Polymere Gallensäure-Resorptionsinhibitoren mit gleichzeitiger Gallensäure- Adsorberwirkung

Die Erfindung betrifft Polymere mit Gallensäure-Resorptionsinhibitor- und gleichzeitiger Gallensäure-Adsorberwirkung, ein Verfahren zu deren Herstellung sowie die Verwendung dieser Polymere als Arzneimittel.

Gallensäuren bzw. deren Salze sind natürliche Detergenzien und haben eine wichtige physiologische Funktion bei der Fettverdauung und bei der Fettresorption. Als Endprodukte des Choiesterinstoffwechsels werden sie in der Leber synthetisiert, in der Gallenblase gespeichert und von dort als Bestandteil der Galle in den Darm abgegeben, wo sie ihre physiologische Wirkung entfalten. Der größte Teil (ca. 85- 90%) der sezernierten Gallensäuren (ca. 16g/Tag) wird über den enterohepatischen Kreislauf vorzugsweise im terminalen lieum wieder von der Darmwand resorbiert und in die Leber zurücktransportiert, also recycliert. Nur 10-15% der Gallensäuren werden mit den Faeces ausgeschieden. In der Leber kann über ein Regelkreissystem eine Verringerung der Gallensäuremenge durch Nachsynthese von Gallensäuren aus Cholesterin bis zu einem gewissen Grad ausgeglichen werden. Eine Verringerung des Lebercholesterinspiegels führt zur Steigerung der Aufnahme von Cholesterin aus dem Blutserum und senkt somit den Cholesterinspiegel im Blutserum. Letztlich kann also durch eine Unterbindung der Gallensäurerückresorption mittels geeigneter Inhibitoren oder Gallensäureadsorber im Darm der enterohepatische Kreislauf unterbrochen und dadurch der Serumcholesterinspiegel im Blut gesenkt werden. Ein zu hoher Serumcholesterinspiegel gilt in der Medizin als bedenklich, da er zu Atherosklerose führt und damit das Herzinfarktrisiko steigt. Daher gibt es viele Therapieansätze zur Behandlung von Hypercholesterinämie. Einer dieser Ansätze ist die Unterbrechung des enterohepatischen Kreislaufs. Mit diesem Ansatz können ferner alle Krankheiten

therapiert werden, bei denen eine Inhibierung der Gallensäurerückresorption im Dünndarm wünschenswert erscheint.

Im Stand der Technik wurden beschrieben:

a) Polymere Gallensäure-Adsorber:

Nicht resorbierbare Polymere werden seit geraumer Zeit zur Bindung von Gallensäuren therapeutisch genutzt. Insbesondere werden hierzu unlösliche, zumeist vernetzte Polymere eingesetzt, die quarternisierte Stickstoffzentren enthalten und ähnlich wie Anionenaustauscher wirken. Diese Polymere binden einen Teil der im Darm vorkommenden Gallensäureanionen über vorwiegend ionische Wechselwirkungen und transportieren sie aus dem Darm ab. Handelsprodukte dieses Typs enthalten z.B. die Wirkstoffe Cholestyramin und Colestipol. Sie werden beispielsweise zur Therapie von Hypercholesterinämie eingesetzt.

b) Gallensäure-Resorptionsinhibitoren (Rezeptorblocker):

Neben den polymeren Gallensäureadsorbern wurde auch der Wirkansatz der Gallensäure-Resorptionsinhibition verfolgt. Hier werden die

Gallensäurerezeptorstellen im terminalen lleum durch Moleküle blockiert, die analog den Gallensäuren Wechselwirkungen mit den Rezeptoren eingehen können, aber im Unterschied zu den Gallensäuren nicht resorbiert werden. Durch diese Rezeptorblockade können die Gallensäuren nicht mehr resorbiert werden und werden dann mit den Faeces ausgeschieden. Beispiele für polymere Gallensäurerezeptorblocker finden sich in EP 0 549 967. Hierin werden Gallensäurepolymere und -oligomere beschrieben, in denen Gallensäuremoleküle lateral an ein Polymerbackbone angeknüpft sind.

Die im Stand der Technik beschriebenen Verbindungen weisen folgende Nachteile auf.

a) Polymere Gallensäureadsorber:

1. Alle bisher auf dem Markt befindlichen polymeren Gallensäureadsorber haben den Nachteil der hohen Dosierung (10-30 g/Tag; empfohlene Dosis bei Cholestyramin z.B. 12 g Tag). Die hohe Tagesdosis ist bei den bisher bekannten Polymeren auf eine geringe Bindungsrate bzw. auf eine teilweise Wiederfreisetzung der adsorbierten Gallensäuren im isotonen Darmmedium zurückzuführen.

2. Geringe Compliance beim Patienten, aufgrund des fischartigen Geruchs und des unangenehmen, sandartigen Geschmacks sowie der sandigen Konsistenz des Pulvers der Adsorber (z. B. Cholestyramin). Die bisherige Darreichungsform ist problematisch, da sich das Adsorberpulver nicht in Wasser löst, sondern nur als Suspension aufgeschlämmt werden kann. Zur Compliance-Verbesserung müssen z. T. mehr als 50% geschmacks- und geruchsverbessernde Additive zugesetzt werden, so daß dadurch die Tagesdosis an Adsorbermedikament weiter erhöht wird.

3. Die bisher bekannten Adsorber wirken nicht selektiv genug und binden ebenfalls Vitamine (z. B. Vitamin K) und andere physiologisch wichtige Stoffe, so daß es zu Mangelerscheinungen (z. B. Avitaminosen) kommen kann.

4. Es fehlt eine dämpfende Wirkung auf den Cholesterinstoffwechsel der Darmbakterien.

b) Gallensäure-Resorptionsinhibitoren:

1. Bei allen bisher bekannten niedermolekularen Resorptionsinhibitoren besteht die Gefahr cytotoxischer Nebenwirkungen durch Resorption im Darm. So können Pinocytose und andere Transportmechanismen zur Resorption dieser niedermolekularen Inhibitoren nicht ausgeschlossen werden. Eine nichtsystemische Wirkung kann nicht garantiert werden.

2. Als unangenehmer Nebeneffekt kann bei den bisher bekannten Gallensäure- Resorptionsinhibitoren, wegen der durch die Rezeptorblockade verursachten Erhöhung der Gallensäurekonzentration im Darm, Diarrhö auftreten.

Aufgabenstellung der vorliegenden Erfindung:

Es war Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen nichtsystemisch wirkenden polymeren Wirkstoff zur Unterbrechung des enterohepatischen Kreislaufs herzustellen, der die oben genannten Nachteile nicht mehr besitzt.

Die Aufgabe wird gelöst indem Gallensäuremoleküle oder niedermolekulare Gallensäure-Resorptionsinhibitor-Moleküle kovalent oder über eine Spacergruppe, fest an ein Polymermolekül gebunden werden, so daß sie nicht mehr selbst resorbierbar sind, aber ihre resorptionsinhibierende Wirkung noch behalten. Auf diese Weise können die teilweise auftretenden systemischen cytotoxischen Nebenwirkungen der niedermolekularen Resorptionsinhibitoren, die durch deren eigene Resorption verursacht werden können, vermieden werden. Das Polymer seinerseits ist zu groß, um noch resorbiert werden zu können. Das Polymer enthält zusätzlich Gallensäureadsorber-Zentren, z. B. quarternisierte Stickstoff-Zentren, im Molekül. Diese verringern die durch die Rezeptorblockade erhöhte Gallensäurekonzentration im Darm, indem sie Gallensäureanionen binden und adsorbieren.

Polymere dieses Typs besitzen somit eine duale Wirkung. Sie wirken zum einen durch die kovalent fest gebundenen Rezeptorblocker-Einheiten als polymere Gallensäure-Resorptionsinhibitoren und zum zweiten als Gallensäureadsorber.

Die Erfindung betrifft daher Vinylcopolymere bestehend aus Einheiten der Formel

und deren physiologisch verträgliche Salze, worin bedeuten:

R ¹ , R ² , R ³ Wasserstoff oder CH ₃ ;

R ⁴ , R ⁵ Wasserstoff, (C _r C ₆ )-alkyl, (C _r C ₆ )-acyl; d 0,01 bis 1,00; e 0 bis 0,99; f 0 bis 0,99; wobei d + e + f gleich 1 sein muß;

L: eine Bindung, -NH-, -N(CH ₃ )-, - ⁺ NH ₂ Cr-, - ⁺ NH(CH ₃ )Cr-, - ⁺ N(CH ₃ ) ₂ Cr-, -NH-CO-, -NH-(CH ₂ ) _n -, -NH-[(CH ₂ ) _n -O-] _m -(CH ₂ ) _p -, -NH-(CH ₂ ) _n -CO-, -NH-CO-(CH ₂ ) _p -, -NH-(CH ₂ ) _n -CO-NH(CH ₂ ) _rτι -N-(CH ₃ ) ₂ ⁺ Cr-(CH ₂ ) _m -, -NH-[CH ₂ -CH(CH ₃ )-O-] _m - CH ₂ -CH(CH ₃ )-, -NH-(CH ₂ ) _m -N(CH ₃ ) ₂ ⁺ Cr-(CH ₂ ) _n -, -O-(CH ₂ ) _n -, -O-(CH ₂ ) _n -CO-, -CO-, -CO-NH-, -CO-N(CH ₃ )-,

-CO-NH-CO-, -CO-NH-(CH ₂ ) _n -, -CO-NH-[(CH ₂ ) _n -O-] _m -(CH ₂ ) _p -, -CO-NH-(CH ₂ ) _n -CO-, -CO-NH-CO-(CH ₂ ) _n -, -CO-NH-[CH ₂ -CH(CH ₃ )-O-] _m - CH ₂ -CH(CH ₃ )-, -CO-NH-( ^CH2 ) _m - ⁺ N(CH ₃ ) ₂ C|--(CH ₂ ) _n -, -CO-(CH ₂ ) _n -O-(CH ₂ ) _p -CO-,

-Ar-, -Ar-CO-, -Ar-CH ₂ -, -Ar-CH ₂ - ⁺ N(CH ₃ ) ₂ Cr-(CH ₂ ) _n -, -CO-Ar-CO-, -(C _r C ₁₂ )- alkylen-,

CH ₃

I

-NH-CH ₂ -Ar-CH ₂ -N ⁺ -(CH ₂ ) _n -,

CH ₃ Cl ^' -NH-Ar-CO-, -NH-CH ₂ -Ar-CH ₂ -, -NH-CO-Ar-CO-;

H eine Bindung, -CH ₂ -, -Ar-, -Ar-CH ₂ -,

wobei Ar bedeutet Phenylen, Naphthylen m 1 bis 18; n 1 bis 18;

P 1 bis 18;

-O-, -NH-, eine Bindung;

B -OH, -ONa, -OK, -NH ₂ , -NH-CH ₃ , -N(CH ₃ ) ₂ , -NH-CH ₂ -CH ₂ -SO ₃ Na, -NH-CH ₂ -COONa, -NH-CH ₂ -CH ₂ - ⁺ N(CH ₃ ) ₃ CI-, -O-(C ₁ -C ₁₈ )-alkyl, -NH-(C C ₆ )-alkyl, NH-(C _r C ₆ )-alkylen-OMe,

R ⁷ -OH, -O-(C _r C _e )-alkyl, -NH ₂ ;

-NH ₂ , - ⁺ NH ₃ Cr-, -NH-R ⁹ , - ⁺ NH ₂ R ⁹ Cl\ -NR ⁹ R ¹⁰ , - ⁺ NR ⁹ R ¹⁰ R ¹¹ Cl ^" , -(C _r C ₁₈ )- alkylen-NH ₂ -, -(C _r C ₁₈ )-alkylen- ⁺ NH ₃ C|--, -(C _r C ₁₈ )-alkylen-NHR ⁹ , -(C _r C ₁₈ )- alkylen-NR ⁹ R ¹⁰ , -(C _r C ₁₈ )-alkylen- ⁺ NR ⁹ R ¹⁰ R ¹¹ Cr, -NH-CO-(C _r C ₁₈ )-alkyl, -NH-CO-(C _r C ₁₂ )-alkylen-NR ⁹ R ¹⁰ , -NH-CO-(C _r C ₁₂ )-alkylen- ⁺ NR ⁹ R ¹⁰ R ¹ Cr, - COR ⁹ , -CO-OR ⁹ , -CO-NH-(C _r C ₁₈ )-alkylen- ⁺ NR ⁹ R ¹⁰ R ¹¹ Cr, -phenyl, -phenylen-(C ₀ -C ₆ )- alkylen-NH ₂ , -phenylen-(C ₀ -C ₆ )-alkylen-NH-R ⁹ , -phenylen- (C ₀ -C ₆ )-alkylen-NR ⁹ R ¹⁰ , -phenylen-( ^C0 -C ₆ )-alkylen- ⁺ NR ⁹ R ¹⁰ R ¹¹ Cr, -CO-NH- R ⁹ , -NH-(C _r C ₁₈ )-alkylen-NHR ⁹ , -NH-(C _r C ₁₈ )-alkylen-NR ⁹ R ¹⁰ , -NH-(C _r C ₁₈ )- alkylen- ⁺ NR ⁹ R ¹⁰ R ¹¹ Cl ^" , -COOH,

-O-R ⁹ , -CONH ₂ , -O-CO-R ⁹ , -CO-(C C ₁₂ )-alkyl, -O-CO-(C _r C ₁₂ )-alkylen- NR ⁹ R ¹⁰ , -O-CO-(C _r C ₁₂ )-alkylen- ⁺ NR ⁹ R ¹⁰ R ¹¹ Cl ^" ,

-C H ₂ -O H

O

II -C-0-(C ₁ -C ₁₈ )-alkylen- ⁺ N-(C ₁ -C ₁₈ -alkyl) ₃ CI ^"

O

9 10 C-0-(C C ₁₈ )-alkylen-NR R

-NH ₂ , - ⁺ NH ₃ Cr-, -NH-R ⁹ , - ⁺ NH ₂ R ⁹ Cl ^" -, -NR ⁹ R ¹⁰ , - ⁺ NR ⁹ R ¹⁰ R ¹¹ Cl ^" , -(C _r C ₁₈ )- alkylen-NH ₂ -, -(C ₁ -C ₁₈ )-alkylen- ⁺ NH ₃ Cr-, -(C _r C ₁₈ )-alkylen-NHR ⁹ , -(C _r C ₁₈ )- alkylen-NR ⁹ R ¹⁰ , -(C _r C ₁₈ )-alkylen- ⁺ NR ⁹ R ¹⁰ R ¹¹ C ^| -, -NH-CO-(C _r C ₁₈ )-alkyl, -NH-CO-(C ₁ -C ₁₂ )-alkylen-NR ⁹ R ¹⁰ , -NH-CO-(C ₁ -C ₁₂ )-alkylen- ⁺ NR ⁹ R ¹⁰ R ¹¹ Cr, - COR ⁹ , -CO-OR ⁹ , -CO-NH-(C _r C ₁₈ )-alkylen- ⁺ NR ⁹ R ¹⁰ R ¹¹ Cr, -phenyl, -phenylen-(C ₀ -C ₆ )- alkylen-NH ₂ , -phenylen-(C ₀ -C ₆ )-alkylen-NH-R ⁹ , -phenylen- (C ₀ -C ₆ )-alkylen-NR ⁹ R ¹⁰ , -phenylen-(C ₀ -C ₆ )-alkylen- ⁺ NR ⁹ R ¹⁰ R ¹¹ Cr, -CO-NH- (C C ₁₂ )alkyl, -NH-(C C ₁₈ )-alkylen-NHR ⁹ , -NH-(C _r C ₁₈ )alkylen-NR ⁹ R ¹⁰ , -NH- (C ₁ -C ₁₈ )-alkylen- ⁺ NR ⁹ R ¹⁰ R ¹¹ Cl ^" , -COOH, -O-R ⁹ , -CONH ₂ , -O-CO-R ⁹ , -CO-(C _r C ₁₂ )alkyl,

-O-CO-(C _r C ₁₂ )-alkylen-NR >9 ^a DR1 ^ι 0 ^υ , -O-CO-(C ₁ -C ₁₂ )-alkylen- ⁺ NR ^ö R ¹⁰ R ¹¹ Cl";

-C-NH-(CH ₂ ) _m -NR ⁹ R ¹⁰ O

-C-O-(C ₁ -C ₁₈ )-alkylen-N ⁺ -(C ₁ -C ₁₈ -alkyl) ₃ Cl

oder einen Vernetzer bedeutet, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

-CO-X-(C ₂ -C ₆ )-alkylen-X-CO-CR ¹ -CH ₂ -

-(0-(C ₁ -C ₃ )-alkylen) ₁ . _{1 8} -0-C H-CH ₂

-NH-(C ₁ -C ₁₂ )-alky len-NH-CH-CH ₂ - ,

-NH-CH ₂ -CH(OH)-CH ₂ -NH-CH-CH ₂ - ,

-NH-CHOH-(C ₁ -C ₁₂ )-alkylen-CHOH-NH-CH-CH ₂ -

X O, -NH-;

R ⁹ , R ⁰ (C ₁ -C ₁₈ )-alkyl-, -phenyi, -CH ₂ -phenyl; R ¹¹ H, (C _r C ₁₈ )-alkyl-phenyl, -CH ₂ -phenyl;

wobei mindestens einer der Reste L, Y und Z ein Ammoniumzentrum enthalten muß.

Bevorzugt sind Verbindungen der Formel i und deren physiologisch verträgliche Salze, worin bedeuten:

R ¹ , R ² , R ³ Wasserstoff oder CH ₃ ;

R ⁴ , R ⁵ Wasserstoff; d 0,01 bis 1 ,00; e 0 bis 0,99; f 0 bis 0,99; wobei d+e+f gleich 1 sein muß;

L -NH-, -NH-(C _r C ₁₈ )alkylen-, -NH-(-(C ₁ -C ₃ )-alkylen-O-) ₁ . ₁₈ -(C ₁ -C ₃ )-alkylen-, -CO-NH-, -CO-NH-(C C ₁₈ )-alkylen-,

H eine Bindung, -CH ₂ -;

A -O-, eine Bindung, -NH-;

B -OH, -ONa, -OCH ₃ , -NH-CH ₂ -CH ₂ -OCH ₃ ,

-NH ₂ , -NHR ⁹ -NR ⁹ R ¹⁰ , - ⁺ NR ⁹ R ¹⁰ R ^{1 1} Cr, -NH-(C ₁ -C ₁₈ )-alkylen- ⁺ NR ⁹ R ¹⁰ R ^{1 1} Cr, -CH ₂ -NH ₂ , -CH ₂ -NH-R ⁹ , -CH2-NH-(C _r C ₈ )alkylen-NR ⁹ R ¹⁰ , -CH ₂ -NH-(C ₁ -C ₁₈ )-alkylen- ⁺ NR ⁹ R ¹⁰ R ¹¹ C|- _l -NH-CO-R ⁹ ,

-CO-NH-R ^y , -CO-NH-propylen- + ⁺ N _M R _D 9 ^a R _D 1 ^ι 0 ^υ R _D 11Cr, —N

-CO-O-(C _r C ₁₈ )-alkylen-NR 9 ^b _D ι1 I0U..

-NH ₂ , -NHR ⁹ , -NR ⁹ R ¹⁰ , -NH-(C _r C ₁₈ )-alkylen- ⁺ N-(CH ₃ ) ₃ Cr, -CH ₂ -NH ₂ , -CH ₂ - NH-R ⁹ , -CH ₂ -NR ⁹ R ¹⁰ , -CH ₂ -NH-(C ₁ -C ₁₈ )-alkylen- ⁺ NR ⁹ R ¹⁰ R ^{1 1} C|-, oder einen Vernetzer, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

-NH(C ₁ -C ₁₂ )-alkylen-NH-CH-CH ₂ - ,

-CO-X-(C ₂ -C ₁₈ )-alkyien-X-CO-CR ¹ -CH ₂ -

-NH-CH ₂ -CH(OH)-CH ₂ -NH-CH-CH ₂ -;

X -O-, -NH-,

R ⁹ , R ¹⁰ , R ¹¹ (C _r C _β )alkyl-, -phenyl, -CH ₂ -phenyl, wobei mindestens einer der Reste L, Y und Z ein Ammoniumzentrum enthalten muß.

Besonders bevorzugt sind Verbindungen der Formel I und deren physiologisch verträgliche Salze, worin bedeuten:

R ¹ , R ² , R ³ Wasserstoff; R ⁴ , R ⁵ Wasserstoff; d 0,01 bis 1,00; e 0 bis 0,99; f 0 bis 0,99; wobei d+e+f gleich 1 sein muß;

L -NH-CH ₂ -CH ₂ -O-CH ₂ -CH ₂ -O-CH ₂ -CH ₂ -,

O -C-M+^-C^-äl ylen- .

-NH-(C _r C ₁₈ )-alkylen-, -CO-, -NH-,

-(C ₁ -C ₆ )-alkylen-NH-(C ₁ -C ₆ )-alkylen-;

H eine Bindung, -CH ₂ -;

A -O-, -NH-, eine Bindung;

B -OH, -ONa, -NH-CH ₂ -CH ₂ -OCH ₃ ;

Y -NH ₂ , -NHR ⁹ , -NH-(C _r C ₁₈ )alkylen- ⁺ N(CH ₃ ) ₃ Cr, -CO-NH-(C _r C ₁₀ )-alkylen- ⁺ N(CH ₃ ) ₃ Cr, -CO-NH-(C _r C ₆ )-alkylen-N(CH ₃ ), -CH ₂ -NH ₂ , -CH ₂ -NHR ⁹ ;

Z -NH ₂ , -NHR ⁹ , -CH ₂ -NH ₂ , -CH ₂ NHR ⁹ , -NH-(C _r C ₁₈ )-alkylen- ⁺ N-(CH ₃ ) ₃ Cr,

-CH ₂ -NH-(C _r C ₁₈ )alkylen- ⁺ N-(CH ₃ ) ₃ Cr, -CO-NH-Propylen- ⁺ N(CH ₃ ) ₃ Cr; wobei mindestens einer der Reste L, Y und Z ein Ammoniumzentrum enthalten muß.

Unter physiologisch verträglichen Säureadditionssalzen werden in Wasser leicht lösliche, lösliche und wenig lösliche Verbindungen gemäß der Definition im "Deutschen Arzneibuch" (9. Ausgabe 1986, Amtliche Ausgabe, Deutscher Apotheker-Verlag Stuttgart), Seite 19 verstanden. Bevorzugt sind die Hydrochloride und Sulfate der Verbindungen.

Unter einem Ammoniumzentrum wird ein positiv geladenes Stickstoffatom (quarternisiertes) verstanden.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Polymere bestehend aus Einheiten der Formel I.

Allgemeine Bescheibung der Herstellverfahren der Polymere:

Die Synthese der cholathaltigen Monomere erfolgte wie in den Beispielen beschrieben.

Methode 1 :

Anbindung eines Linkers an Cholsäure und nachfolgende polymeranaloge Umsetzung mit einem Aminogruppen enthaltenden Polymer Cholsäure wird zunächst mit Methansulfonsäurechlorid im basischen Milieu mesyliert. Die

Mesylgruppe ist eine gute Abgangsgruppe und ermöglicht den Anbau von Seitenketten, z.B. einer Triethylenglykol-Einheit, durch nucleophile Substitution. Die freie Hydroxylgruppe der Triethylenglykoleinheit wird anschließend selektiv durch Umsetzung mit Tosylchlorid aktiviert. Die so gebildete Tosyl-Abgangsgruppe ermöglicht die polymeranaloge Umsetzung mit aminogruppenhaltigen Polymeren, z.B. Polyallylamin oder Polyvinylamin. (Beispiel 1d). Der Substitutionsgrad läßt sich durch Änderung des Verhältnisses Polyamin:Cholsäurederivat einstellen.

Methode 2:

Herstellung von Cholsäureamidoethern und nachfolgende Anbindung eines Linkers und polymeranaloge Umsetzung mit aminogruppenhaltigen Polymeren

Cholsäure wird zunächst mit p-Nitrophenol in den Aktivester überführt. Durch Umsetzung mit 2-Methoxyethylamin wird dann der Amidoether erhalten (Beispiel 3b). Dieser wird wie in Methode 1 beschrieben über einen Linker an ein aminogruppenhaltiges Polymer angeknüpft.

Methode 3:

Radikalische Copolymerisation von acrylsubstituierten Cholsäurederivaten mit vinylischen Monomeren

Ein acrylsubstituiertes Cholsäurederivat wird durch radikaltische Copolymerisation mit einem vinylischen (bevorzugt acrylischen) Monomer umgesetzt (siehe Beispiel 5). Eventuell noch vorhandene Estergruppen im Cholatrest sind selektiv basisch verseifbar.

Methode 4:

Polymeranaloge Umsetzung von mesylsubstituierter Cholsäure mit aminogruppenhaltigen Polymeren

Cholsäuremesylat läßt sich direkt mit aminogruppenhaltigen Polymeren, z.B.

Polyaminen, in einer polymeranalogen Reaktion bei pH = 8-10 umsetzen. Dabei können auch substituierte Polyamine eingesetzt werden (Beispiel 6, 17).

Methode 5

Einführung einer Linkergruppe durch Umsetzung von Cholsäure mit Dibromalkanen und nachfolgende polymeranaloge Umsetzung mit aminogruppenhaltigen

Polymeren

Bei dieser Methode wird eine direkte Umsetzung von Cholsäuren mit einem Dibromalkan, z.B. Dibromhexan, in THF im basischen Milieu erreicht (Beispiele 7a, 15). Ein großer Überschuß an Dibromalkan ist dabei wichtig. Die erhaltene omega- Bromalkoxycholsäure wird anschließend in einer polymeranalogen Reaktion mit einem aminogruppenhaltigen Polymer z.B. einem Polyamin, in das erfindungsgemäße Polymer überführt (Beispiele 7b, 12, 13, 15).

Methode 6

Synthese eines Cholsäurederivats mit kationischem Zentrum in der Linkergruppe und anschließende Homo- oder Copolymerisation des erhaltenen Monomers

S^N.N-Dimethylaminopropy methacrylamid wird in einer Menschutkin-Reaktion mit einem Brom- oder Mesyl-substituierten Cholsäurederivat umgesetzt. Dabei wird die 3-Aminogruppe quaternisiert und ein gut wasserlösliches acrylatsubstituiertes Cholsäurederivat erzeugt (Beispiele 8, 9a). Dieses kann radikalisch homopolymerisiert oder mit anderen vinylischen Comonomeren copolymerisiert werden (Beispiel 9).

Methode 7:

Radikalische Copolymerisation von acrylsubstituierter Cholsäure mit Allylamin

(-hydrochlorid) oder einem anderen vinylischen polymerisierbaren Amin

Allylamin(-hydrochlorid) und andere radikalisch polymerisierbare vinylische Amine

können mit acrylsubstituierten Cholsäurederivaten direkt polymerisiert werden (Beispiel 11 , 16).

Methode 8

Polymeranaloge Michael-Addition von acrylsubstituiertem Cholat an aminogruppenhaltige Polymere

Bei dieser Reaktion wird ein acrylsubstituiertes Cholsäurederivat in alkoholischer Lösung bei pH = 9-10 in einer Michael-Addition mit einem aminogruppenhaltigen Polymer, z.B. einem Polyamin, umgesetzt.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zubereitungen die einen oder mehrere der erfindungsgemäßen Wirkstoffe und gegebenenfalls weitere Lipidsenker enthalten.

Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe eignen sich zur Anwendung als lipidsenkende Medikamente.

Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe werden z.B. als pharmazeutische Präparate, Nahrungsmittelzusätze, Formulierungs-Hilfsstoffe, Detergentien, Medikamente zur Beeinflussung des enterohepatischen Kreislaufs der Gallensäuren, Medikamente zur Beeinflussung der Lipidresorption, Medikamente zur Beeinflussung des Serumcholesterinspiegels, Medikamente zur konzentrationsabhängigen Hemmung der Gallensäureresorption im gastrointestinalen Trakt oder als Medikamente zur Prävention arteriosklerotischer Erscheinungen verwendet.

Experimenteller Teil:

Beispiel 1:

a) Beispiel 1a: Cholsäuremesylat:

1a

Zu 40.9 g (100 mmol) Cholsäure in 200 ml Pyridin wurden bei 0°C 9.2 ml (117 mmol) Methansulfonsäurechlorid innerhalb von 20 min getropft. Die Mischung wurde zunächst 15 min bei 0°C und dann 5 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Stehen über Nacht wurde die Mischung auf 1000 ml Eiswasser/200 ml konz. Schwefelsäure gegossen und noch 10 min gerührt. Der entstandene Niederschlag wurde abgesaugt und mit Wasser nachgewaschen. Anschließend wurde der Niederschlag in Methylenchlorid gelöst und mit Wasser extrahiert. Die organische Phase wurde mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das Produkt (Beispiel 1a) wurde quantitativ erhalten und ohne weitere Reinigung für die Folgestufe eingesetzt werden.

¹ H NMR: (CDCI ₃ ) δ = 0.69 ppm (s, 3H, CH ₃ ); 0.91 (s, 3H, CH ₃ ); 0.99 (d, J=6.0 Hz, CÜ ₃ CH), 0.9-2.6 (m, 24 H, aliphat. CH), 2.99 (s, 3H, CH ₃ SO ₃ ); 3.87 (br. s, 1H, CÜOH); 4.01 (br. s, 1H, CFLOH); 4.50 (m; 1 H, CHOSO ₂ ).

Beispiel 1b:

Addukt von Triethylenglycol an Cholsäure:

1a 1b

6.1 g (12.5 mmol) Beispiel 1a wurden in 25 ml (150 mmol) Triethylenglycol suspendiert und durch kurzes Erhitzen auf 100°C gelöst. Es wurden 4.0 g (100 mmol) Magnesiumoxid zugegeben und 5 h bei 100°C gerührt. Nach Stehen über Nacht wurden 100 ml Methylenchlorid zugegeben und der entstandene Niederschlag abgesaugt und mit Methylenchlorid nachgewaschen. Die organische Phase wurde mit 200 ml 2 N wäßr. Salzsäure extrahiert und anschließend eingeengt. Rohausbeute: 7.2 g. Das Rohmaterial wurde durch Chromatographie auf Kieselgel (Gradient Ethylacetat — > Ethylacetat : Methanol = 1 : 1) gereinigt. Die Produktfraktion wurde mit Methylenchlorid unter Ultraschall ausgerührt und der Niederschlag abfiltriert. Das Filtrat enthält reines Beispiel 1 b. Ausbeute nach Einengen: 1.7 g (25%) Beispiel 1b.

¹ H NMR: (CDCI ₃ ) δ = 0.69 ppm (s, 3H, CH ₃ ); 0.91 (s, 3H, CH ₃ ); 0.99 (d, J=6.0 Hz, CH ₃ CH), 0.8-2.4 (m, 24 H, aliphat. CH); 3.5-3.75 (m, 13H, O-CH ₂ -CH ₂ -O und CHR ₂ OCH ₂ ) 3.85 (br. s, 1H, CHOH); 3.97 (br. s, 1H, CIHOH).

Beispiel 1c:

1b 1c

Zu 600 mg (1.1 mmol) Beispiel 1b und 140 mg (2.5 mmol) Kaliumhydroxid-Pulver in 30 ml Dichlormethan wurden bei 0°C innerhalb von 30 min portionsweise 248 mg (1.3 mmol) Tosylchlorid, gelöst in 20 ml Dichlormethan, gegeben. Da DC-Kontrolle noch keine vollständige Umsetzung zeigte, wurden nochmals 100 mg (1.8 mmol) Kaliumhydroxid-Pulver zugesetzt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur noch 1 h gerührt. Der entstandene Niederschlag wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde eingeengt. Rohausbeute: 1.3 g. Das Rohprodukt wurde in wenig Dichlormethan gelöst und mittels Säulenchromatographie auf Kieselgel (Ethylacetat : Methanol = 9 1) gereinigt. Ausbeute: 540 mg (70%).

¹ H NMR: (CDCI ₃ ) δ = 0.68 ppm (s, 3H, CH ₃ ); 0.90 (s, 3H, CH ₃ ); 0.98 (d, J=6.0 Hz, CH_ ₃ CH), 0.6-2.5 (m, 24 H, aliphat. CH); 2.44 (s, 3H, Ts-CH ₃ ); 3.5-3.75 (m, 12H, O- Cti2-CH ₂ -0); 3.84 (br. s, 1 H, CHOH); 3.97 (br. s, 1H, CHOH); 4.15 (m, 1H, CH_R ₂ OCH ₂ ); 7.34 (d, J=9Hz,2H, Aryl-H), 7.79 J=9Hz, 2H, Aryl-H).

Beispiel 1d:

1c 1d

200 mg Polyvinylamin wurden in 20 ml Wasser gelöst und pH=10 eingestellt. Es wurden 66 mg (2 mol-%) 1c, gelöst in 20 ml Ethanol, zugegeben und wieder pH=10 eingestellt. Es wurde 6h bei 50°C gerührt, wobei der pH-Wert nach pH=8 wechselte. Der pH-Wert wurde wieder auf pH=10 gestellt und die Mischung über Nacht bei Raumtemp. stehengelassen. Das Produkt 1d wurde durch Ultrafiltration (Membran 5000Ä) mit Ethanol : Wasser = 1 : 1 gereinigt und durch Gefriertrocknung des Retentats isoliert. Ausbeute: 180 mg. ¹ H NMR-Analyse zeigte einen Substitutionsgrad am Polyvinylamin von n=1%.

¹ H NMR (D ₂ O): δ = 0.57 ppm (s, 3H, Cholat-CH ₃ ); 0.79 (br. m, 6H, Cholat-CH ₃ und CH_ ₃ CH); 1.0-1.6 (m, aliphat. Cholat-CH); 1.6-2.5 (m, CH ₂ -CHNH und aliphat. Cholat-CH); 3.3-3.5 (O-CH ₂ -CH ₂ -O); 3.5-4.0 (br. s, CHNH-CH ₂ ); 4.0-4.4 (m, CHOH und CMR ₂ OCH ₂ ).

Beispiel 2:

1c

Zu einer Lösung von 100 mg Polyvinylamin in 20 ml Ethanol wurden 0.7 ml 2 N Natronlauge gegeben und die Mischung auf 40-50°C erwärmt. Portionsweise wurden innerhalb von 6 h 496 mg Beispiel 1c zugesetzt. Der pH-Wert wurde auf pH=9 gehalten und die Mischung 3 Tage bei Raumtemp. stehengelassen. Das Produkt 2 wurde durch Ultrafiltration (Membran 5000Ä) mit Ethanol : Wasser = 1 : 1 gereinigt und durch Gefriertrocknung des Retentats isoliert. Ausbeute: 170 mg. ¹ H NMR- Analyse zeigte einen Substitutionsgrad am Polyvinylamin von n=5%.

¹ H NMR: wie Beispiel 1d.

Beispiel 3:

Beispiel 3a:

3a

20 g (49 mmol) Cholsäure wurden in 300 ml THF gelöst und 10.2 g (73 mmol) p- Nitrophenol und eine Spatelspitze p-N,N-Dimethylaminopyridin zugegeben. Die Mischung wurde auf 0°C gekühlt und dann 13.2 g (64 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 50 ml THF, zugegeben. Die Mischung wurde 30 min bei 0°C und dann 4 h bei Raumtemp. gerührt, wobei sich ein Niederschlag bildete. Dieser wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde auf die Hälfte des Volumens eingeengt und zur beginnenden Trübung mit Pentan versetzt. Es wurde noch 1 h gerührt und der entstandene Niederschlag abfiltriert. Die vereinigten Niederschläge wurden mit Toluol gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 11.5 g. Die vereinigten Filtrate wurden zur Trockne eingedampft und in 100 ml THF gelöst. Es wurde wieder bis zur beginnenden Trübung mit Pentan versetzt und noch 1 h gerührt. Der entstandene Niederschlag wurde wieder abfiltriert. Ausbeute: 4.5 g. Gesamtausbeute an Beispiel 3a: 16.0 g (62%).

¹ H NMR: (CDCI ₃ ) δ = 0.70 ppm (s, 3H, CH ₃ ); 0.90 (s, 3H, CH ₃ ); 1.06 (d, J=6.0 Hz, CH ₃ CH), 0.9-2.8 (m, 24 H, aliphat. CH); 3.47 (br. s, 1H, CHOH); 3.85 (br. s, 1H, CHOH); 3.99 (br. s, 1 H, CHOH); 7.28 (d, J=9Hz,2H, Aryl-H), 8.26 (d, J=9Hz, 2H, Aryl-H).

Beispiel 3b:

3a 3b

750 mg (10 mmol) 2-Methoxyethylamin wurden in einer Mischung aus 100 ml Ethanol und 100 ml Wasser vorgelegt und portionsweise 5.9 g (11 mmol) Beispiel 3a zugegeben, wobei der pH-Wert durch Zugabe von Natronlauge bei 10-11 gehalten wurde. Die trübe Mischung wurde 4 h bei 40-50°C gerührt und dann 3 Tage bei

Raumtemp. stehengelassen. Die Mischung wurde filtriert und das Filtrat auf ein Volumen von 50 ml eingeengt. Durch Zugabe von Salzsäure wurde der pH-Wert auf pH=1 gestellt. Die Mischung wurde zweimal mit Diethylether und dann zweimal mit Dichlormethan extrahiert. Die Etherextrakte wurden verworfen. Die vereinigten Dichlormethanphasen wurden nach Trocknen über Natriumsulfat eingedampft. Ausbeute: 4.4 g (94%) Beispiel 3b.

¹ H NMR: (CDCI ₃ ) δ = 0.68 ppm (s, 3H, CH ₃ ); 0.99 (s, 3H, CH ₃ ); 1.00 (d, J=6.0 Hz, CH ₃ CH), 0.9-2.4 (m, 24 H, aliphat. CH); 3.36 (s, 3H, CH ₃ O); 3.45 (m, 5H, CHOH und NH-CH ₂ -CH ₂ -O); 3.84 (br. s, 1 H, CHOH); 3.96 (br. s, 1 H, CHOH); 6.20 (br. s, 1 H, NH).

Beispiel 3c:

3b 3c

4.1 g (9.9 mmol) Beispiel 3b wurden in 20 ml Pyridin gelöst. Bei 0°C wurden 0.92 ml Methansulfonylchlorid zugegeben und die Mischung 30 min bei 0°C und 1 h bei Raumtemp. gerührt. Die Mischung wurde mit Eis versetzt. Dann wurden langsam 20 ml konz. Schwefelsäure eingerührt. Es wurde noch 5 min nachgerührt. Der entstandene Niederschlag wurde abfiltriert, mit Wasser nachgewaschen und dann in Dichlormethan aufgenommen. Diese Lösung wurde mit Wasser extrahiert. Die organische Phase wurde nach Trocknen über Natriumsulfat eingedampft. Rohausbeute: 4.7 g. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie über Kieselgel (Ethylacetat) gereinigt. Ausbeute: 2.9g (54%) Beispiel 3c.

¹ H NMR: (CDCI ₃ ) δ = 0.69 ppm (s, 3H, CH ₃ ); 0.91 (s, 3H, CH ₃ ); 1.00 (d, J=6.0 Hz,

CH ₃ CH), 0.9-2.4 (m, 24 H, aliphat. CH); 2.99 (s, 3H, CH ₃ SO ₃ ); 3.36 (s, 3H, CH ₃ O); 3.45 (m, 4H, NH-CH ₂ -CH ₂ -O); 3.86 (br. s, 1 H, CHOH); 3.99 (br. s, 1H, CHOH); 4.50 (br. s, 1 H, CHOSO ₂ ); 6.05 (br. s, 1 H, NH).

Beispiel 3d:

3c 3d

Zu einer Lösung von 2.9 g (5.3 mmol) Beispiel 3c und 12.0 g (80 mmol) Triethylenglycol in 5 ml Dichlormethan wurden 1 ml Triethylamin gegeben. Das Methylenchlorid wurde abdestilliert und die Mischung anschließend auf 100°C erhitzt. Es wurden 2 ml Triethylamin zugesetzt und 5 h bei 100°C gerührt. Dann wurden abermals 1 ml Triethylamin zugesetzt und weitere 8 h bei 100°C gerührt. Die Mischung wurde 1 Woche bei Raumtemp. stehengelassen und dann in Dichlormethan gelöst. Die Lösung wurde in 50 ml Eiswasser / konz. Schwefelsäure (1 : 1) gegossen. Diese Mischung wurde 3 mal mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Rohausbeute: 2.5 g. Das Rohmaterial wurde durch Chromatographie auf Kieselgel (Gradient Ethylacetat — > Ethylacetat : Methanol = 9 : 1) gereinigt. Ausbeute: 0.9 g (30%) Beispiel 3d.

¹ H NMR: (CD ₃ OD) δ = 0.70 ppm (s, 3H, CH ₃ ); 0.91 (s, 3H, CH ₃ ); 1.02 (d, J=6.0 Hz, CH ₃ CH), 0.8-2.5 (m, 24 H, aliphat. CH); 3.25-3.35 (m, 2H, NH-CH _.2 -CH ₂ -O); 3.34 (s, 3H, CH ₃ O); 3.41-3.46 (m, 2H, NH-CH ₂ -CH ₂ -O); 3.50-3.67 (m, 13H, O-CH ₂ -CH ₂ -O und CHR ₂ OCH ₂ ); 3.79 (br. s, 1H, CHOH); 3.95 (br. s, 1H, CHOH).

Beispiel 3e:

3d 3e

900 mg (1.5 mmol) Beispiel 1d wurden in 30 ml Dichlormethan gelöst. Bei 0°C wurden zu dieser Lösung 343 mg (1.8 mmol) p-Toluolsulfonylchlorid und 140 mg (2.5 mmol) Kaliumhydroxid-Pulver gegeben. Die Mischung wurde unter Rühren auf Raumtemp. erwärmt. Nach 30 min Rühren bei Raumtemp. wurden nochmals 100 mg (1.8 mmol) Kaliumhydroxid-Pulver zugegeben und nochmals 2h gerührt. Der Niederschlag wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde eingedampft. Rohausbeute: 1.2 g. Reines Beispiel 3e konnte durch Säulenchromatographie über Kieselgel (Gradient Dichlormethan — > Dichlormethan : Methanol = 95 : 5) gewonnen. Ausbeute: 870 mg (77%) 3e.

¹ H NMR: (CDCI ₃ ) δ = 0.69 ppm (s, 3H, CH ₃ ); 0.90 (s, 3H, CH ₃ ); 0.98 (d, J=6.0 Hz, CJd ₃ CH), 1.0-2.4 (m, 24 H, aliphat. CH); 2.45 (s, 3H, Ts-CH ₃ ); 3.36 (s, 3H, CH ₃ O); 3.4-3.65 (m, 13H, O-CH ₂ -CH ₂ -O, H-Chi ₂ -Cti2-0 und CMR ₂ OCH ₂ ); 3.70 (t, J= 6Hz, 2H, Ts-O-CH ₂ -CH ₂ ); 3.84 (br. s, 1H, CHOH); 3.97 (br. s, 1H, CHOH); 4.16 (t, J= 6Hz, 2H, O-CJd ₂ -Chl ₂ ); 1 H, CHR ₂ OCH ₂ ); 7.35 (d, J=9Hz,2H, Aryl-H), 7.80 (d, J=9Hz, 2H, Aryl-H).

Beispiel 3f.

150 mg Polyvinylamin wurden in einer Mischung aus 20 ml Wasser und 20 ml Ethanol gelöst. Es wurde ein pH=10 eingestellt. Bei 40-50°C wurden 131 mg (5 mol- %) Beispiel 3e portionsweise zugegeben. Die Lösung wurde 4 h bei Raumtemp. gerührt und dann 3 h unter Rückfluß erhitzt. Nach Stehenlassen für weitere 3 Tage war immer noch Beispiel 3e nachweisbar. Die die Mischung wurde auf pH=12 gestellt und dann weitere 7h unter Rückfluß erhitzt. Nach Abkühlen wurde das polymere Produkt durch Ultrafiltration (Membran 5000Ä; Ethanol / Wasser = 1 : 1) und anschließende Gefriertrocknung isoliert. Ausbeute: 180 mg Beispiel 3f. Die ¹ H NMR-Analyse ergab einen Substitutionsgrad von ca. n= 1%.

¹ H NMR (D ₂ O): δ = 0.73 ppm (s, 3H, Cholat-CH ₃ ); 0.96 (br. m, 6H, Cholat-CH ₃ ); 0.99 (d, J= 6.0Hz, 3H, CJH ₃ CH); 1.0-2.4 (m, aliphat. Cholat-CH); 1.3-1.8 (br. m, 2H, CHNH-CH ₂ ); 2.94-3.16 (br. m, 1H, CJHNH-CH ₂ ); 3.38 (s, 3H, CH ₃ O); 3.4-3.9 (O-CH ₂ , N-CH ₂ , O-Cb); 3.91 (br. s, 1 H, CHOH); 4.08 (br. s, 1 H, CHOH).

Beispiel 4:

100 mg Polyvinylamin wurden in einer Mischung aus 20 ml Wasser und 20 ml Ethanol gelöst. Es wurde pH=10 eingestellt. Bei 40-50X wurden 350 mg (20 mol-%) Beispiel 3e portionsweise zugegeben. Die Lösung wurde 4 h bei Raumtemp. gerührt und dann 3 h unter Rückfluß erhitzt. Nach Stehenlassen für weitere 3 Tage war immer noch Beispiel 3e nachweisbar. Die die Mischung wurde auf pH=12 gestellt und dann weitere 7h unter Rückfluß erhitzt. Nach Abkühlen wurde das polymere Produkt durch Ultrafiltration (Membran 5000Ä; Ethanol / Wasser = 1 : 1) und anschließende Gefriertrocknung isoliert. Ausbeute: 170 mg Beispiel 3f. Die ¹ H NMR- Analyse ergab einen Substitutionsgrad von ca. n= 5%.

¹ H NMR: (D ₂ O) d = 0.73 ppm (s, 3H, Cholat-CH ₃ ); 0.96 (br. m, 6H, Chotat-CH ₃ ); 0.99 (d, J= 6.0Hz, 3H, Cfci ₃ CH); 1.0-2.4 (m, aliphat. Cholat-CH); 1.3-1.8 (br. m, 2H, CHNH-CH ₂ ); 2.94-3.16 (br. m, 1 H, CHNH-CH ₂ ); 3.38 (s, 3H, CH ₃ O); 3.5-3.85 (O-CH ₂ , N-CM ₂ , O-CH); 3.89 (br. s, 1H, CHOH); 4.05 (br. s, 1H, CjHOH).

Beispiel 5:

Zu einer Lösung von 344 mg Comonomer I (Synthese wie in Pat. EP 548793 beschrieben) in 2 ml Ethanol wurden 132 mg 3-Methacryloylamidopropyl- trimethylammoniumchlorid gegeben. In die Mischung wurde 45 min Stickstoff eingeleitet. Dann wurden 662 μg Trigonox 62 (t-Butylperoxydiethylacetat; AKZO Chemicals)Dibenzoylperoxid unter Stickstoffatmosphäre zugegeben. Die Mischung wurde 27h lang bei 75°C unter Luftausschluß gerührt. Da noch Edukt nachweisbar war, wurden unter Stickstoffatmosphäre 687 μg VA-044 (2,2 ^' -Azobis[2-(2 - cyanvaleriansäure)]; 75%-ige Lösung in Wasser; Wako Chemicals) zugesetzt. Die Mischung wurde 20 h bei 45-50°C gerührt. Dann wurden 5 ml 20%-ige wäßr. Natronlauge zugegeben und 18 h bei 45°C gerührt. Anschließend wurden 150 ml

Wasser zugesetzt. Durch Zugabe von verdünnter Salzsäure wurde pH=7 eingestellt. Beispiel 5 wurde dann durch Ultrafiltration (Membran 5000Ä; Methanol / Wasser = 1 : 2) isoliert.

¹ H NMR: (D ₂ O) δ= 0.73 ppm (s, 3H, Cholat-CH ₃ ); 0.96 (br. m, 6H, Cholat-CH ₃ ); 0.99 (d, J= 6.0Hz, 3H, CH ₃ CH); 1.0-2.4 (m, aliphat. Cholat-CH); 1.3-1.8 (br. m, 2H, CHNH-CH ₂ ); 2.94-3.16 (br. m, 1H, CHNH-CH ₂ ); 3.38 (s, 3H, CH ₃ O); 3.5-3.85 (O-CH ₂ , N-CH. ₂ - O-CH); 3.89 (br. s, 1H, CHOH); 4.05 (br. s, 1H, CHOH). Verhältnis: 57:43

Beispiel 6:

I : m : n = 0.84 : O.l 5 : 0.01

600 mg Trimethylammoniumdodecyl-substituiertes Polyvinylamin (Substitutionsgrad 20%) wurden in einer Mischung aus 10 ml Wasser und 10 ml Methanol gelöst. Die Mischung wurde auf 45-50°C erwärmt. Dann wurden 239 mg (10 mol-%) 3- Mesylcholsäure (Beispiel 1a) zugegeben, wobei der pH-Wert durch Zugabe von

verdünnter Natronlauge auf 8-10 gehalten wurde. Die klare Lösung wurde 15h bei 45-50°C gerührt. Das Produkt wurde durch Ultrafiltration (Membran 5000Ä) in Methanol Wasser = 1 :1 gereinigt und durch Gefriertrocknung isoliert. Ausbeute: 550 mg.

¹ H NMR: (D ₂ 0) δ = 0.8-2.2 ( ), 2.25-4.2 (m), 3.04 (s, N-CH ₃ ). Substitutionsgrad wie oben angegeben.

Beispiel 7:

Beispiel 7a:

12.3 g (30 mmol) Cholsäure wurden in 200 ml THF gelöst. Dann wurden 73.2 g (300 mmol) 1 ,6-Dibromhexan zugegeben und die Mischung unter Rückfluß erhitzt. Innerhalb von 6 h wurden portionsweise 10.2 g (180 mmol) Kaliumhydroxidpulver zugegeben. Dann wurde noch 1 h nachgerührt. Nach dem Abkühlen wurde der entstandene Niederschlag abgesaugt und mit THF nachgewaschen. Das Filtrat wurde eingeengt. Überschüssiges Dibromhexan wurde i. Vak. abdestilliert. Der zähe Rückstand wurde durch Säulenchromatographie (Ethylacetat -> Ethylacetat : Methanol = 9 : 1) gereinigt. Ausbeute: 6 g

¹ H NMR: (CDCI ₃ ) δ = 0.68 ppm (s, 3H, Cholat-CH ₃ ); 0.89 (br. m, 6H, Cholat-CH ₃ ); 0.99 (d, J= 6.0Hz, 3H, CH ₃ CH); 1.0-2.4 (m, aliphat. Cholat-CH); 1.3-1.8 (br. m, 2H,

CHNH-CH ₂ ); 2.6-2.9 (br. m, 3H); 3.42 (d, J= 6.0Hz, 2H); 3.84 (br. s, 1H, CHOH); 3.96 (br. s, 1 H, CHOH 4.06 (d, J= 6.0Hz, 2H).

MS: Cl (Ammoniak): m/z[%]= 590 (M+NH ₄ von ⁸¹ Br-lsotop, 95); 588 (M+NH ₄ von ⁷⁹ Br-lsotop, 100).

Beispiel 7b:

m : n = 0.98 : 0.02

10 g Polyallylamin-hydrochlorid wurden in 100 ml Wasser gelöst und der pH-Wert mit verd. Natronlauge auf pH=10 eingestellt. Innerhalb von 3 h wurden bei 50-60°C 3.1 g Beispiel 7a zugegeben, wobei jedesmal eine vorübergehende Trübung auftrat. Der pH wurde durch Zugabe von verd. Natronlauge auf pH= 9.5-10 gehalten. Es wurde 4 h bei 60°C nachgerührt. Das Produkt wurde durch Ultrafiltration in Methanol/Wasser = 1.1 und anschließende Gefriertrocknung gereinigt. Ausbeute: 7.4 g.

¹ H NMR: (D ₂ O) δ = 0.72 (br. s, 3H, Cholat-CH ₃ ), 0.92 (br. s, 3H, Cholat-CH ₃ ), 0.95- 2.2 (m, aliphat. CH), 2.72 (br. s, 2H, CH ₂ -NH ₂ ), 2.9-4.2 (m, CHOH, CH ₂ O u.a.). Substitutionsgrad an Cholat: 2%.

Beispiel 8:

233 mg (0.44 mmol) 3-(2-Mesyl)ethoxycholsäure wurden in 1 ml Methanol gelöst und dann 75 mg (0.44 mmol) 3-(N,N-Dimethylaminopropyl)-methacrylamid zugegeben. Nach 20 min entstand ein Niederschlag. Es wurde 14 Tage bei 50°C gerührt. Das Lösungsmittel wurde abgezogen und der Rückstand über Kieselgel 3x chromatographiert (Methanol -> Methanol / Wasser / Essigsäure = 10 : 0.5 : 0.05). Es wurden 50 mg Produkt erhalten.

¹ H NMR: (CD ₃ OD) δ = 0.71 (s, 3H, Cholat-CH ₃ ), 0.94 (s, 3H, Cholat-CH ₃ ), 1.01 (d, J= 7 Hz, 3H, Cholat-CH ₃ CH), 1.0-2.5 (m, aliphat. CH), 2.80 (s, 3H, Mesylat-Anion), 3.0-4.0 (mehrere m, CHOH, CH ₂ O u.a.), 3.16 (s, 6H, N-CH ₃ ), 5.40 (br. s, 1H, Vinyl- H), 5.74 (br. s, 1H, Vinyl-H).

MS: m/z[%]= 605 (M ⁺ ).

Beispiel 9:

Beispiel 9a:

251 mg (0.44 mmol) 3-(6-Bromhexyloxy)-cholat wurden in 2 ml Methanol gelöst und dann 75 mg (0.44 mmol) 3-(N,N-Dimethylaminopropyl)-methacrylamid zugegeben. Die Mischung wurde 6 h unter Rückfluß erhitzt und dann über Nacht stehengelassen. Das Lösungsmittel wurde abgezogen und der Rückstand über Kieselgel chromatographiert (Methanol -> Methanol / Wasser / Essigsäure = 99 : 0.5 : 0.5). Es wurden 160 mg Rohprodukt erhalten, das über einen schwach sauren Ionenaustauscher weiter gereinigt wurde. Ausbeute: 80 mg.

¹ H NMR: (CDCI ₃ ) δ= 0.67 (s, 3H, Cholat-CH ₃ ), 0 87 (s, 3H, Cholat-CH ₃ ), 0.99 (d, J= 7 Hz, 3H, Cholat-CH ₃ CH), 1.0-2.4 (m, aliphat. CH), 3.1-4.1 (mehrere m, CHOH, CH ₂ O u.a.), 3.15 (s, 6H, N-CH ₃ ), 3.86 (s), 5.35 (br. s, 1H, Vinyl-H), 5.85 (br. s, 1H,

Vinyl-H).

Beispiel 9b:

Zu einer Lösung von 55 mg (77 μmol) Beispiel 9a und 17 mg (77 μmol) Trimethylammoniumpropylmethacrylat-chlorid in 3 ml Wasser wurden 0.52 mg Radikalinitiator VA 044 (Fa. Wako) gegeben. Die Mischung wurde entgast und dann 70 h bei 45°C gerührt. Die Mischung wurde eingedampft und der Rückstand in 10 ml Wasser gelöst und durch Ultrafiltration (Membran 5000Ä) gereinigt. Nach Gefriertrocknung wurden 66 mg Beispiel 9b erhalten.

¹ H NMR: (CDCI ₃ ) δ = 0.67 (s, 3H, Cholat-CH ₃ ), 0.87 (s, 3H, Cholat-CH ₃ ), 0.99 (d, J= 7 Hz, 3H, Cholat-CH ₃ CH), 1.0-2.4 (m, aliphat. CH), 3.1-4.1 (mehrere m, CHOH, CH ₂ O u.a.), 3.15 (s, 6H, N-CH ₃ ), 3.86 (s), 5.35 (br. s, 1 H, Vinyl-H), 5.85 (br. s, 1 H, Vinyl-H).

Beispiel 9c:

Durch eine Lösung von 741 mg (1,0 mmol) Beispiel 9a in 3,5 ml Methanol wurde 30 min lang Stickstoff hindurchgeleitet. Die Lösung wurde dann auf 60°C erwärmt. Es wurden 10 mg Radikalinitiator VA 044 (Fa. Wako) zugegeben. Die Mischung wurde dann 4 h bei 60°C unter Stickstoff-Atmosphäre gerührt. Anschließend wurde sie mit Wasser verdünnt und durch Ultrafiltration (Membran 5000 A) gereinigt. Zum Austausch des Gegenions Br ^" - Cl ^" wurde anschließend 2x mit verdünnter wäßriger NaCI-Lösung und dann 2x mit Wasser nachgewaschen. Nach Gefriertrocknung wurden 456 mg erhalten.

Elementaranalyse: Berechnet: C 66,4 % H 10,4 % N 14,3 % Cl 5,3 % Gefunden: C 66,2 % H 10,5 % N 14,2 % Cl 5,2 %

Beispiel 10:

38 mg (0.35 mmol) N-(3-N,N-Dimethylaminopropyl)methacrylamid und 200 mg (0.35 mmol) Comonomer I wurden in 1.39 ml Ethanol gelöst. In die Mischung wurde 45 min lang unter Rühren Stickstoff eingeleitet. Dann wurden 0.66 mg VA 044-lnitiator zugegeben. Die Mischung wurde 27 h bei 45-50°C gerührt. Nach Abkühlen wurde das entstandene Copolymer durch Ultrafiltration in Wasser (Membran 5000A) und anschließende Gefriertrocknung isoliert. Ausbeute: 196 mg.

Beispiel 11 :

Zu einer Lösung von 80 mg (0.17 mmol) I in 3 ml Ethanol wurden bei Raumtemp. 181 mg (3.19 mmol) Allylamin gegeben. In die Mischung wurde 1 h lang Stickstoff eingeleitet. Dann wurden 1.14 mg (1 mol-%) VA 044-lnitiator zugegeben. Die Mischung wurde 15 h bei 50°C gerührt. Die Mischung wurde eingeengt und der Rückstand in 5 ml 20%-iger wäßr. Natronlauge 4 h bei 70°C gerührt. Die Lösung wurde auf pH=7 gestellt. Durch Ultrafiltration in Wasser (Membran 5000A) und anschließende Gefriertrocknung wurde das Produkt isoliert. Ausbeute: 106 mg.

Beispiel 12:

I : m : n = 0.79 : 0.20 : 0.01

Zu einer Lösung von 5.00 g (43 mmol) I in 100 ml Wasser wurden bei Raumtemp. 1.74 g Natriumhydroxid-Pulver gegeben. Dann wurde eine Lösung von 1.98 g II in 60 ml Methanol zugegeben. Die Mischung wurde 6 h bei 60°C gerührt. Die Mischung wurde mit Wasser auf ein Volumen von 2 I verdünnt. Der pH-Wert wurde auf pH=7 eingestellt. Durch Ultrafiltration in Wasser (Membran 5000Ä) und anschließende Gefriertrocknung wurde das Produkt isoliert. Ausbeute: 5.63 g.

¹ H NMR (D ₂ 0): I : m : n = 0.79 : 0.20 : 0.01

Beispiel 13:

I : : n = 0.79 : 0.20 : 0.01

Zu einer Lösung von 5.00 g (55.6 mmol) I in 100 ml Wasser wurden bei Raumtemp. 2.22 g (55.6 mmol) Natriumhydroxid-Pulver gegeben. Dann wurde eine Lösung von 2.54 g II in 75 ml Methanol zugegeben. Die Mischung wurde 8 h bei 60°C gerührt. Die Mischung wurde mit Wasser auf ein Volumen von 2 I verdünnt. Der pH-Wert wurde auf pH=7 eingestellt. Durch Ultrafiltration in Wasser (Membran 5000A) und anschließende Gefriertrocknung wurde das Produkt isoliert. Ausbeute: 5.50 g.

¹ H NMR (D ₂ O): I : m : n = 0.79 : 0.20 : 0.01

Beispiel 14:

m : n = 0.99 : 0.01

Zu einer Lösung von 107 mg (2.5 mmol) Polyvinylamin in 5 ml Ethanol wurden bei Raumtemp. 274 mg (0.50 mmol) I gegeben. Der pH-Wert der Lösung wurde auf pH= 9-10 gestellt und die Mischung 1 Woche bei Raumtemp. gerührt. Die Mischung wurde auf ein Viertel des Volumens eingeengt und mit 10 ml 10%-iger wäßriger Natronlauge versetzt. Es wurde 2 Tage bei Raumtemp. gerührt und der pH dann auf pH= 7 gestellt.

Durch Ultrafiltration in Wasser (Membran 5000A) und anschließende Gefriertrocknung wurde das Produkt isoliert. Ausbeute: 90 mg.

¹ H NMR (D ₂ O): m : n = 0.99 : 0.01

Beispiel 15:

Beispiel 15a:

4.1 g (10 mmol) Cholsäure wurden in 100 ml THF gelöst. Dann wurden 9.0 g (30 mmol) 1 ,10-Dibromdecan zugegeben und die Mischung unter Rückfluß erhitzt. Innerhalb von 5 h wurden portionsweise 3.4 g (60 mmol) Kaliumhydroxidpulver zugegeben. Dann wurde noch 1 h nachgerührt. Nach dem Abkühlen wurde der entstandene Niederschlag abgesaugt und mit THF nachgewaschen. Das Filtrat wurde eingeengt. Überschüssiges Dibromdecan wurde i. Vak. abdestilliert. Der zähe Rückstand wurde durch Säulenchromatographie (Ethylacetat) gereinigt. Ausbeute: 0.81 g

Beispiel 15b:

m : n = 0.99 : 0.01

1.5 g Polyallylamin-hydrochlorid wurden in 15 ml Wasser und 10 ml Methanol gelöst und der pH-Wert mit verd. Natronlauge auf pH=10 eingestellt. Innerhalb von 2 h wurden bei 50-60°C 0.5 g (5 mol-%) Beispiel 15a zugegeben, wobei eine vorübergehende Trübung auftrat. Der pH wurde durch Zugabe von verd. Natronlauge auf pH= 9.5-10 gehalten. Es wurde 5 h bei 60°C nachgerührt. Das Produkt wurde durch Ultrafiltration (Membran 3000 A) in Ethanol/Wasser = 1:1 und dann in Wasser und anschließende Gefriertrocknung gereinigt. Ausbeute: 0.95 g.

¹ H NMR: (D ₂ O) Substitutionsgrad an Cholat: 1%.

Beispiel 16:

Durch eine Lösung von 63 mg (0.14 mmol) 3-Acryloylcholsäuremethylester in 2 ml Ethanol wurde 30 min lang Stickstoff hindurchgeleitet. Dann wurden 250 mg (2.60 mmol) N-Vinylimidazol (Fa. Polyscience) und 8.9 mg (0.027 mmol) VA 044-lnitiator zugegeben. Die Mischung wurde unter Stickstoff auf 45-48°C erwärmt und 2 Tage bei dieser Temperatur gerührt. Es wurde eine zähe Masse erhalten. Diese wurde in 10 ml Methanol gelöst. Dann wurden 3 ml 20%-ige wäßrige Natronlauge zugegeben und die Mischung 12 h bei 50°C gerührt. Der pH-Wert wurde auf pH= 7 gestellt. Das Produkt wurde durch Ultrafiltration (Membran 5000 A) in Wasser und anschließende Gefriertrocknung isoliert. Ausbeute: 200 mg.

¹ H NMR: (D ₂ O) Substitutionsgrad an Cholat: 3%.

Beispiel 17:

m : n = 0.99 : 0.01

500 mg Polyvinylamin wurden in einer Mischung aus 10 ml Wasser und 10 ml Ethanol gelöst. Bei 40-50°C wurden portionsweise 57 mg 3-Mesyl-cholsäure zugegeben. Der pH-Wert wurde zwischen 9 und 10 gehalten. Die Mischung wurde 9 h bei 40-50°C gerührt. Dann wurden 200 ml Ethanol : Wasser = 1 : 1 zugegeben. Das Produkt wurde durch Ultrafiltration (Membran 5000 A) in Wasser und anschließende Gefriertrocknung isoliert. Ausbeute: 500 mg.

¹ H NMR: (D ₂ O) Substitutionsgrad an Cholat: 1%.

Beispiel 18:

Zu einer entgasten Lösung von 300 mg (0.63 mmol) 3-Acryloylcholsäuremethylester in 2.1 ml Ethanol wurden 139 mg (0.63 mmol) 3-Methacrylamidopropyl- trimethylammoniumchlorid und 4.1 mg (0.013 mmol) VA 044-lnitiator gegeben. Die Mischung wurde 2 Tage lang bei 45-48°C unter Stickstoff gerührt. Bei der DC- Kontrolle waren keine Monomere mehr nachweisbar. Der pH-Wert wurde auf pH= 7 gestellt und 50 ml Wasser zugegeben. Das Produkt wurde durch Ultrafiltration (Membran 5000 A) in Wasser und anschließende Gefriertrocknung isoliert. Ausbeute: 370 mg. Zu diesem Produkt wurden 10 ml THF und 1 ml 20%-ige Natronlauge gegeben. Die Mischung wurde bei 50°C erwärmt. Da keine homogene

Lösung erzielt wurde, wurde das THF im Vakuum abdestilliert. Es wurden 100 ml Wasser zugegeben und die Mischung über Nacht bei Raumtemp. gerührt. Der pH- Wert wurde auf pH= 7 gestellt. Beispiel 18 wurde dann durch Ultrafiltration (Membran 5000A; Methanol / Wasser = 1 : 1) und anschließende Gefriertrocknung isoliert.

¹ H NMR: (D ₂ O): Verhältnis: 70 : 30.

Im Rindergalle-Assay-Adsorptionstest wird die Fähigkeit des Polymers, Gallensäuren zu adsorbieren, gemessen.

Rindergalle-Assay-Adsorptionstest:

Die Proben wurden wie folgt vorbereitet:

Zunächst wird eine wäßrige Lösung hergestellt, die folgende Salze in den nachstehend angegebenen Konzentrationen enthält:

NaCI 90 mmol/l

KCI 6 mmol/l

CaCI ₂ 3 mmol/l

NaHCO ₃ 10 mmol/l

Natrium-taurocholat 1 ,38 g/l

Natrium-glycocholat 2,49 g/l

Der pH-Wert dieser Lösung wird auf pH = 7,0 ± 0,2 eingestellt.

10 ml der obigen Lösung werden entnommen und in ein Probengefäß gegeben. Dann werden 20 mg des Polymers (Beispiel 1 bis 18) zugegeben. Die Mischung wird 2 h langsam gerührt und dann Zentrifugiert (5000 U/min). Aus dem Überstand wird für die Analyse eine Probe von 30 μl entnommen und wie nachfolgend

beschrieben analysiert.

HPLC mit FLUORESZENZDETEKTION

Geräte: HPLC-Anlage der Fa. Kontron, bestehend aus drei Pumpen und

Mischkammer, Autosampier, UV-Detektor und Auswerteeinheit mit Software MT2.

Fluroeszenzdetektor von Merck-Hitachi

Da die Proben licht- und temperaturempfindlich sind, wird der

Autosampier auf ca. 5°C gekühlt.

Mobile Phase: Laufmittel A: ®Millipore-Wasser (eigene Anlage) Laufmittel B: Acetonitril/Methanol 60:30

Säule: ^ö LiChrospher 100 RP-18, 25 mm, 5 μm von Merck

Vorsäule: LiChrospher 60 RP-select B, 4 mm, 5 μm von Merck

Flußrate: 1.3 ml/min

Detektion: Excitation: 340 nm Emission: 410 nm

Gradient: 0,00 min 66 % B 7,50 min 66 % B 8,00 min 76 % B 12,50 min 76 % B 13,00 min 83 % B 25,00 min 83 % B 25,50 min 91 % B 40,00 min 91 % B

Enzymatische Bestimmung der Gesamtgallensäure

In Eppendorfgefäße werden je 900 μl des folgenden Gemisches gegeben:

6 ml Tetra-Natrium-Diphosphat-Puffer 0,1 M, pH 8,9,

2 ml NAD-Lösung (4 mg/ml Wasser),

20 ml Millipore-Wasser

Dazu werden 30 μl der Probe (Konzentration: 2 mg Polymer pro 1 ml Wasser) und 30 μl Enzymlösung pipettiert.

Enzymlösung: 3-alpha-Hydroxysteroiddehydrogenase 0,5 units/ml

Die Ansätze werden gemischt und 2 h bei Raumtemperatur inkubiert.

Anschließend Umfüllen in 1 ml-Einmalküvetten und Messung im Photometer bei 340 nm.

Ergebnisse der Enzymtests

Substanz Adsorption

Bsp. 7b 53 %

Bsp. 14 52 %

Cholestyramin 33 %

Substanz aus EP 5 % 0549 967, Beispiel 15

HPLC mit UV-DETEKTION

Geräte: HPLC-Anlage der Fa. Kontron, bestehend aus drei Pumpen und Mischkammer, Autosampier, UV-Detektor und Auswerteeinheit mit Software MT2.

Mobile Phase: Laufmittel A: Ammoniumcarbamatpuffer 0,019 M, mit

Phosphorsäure auf pH 4,0 eingestellt. Laufmittel B: Acetonitril

Säule: LiChrospher 100 RP-8, 25 mm, 5 μm von Merck

Vorsäule: LiChrospher 60 RP-select B, 4 mm, 5 μm von Merck

Flußrate: Gradient: 0,00 min 0,8 ml/min 20,00 min 0,8 ml/min 23,00 min 1,3 ml/min 51 ,00 min 1 ,3 ml/min

Detektion: 200 nm (für Präparat

Gradient: 0,00 min 32 % B

8,00 min 35 % B

17,00 min 38 % B

20,00 min 40 % B

24,00 min 40 % B

30,00 min 50 % B

45,00 min 60 % B

Bindung der Gallensäuren [%]

Chc slestyramin Beispiel 6 Beispiel 17

Taurocholat (TC) 52 57 57

Glycocholat (GC) 34 50 48

Taurodesoxycholat (TDC) 86 93 89

Glycodesoxycholat (GDC) 74 90 88

Taurochenodesoxycholat (TCDC) 100 100 100

Glycochenodesoxycholat (GCDC) 77 89 84

Der Test "in vivo perfundierter Rattendarm " untersucht die Fähigkeit der Polymere, die Gallensäurerückresorption im Bereich des lleums zu blockieren. In vivo perfundierter Rattendarm:

Die in vivo Untersuchung erfolgte wie bei F.G.J. Poelma et al. (J. Pharm. Sei. 78 (4), 285-89, 1989) beschrieben - Modifikationen des Tests sind angegeben.

In den Untersuchungen werden Taurocholat und Taurocholsäure bzw. Cholat und Cholsäure synonym verwendet.

Kanülierung des Gallengangs

Der Gallengang wird freipräpariert und ein Katheter eingebunden (PE 50, Intramedic®). An dessen Ende wurde ein Adapter zur Aufnahme von 100 μl Einmalpipettenspitzen (Brandt) angebracht. In diesen Pipetten wird die Galle gesammelt und nach bestimmten Zeitabständen in ausgewogene Eppendorf- Reaktionsgefäße gefüllt. Nach Versuchsende wird die Galle, wie auch die Mediumproben, ausgewogen und Aliquots im Szintillationszähler vermessen. Dazu werden 10 μl Probe in ein Sarstedt Probengefäß, 58 x 22 mm, pipettiert, mit 10 ml Quickszint 212 (Zinsser GmbH, Frankfurt am Main, Deutschland) versetzt und nach 30 min Abklingzeit in einem Beckman 2800 ß-Counter gezählt.

1. Die erfindungsgemäßen Verbindungen, Beispiele 1 bis 18, wurden zusammen mit 10 mM Taurocholat mit ³ H-Taurocholat oder ¹⁴ C-Taurocholat als Tracer in das Darmsegment instilliert und die Perfusionslösung mit Hilfe einer Peristaltikpumpe 2 h umgepumpt. Die Abnahme des Tracers im Darm (Medium) bzw. das Erscheinen des Tracers in der Gallenflüssigkeit (Galle) wurde mit Hilfe von Szintillationsmessungen und HPLC ermittelt. Als Kontrolle wurde 10 mM Taurocholat mit dem Tracer ohne erfindungsgemäße Verbindung instilliert und die Änderung im Darm und in der Gallenflüssigkeit ermittelt.

2. In vivo perfundierter Darm

Als Versuchstiere kommen Wistar-Ratten aus eigener Zucht (Tierhaltung Hoechst) mit durchschnittlich 230-290 g Körpergewicht zum Einsatz. Die Versuchstiere werden vor der Narkose (Urethan 1 g/kg i.p.) nicht gehungert. Nach Eintritt der

Narkose werden die Tiere auf einem temperierbaren (konstant 37 °C) OP-Tisch (Medax) fixiert, auf der Bauchseite geschoren und anschließend wird den Tieren mit einem ca. 7 cm langem Schnitt die Bauchdecke geöffnet. Sodann wird ca. 8 cm von der lleozökalklappe ein Luer-Adapter (Feinmechanik Hoechst) in den unteren Dünndarm eingebunden, dabei wird der weiterführende Dünndarm abgebunden. Nun erfolgt eine weitere Ein- und Abbindung des Dünndarms 13-14 cm zum Dünndarmanfang hin. Der Inhalt dieses Darmsegments wird mit 37°C warmer isotonischer Kochsalzlösung vorsichtig ausgespült. In dieses Segment, Endteil Jejunum-Anfang lleum, wird später die Versuchslösung instilliert.

Zuerst wird der Pumpenschlauch aus den 2 ml Instillationslösung (10 mM Taurocholat, Polymer (Beispiel 1 bis 18) in einer Konzentration von 0,1 mmol/l in 0,9 %igen phosphatgepufferter Kochsalzlösung, Tracer: 3.5 μCi [ ³ H(G)]-Taurocholsäure, NET-322, Lot 2533-081 , DuPont de Nemour GmbH, Dreieich, Deutschland, gelöst in Phosphat-gepufferter isotonischer Kochsalzlösung gefüllt (Silikon Tubing A, 0,5 mm Desaga, Heidelberg, Deutschland, Best. Nr. 132020). Danach wird der Pumpenschlauch mit zwei Luer-Adaptern an das Darmsegment angeschlossen und die Restlösung über einen Dreiweghahn (Pharmascal K 75a) und einer 2 ml- Einwegspritze (Chirana) eingefüllt. Unmittelbar danach wird die Peristaltikpumpe (LKB Multiperpex 2115) eingeschaltet, und das Medium mit 0,25 ml/min umgepumpt. In regelmäßigen Abständen wird aus einem in den Kreislauf integrierten Infusionsschlauch mittels einer Hamilton-Spritze und einer Kanüle (Termo 0,4 x 20) eine Probe für die Messung der Aktivität (Abnahme Radioaktivität im Darm = Resorptionsrate) entnommen.

Zum Nachweis der prolongierten Wirkung der oligomeren bzw. polymeren Gallensäuren wird in diesem speziellen Versuchsdesign der Abstrom (Darm) und das Anfüllen (Galle) des radioaktiven Tracers während der ersten (Inst. I) mit Inhibitor und während der zweiten Instillation (Inst. II) ohne den Inhibitor geprüft.

Cholestyramin: 25% Resorptionsinhibition

Beispiel 6: 36% Resorptionsinhibition

Beispiel 7b: 50% Resorptionsinhibition

Beispiel 15b: 60% Resorptionsinhibition

Auswertung der Tests

Der Rindergalle-Assay-Adsorptionstest zeigt, daß die erfindungsgemäßen Polymere eine deutlich größere Fähigkeit Gallensäuren zu adsorbieren besitzen wie die Substanz des Beispiels 15 aus EP 0 549 967. Die erfindungsgemäßen Polymere besitzen eine ähnlich große Fähigkeit Gallensäuren zu adsorbieren wie Cholestyramin.

Im Testsystem "In vivo perfundierter Rattendarm" zeigen die erfindungsgemäßen Polymere eine resorptionsinhibierende Wirkung von 36% bis 60%. Cholestyramin zeigt demgegenüber eine kleinere resorptionsinhibierende Wirkung von 25%. Die erfindungsgemäßen Polymere sind somit auch Cholestyramin in Ihrer Wirkung überlegen, da sie neben einer großen Fähigkeit Gallensäuren zu adsorbieren, selbst gut an den Gallensäurerezeptor gebunden werden und somit eine resorptionsinhibierende Wirkung zeigen.