytik interessant sind, mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens realisiert werden kann. Durch die Integration aller Prozesse von der Probenvorbereitung (Nukleinsäureextraktion) bis hin zur Detektionsreaktion an einer festen Phase resultiert, dass die komplexe Automatisierung einer Nukleinsäurenanalytik leicht zu realisieren und somit besonders vorteilhaft ist.

Die Herstellung des erfindungsgemäßen Trägermaterials wird im folgenden an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert.

Ausfuhrungsbelsplel Membran, negativ und positiv geladen (ionisch) Variante a) sequentielle Modifizierung (negativ und positiv geladene Gruppen nacheinander) Eine Polypropylenmembran im DIN A4-Format (Porengröße 0,2 um) wird für 5 min. in eine 150 mM Lösung von Benzophenon (Photoinitiator) in Aceton getaucht und danach getrocknet. Anschließend wird die Membran in eine Glaswanne mit der Reaktionslösung, bestehend aus 20 g/l Acrylsäure in Wasser, überschichtet. Die Glaswanne wird mit einer Glasplatte (Tief-UV-Filter, X > 310 nm) abgedeckt. Nach 10 min. erfolgt die Belichtung an einem UV-Trockner (Beltron GmbH) bei Halblast für 10 min. (10 Passagen durch die Belichtungszone). Anschließend wird die Membran mit Methanol und Wasser extrahiert.

Danach wird getrocknet und gravimetrisch der Modifizierungsgrad bestimmt.

Die bereits mit negativen Gruppen funktionalisierte Membran wird für 5 min. in eine 150 mM Lösung von Benzophenon (Photoinitiator) in Aceton getaucht und danach getrocknet.

Anschließend wird die Membran in eine Glaswanne mit der Reaktionslösung, bestehend aus 30 g/l 2-Aminoethylmethacrylsäureamid Hydrochlorid in Wasser, überschichtet.

Die Glaswanne wird mit einer Glasplatte (Tief-UV-Filter, X > 310 nm) abgedeckt. Nach 10 min. erfolgt die Belichtung an einem UV-Trockner (Beltron GmbH) bei Halblast für 20 min. (20 Passagen durch die Belichtungszone). Anschließend wird die Membran mit Methanol und Wasser extrahiert. Danach wird getrocknet und gravimetrisch der Modifizierungsgrad bestimmt.

Variante b) simultane Modifizierung (negativ und positiv geladene Gruppen gleichzeitig) Eine Polypropylenmembran im DIN A4-Format (Porengröße 0,2 um) wird für 5 min. in eine 150 mM Lösung von Benzophenon (Photoinitiator) in Aceton getaucht und danach getrocknet. Anschließend wird die Membran in eine Glaswanne mit der Reaktionslösung, bestehend aus 20 g/l Acrylsäure und 30 g/l 2-Aminoethylmethacrylsäureamid Hydrochlorid in Wasser, überschichtet. Die Glaswanne wird mit einer Glasplatte (Tief- UV-Filter, X > 310 nm) abgedeckt. Nach 10 min. erfolgt die Belichtung an einem UV- Trockner (Beltron GmbH) bei Halblast für 20 min. (20 Passagen durch die Belichtungszone). Anschließend wird die Membran mit Methanol und Wasser extrahiert.

Danach wird getrocknet und gravimetrisch der Modifizierungsgrad bestimmt.

FTIR-ATR-Spektroskopie : 1720 cm~' (C=O Valenzschwingung) Carboxyl-Gruppe 1650 cm-' (C=O Valenzschwingung) Säureamid 1 1540 cm-' (N-H-Deformation) Säureamid II 3300 cm~' (N-H-Valenzschwingung) Amino-Gruppe (protoniert)