Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polyguanidinsilikat, sowie dessen Herstellung und Verwendung. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Arzneimittel, welche ein Polyguanidinsilikat als Wirkstoff enthalten.

Biozide polymere Guanidinsalze auf Basis von Diaminen sind u.a. aus der AT 406.163 B und der AT 41 1.060 B bekannt. Chloride dieser Polymeren werden hergestellt, indem das Diamin, z.B. Hexamethylendiamin oder Triethylenglycoldiamin, mit Guanidinhydrochlorid umgesetzt wird. Dabei bildet sich ein kationisches Polymer (Polyguanidinium-Kation) mit Chlorid als Gegenion. Es ist bekannt, dass diese

Verbindung ausgeprägte biozide Eigenschaften besitzt.

Weitere Salze dieser polymeren Guanidine können gemäß AT 41 1.060 B hergestellt werden, indem statt des Hydrochlorids ein anderes Salz des Guanidins eingesetzt wird. In der AT 41 1.060 B werden auf diese Weise die kationischen Polymere

(Polyguanidinium-Kationen) mit Dihydrogenphosphat, Carbonat, Nitrat,

Dehydroacetat oder Citrat als Gegenion hergestellt. Das Beispiel 9 der AT 41 1.060 B bezieht sich zwar auf die Herstellung eines Silikats, indem Triethylenglykoldiamin mit Guanidinsilikat umgesetzt wird, wobei sich Polytriethylenglykol-Guanidinsilikat bilden soll. Es hat sich aber gezeigt, dass diese Umsetzung nicht wie in der AT

41 1.060 B beschrieben funktioniert und kein polymeres Guanidinsilikat hergestellt werden kann. Ein Silikat wäre aber wünschenswert, da dieses bei der Anwendung die Umwelt weniger belastet als andere polymere Guanidine.

Aus der RU 2 236 428 Cl ist ein Beschichtungsmaterial bekannt, welches zur

Desinfektion verwendet wird und folgende Inhaltsstoffe enthält: chlorsulfuriertes Polyethylen, Polyhexamethylenguanidin, Wasser, ein oganisches Lösungsmittel und Dialkylphosphorsäure. Diese Zusammensetzung kann ferner 0,1-0,3% Natriumsilikat enthalten.

Aus der JP 2009108184 A ist eine bakterizide Detergenszusammensetzung bekannt, welche enthält: zu 0,1-5 Masse% ein Polyhexamethylenguanidinsalz, zu 0,5-3 Masse% ein Silikat, zu 1-10 Masse% ein erstes Alkylenoxidaddukt aus einem sekundären Alkohol, und zu 1-10 Masse% ein zweites Alkylenoxidaddukt.

Die GB 1 202 303 beschreibt ein Guanidinsilikat mit einem Molverhältnis von

Guanidiniumionen/Silikationen von 1,5 - 0,65. Es wird auch ein polymeres Produkt

BESTÄTIGUNGSKOPIE beschrieben, welches durch Polymerisation dieses Guanidinsilikates mit z.B. Formaldehyd erhalten werden kann.

Aus der WO 2009/009815 ist ein silikatischer Füllstoff für Kunststoffe bekannt, der mit einem biozid wirkenden polymeren Guanidinderivat modifiziert ist. Dieser

Füllstoff wird hergestellt, indem z.B. eine l-30%ige wässerige Lösung des polymeren Guanidinhydrochlorids bei Raumtemperatur in feine, als Feststoff vorliegende Aerosil- Typen eingemischt wird. Bei diesem Mischen bindet das polymere

Guanidinhydrochlorid an das in fester Form vorliegende Silikat. Das Wasser wird anschließend durch Trocknen wieder entfernt. Die Bindung der polymeren

Guanidinderivate an das Silikat ist so fest, dass sie praktisch nicht mehr wasserlöslich sind, aber trotzdem noch ihre mikrobiozide Wirkung aufweisen. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, wird festgehalten, dass das Hydrochlorid nach der Bindung an das Silikat noch als solches vorliegt, d.h., dass das Gegenion zum kationischen Guanidin nach wie vor das Chlorid ist. M.a.W., es handelt sich nicht um ein

Polyguanidiniumsilikat, also einem kationischen Polyguanidinium mit einem Silikat als Gegenion.

Mikrobiozid wirkende Polymere auf der Basis von Guanidinium-Hydrochlorid, insbesondere deren Wirkung gegen Escherichia c<?//-Bakterien, sind ebenfalls bereits bekannt (vgl. WO 01/85676). Weiterhin ist bereits bekannt, dass solche Guanidin- Derivate als fungizide Mittel verwendet werden können (vgl. WO 2006/047800). Von besonderer Bedeutung sind die Polymere Akacid ^® , das Poly-[2-(2-ethoxy)-ethoxyethyl- guanidiniumchlorid], und Akacid plus ^® , eine 3: 1 -Mischung aus Poly-(hexamethylen- guanidiniumchlorid) und Poly-[2-(2-ethoxy)-ethoxyethyl)-guanidiniumchlorid] (vgl.

Antibiotika Monitor, 22. Jahrgang, Heft 1/2/2006, Online- Ausgabe unter

httpV/vvww.antibiotikam

Die genannten mikrobizid wirkenden Polymere gehören zur Gruppe der kationischen Antiseptika, welche chemisch sehr unterschiedliche Substanzen umfassen, die aber als gemeinsames Charakteristikum stark basische Gruppen, gebunden an ein ziemlich massives lipophiles Molekül, besitzen. Die wichtigsten Vertreter sind unter den

Quarternären Ammoniumverbindungen Benzaikoniumchlorid und Cetrimid, unter den Bisbiguaniden Chlorhexidin und Alexidin und unter den polymerischen Biguaniden Polyhexamethylen-Biguanid (PHMB).

Aufgrund ihrer eigenen positiv geladenen Moleküle haben die kationisch

antimikrobiell wirksamen Substanzen eine hohe Bindungsaffinität an die negativ geladenen Zellwände und Membranen von Bakterien. Durch Störung dieser Angriffspunkte kommt es zunächst zur Herabsetzung der Membran fluidit t und zu einer Störung der osmoregulatorischen und physiologischen Zellfunktionen. In weiterer Folge entstehen hydrophile Poren in der Phospholipidmembran, und die Proteinfunktion wird gestört. Das Endresultat ist eine Lyse der Zielzelle. Dieser Membran-schädigende Wirkmechanismus konnte auch für die polymerischen

Guanidine gegenüber Escherichia coli demonstriert werden.

Aus der WO 99/54291 sind Polyhexamethylenguanidine bekannt, die aufgrund ihrer mikrobioziden Wirkung als Desinfektionsmittel eingesetzt werden können. Diese Stoffe werden durch Polykondensation von Guanidin mit einem Alkylendiamin, insbesondere Hexamethylendiamin, hergestellt. Das erhaltenene

Kondensationsprodukt besitzt eine gute biozide Wirkung.

Aus der WO 2006/047800 AI ist ein polymeres Kondensationsprodukt bekannt, das durch Umsetzen von Guanidin oder seinem Salz mit einem Alkylendiamin und einem Oxyalkylendiamin erhalten werden kann. Dieses Kondensationsprodukt wirkt biozid und insbesondere fungizid. Ein Vertreter dieses Kondensationsprodukts ist als auch als „Akacid Plus" im Handel.

Aus der WO 2008/080184 A2 wiederum ist bekannt die Herstellung und Verwendung von polymeren Guanidinium-Hydroxiden auf Basis eines Diamins, welches

Oxyalkylenketten und/oder Alkylengruppen zwischen zwei Aminogruppen enthält und erhältlich ist durch Polykondensation eines Guanidin- Säureadditionssalzes mit dem Diamin, wobei ein Polykondensationsprodukt in Salzform erhalten wird, welches anschließend durch basischen Anionenaustausch in die Hydroxidform überführt wird, zur Bekämpfung von Mikroorganismen.

Im Stand der Technik sind ferner Arzneimittel beschrieben, welche die polymeren Guanidinderivate als Wirkstoffe enthalten, antimikrobiell wirken und in der

Humanmedizin, wie auch in der Veterinärmedizin zur Bekämpfung von Infektionen eingesetzt werden können.

Es hat sich bei der Anwendung der Arzneimittel, z.B. im Veterinärbereich, gezeigt, dass Geflügel Trinkwasser verweigerte, dem das polymere Guanidinderivat zugesetzt worden war. Ähnliches wurde bei der Verfutterung an Schweinen beobachtet, also wenn granulatformiges polymeres Guanidinderivat dem Schweinefutter beigemischt wurde. Als weiterer Nachteil hat sich bei durchgeführten Resorptionsstudien gezeigt, dass bis zu 17% der aktiven Substanz aus dem Gastrointestinaltrakt resorbiert wurden.

Die vorliegende Erfindung stellt sich die Aufgabe, ein biozid wirkendes, polymeres Guanidinsalz zu schaffen, welches einfach herstellbar ist und die oben genannten Nachteile nicht aufweist. Das erfindungsgemäße Polyguanidinsalz soll ferner möglichst wenig wasser- und alkohollöslich sein.

Die Aufgabe wird mit einem Polyguanidinsilikat gelöst, welches erhältlich ist durch Vermischen einer ersten wässerigen Lösung, welche ein Salz eines polymeren

Guanidins mit einer anorganischen oder organischen Säure gelöst enthält, mit einer zweiten wässerigen Lösung, welche Natrium- und/oder Kaliumsilikat gelöst enthält, wobei sich das Polyguanidinsilikat als Feststoff und ein Natrium- und/oder Kaliumsalz der anorganischen oder organischen Säure, welches in gelöster Form vorliegt, bildet.

Das als Feststoff ausfallende Polyguanidinsilikat kann aus der Reaktionsmischung einfach abfütriert werden. Es kann durch Waschen von eventuell noch vorhandenen Ausgangsprodukten und von eventuell noch vorhandenem Natrium- und/oder

Kaliumsalz der anorganischen oder organischen Säure befreit werden. Eine chemische Analyse des so gereinigten Produktes ergab, daß praktisch kein Chlorid mehr vorhanden war, daß somit sämtliche Chlorid-Ionen durch Silikat-Ionen ersetzt wurden.

Wie oben bereits beschrieben, sind für die Synthese des erfindungsgemäßen

Polyguanidinsilikats verwendeten wasserlöslichen polymeren Guanidinsalze im Stand der Technik bekannt. Bevorzugte Vertreter dieser Verbindungsklasse werden weiter unten beschrieben.

Entscheidend ist, dass das polymere Guanidinsalz in einer wässerigen Lösung vorliegt und mit einer wässerigen Lösung eines Natrium- und/oder Kaliumsilikates umgesetzt wird. Dies kann durch einfaches Mischen geschehen, wobei das erfindungsgemäße Polyguanidinsilikat sofort als Pulver aus der wässerigen Lösung ausfällt.

In der vorliegenden Erfindung wird als wässerige Lösung eines Natrium- und/oder Kaliumsalzes bevorzugt„Wasserglas" verwendet. Als„Wasserglas" werden im allgemeinen im Handel erhältliche, wässerige Lösungen von Alkalisilikaten

bezeichnet, die durch Auflösen der aus Quarzsand und Pottasche oder aus Quarzsand und Soda bzw. Glaubersalz/Kohle („Natronwasserglas") erhaltenen Schmelze in Wasser gewonnen werden und in der Hauptsache die Salze M ₂ SiO ₃ und M ₂ Si ₂ 0 ₅ enthalten (Holleman-Wiberg,„Lehrbuch der anorganischen Chemie", 1964, Seite 330).

Als das polymere Guanidinsalz wird bevorzugt ein polymeres Bisguanidinsalz eingesetzt werden. Ein bevorzugter Vertreter der Bisguanidinsalze ist das im Stand der Technik bekannte Polyhexamethylenbiguanid (Polyhexanid).

Eine weitere bevorzugte Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen

Polyguanidinsiiikats besteht darin, dass das polymere Guanidinsalz erhältlich ist durch Umsetzen eines Guanidinsalzes mit einem Alkylendiamin und/oder einem

Oxyalkylendiamin. Derartige polymere Guanidinsalze sind z.B. aus der AT 406.163 B, der AT 408.302 B, der AT 41 1.060 B und der WO 2006/047800 AI bekannt.

Ein bevorzugt eingesetztes polymeres Guanidinsalz ist erhältlich durch eine

Umsetzung, bei welcher pro Mol Diamin (Summe aus Alkylendiamin und

Oxyalkylendiamin) 0,8 bis 1,2 Mol Guanidinsalz davon eingesetzt werden.

Eine weiters bevorzugt eingesetztes polymeres Guanidinsalz ist erhältlich durch eine Umsetzung, bei welcher das Alkylendiamin und das Oxyalkylendiamin im

Molverhältnis zwischen 4: 1 und 1 :4 eingesetzt werden.

Die Aminogruppen des Alkylendiamins und/oder des Oxyalkylendiamins sind bevorzugt endständig.

Als Alkylendiamin ist ferner bevorzugt eine Verbindung der allgemeinen Formel

NH ₂ (CH ₂ ) _n NH ₂ vorgesehen, in welcher n eine ganze Zahl zwischen 2 und 10, insbesondere 6, ist.

Als Oxyalkylendiamin ist ferner bevorzugt eine Verbindung der allgemeinen Formel H ₂ [(CH ₂ ) ₂ O)] _n (CH ₂ ) ₂ NH ₂ vorgesehen ist, in welcher n eine ganze Zahl zwischen 2 und 5, insbesondere 2, ist.

Als Oxyalkylendiamin wird insbesondere Triethylenglykoldiamin (relative

Molekularmasse: 148), Polyoxypropylendiamin (relative Molekularmasse: 230) und/oder Polyoxyethylendiamin (relative Molekularmasse: 600) eingesetzt. Die mittlere Molekularmasse des eingesetzten polymeren Guanidinsalzes liegt im Bereich zwischen 500 und 3.000.

Als Salz des Guanidins ist bevorzugt ein Hydrochlorid vorgesehen.

Das erfindungsgemäße Polyguanidinsilikat besitzt eine ausgeprägte biozide Wirkung und kann als biozides Mittel oder als biozid wirkender Zusatzstoff verwendet werden.

Das erfindungsgemäße Polyguanidinsilikat kann z.B. Farben, Lacken, Silikonmassen, sonstige Baumaterialien, Kunststoffen oder Kosmetika zugegeben werden, um diese vor schädlichen Mikroben zu schützen bzw. die Verbreitung solcher unerwünschten Keime zu verhindern.

Die gegenständliche Erfindung erfüllt den angestrebten Schutz durch das Einarbeiten des erfindungsgemäßen Biozides, insbesondere in Pulverform. Einen wesentlichen Vorteil bietet das erfindungsgemäße Biozid insofern, als es nicht wasserlöslich ist. Auf diese Weise werden antimikrobiell wirksame Materialien mit geringster

Umweltbelastung hergestellt.

Das erfindungsgemäße Biozid kann ferner nicht ins Grundwasser gelangen. Das Silikat als größter Bestandteil der Erdoberfläche ist nicht schädlich.

Auch bei Produktionsprozessen, die viel Wasser in Anspruch nehmen, wie z.B. die Papierindustrie, kann das erfindungsgemäße Biozid, z.B. in Pulverform, den anderen Füllstoffen während des Herstellungsprozesses zugesetzt werden und so z.B.

Kartonagen gegen Schimmelbefall und vor Zersetzung schützen.

Zugesetzt zu Dispersionsfarben, Silikonfugenmassen und anderen

Beschichtungsmaterialien erfüllt das erfindungsgemäße Biozid seine Aufgabe, die Materialien antimikrobiell auszurüsten.

Der Zusatz von Bioziden ist an und für sich bekannt, doch wiesen sie bisher den Nachteil der Wasserlöslichkeit auf. Das erfindungsgemäße Polyguanidinsilikat ist jedoch nicht wasserlöslich. Dies ist ganz entscheidender Vorteil.

Wie bereits oben beschrieben, erfolgt die Herstellung in wässriger Phase, wobei entweder das Polyguanidinsalz oder die Lösung des Silikats, insbesondere Wasserglas, vorgelegt werden und der Reaktionspartner unter intensivem Rühren langsam zugesetzt wird. Beim Zusetzen des Reaktionspartners fällt sofort das

erfindungsgemäße Polyguanidinsilikat, bei Bildung eines Kalium- oder Natrium- Salzes, welches in der wässrigen Lösung verbleibt, aus.

Als das polymere Guanidinsalz wird bevorzugt ein polymeres Bisguanidinsalz eingesetzt werden. Ein bevorzugter Vertreter der Bisguanidinsalze ist das im Stand der Technik bekannte Polyhexamethylenbiguanid (Polyhexanid).

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des im erfindungsgemäßen Arzneimittel enthaktenen Polyguanidinsilikats besteht darin, dass das polymere Guanidinsalz erhältlich ist durch Umsetzen eines Guanidinsalzes mit einem Alkylendiamin und/oder einem Oxyalkylendiamin. Derartige polymere Guanidinsalze sind z.B. aus der AT 406.163 B, der AT 408.302 B, der AT 41 1.060 B und der WO 2006/047800 AI bekannt.

Ein bevorzugt eingesetztes polymeres Guanidinsalz ist erhältlich durch eine

Umsetzung, bei welcher pro Mol Diamin (Summe aus Alkylendiamin und

Oxyalkylendiamin) 0,8 bis 1,2 Mol Guanidinsalz davon eingesetzt werden.

Eine weiters bevorzugt eingesetztes polymeres Guanidinsalz ist erhältlich durch eine Umsetzung, bei welcher das Alkylendiamin und das Oxyalkylendiamin im

Molverhältnis zwischen 4:1 und 1 :4 eingesetzt werden.

Die Aminogruppen des Alkylendiamins und/oder des Oxyalkylendiamins sind bevorzugt endständig.

Als Alkylendiamin ist ferner bevorzugt eine Verbindung der allgemeinen Formel

NH ₂ (CH ₂ ) _n NH ₂ vorgesehen, in welcher n eine ganze Zahl zwischen 2 und 10, insbesondere 6, ist. Als Oxyalkylendiamin ist ferner bevorzugt eine Verbindung der allgemeinen Formel

NH ₂ [(CH ₂ ) ₂ O)] _n (CH ₂ ) ₂ NH ₂ vorgesehen ist, in welcher n eine ganze Zahl zwischen 2 und 5, insbesondere 2, ist. Als Oxyalkylendiamin wird insbesondere Triethylenglykoldiamin (relative Molekularmasse: 148), Polyoxypropylendiamin (relative Molekularmasse: 230) und/oder Polyoxyethylendiamin (relative Molekularmasse: 600) eingesetzt.

Die mittlere Molekularmasse des eingesetzten polymeren Guanidinsalzes liegt im Bereich zwischen 500 und 3.000.

Als Salz des Guanidins ist bevorzugt ein Hydrochlorid vorgesehen.

Das im erfindungsgemäßen Arzneimittel als Wirkstoff enthaltene Polyguanidinsilikat besitzt eine ausgeprägte biozide Wirkung und kann als biozides Mittel oder als biozid wirkender Zusatzstoff verwendet werden.

Das erfindungsgemäße Biozid kann ferner nicht ins Grundwasser gelangen. Das Silikat als größter Bestandteil der Erdoberfläche ist nicht schädlich.

Wie bereits oben beschrieben, erfolgt die Herstellung in wässriger Phase, wobei entweder das Polyguanidinsalz oder die Lösung des Silikats, insbesondere Wasserglas, vorgelegt werden und der Reaktionspartner unter intensivem Rühren langsam zugesetzt wird. Beim Zusetzen des Reaktionspartners fällt sofort das

erfindungsgemäße Polyguanidinsilikat, bei Bildung eines Kalium- oder Natrium- Salzes, welches in der wässrigen Lösung verbleibt, aus.

Es hat sich gezeigt, daß das erfindungsgemäße Polyguanidinsilikat praktisch nicht wasserlöslich, fettlöslich und auch nicht alkohollöslich ist. Umso erstaunlicher ist, daß das erfindungsgemäße Polyguanidinsilikat seine biozide Wirkung trotzdem entfaltet (siehe auch unten). Dazu kommt noch, daß es bei oraler Aufnahme von Mensch und Tier gut vertragen wird.

Aufgrund all dieser Eigenschaften eignet sich das erfindungsgemäße

Polyguanidinsilikat auch als Zusatz zu Lebensmitteln, um sie besser konservieren zu können.

Ein weiteres Einsatzgebiet sind Tierfuttermittel, denen das erfindungsgemäße

Polyguanidinsilikat beigegeben werden kann. Auf diese Weise können im übrigen jene Antibiotika ersetzt werden, die in der Massentierhaltung gerne eingesetzt werden, wenngleich dieser Einsatz in immer mehr Ländern zunehmend verboten wird. Auch in der Fischaufzucht („fish farming") kann das erfindungsgemäße Polyguanidinsilikat eingesetzt werden. Da das erfindungsgemäße Polyguanidinsilikat auch in Mensch und Tier seine biozide Wirkung entfaltet, ist eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Arzneimittel, welche als Wirkstoff das erfindungsgemäße

Polyguanidinsilikat enthält. Das erfindungsgemäße Arzneimittel eignet sich

insbesondere zur Bekämpfung von Infektionen, und zwar bei Mensch und Tier.

Mit den nachfolgenden Beispielen werden bevorzugte Ausführungsformen der

Erfindung noch näher beschrieben, wobei mit dem Beispiel 1 die Herstellung eines bevorzugten Vertreters des erfindungsgemäßen Polyguanidinsilikats beschrieben wird. Die Beispiele 2 bis 6 dokumentieren die Eigenschaften des in Beispiel 1 hergestellten Polyguanidinsilikats.

Beispiel 1

Für die Herstellung eines erfindungsgemäßen Polyguanidinsilikats wurde das aus der AT 406.163 B bekannte polymere Guanidinsalz verwendet, und zwar das

Polyhexamethylenguanidin-hydrochlorid.

In einem 50 L-Faß wurden 24 1 einer wässerigen, 1%-igen Lösung von

Polyhexamethylenguanidin-hydrochlorid vorgelegt. Die Herstellung des

Polyhexamethylenguanidinhydrochlorids erfolgte gemäß dem in der AT 406.163 B beschriebenen Verfahrens.

In diese Lösung wurden unter Rühren 1,5 1 20%-ige Lösung von Natriumwasserglas mittels Tropftrichter langsam (über ca. 2h) eingetropft. Bei diesem Vorgang fiel die erfindungsgemäße Substanz als weißes Pulver aus. Dieses Pulver kann auf

verschiedenen Wegen abgetrennt werden. Falls notwendig, kann das Pulver dabei auch mit Wasser gewaschen werden, um das entstandene Natriumchlorid zu entfernen samt etwaig noch vorhandenen Ausgangssubstanzen auszuwaschen.

Das Pulver wurde abfiltriert und der Filterkuchen im Trockenschrank getrocknet.

Mittels chemischer Analyse wurde nachgewiesen, daß das Produkt praktisch kein nachweisbares Chlorid mehr aufwies, daß somit sämtliche Chlorid-Ionen des

Polyguanidinchlorids durch Silikat-Ionen ausgetauscht wurden.

Es hat sich gezeigt, dass das erfindungsgemäße Verfahren auch in technischem

Maßstab gut und ökonomisch durchführbar ist. Das nach Beispiel 1 gewonnene Pulver wurde auf orale Toxizität untersucht. Die Methode wurde die nach OECD-Richtlinie 423, 1996 und Direktive 96/54/EC, method B. l .tris angewandt. Das Pulver wurde in entionisiertem Wasser suspendiert, und einmal mittels Magenintubierung bei sechs männlichen und sechs weiblichen Ratten (Crl:CD(SD)IGS BR) verabreicht. Das Resultat: LD 50 oral von PGS als aktive Substanz ist höher als 5000 mg/kg Körpergewicht. Es wurden keine toxischen Effekte beobachtet.

Die antimikrobielle bzw. biozide Wirkung des erfindungsgemäßen Pulvers wurde getestet und in den nachfolgenden Beispielen beschrieben.

Beispiel 2

In diesem Beispiel wird die bakterizide Wirkung des in Beispiel 1 beschriebenen Pulvers (nachfolgend als„PGS" bezereichnet) in Müller Hinton Bouillon (MHB) gegen das Bakterium Escherichia coli ATCC 10536 dokumenteiert.

Material und Methode

Um die bakterizide Wirksamkeit des PGS zu testen, wurde ein Versuch zur

Feststellung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) in Reagenzgläsern mit Schraubdeckeln durchgeführt. Die jeweiligen Verdünnungsreihen wurden mit Müller Hinton Bouillon geprüft, die mit E. coli mit 10 ⁵ KBE/mL versetzt waren. Jeweils 10 ml der Flüssigkeiten wurden in Reagenzgläser (20 ml) pipettiert.

Da PGS nicht wasserlöslich ist und sich das Pulver in kurzer Zeit auf den Boden der Reagenzgläser absetzte, wurden die Reagenzgläser liegend auf einem Schüttler bei 35°C im Dunkeln über Nacht inkubiert. Auf diese Weise wurden die PGS-Partikel in Bewegung gehalten und kamen so in ausreichenden Kontakt mit den Bakterien.

Nach der ersten Auswertung wurden die Proben noch weitere 96 Stunden bei

Zimmertemperatur (20°C ± 2°C) inkubiert. Eine Trübung der transparenten

Ausgangsflüssigkeiten zeigt Bakterien Wachstum an. Die niedrigste Konzentration in der kein Bakterienwachstum stattfindet, also die Flüssigkeit transparent bleibt, gibt die minimale Hemmkonzentration an.

Die Verdünnungsreihen wurden in 3 Wiederholungen mit den Konzentrationen 0, 1, 5, 10, 50, 100μg/mL hergestellt. Gestestet wurde PGS 1 1 und Müller Hinton Bouillon ohne Zusatz als Kontrolle für das Bakterienwachstum. In Tabelle 1 sind die Ergebnisse des Versuches zusammengefasst.

Tabelle 1 : Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration von PGS gegen

1. Müller Hinton Bouillon: Die Kontrolle für das Bakterienwachstum war positiv, d.h. in allen 3 Reagenzgläsern waren die Flüssigkeiten trübe.

2. PGS: Bei einer Konzentration von PGS und 5μg/mL waren die

Flüssigkeiten in den Reagenzgläsern trübe, d.h. hier wuchsen die Bakterien. Aber bei Konzentrationen von 10, 50 und 100 μg/mL fand kein Bakterienwachstum mehr statt. Somit lag die minimale Hemmkonzentration in dieser Verdünnungsreihe bei 10 g/mL.

Der Tabelle 1 kann entnommen werden, dass das PGS eine gute bakterizide Wirkung hat, wobei die minimale Hemmkonzentration zwischen 5 und 10μg/ml liegt.

Beispiel 3

In diesem Beispiel wird die fungizide Wirkung von PGS, welches in

Kartoffeldextrose-Agar eingearbeitet ist, gegen die Schimmelpilze Aspergillus brasiliensis (niger) DSM 1957 und Penicillium funiculosum (pinophilum) DSM 1944 beschrieben.

Schimmelpilze sind in großer Vielfalt überall in der Umwelt vorhanden, von denen die Gattungen Aspergillus und Penicillium als Schimmelbildner am häufigsten in

Innenräumen auftreten. Die Pilze Aspergillus brasiliensis (niger) DSM 1957 und Penicillium pinophilum (funiculosum) DSM 1944 wurden ausgewählt, um die fungizide Wirkung des PGS gegen diese Mikroorganismen zu testen.

Material und Methode Die Pilze Aspergillus brasiliensis DSM 1957 und Penicillium pinophilum DSM 1944 wurden auf einem Kartoffeldextrose- Agar-Nährboden in Petrischalen (Durchmesser 90mm) bei 24°C im Dunkeln angezogen. Nach zwei Wochen wurden von den gut wachsenden und sporulierenden Pilzkulturen wässrige Sporenlösungen hergestellt und mittels eines Hamocytometers auf eine Sporenkonzentration von jeweils 10 ⁴

Sporen/mL eingestellt.

Die beiden Sporenlösungen von Aspergillus brasiliensis und Penicillium pinophilum wurden unvermischt oder 1 : 1 vermischt auf die Oberfllächen von frischem

Kartoffeldextrose-Agar-Nährboden in Petrischalen mit Hilfe eines Handsprühers (30ml) so verteilt, dass sich auf den Oberflächen feine Tröpfchen bildeten ohne zusammen zu laufen. Die geprüften Konzentrationen des PGS im Agar wurden auf 0, 10, 20, 40 und 80μg/ml eingestellt. Alle Versuchsglieder wurden in dreifacher Wiederholung getestet. Das Pilzwachstum wurde in wöchentlichen Abständen evaluiert.

Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 angegeben. Der Tabelle 2 kann entnommen werden, dass das PGS nach 21 Tagen in allen geprüften Konzentrationen im

Kartoffeldextrose-Agar-Nährboden eine fungizide Wirkung gegen die getesteten Pilze besaß. Es konnte kein Myzelwachstum auf der Agar-Oberfläche beobachtet werden. In der Kontrolle ohne PGS waren die Petrischalen bereits nach einer Woche mit

Pilzmyzel vollständig überwachsen. Das bedeutet, dass das PGS mit weniger als 10μ /mL diese Pilze am Wachstum hindern kann.

Tabelle 2: Antimikrobielle Wirksamkeit von PGS eingearbeitet in Kartoffeldextrose- Agar-Nährboden gegen die Schimmelpilze Aspergillus brasiliensis und P. pinophilum unvermischt oder 1 : 1 vermischt nach 21 Tagen nach Inokulation, (x = Pilze wachsen; o = Pilze wachsen nicht).

Konzentration A. brasiliensis P. pinophilum A. brasiliensis +

^g PGS pro mL) P. pinophilum

0 x X X

10 0 0 0

20 0 o o

40 0 0 o

80 0 0 o Beispiel 4

In diesem Beispiel wird die fungizide Wirkung von PGS in Acryl- Innendispersionsfarbe gegen die Schimmelpilze Aspergillus brasiliensis (niger) DSM 1957 und Penicillium pinophilum (funiculosum) DSM 1944 beschrieben.

Material und Methode

Sax Walith Power Acryl-Innendispersionsfarbe ist ein handelsüblicher

wasserverdünnbarer Acryldispersionslack der Firma Sax Farben AG, CH Urdorf. In die Dispersionsfarbe wurde das erfindungsgemäße Pulver mit einer Endkonzentration von 1% (w/w) gleichmäßig eingerührt. Anschließend wurde die dickflüssige Farbe und die Farbmischung mit einem Pinsel auf jeweils vier Filterpapierblättchen (5cm x 5cm) in einer gleichmäßigen Schicht aufgetragen. Diese Beschichtungen wurden 24 Stunden bei 22°C zur Austrocknung gelagert.

Die fungizide Wirksamkeit der trockenen Farboberflächen wurde mit den Testkeimen Aspergillus brasiliensis DSM 1957und Penicillium pinophilum DSM 1944 in

Anlehnung an die Standardmethode der„American Society for Testing and Materials" ASTM D 5590 (2005)„Determining the resistance of paint films and related coatings to fungal defacement by accelerated four-week agar plate assay" durchgeführt. Je stärker die Pilze wachsen, desto schwächer ist die Wirksamkeit des zu testenden Materials. Zur Evaluierung wurden die Farbproben auf ein in Petrischalen

(Durchmesser 90mm) befindliches Kartoffeldextrose-Nährmedium gelegt. Medium und Proben wurden dann mit einer Sporenlösung der beiden Testkeime beimpft.

Dazu wurden die Pilze nach Art getrennt auf einem Malzextraktagar-Nährboden in Petrischalen (Durchmesser 90mm) bei 24°C im Dunkeln angezogen. Nach zwei Wochen wurden von den gut wachsenden und sporulierenden Pilzkulturen wässrige Sporenlösungen hergestellt und mittels eines Hämocytometers auf eine

Sporenkonzentration von jeweils 10 ⁴ Sporen/mL eingestellt. Die beiden

Sporenlösungen wurden 1 : 1 vermischt und auf die Probeflächen und die nicht bedeckten Flächen des Nährmediums mit Hilfe eines Handsprühers (30mL) so verteilt, dass sich auf den Oberflächen feine Tröpfchen bildeten.

Die visuelle Bewertung des Pilzwachstums erfolgte einen Monat lang in

wöchentlichen Abständen nach folgender Skala:

0 = Kein Pilzwachstum auf den Platten 1 = <10% der Platte mit Pilzen bewachsen (Spuren)

2 = 10-30% der Platte mit Pilzen bewachsen (wenig Wachstum)

3 = > 30-60% der Platte mit Pilzen bewachsen (mittleres Wachstum)

4 = > 60-100% der Platte mit Pilzen bewachsen (starkes Wachstum)

Treten Werte von gleich oder kleiner als 1 auf, so wird die Prüfsubstanz als fungistatisch angesehen.

Die Ergebnisse der fungiziden Wirksamkeit der Farboberflächen sind in Tabelle 3 dargestellt. Das Pilzwachstum auf den Probeflächen ohne (0%) und mit PGS (1%) wurde ab der ersten Woche nach der Inokulation sichtbar. In den nachfolgenden Wochen entwickelten sich die Testpilze auf den Proben ohne PGS wesentlich stärker als auf den Proben mit PGS, was auch an den Zahlenwerten in Tabelle 3 deutlich sichtbar wurde. Die für die Pilze wachstumshemmende Wirkung des PGS hielt bis zum Versuchsende, vier Wochen nach Inokulation, an.

Die mit PGS angereicherten Proben wurden von den Testpilzen nur vom Rand her besiedelt. Das nicht mit Probeblättchen bedeckte Kartoffeldextrose-Nährmedium in den Petrischalen war ab der ersten Woche vollständig mit Pilzmyzel überwachsen.

Tabelle 3 : Bestimmung der fungiziden Wirkung von Sax Walith Power

Innendispersionsfarbe mit oder ohne PGS-Pulverzusatz auf Filterpapierblättchen (5x5cm) gegen Aspergillus brasilensis und Penicillium pinophilum in Anlehnung an ASTM international: D 5590 2005), n = 4. Gesamtdauer des Versuches = 4 Wochen.

Beispiel 5

Mit diesem Infektionsexperiment wurde die mikrobiozide Wirkung des

erfindungsgemäßen Polyguanidinsilikats bei einem Vertreter der Enterobacteriacaea, namentlich Campylobacter jejuni, bei Hühnern getestet.

Material und Methoden

Tiere und Infektion

Pathogen freie (SPF) Küken der Rasse VALO (Fa. Lohmann, Cuxhaven) wurden an der Klinik für Geflügel, Ziervögel, Reptilien und Fische, Veterinärmedizinische Universität Wien, ausgebrütet und unter SPF-Bedingungen in Isolatoren gehalten. Für die vorliegende Studie wurden 60 Tiere in vier Gruppen (ä 15 Tiere) getrennt gehalten. Zu Beginn des Versuches wurden die Tiere mittels Swiftack individuell markiert.

Die Infektion der Tiere erfolgte oral am 14. Lebenstag mit 1 x 10 ⁸ KBE/Tier. Bei dem verwendeten Bakterienisolat handelte es sich um einen an der Klinik für Geflügel, Ziervögel und Reptilien in Reinkultur vorliegenden Stamm, der auch schon in früheren Versuchen eingesetzt wurde. Das PGS wurde den Tieren in einer Gesamtkonzentration von 500mg/kg Körpergewicht mittels Kropfsonde 2x täglich verabreicht.

Die Tötung erfolgte tierschutzgerecht durch Euthanasie oder durch Genickschlag mit Ausbluten.

Gruppenzusammenstellungen und Probennahmen

Folgende Gruppenzusammenstellung der Küken erfolgte, um die Wirkung von PGS auf den Infektionserreger Campylobacter jejuni sowie den Gesundheitszustand der Tiere zu untersuchen:

Gruppe 1 : Medikation mit PGS und Infektion mit Campylobacter jejuni

Gruppe 2: Medikation mit PGS und keine Infektion mit Campylobacter jejuni

Gruppe 2: Ohne Medikation und Infektion mit Campylobacter jejuni

Gruppe 4: Ohne Medikation und keine Infektion mit Campylobacter jejuni

Bakteriologische Untersuchung von Kloakentupfern

Kloakentupfer zum Nachweis der Bakterienfreiheit wurden von allen Tieren am 14. Lebenstag entnommen. Die Entnahme von Kloakentupfern am 21. und 28. Lebenstag wurde von jeweils 5 Tieren pro Gruppe durchgeführt und diente einerseits der

Bestimmung der Bakterien- Ausscheidungsrate bei den mit C. jejuni infizierten Tieren, sowie dem Nachweis der Bakterienfreiheit bei den nicht-infizierten Tieren. Die

Untersuchungen erfolgten mit Hilfe des Bakterien-Anreicherungsverfahrens.

Ergebnisse

Allgemeinverhalten und Gesundheitsstatus der Küken

Es konnte kein signifikanter Unterschied im Allgemeinverhalten/Gesundheitsstatus zwischen den Tieren, denen PGS verabreicht wurde und jenen Tieren, die kein

Präparat erhielten (Negativkontrollgruppe) festgestellt werden.

Tabelle 4: Ergebnisse der bakteriologischen Untersuchung von Kloakentupfern auf C. jejuni mit Hilfe des Bakterien-Anreicherungsverfahrens

Bakteriologische Untersuchung von Kloakentupfern

Keiner der am 14. Lebenstag genommenen Kloakentupfern erwies sich als

Campylobacter-positiv (Tab. 4). Bei keinem Tier aus den Gruppen 2 und 4, die nicht mit C. jejuni infiziert worden sind, wurden Bakterien nachgewiesen.

Allerdings konnte ein signifikanter Unterschied in der Ausscheidungsrate zwischen den Tieren, die PGS erhalten hatten und mit C. jejuni infiziert worden sind und jenen Tieren, die kein PGS bekommen hatten und mit C. jejuni infiziert wurden, festgestellt werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass durch die Verabreichung von PGS eine C. ye/w ^' -Infektion bei Hühnern verhindert werden kann.

Literatur

EFSA (2005)

Scientific Report of the Scientific Panel on Biological Hazards on the request from the Commission related to Campylobacter in animals and foodstuffs., pp. 1-105 Annex to The EFSA Journal (2005).

EU (2003)

Richtlinie 2003/99/EG des Europäischen Parlaments und des Rates vom 17. November 2003, zur Überwachung von Zoonosen und Zoonoseeregern und zur Änderung der Entscheidung 90/424/EWG des Rates sowie zur Aufhebung der Richtlinie 92/117/EWG

Glünder, G. (1993)

Campylobacter-Infektionen beim Geflügel - Epizootologie, Bedeutung und Bekämpfungsmöglichkeiten -. Archiv f. Geflügelkunde, 57, 241-248.

Beispiel 6

Der Erfinder dieser Erfindung hat durch eine Infektion Brechdurchfall bekommen, hat dann 2 gehäufte Kaffeelöffel von PGS in Joghurt verrührt eingenommen, und bereits nach einer Stunde ist der Rückgang der Beschwerden beobachtet worden.