CHEVAL

La présente invention est relative à une formule de vaccin permettant la vaccination des équidés, notamment des chevaux. Elle est également relative à une méthode de vaccination correspondante.

La pathologie des chevaux présente une assez grande diversité. Outre les pathologies respiratoires bien connues, telles que la rhinopneumonie et la grippe, les chevaux sont sensibles, notamment sur le continent américain, aux diverses encéphalites. Enfin, les chevaux présentent diverses autres pathologies parmi lesquelles on peut citer, notamment, le tétanos, la maladie de Lyme, l'artérite équine, sans oublier les risques d'exposition au virus de la rage.

Les conditions d'exposition des chevaux aux divers microorganismes pathogènes ont été multipliées par les déplacements de nombreux chevaux sur les distances importantes par voie de terre ou par voie aérienne, de sorte que le risque infectieux a tendance à augmenter.

Or, compte-tenu du coût élevé de ces animaux, notamment dans le cas des reproducteurs, des chevaux de selle et des chevaux de course, il est économiquement important de contrôler le plus possible les risques infectieux se traduisant par de longues indisponibilités de l'animal, voir sa perte. Il existe déjà un certain nombre de vaccins pour chevaux, dont l'efficacité est variable.

Ainsi, ont été développés, pour la rhinopneumonie équine, provoquée par les différentes souches d'herpès virus équin (EHV) , des vaccins inactivés ou de sous-unités, qui présentent cependant tous un certain nombre de limites se traduisant par des protections incomplètes et de courte durée et éventuellement des problèmes d'innocuité liés aux adjuvants utilisés. La grippe équine constitue également une pathologie importante, que l'on cherche, également à prévenir par la vaccination. Les vaccins utilisés sont des vaccins inactivés ou de sous-unités, qui présentent une certaine efficacité mais qui

ne restent pas néanmoins sans problème. En effet, il est fréquent que la protection ne soit pas complète et elle est généralement d'une durée relativement brève, nécessitant, comme pour la rhinopneumonie, des revaccinations. On peut aussi rencontrer des problèmes d'innocuité.

Des vaccins à base d'anatoxine antitétanique ont également été mis au point et présentent une efficacité indéniable.

Il existe également des vaccins contre les encéphalites, quelques encéphalites de l'Est, l'encéphalite de l'Ouest et l'encéphalite vénézuélienne, dont l'efficacité est encore mal connue.

Pour des raisons tenant d'une part à l'économie, et d'autre part à la gestion rationnelle des vaccinations équines, on a déjà proposé des formulations de vaccin multivalent pour la prévention de plusieurs de ces maladies infectieuses.

Les associations développées jusqu'à présent étaient réalisées à partir de vaccins inactivés ou de vaccins vivants et éventuellement de mélanges de tels vaccins. Leur mise en oeuvre pose des problèmes de compatibilité entre valences et de stabilité. Il faut en effet assurer à la fois la compatibilité entre les différentes valences, que ce soit au plan des différents antigènes utilisés et au plan des formulations elles-mêmes, notamment dans le cas où l'on combine à la fois des vaccins inactivés et des vaccins vivants. Il se pose également le problème de la conservation de tels vaccins combinés et aussi de leur innocuité notamment en présence d'adjuvant. Ces vaccins sont en général assez coûteux.

En outre, ces formulations n'ont pas permis d'associer trois des valences majeures, à savoir les valences grippe équine, rhinopneumonie, notamment EHV-1 et EHV-4, et tétanos.

On connaît, par exemple, les associations des valences grippes et encéphalites, ou rhinopneu ie et encéphalites.

Les demandes de brevet O-A-90 11092, O-A-93 19183, WO- A-94 21 797 et WO-A-95 20 660 ont proposé de faire usage de la technique récemment développée des vaccins polynucléotidiques.

On sait que ces vaccins utilisent un plasmide apte à exprimer dans les cellules de l'hôte l'antigène inséré dans le plasmide. Toutes les voies d'administration ont été proposées

( intrapéri onéale, intraveineuse, intramusculaire, transcutanée, intradermique, mucosale, etc.) . Différents moyens de vaccination peuvent également être utilisés, tels que ADN déposé à la surface de particules d'or et projeté de façon à pénétrer dans la peau de l'animal (Tang et al., Nature 356, 152-154, 1992) et les injecteurs par jet liquide permettant d'assurer la transfection à la fois dans la peau, le muscle, les tissus graisseux, et les tissus mammaires (Furth et al.. , Analytical Biochemistry, 205, 365-368, 1992) . Les vaccins polynucléotidiques peuvent utiliser aussi bien des ADN nus que des ADN formulés, par exemple au sein des liposomes ou de lipides cationiques.

Des vecteurs polynucléotidiques, intégrant les gènes HA ou NP, ont été essayés pour le virus de la grippe (influenza virus) chez la souris, le furet et le poulet. Aucune donnée n'est disponible chez le cheval.

Concernant le tétanos, il a été rapporté, récemment, que l'immunisation de souris par un plasmide exprimant, avec le fragment C, la région C-terminale non toxique de la toxine tétanique, induisait 1'apparition d'anticorps séro-protecteurs chez la souris.

Il n'est cependant pas possible de transposer directement les enseignements des résultats obtenus chez ces animaux de faibles longévités à celui d'autres mammifères, et notamment les mammifères de grandes tailles.

La protection des équidés et notamment des chevaux contre la pathologie infectieuse demande donc toujours à être améliorée.

L'invention se propose de fournir une formule de vaccin multivalent permettant d'assurer une vaccination des équidés, et notamment des chevaux, contre un certain nombre d'agents pathogènes.

Un autre objectif de l'invention est de fournir une telle formule de vaccin associant différentes valences tout en présentant les critères requis de compatibilité et de stabilité des valences entre elles.

Un autre objectif de l'invention est de fournir une telle formule de vaccin permettant d'associer différentes valences

dans un même véhicule.

Un autre objectif de l'invention est de fournir une telle formule de vaccin qui soit de mise en oeuvre aisée et peu coûteuse. Un autre objectif encore de l'invention est de fournir une telle formule et une méthode de vaccination des chevaux qui permette d'obtenir une protection, y compris une protection multivalente, avec un niveau élevé d'efficacité et de longue durée, et une bonne innocuité. La présente invention a donc pour objet une formule de vaccin contre des pathologies des équidés et notamment des chevaux, comprenant au moins 3 valences de vaccin polynucléotidique comprenant chacune un plasmide intégrant, de manière à l'exprimer in vivo dans les cellules, un gène d'une valence de pathogène équin, ces valences étant choisies parmi celles du groupe consistant en virus de la rhinopneumonie équine EHV, virus de la grippe équine EIV et le tétanos (Cl. tetani) , ces plasmides comprenant, pour chaque valence, un ou plusieurs des gènes choisis parmi le groupe consistant en gB et gD pour le virus de la rhinopneumonie équine, HA, NP, N pour le virus de la grippe équine et un gène codant pour tout ou partie de la sous-unité C de la toxine tétanique.

Par valence, dans la présente invention, on entend au moins un antigène assurant une protection contre le virus du pathogène considéré, la valence pouvant contenir, à titre de sous-valence, un ou plusieurs gènes naturels ou modifiés d'une ou plusieurs souches du pathogène considéré.

Par gène d'agent pathogène, on entend non seulement le gène complet, mais aussi les séquences nucléotidiques différentes, y compris fragments, conservant la capacité à induire une réponse protectrice. La notion de gène recouvre les séquences nucléotidiques équivalentes à celles décrites précisément dans les exemples, c'est-à-dire les séquences différentes mais codant pour la même protéine. Elle recouvre aussi les séquences nucléotidiques d'autres souches du pathogène considéré, assurant une protection croisée ou une protection spécifique de souche ou de groupe de souche. Elle recouvre encore les séquences nucléotidiques σui ont été

modifiées pour faciliter l'expression in vivo par l'animal hôte mais codant pour la même protéine.

Ainsi, de manière particulièrement préférée, le vaccin selon l'invention comprend dans la valence rhinopneumonie équine, au moins un antigène de la souche EHV-1 et au moins un antigène de la souche EHV-4, et de préférence le même type d'antigène.

Les quantités thérapeutiquement efficaces des valences polynucléotidiques sont contenues ou destinées à être contenues, dans un véhicule convenable pour une administration à l'animal, et de préférence pour une administration intramusculaire. De préférence, ce véhicule est un véhicule aqueux dépourvu de constituants huileux.

En ce qui concerne la valence rhinopneumonie équine, on préférera associer les gènes gB et gD, de préférence des souches EHV, notamment souches 1 et 4.

En ce qui concerne la valence grippe équine, on préfère utiliser le gène codant pour l'hémagglutinine HA ou l'association des gènes codant pour HA et NP. De préférence, on associera dans le même vaccin, les séquences HA de virus influenza, en particulier des différentes souches rencontrées sur le terrain. En revanche, NP assure une protection croisée et l'on pourra donc se contenter de la séquence d'une seule souche du virus. Pour la valence tétanos, on préférera la sous-unité C éventuellement modifiée par mutation ou délétion.

L'association de gènes codant pour plusieurs antigènes d'une même valence, ou d'une même souche dans une valence, peut être réalisée par le mélange de plasmide exprimant un seul antigène, ou au contraire en insérant plusieurs gènes dans un même plasmide.

La combinaison des différentes valences du vaccin selon l'invention peut être effectuée, de préférence, par mélange de plasmides polynucléotidiques exprimant un ou des antigènes de chaque valence, mais on peut également prévoir de faire exprimer plusieurs antigènes de plusieurs valences par un même vecteur de type plasmidique.

Dans une forme perfectionnée de l'invention, la

formulation peut encore comporter une ou plusieurs autres valences d'autres pathogènes des équins, et notamment des valences des virus de l'encéphalite de l'Est EEV, de l'encéphalite de l'Ouest WEV et de l'encéphalite vénézuélienne VEV, de préférence les trois simultanément.

Parmi ces valences peuvent également figurer avantageusement la valence de la maladie de Lyme, B. burgdorferi, de l'artérite équine (EAV) et de la rage.

Parmi les gènes des encéphalites précitées, on utilise les gènes des antigènes C et E2, et de préférence le gène E2 seul ou l'association des deux gènes E2 et C.

Dans la valence de la maladie de Lyme, on choisit parmi les gènes OspA, OspB et plOO, de préférence OspA.

Pour l'artérite équine, on retiendra les gènes E, M et N, seuls ou associés.

Pour la rage, on retiendra le gène G.

Une formule de vaccin selon l'invention pourra se présenter sous un volume de doses compris entre 0,1 et 10 ml et en particulier entre 1 et 5 ml. La dose sera généralement comprise entre 10 ng et 1 mg, notamment entre 100 ng et 500 μg, et préférentiellement entre 1 μg et 250 μg par type de plasmide.

On utilisera de préférence des plasmides nus, simplement placés dans le véhicule de vaccination qui sera en général de l'eau physiologique (NaCl 0,9 %) , de l'eau ultrapure, du tampon

TE, etc. On peut bien entendu utiliser toutes les formes de vaccin polynucléotidique décrites dans l'art antérieur.

Chaque plasmide comprend un promoteur apte à assurer l'expression du gène inséré sous sa dépendance dans les cellules hôtes. Il s'agira, en général, d'un promoteur eucaryote fort, et en particulier d'un promoteur précoce du cytomégalovirus CMV-IE, d'origine humaine ou murine, ou encore éventuellement d'une autre origine telle que rat, porc, cobaye. De manière plus générale, le promoteur pourra être soit d'origine virale, soit d'origine cellulaire. Comme protecteur viral autre que CMV-IE, on peut citer le promoteur précoce ou tardif du virus SV 40 ou le promoteur LTR du virus du Sarcome de Rous . Il peut aussi s'agir d'un promoteur du virus dont

provient le gène, par exemple le promoteur propre au gène.

Comme promoteur cellulaire, on peut citer le promoteur d'un gène du cytosquelette, tel que par exemple le promoteur de la desmine (Pol ont et al., Journal of Submicroscopic Cytology and Pathology, 1990, 22, 117-122 ; et Zhenlin et al., Gène, 1989, 78, 243-254), ou encore le promoteur de l'actine.

Lorsque plusieurs gènes sont présent dans un même plasmide, ceux-ci peuvent être présentés dans la même unité de transcription ou dans deux unités différentes. L'invention a encore pour objet des formules de vaccin monovalent comprenant un ou plusieurs plasmides codant pour un ou plusieurs gènes de l'un des agents pathogènes précités, et notamment de la rhinopneumonie ou de la maladie de Lyme, de l'artérite équine, de l'encéphalite de l'Est, de l'encéphalite de l'Ouest et de l'encéphalite vénézuélienne, les gènes étant ceux décrits plus haut. Ces formules peuvent comprendre les caractéristiques énoncées plus haut en ce qui concerne le choix des gènes d'un même pathogène et leur combinaison, la composition des plasmides, les volumes de doses, les dosages, etc.

La présente invention a également pour objet une méthode de vaccination des équidés et notamment des chevaux contre des maladies infectieuses, comprenant l'administration d'une dose efficace d'une formule de vaccin, multivalente ou monovalente, telle que décrite plus haut.

Cette méthode de vaccination comprend l'administration d'une ou de plusieurs doses de la formule de vaccin.

Les formules de vaccin selon l'invention pourront être administrées par les différents voies d'administration proposées dans le cadre général de la vaccination polynucleotidique et au moyen des techniques d'administration connues. On préférera cependant nettement la voie intramusculaire.

On peut aussi vacciner par voie intradermique à l'aide d'un injecteur par jet liquide, de préférence par jets multiples, et en particulier un injecteur utilisant une tête d'injection munie de plusieurs trous ou buses, notamment comprenant de 5 à 6 trous ou buses, tel que l'appareil Pigjet

fabriqué et distribué par la société Endoscoptic, Laons, France.

Le volume de dose pour un tel appareil sera réduit de préférence entre 0,1 et 0,9 ml, en particulier entre 0,2 et 0,6 ml et avantageusement entre 0,4 et 0,5 ml, le volume pouvant être administré en une ou plusieurs, de préférence 2 _, applications.

Les vaccins monovalents précités peuvent être notamment utilisés pour la préparation du vaccin polyvalent selon l'invention.

Les formules de vaccin monovalent peuvent aussi être utilisées associées à un vaccin d'un autre type (entier vivant ou inactivé, recombinant, sous-unité) contre une autre pathologie ou comme rappel d'un vaccin comme décrit ci-après. La présente invention a en effet encore pour objet l'utilisation d'un ou de plusieurs plasmides selon l'invention pour la fabrication d'un vaccin destiné à vacciner des chevaux primo-vaccinés au moyen d'un premier vaccin classique (monovalent ou multi-valent) du type de ceux de l'art antérieur, choisi notamment dans le groupe consistant en vaccin entier vivant, vaccin entier inactivé, vaccin de sous-unité, vaccin recombinant, ce premier vaccin présentant (c'est-à-dire contenant ou pouvant exprimer) le ou les antigène(s) codé(s) par le ou les plasmide(s) ou antigène(s) assurant une protection croisée.

De manière remarquable, le vaccin polynucleotidique a un effet de rappel puissant se traduisant par une amplification de la réponse immunitaire et l'instauration d'une immunité de longue durée. De manière générale, les vaccins de primo-vaccination pourront être choisis parmi les vaccins commerciaux disponibles auprès des différents producteurs de vaccins vétérinaires.

Dans une forme de mise en oeuvre préférée du procédé selon l'invention, on administre dans un premier temps, à l'animal, une dose efficace du vaccin de type classique, notamment inactivé, vivant, atténué ou recombinant, ou encore un vaccin de sous-unité de façon à assurer une primo-vaccination, et, après un délai de préférence de 2 à 4 semaines, on assure

l'administration du vaccin polyvalent ou monovalent selon 1 ' invention.

L'invention a aussi pour objet un kit de vaccination regroupant une formule de vaccin selon l'invention et un vaccin de primo-vaccination tel que décrit ci-dessus. Elle a aussi trait a une formule de vaccin selon l'invention accompagnée d'une notice indiquant l'usage de cette formule comme rappel d'une primo-vaccination telle que décrite ci-avant.

L' invention concerne aussi la méthode de préparation des formules de vaccin, a savoir la préparation des valences et leurs mélanges, telle qu'elle ressort de cette description.

L'invention va être maintenant décrite plus en détail a l'aide de modes de réalisation de l'invention pris en référence aux dessins .

Liste des figures

Figure N° 1 Plasmide pVR1012

Figure N° 2 Plasmide pAB042

Figure N° 3 Plasmide pAB031

Figure N° 4 Plasmide pAB013

Figure N° 5 Plasmide pAB032

Figure N° 6 Plasmide pAB043

Figure N° 7 Plasmide pAB033

Figure N° 8 Séquence du gène HA Grippe équine souche Fontainebleau

Figure N° 9 Plasmide pAB099

Figure N° 10 : Plasmide pAB085

Figure N° 11 Plasmide pAB084

Figure N° 12 Plasmide pAB070

Figure N° 13 Plasmide pAB017

Figure N° 14 Plasmide pAB094

Figure N° 15 Plasmide pAB093

Figure N° 16 Plasmide pAB096

Figure N° 17 Plasmide pAB095

Figure N° 18 Plasmide pAB098

Figure N° 19 Plasmide pAB097

Figure N° 2C Plasmide pAB041

Liste des séquences SEQ ID N°

SEQ ID N° 1 Oligonucleotide AB013 SEQ ID N° 2 Oligonucleotide AB014 SEQ ID N° 3 Oligonucleotide AB071 SEQ ID N° 4 Oligonucleotide AB074 SEQ ID N° 5 Oligonucleotide AB030 SEQ ID N° 6 Oligonucleotide AB031 SEQ ID N° 7 Oligonucleotide AB075

SEQ ID N° 8 : Oligonucleotide AB076 SEQ ID N° 9 : Oligonucleotide AB015 SEQ ID N° 10 Oligonucleotide AB016 SEQ ID N° 11 Oligonucleotide AB077 SEQ ID N° 12 Oligonucleotide AB078 SEQ ID N° 13 Oligonucleotide AB186 SEQ ID N° 14 Oligonucleotide AB187 SEQ ID N° 15 Séquence du gène HA Grippe équine (souche Fontainebleau) SEQ ID N° 16 Oligonucleotide AB156 SEQ ID N° 17 Oligonucleotide AB159 SEQ ID N° 18 Oligonucleotide AB157 SEQ ID N° 19 Oligonucleotide AB128 SEQ ID N° 20 Oligonucleotide AB129 SEQ ID N° 21 Oligonucleotide AB038 SEQ ID N° 22 Oligonucleotide AB039 SEQ ID N° 23 Oligonucleotide AB176 SEQ ID N° 24 Oligonucleotide AB177 SEQ ID N° 25 Oligonucleotide AB174 SEQ ID N° 26 Oligonucleotide AB175 SEQ ID N° 27 Oligonucleotide AB180 SEQ ID N° 28 Oligonucleotide AB181 SEQ ID N° 29 Oligonucleotide AB178 SEQ ID N° 30 Oligonucleotide AB179 SEQ ID N° 31 Oligonucleotide AB184 SEQ ID N° 32 Oligonucleotide AB185 SEQ ID N° 33 Oligonucleotide AB182 SEQ ID N° 34 Oligonucleotide AB183 SEQ ID N° 35 Oligonucleotide AB011 SEQ ID N° 36 Oligonucleotide AB012

EXEMPLES

Exemple 1 : Culture des virus

Les virus sont cultivés sur le système cellulaire approprié jusqu'à obtention d'un effet cytopathique. Les systèmes cellulaires à utiliser pour chaque virus sont bien connus de l'homme du métier. Brièvement, des cellules sensibles au virus utilisé, cultivées en milieu minimum essentiel de Eagle (milieu "MEM) ou un autre milieu approprié, sont inoculées avec la souche virale étudiée en utilisant une multiplicité d'infection de 1 . Les cellules infectées sont alors incubées à 37°C pendant le temps nécessaire à l'apparition d'un effet cytopathique complet (en moyenne 36 heures).

Exemple 2 : Culture des bactéries:

Tétanos Les bactéries sont cultivées dans les milieux appropriés et selon les conditions bien connues de l'homme de l'art de manière à obtenir une biomasse bactérienne suffisante pour l'extraction du matériel génétique. Cette extraction se fait selon les techniques usuelles décrites par Sambrook J. er al. (Mo/ecu/ar Cloning: A Laboratory Manual. 2 ⁿ Edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York. 1 989). Les souches de Borrelia burgdorfe sont cultivées dans les milieux appropriés et selon les conditions bien connues de l'homme de l'art. Ces conditions et milieux sont en particulier décrits par A. Barbour (J. Biol. Med. 1984. 57. 71 - 75). L'extraction de l'ADN bactérien a été réalisé selon les conditions décrites par W. Simpson et al. (Infect. Immun. 1 990. 58. 847-853) . Les techniques usuelles décrites par J. Sambrook et al. {Mo/ecu/ar Cloning: A Laboratory Manual. 2 ^nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York. 1 989) peuvent également être utilisées.

Exemple 3 : Extraction des ADNs génomiques viraux: Après culture, le surnageant et les cellules lysées sont récoltées et la totalité de la suspension virale est centrifugée à 1000 g pendant 10 minutes à + 4°C pour éliminer les débris cellulaires. Les particules virales sont alors récoltées par

ultracentrifugation à 400000 g pendant 1 heure à + 4°C. Le culot est repris dans un volume minimum de tampon (Tris 1 0 mM, EDTA 1 mM). Cette suspension virale concentrée est traitée par la protéinase K (100 //g/ml final) en présence de sodium dodecyl sulfate (SDS) (0,5% final) pendant 2 heures à 37°C. L'ADN viral est ensuite extrait avec un mélange de phénol/chloroforme, puis précipité avec 2 volumes d'éthanol absolu. Après une nuit à - 20°C, l'ADN est centrifugé à 10000 g pendant 1 5 minutes à + 4°C. Le culot d'ADN est séché, puis repris dans un volume minimum d'eau ultrapure stérile. Il peut alors être digéré par des enzymes de restriction.

Exemple 4 : Isolement des ARNs génomiques viraux

Les virus à ARN ont été purifiés selon les techniques bien connues de l'homme du métier. L'ARN viral génomique de chaque virus a été ensuite isolé en _, utilisant la technique d'extraction "thiocyanate de guanidiurπ/phénol- chloroforme" décrite par P. Chomczynski et N. Sacchi (Anal. Biochem. 1987. 162. 1 56- 1 59) .

Exemple 5 : Techniques de biologie moiécuiaire

Toutes les constructions de plasmides ont été réalisées en utilisant les techniques standards de biologie moléculaire décrites par J. Sambrook et al. {Mo/ecu/ar Cloning: A Laboratory Manual. 2 ^nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York. 1 989). Tous les fragments de restriction utilisés pour la présente invention ont été isolés en utilisant le kit "Geneclean" (BIO 101 Inc. La Jolla, CA).

Exemple 6 : Technique de RT-PCR

Des oligonucléotides spécifiques (comportant à leurs extrémités 5' des sites de restriction pour faciliter le clonage des fragments amplifiés) ont été synthétisés de telle façon qu'ils couvrent entièrement les régions codantes des gènes devant être amplifiés (voir exemples spécifiques). La réaction de transcription inverse (RT) et l'amplification en chaîne par polymérase (PCR) ont été effectuées selon les techniques standards (Sambrook J. et a/. 1989) . Chaque

réaction de RT-PCR a été faite avec un couple d'amplimers spécifiques et en prenant comme matrice l'ARN génomique viral extrait. L'ADN complémentaire amplifié a été extrait au phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25:24: 1 ) avant d'être digéré par les enzymes de restriction.

Exemple 7 : plasmide pVR1012

Le plasmide pVR1 01 2 (Figure N ° 1 ) a été obtenu auprès de Vical Inc. San Diego, CA, USA. Sa construction a été décrite dans J. Hartikka et al. (Human Gène Therapy. 1 996. 7. 1 205- 1 21 7).

Exemple 8 : Construction du plasmide pAB042 (gène EHV-1 gB)

Une réaction de PCR a été réalisée avec l'ADN génomique de l'herpèsvirus équin de type 1 (EHV-1 ) (Souche Kentucky D) (P. G o et a/. J. Virol. 1 990. 64. . 2399-2406) et avec les oligonucléotides suivants: AB01 3 (32 mer) (SEQ ID N° 1 )

5'AAAACTGCAGCCGTCATGTCCTCTGGTTGCCG 3'

AB014 (39 mer) (SEQ ID N° 2)

5'ATAAGAAGCGGCCGCTAAACATGTTTAAACCATTTTTTC 3' pour isoler le gène codant pour la glycoprotéine gB (EHV- 1 gB) sous la forme d'un fragment Pstl-Notl. Après purification, le produit de PCR de 2981 pb a été digéré par Pst\ et Not\ pour isoler un fragment Pstl-Notl de 2959 pb. Ce fragment a été ligaturé avec le vecteur pVR1012 (exemple 7), préalablement digéré avec Pst\ et Not\, pour donner le plasmide pAB042 (7841 pb) (Figure N° 2) .

Exemple 9 : Construction du plasmide pAB031 (gène EHV-4 gB) Une réaction de PCR a été réalisée avec l'ADN génomique de l'herpèsvirus équin de type 4 (EHV-4) (Souche 1 942) (M. Riggio et al. J. Virol. 1 989. 63. 1 1 23- 1 1 33) et avec les oligonucléotides suivants: AB071 (38 mer) (SEQ ID N ° 3)

5'AAAACTGCAGACATGTCCACTTGTTGCCGTGCTATTTG 3' AB074 (36 mer) (SEQ ID N ° 4)

5'CTAGTCTAGATTAAACCATTTTTTCGCTTTCCATGG 3' pour amplifier un fragment de 2949 pb contenant le gène codant pour la glycoprotéine gB du EHV-4 sous la forme d'un fragment Pstl-Xbal. Après purification, le produit de PCR a été digéré par Pst\ et Xba\ pour donner un fragment Pstl-Xbal de 2931 pb.

Ce fragment a été ligaturé avec le vecteur pVR101 2 (exemple 7), préalablement digéré avec Pst\ et Xba\, pour donner le plasmide pAB031 (7806 pb) (Figure N ° 3).

Exemple 10 : Construction du plasmide pAB013 (gène EHV-1 gD)

Une réaction de PCR a été réalisée avec l'ADN génomique de l'herpèsvirus équin de type 1 (EHV- 1 ) (Souche Kentucky D) (J.C. Audonnet et al. J. Gen. Virol. 1 990. 71 . 2969-2978) et avec les oligonucléotides suivants: AB030 (32 mer) (SEQ ID N° 5) 5'AAAACTGCAGCATGTCTACCTTCAAGCTTATG 3' AB031 (37 mer) (SEQ ID N ° 6)

5'CGCGGATCCTTACGGAAGCTGGGTATATTTAACATCC 3' pour isoler le gène codant pour la glycoprotéine gD (EHV-1 gD) sous la forme d'un fragment Pstl-BamHI. Après purification, le produit de PCR de 1 228 pb a été digéré par P$t\ et Bam \ pour isoler un fragment Pstl-BamHI de 1 21 1 pb. Ce fragment a été ligaturé avec le vecteur pVR 101 2 (exemple 7), préalablement digéré avec Pst\ et Bam \, pour donner le plasmide pAB01 3 (6070 pb) (Figure N° 4).

Exemple 1 1 : Construction du plasmide pAB032 (gène EHV-4 gD)

Une réaction de PCR a été réalisée avec l'ADN génomique de l'herpèsvirus équin de type 4 (EHV-4) (A. Cullinane et al. J. Gen. Virol. 1 993. 74. 1 959- 1 964) et avec les oligonucléotides suivants: AB075 (33 mer) (SEQ ID N° 7) 5'AAAACTGCAGATATGTCTACCTTCAAGCCTATG 3' AB076 (33 mer) (SEQ ID N° 8) 5'CGCGGATCCTTACGGAAGCTGAGTATATTTGAC 3'

pour isoler le gène codant pour la glycoprotéine gD du EHV-4 (EHV-4 gD) sous la forme d'un fragment Pstl-BamHI. Après purification le produit de PCR de 1 230 pb a été digéré par Pst\ et BamHl pour isoler un fragment Pstl-BamHI de 1 21 2 pb. Ce fragment a été ligaturé avec le vecteur pVR101 2 (exemple 7), préalablement digéré avec Pst\ et BamH\, pour donner le plasmide pAB032 (6071 pb) (Figure N ° 5).

Exemple 12 : Construction du plasmide pAB043 (gène grippe équine HA souche Prague) Une réaction de RT-PCR selon la technique décrite dans l'exemple 6 a été réalisée avec l'ARN génomique du virus de la grippe équine (Equine Influenza Virus ou EIV) (Souche H7N7 Prague) (J. Me Cauley. N° d'accès séquence sur Genbank = X62552), préparé selon la technique décrite dans l'exemple 4, et. avec les oligonucléotides suivants: AB01 5 (36 mer) (SEQ ID N° 9)

5'ACGCGTCGACATGAACACTCAAATTCTAATATTAGC 3'

AB01 6 (35 mer) (SEQ ID N° 10)

5'CGCGGATCCCTTATATACAAATAGTGCACCGCATG 3' pour isoler le gène codant pour la glycoprotéine HA du virus de la grippe équine sous la forme d'un fragment Sall-BamHI. Après purification, le produit de RT- PCR de 1 733 pb a été digéré par Sa/1 et BamH\ pour isoler un fragment Sall- BamHI de 1720 pb. Ce fragment a été ligaturé avec le vecteur pVR101 2 (exemple 7), préalablement digéré avec Sal\ et Bam \, pour donner le plasmide PAB043 (6588 pb) (Figure N° 6).

Exemple 13 : Construction du plasmide pAB033 (gène Grippe équine HA souche Suffolk)

Une réaction de RT-PCR selon la technique de l'exemple 6 a été réalisée avec l'ARN génomique du virus de la grippe équine (EIV) (Souche Suffolk) (M. Binns. N ° d'accès séquence sur Genbank = X68437), préparé selon la technique de l'exemple 4, et avec les oligonucléotides suivants: AB077 (33 mer) (SEQ ID N ° 1 1 )

5'ACGCGTCGACGCATGAAGACAACCATTATTTTG 3' AB078 (34 mer) (SEQ ID N ° 1 2)

5'CGCGGATCCTCAAATGCAAATGTTGCATCTGATG 3' pour isoler le gène codant pour la glycoprotéine HA du virus de la grippe équine sous la forme d'un fragment Sall-BamHI. Après purification, le produit de RT- PCR de 1 729 pb a été digéré par Sa/\ et Bam \ pour isoler un fragment Sall- BamHI de 1 71 7 pb. Ce fragment a été ligaturé avec le vecteur pVR101 2 (exemple 7), préalablement digéré avec Sa/I et Bam \, pour donner le plasmide pAB033 (6584 pb) (Figure N° 7).

Exemple 14 : Construction du plasmide pAB099 (gène Grippe équine HA souche Fontainebleau)

Une réaction de RT-PCR selon l'exemple 6 a été réalisée avec l'ARN génomique. du virus de la grippe équine (EIV) (Souche Fontainebleau), préparé selon l'exemple 4, et avec les oligonucléotides suivants: AB186 (32 mer) (SEQ ID N° 1 3) 5'TTTGCGGCCGCATGAAGACAACCATTATTTTG 3' AB187 (35 mer) (SEQ ID N ° 14) 5'TTTGCGGCCGCTTACTCAAATGCAAATGTTGCATC 3' pour isoler le gène codant pour la glycoprotéine HA du virus de la grippe équine (souche Fontainebleau) (Figure N° 8 et SEQ ID N° 1 5) sous la forme d'un fragment Notl-Notl. Après purification le produit de RT-PCR de 1 724 pb a été digéré par Not\ pour isoler un fragment Notl-Notl de 1710 pb. Ce fragment a été ligaturé avec le vecteur pVR1012 (exemple 7), préalablement digéré avec Not\, pour donner le plasmide pAB099 (6625 pb) qui contient le gène HA (grippe équine souche Fontainebleau) dans la bonne orientation par rapport au promoteur (Figure N° 9).

Exemple 15 : Construction du plasmide pAB085 (gène Grippe équine NP souche Prague)

Une réaction de RT-PCR selon la technique de l'exemple 6 a été réalisée avec l'ARN génomique du virus de la grippe équine (EIV) (.Souche H7N7 Prague) (O .

Gorman ef al. J. Virol. 1 991 . 65. 3704-371 4), préparé selon la technique de l'exemple 4, et avec les oligonucléotides suivants: AB1 56 (32 mer) (SEQ ID N ° 1 6) 5'CCGGTCGACATGGCGTCTCAAGGCACCAAACG 3' AB1 59 (34 mer) (SEQ ID N ° 1 7)

5'CGCGGATCCTTAATTGTCAAACTCTTCTGCATTG 3' pour isoler le gène codant pour la nucléoprotéine NP du virus de la grippe équine sous la forme d'un fragment Sall-BamHI. Après purification, le produit de RT-PCR de 1 51 5 pb a été digéré par Sal\ et Bam \ pour isoler un fragment Sall-BamHI de 1 503 pb. Ce fragment a été ligaturé avec le vecteur pVR 101 2 (exemple 7), préalablement digéré avec Sa/1 et -SamHI, pour donner le plasmide pAB085 (6371 pb) (Figure N° 10) .

Exemple 16 : Construction du plasmide pAB084 (gène Grippe équine NP souche Jillin)

Une réaction de RT-PCR selon la technique de l'exemple 6 a été réalisée avec l'ARN génomique du virus de la grippe équine (EIV) (Souche H3N8 Jillin) (O.

Gorman et al. J. Virol. 1 991 . 65. 3704-3714), préparé selon la technique de l'exemple 4, et avec les oligonucléotides suivants: AB1 56 (32 mer) (SEQ ID N ° 1 6)

5'CCGGTCGACATGGCGTCTCAAGGCACCAAACG 3'

AB1 57 (34 mer) (SEQ ID N ° 18)

5'CGCGGATCCTTAATTGTCATATTCCTCTGCATTG 3' pour isoler le gène codant pour la nucléoprotéine NP du virus de la grippe équine sous la forme d'un fragment Sall-BamHI. Après purification, le produit de RT-PCR de 1 51 5 pb a été digéré par Sa/1 et Bam \ pour isoler un fragment

Sall-BamHI de 1 503 pb. Ce fragment a été ligaturé avec le vecteur pVR101 2

(exemple 7), préalablement digéré avec Sali et BamHI, pour donner le plasmide

PAB084 (6371 pb) (Figure N° 1 1 ).

Exemple 17 : Construction du plasmide pAB070 (gène sous-unité C toxine tétanique)

Une réaction de PCR a été réalisée avec l'ADN génomique de C/ostridium tetani (Souche CN391 1 ) (N. Fairweather et al. J. Bact. 1 986. 165. 21 -27), préparé selon la technique de l'exemple 2, et avec les oligonucléotides suivants: AB1 28 (34 mer) (SEQ ID N ° 1 9)

5'AAACTGCAGATGAAAAATCTGGATTGTTGGGTTG 3' AB1 29 (30 mer) (SEQ ID N° 20) 5TTTGGATCCTTAATCATTTGTCCATCCTTC 3' pour isoler la séquence codant pour la sous-unité C de la toxine de C/ostridium tetani sous la forme d'un fragment Pstl-BamHI. Après purification, le produit de PCR de 1 377 pb a été digéré par Pst\ et BamH\ pour isoler un fragment Pstl- BamHI de 1 361 pb. Ce fragment a été ligaturé avec le vecteur pVR101 2 . (exemple 7), préalablement digéré avec Pst\ et Bam \, pour donner le plasmide pAB070 (621 9 pb) (Figure N ° 1 2).

Exemple 18 : Construction du plasmide pAB017 (gène ospA de Borrelia burgdorferi)

Une réaction de PCR a été réalisée avec l'ADN génomique de Borrelia burgdorferi (Souche B31 ) (S. Bergstrom et al. Mol. Microbiol. 1 989. 3. 479-

486), préparé selon la technique de l'exemple 2, et avec les oligonucléotides suivants:

AB038 (37 mer) (SEQ ID N° 21 )

5'ACGCGTCGACTATGAAAAAATATTTATTGGGAATAGG 3' AB039 (34 mer) (SEQ ID N° 22)

5'CGCGGATCCCTTATTTTAAAGCGTTTTTAATTTC 3' pour isoler le gène codant pour la protéine de membrane OspA sous la forme d'un fragment Sall-BamHI. Après purification, le produit de PCR de 842 pb a été digéré par Sa/I et Bam \ pour isoler un fragment Sall-BamHI de 829 pb. Ce fragment a été ligaturé avec le vecteur pVR1 01 2 (exemple 7), préalablement digéré avec Sali et BamHI, pour donner le plasmide pAB01 7 (5698 pb) (Figure

N ° 1 3) .

Exemple 19 : Construction du plasmide pAB094 (gène E2 du virus de l'encéphalite de l'Est)

Une réaction de RT-PCR selon la technque de l'exemple 6 a été réalisée avec l'ARN génomique du virus de l'encéphalite de l'Est (EEV) (Souche North America 82V21 37) (S. Weaver et al. Virology. 1 993. 197. 375-390), préparé selon la technique de l'exemple 4, et avec les oligonucléotides suivants:

AB1 76 (34 mer) (SEQ ID N ° 23)

5'AAACTGCAGATGGATTTGGACACTCATTTCACCC 3'

AB1 77 (44 mer) (SEQ ID N ° 24) 5'CGCGGATCCTCAATAAAAATCATGCCCTCGTCGGCTTAATGCAG 3' pour isoler le gène codant pour la glycoprotéine E2 du EEV sous la forme d'un fragment Pstl-BamHI. Après purification, le produit de RT-PCR de 1 294 pb a été digéré par Pst\ et BamH pour isoler un fragment Pstl-BamHI de 1 278 pb. Ce - fragment a été ligaturé avec le vecteur pVR1 01 2 (exemple 7), préalablement digéré avec PstI et BamHI, pour donner le plasmide pAB094 (61 36 pb) (Figure

N° 1 4) .

Exemple 20 : Construction du plasmide pAB093 (gène C du virus de l'encéphalite de l'Est) Une réaction de RT-PCR selon la technique de l'exemple 6 a été réalisée avec l'ARN génomique du virus de l'encéphalite de l'Est (EEV) (Souche North America 82V21 37) (S. Weaver et al. Virology. 1 993. 197. 375-390), préparé selon la technique de l'exemple 4, et avec les oligonucléotides suivants: AB1 74 (33 mer) (SEQ ID N° 25) 5'AAACTGCAGATGTTCCCATACCCTACACTTAAC 3' AB1 75 (45 mer) (SEQ ID N ° 26)

5'TGAAGATCTTCAATAAAAATCACCATGGCTCTGACCCCTCTGGTG 3' pour isoler le gène codant pour la protéine de capside C (EEV C) sous la forme d'un fragment Pstl-Bglll. Après purification, le produit de RT-PCR de 801 pb a été digéré par Pst\ et -3g ^* /ll pour isoler un fragment Pstl-Bglll de 785 pb. Ce fragment a été ligaturé avec le vecteur pVR101 2 (exemple 7), préalablement digéré avec PstI et BglW, pour donner le plasmide pAB093 (5650 pb) (Figure N °

1 5) .

Exemple 21 : Construction du plasmide pAB096 (gène E2 du virus de l'encéphalite de l'Ouest) Une réaction de RT-PCR selon la technique de l'exemple 6 a été réalisée avec l'ARN génomique du virus de l'encéphalite de l'Ouest (WEV) (Souche BSF1 703) (C. Hahn et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1 988. 85. 5997-6001 ), préparé selon la technique de l'exemple 4, et avec les oligonucléotides suivants: AB1 80 (35 mer) (SEQ ID N° 27) 5'ACGCGTCGACATGAGCATTACCGATGACTTCACAC 3' AB1 81 (44 mer) (SEQ ID N ° 28)

5'CGCGGATCCTCAATAAAAATCAAGCGTTGGTTGGCCGAATACAG 3 ^* pour isoler le gène codant pour la glycoprotéine E2 du WEV sous la forme d'un , fragment Sall-BamHI. Après purification, le produit de RT-PCR de 1 304 pb a été digéré par Sa/I et BamHI pour isoler un fragment Sall-BamHI de 1 291 pb. Ce fragment a été ligaturé avec le vecteur pVR101 2 (exemple 7), préalablement digéré avec Sa/I et BamHI, pour donner le plasmide pAB096 (61 59 pb) (Figure N ° 1 6).

Exemple 22 : Construction du plasmide pAB095 (gène C du virus de l'encéphalite de l'Ouest)

Une réaction de RT-PCR selon l'exemple 6 a été réalisée avec l'ARN génomique du virus de l'encéphalite de l'Ouest (WEV) (Souche BSF1 703) (C. Hahn et ai.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1 988. 85. 5997-6001 ), préparé selon l'exemple 4, et avec les oligonucléotides suivants:

AB1 78 (34 mer) (SEQ ID N° 29)

5'ACGCGTCGACATGTTTCCATACCCTCAGCTGAAC 3'

AB1 79 (44 mer) (SEQ ID N° 30)

5'CGCGGATCCTCAATAAAAATCACCACGGTTCAGAACCTTCGGGG 3' pour isoler le gène codant pour la protéine de capside C du virus WEV sous la forme d'un fragment Sall-BamHI. Après purification, le produit de RT-PCR de

809 pb a été digéré par Sa/I et BamH\ pour isoler un-fragment Sall-BamHI de

796 pb. Ce fragment a été ligaturé avec le vecteur pVR 1 01 2 (exemple 7) , préalablement digéré avec Sa/I et BamH\, pour donner le plasmide pAB095 (5664 pb) (Figure N ° 1 7).

Exemple 23 : Construction du plasmide pAB098 (gène E2 du virus de l'encéphalite vénézuélienne)

Une réaction de RT-PCR selon l'exemple 6 a été réalisée avec l'ARN génomique du virus de l'encéphalite vénézuélienne (VEV) (Souche P676 (Type IC)) (R.

Kinney et al. Virology. 1 992. 191. 569-580), préparé selon l'exemple 4, et avec les oligonucléotides suivants:

AB1 84 (35 mer) (SEQ ID N° 31 )

5'ACGCGTCGACATGTCCACCGAGGAGCTGTTTAAGG 3'

AB1 85 (44 mer) (SEQ ID N ° 32)

5'CGCGGATCCTCAATAAAAATCAGGCCCGGGCAGTGCGGGCGCAG 3' pour isoler le gène codant pour la glycoprotéine E2 du virus VEV sous la forme d'un fragment Sall-BamHI. Après purification, le produit de RT-PCR de 1 304 pb a été digéré par Sa/l et BamHI pour isoler un fragment Sall-BamHI de 1 291 pb.

Ce fragment a été ligaturé avec le vecteur pVR101 2 (exemple 7), préalablement digéré avec Sa/1 et BamH\, pour donner le plasmide pAB098 (61 59 pb) (Figure N° 1 8).

Exemple 24 : Construction du plasmide pAB097 (gène C du virus de l'encéphalite vénézuélienne)

Une réaction de RT-PCR selon l'exemple 6 a été réalisée avec l'ARN génomique du virus de l'encéphalite vénézuélienne (VEV) (Souche P676 (Type !Q) (R.

Kinney et al. Virology. 1 992. 191. 569-580), prépaé selon l'exemple 4, et avec les oligonucléotides suivants:

AB1 82 (30 mer) (SEQ ID N ° 33)

5'AAACTGCAGATGTTCCCGTTCCAGCCAATG 3' AB1 83 (45 mer) (SEQ ID N° 34)

5'CGCGGATCCTCAATAAAAATCACCATTGCTCGCAGTTCTCCGGAG 3' pour isoler le gène codant pour la protéine de capsida C du virus VEV sous la

forme d'un fragment Pstl-BamHI. Après purification, le produit de RT-PCR de 856 pb a été digéré par Pst\ et BamHI pour isoler un fragment Pstl-BamHI de 839 pb. Ce fragment a été ligaturé avec le vecteur pVR101 2 (exemple 7), préalablement digéré avec Pst\ et BamHI, pour donner le plasmide pAB097 (5698 pb) (Figure N ° ^' ι 9) .

Exemple 25 : Construction du plasmide pAB041 (gène G du virus de la rage)

Une réaction RT-PCR selon l'exemple 6 a été réalisée avec l'ARN génomique du virus de la rage (Souche ERA) (A. Anilionis et al. Nature. 1 981 . 294. 275-278), préparé selon l'exemple 4, et avec les oligonucléotides suivants:

AB01 1 (33 mer) (SEQ ID N ° 35)

5'AAAACTGCAGAGATGGTTCCTCAGGCTCTCCTG 3'

AB01 2 (34 mer) (SEQ ID N ° 36)

5'CGCGGATCCTCACAGTCTGGTCTCACCCCCACTC 3' pour amplifier un fragment de 1 589 pb contenant le gène codant pour la protéine G du virus de la rage. Après purification, le produit de RT-PCR a été digéré par Pst\ et BamH\ pour donner un fragment Pstl-BamHI de 1 578 pb.

Ce fragment a été ligaturé avec le vecteur pVR101 2 (exemple 7), préalablement digéré avec Pst\ et BamHI, pour donner le plasmide pAB041 (6437 pb) (Figure N ° 20) .

Exemple 26 : Préparation et purification des plasmides

Pour la préparation des plasmides destinés à la vaccination des animaux, on peut utiliser toute technique permettant d'obtenir une suspension de plasmides purifiés majoritairement sous forme superenroulée. Ces techniques sont bien connues de l'homme de l'art. On peut citer en particulier la technique de lyse alcaline suivie de deux ultracentrifugations successives sur gradient de chlorure de césium en présence de bromure d'éthidium telle que décrite dans J. Sambrook et al. {Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2 ^πd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York. 1 989) . On peut se référer également aux demandes de brevet PCT WO 95/21 250 et PCT WO 96/02658 qui décrivent des méthodes pour produire à l'échelle industrielle des

plasmides utilisables pour la vaccination. Pour les besoins de la fabrication des vaccins (voir exemple 1 7) , les plasmides purifiés sont resuspendus de manière à obtenir des solutions à haute concentration ( > 2 mg/ml) compatibles avec le stockage. Pour ce faire, les plasmides sont resuspendus soit en eau ultrapure, soit en tampon TE (Tris-HCI 10 mM; EDTA 1 mM, pH 8,0) .

Exemple 27 : Fabrication des vaccins associés

Les divers plasmides nécessaires à la fabrication d'un vaccin associé sont mélangés à partir de leurs solutions concentrées (exemple 1 6) . Les mélanges sont réalisés de telle manière que la concentration finale de chaque plasmide corresponde à la dose efficace de chaque plasmide. Les solutions utilisables pour ajuster la concentration finale du vaccin peuvent être soit une solution NACI à 0,9 % , soit du tampon PBS. Des formulations particulières telles que les liposomes, les lipides cationiques, peuvent aussi être mises en oeuvre pour la fabrication des vaccins.

Exemple 28 : Vaccination des chevaux

Les chevaux sont vaccinés avec des doses de 100 μg, 250 μg ou 500 μg par plasmide. Les injections peuvent être réalisées à l'aiguille par voie intramusculaire dans les muscles du cou. Dans ce cas, les doses vaccinales sont administrées sous un volume de 2 ml.

Les injections peuvent être réalisées par voie intradermique en utilisant un appareil d'injection à jet liquide (sans aiguille) délivrant une dose de 0,2 ml en 5 points (0,04 ml par point d'injection) (par exemple, appareil "PIGJET") . Dans ce cas, les doses vaccinales sont administrées sous des volumes de 0,2 ou 0,4 ml, ce qui correspond respectivement à une ou à deux administrations. Lorsque deux administrations successives sont pratiquées au moyen de l'appareil PIGJET, ces administrations sont réalisées de manière décalée, de façon à ce que les deux zones d'injection soient séparées l'une de l'autre par une distance d'environ 1 à 2 centimètres.