Polypeptidwirkstoffe in der Form von Konjugaten aus keratinbindenden Polypeptiden, Polymeren und Effektormolekülen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung

Beschreibung

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Polypeptidwirkstoffe in der Form von Konjugaten aus keratinbindenden Polypeptiden, Polymeren und Effektormolekülen, worin die Effektormoleküle über die Polymeren mit den keratinbindenden Polypeptiden verknüpft sind.

Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ein neues Verfahren zur Herstellung von Polypeptidwirkstoffen in der Form von Konjugaten aus keratinbindenden Polypeptiden, Polymeren und Effektormolekülen, bei dem Effektormoleküle über Polymere mit keratinbindenden Polypeptiden verknüpft werden.

Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der neuen Polypeptidwirkstoffe in der Form von Konjugaten aus keratinbindenden Polypeptiden, verzweigten Polymeren und Effektormolekülen sowie der nach dem neuen Verfahren hergestellten Konjugate.

Stand der Technik

Vertebratenzellen enthalten Filamente, von denen eine Gruppe aus Keratinen aufgebaut ist. An diese Keratine, die auch in Haaren, Haut und Finger- und Fußnägeln vorkommen, binden spezifische Proteine oder Polypeptide wie beispielsweise Desmoplakin oder Plakophilin 1 mittels eines speziellen Sequenzmotivs, einer sogenannten keratinbindenden Domäne (KBD) (Fontao L, Favre B, Riou S, Geerts D, Jaunin F, Saurat JH, Green KJ, Sonnenberg A, Borradori L., Interaction of the bullous pemphigoid antigen 1 (BP230) and desmoplakin with intermediate filaments is mediated by distinct sequences within their COOH terminus., Mol Biol Cell. 2003 May; 4(5): 1978-92. Epub 2003 Jan 26; Hopkinson SB, Jones JC, The N terminus of the transmembrane protein BP180 interacts with the N-terminal domain of BP230, thereby mediating keratin cytoskeleton anchorage to the cell surface at the Site of the hemidesmosome, Mol Biol Cell. 2000 Jan; 1 1 (1 ): 277-86;

Smith E.A., Fuchs E., Defining the Interactions Betweeen Intermediate Filaments and Desmosomes, The Journal of Cell Biology, Volume 141 , 1998). Die Keratinbindenden Polypeptide können inzwischen auch mithilfe gentechnischer Methoden erzeugt werden (vgl. die amerikanische Patentanmeldung US 2005/170306 A1 oder die internationale Patentanmeldung WO 2006/097432 A2).

Zusammensetzungen zum Färben von Haaren (Haarfärbemittel) werden je nach ihrer Farbbeständigkeit in drei Klassen eingeteilt: Temporäre Haarfärbemittel, die nur 1-2 Haarwäschen haltbar sind, semipermanente Haarfärbemittel, die nach 8-10 Haarwäschen erneuert werden müssen und permanente Haarfärbemittel, die sich nicht heraus waschen lassen.

Temporäre und semipermanente Haarfärbemittel werden als nicht oxidativ bezeichnet. Hier lagern sich die Farbstoffe an das Keratin des Haares an oder dringen in die Haarfaser ein. Bei permanenten Haarfärbemitteln, den mit Abstand am weitesten verbreiteten Haarfärbemitteln, werden die Farben aus farblosen Vorstufen durch chemische Reaktion in der Gegenwart von Wasserstoffperoxid, das als Oxidationsmittel dient, direkt auf und im Haar gebildet. Dabei wird das Haar vollständig durchgefärbt, die Farbe ist nicht auswaschbar. Man bezeichnet diese Haarfärbemittel als oxidative Haarfärbemittel.

Die permanente Haarfärbung ist sehr beständig gegenüber der Haarwäsche, Lichteinwirkung und anderen Haarbehandlungsmethoden. Sie ist am weitesten verbreitet und besitzt unter den Haarfärbemitteln einen Marktanteil von ca. 80%. Sie braucht nur, bedingt durch den Haarwuchs, etwa jeden Monat erneuert zu werden. Bei diesem Färbesystem werden die Farbstoffe direkt auf und im Haar gebildet, und zwar durch chemische Reaktionen, denen die ungefärbten Zwischenprodukte bzw. Vorprodukte unterworfen werden. Es laufen dabei Oxidationsreaktionen und Kupplungsvorgänge bzw. Kondensationen ab, die durch Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Ammoniak oder Monoethanolamin hervorgerufen werden. Die Verwendung von Wasserstoffperoxid als Oxidationsmittel ist deshalb erforderlich, weil es nicht nur die Farbstoffbildung initiiert, sondern gleichzeitig auch die Melanin- Pigmente des Haares zerstört und auf diese Weise eine Blondierung hervorruft, weshalb man bei diesem Färbevorgang auch von einer aufhellenden Färbung spricht.

Zu den permanenten Haarfärbemitteln sind prinzipiell auch die so genannten selbstoxidierenden Farbstoffe zu rechnen, die bereits durch Luftsauerstoff oxidiert werden.

Haarfärbemittel liegen üblicherweise in Form von wässrigen, vorzugsweise verdickten, Lösungen oder Emulsionen vor und enthalten neben Farbstoffen beispielsweise Fettalkohole und/oder andere ölkomponenten, Emulgatoren und Tenside, sowie gegebenenfalls Alkohole.

Oxidations-Haarfärbemittel bestehen in der Regel aus zwei Komponenten, nämlich

(A) der die Farbstoffe enthaltenden Farbstoffträgermasse und

(B) der Oxidationsmittelzubereitung.

Diese Komponenten werden kurz vor der Anwendung vermischt und dann auf die zu färbende Faser aufgetragen. übliche Darreichungsformen für solche Permanent- oder Oxidations-Haarfärbemittel sind Cremehaarfarben und Haarfärbegele.

Laut Studien färben sich 35% der Frauen und 10% der Männer in Industrieländern regelmäßig die Haare. Allerdings sind chemische Haarfarben seit längerem umstritten, da gesundheitliche Risiken nicht ausgeschlossen sind.

So erfolgt bei jeder Haarfärbung auch gleichzeitig eine Schädigung der Haare. Die färbenden Pigmente müssen durch die schützende Schuppenschicht hindurch in die Rindenschicht des Haares geschleust werden.

Wie bereits oben ausgeführt, enthalten Haarfarben zwei Komponenten: ein Oxidationsmittel und eine Farbcreme. Die in den Haarfarben enthaltenen aromatischen Amine sind in der jüngsten Vergangenheit besonders in die Kritik geraten. Bei der Färbung sollen diese über den Kopf in den Körper gelangen und in der Leber abgebaut werden. In der Blase werden die Abbauprodukte dann teilweise zu krebserregenden Stoffen umgewandelt.

Eine kürzlich erschienene Studie der Dartmouth Medical School im "International Journal of Cancer" (A. Andres: Int J Cancer 2004; 109: 581-586) sieht einen möglichen Zusammenhang zwischen Haarfärbungen und Blasenkrebs: Frauen, die

regelmäßig permanente Haarfärbemittel benutzten, hätten im Durchschnitt ein 1 ,5 bis 2,3-fach erhöhtes Risiko an Harnblasenkrebs zu erkranken als Frauen, die sich nicht die Haare färbten.

Permanente Haarfarben, die nicht auf ihre Unbedenklichkeit hin getestet worden sind, sollen in der EU zukünftig verboten werden. Das beträfe im Moment die Hälfte aller Haarfärbemittel.

Ein weiterer Problemkreis ist die menschliche Haut.

Die menschliche Haut unterliegt gewissen Alterungsprozessen, die teilweise auf intrinsische Prozesse (chronoaging) und teilweise auf exogene Faktoren (environmental, z.B. photoaging) zurückzuführen sind. Zusätzlich können vorübergehende oder auch andauernde Veränderungen des Hautbildes auftreten, wie Akne, fettige oder trockene Haut, Keratosen, Rosaceae, lichtempfindliche, entzündliche, erythematöse, allergische oder autoimmunreaktive Reaktionen wie Dermatosen und Photodermatosen.

Zu den exogenen Faktoren zählen insbesondere das Sonnenlicht oder künstliche Strahlungsquellen mit vergleichbarem Spektrum sowie radikalische oder ionische

Verbindungen, die durch die Strahlung entstehen können. Zu diesen Faktoren zählen auch Zigarettenrauch und die darin enthaltenen reaktiven Verbindungen wie Ozon, freie Radikale, Singulettsauerstoff und andere reaktive Sauerstoff- oder

Stickstoffverbindungen, die die natürliche Physiologie oder Morphologie der Haut stören.

Das Totalozon hat in Deutschland seit 1968 insgesamt um knapp 10% abgenommen bzw. pro Jahrzehnt um rund 3%. Die UV-Strahlung ist im gleichen Zeitraum um etwa 15% angestiegen.

Sonnenbrand auslösende UV-B-Strahlung um 300 nm Wellenlänge hat die größte Krebswirksamkeit. Sie erhöht das Risiko, an so genanntem Nichtmelanom-Hautkrebs (Spinaliom bzw. Stachelzellkrebs oder Basaliom bzw. Basalzellkrebs) zu erkranken. Dabei steigt das Risiko für Tumoren mit der Anzahl der Sonnenbrände. Besonders die UV-Belastung in den ersten zehn Lebensjahren (Sonnenbrand bei Kindern) beeinflusst das Krebsrisiko.

Nach Schätzungen der WHO erkranken jährlich zwei Millionen Menschen weltweit an Basalzell- und Stachelzellkarzinomen der Haut und etwa 200.000 am Melanom. In Deutschland liegt die Zahl der Hautkrebs-Neuerkrankungen bei ca 120.000, davon entfallen 7% auf Melanome. Jährlich gehen in Deutschland je ca. 1600 Todesfälle auf Melanom- bzw. Nichtmelanom-Hautkrebs zurück. (ärztezeitung 17.5.2000)

Zur Vermeidung und Behandlung der oben genannten Schädigungen und Erkrankungen sowie zur Pflege und dekorativen Behandlung von Haut, Haaren, Finger- und Fußnägeln besteht daher ein immer größer werdender Bedarf an neuen Wirkstoffen und Produkten sowie an innovativen Applikationsmethoden derselben.

Im Stand der Technik sind bereits Lösungsvorschläge gemacht worden.

So können die keratinbindenden Polypeptide als solche als Bestandteile von kosmetischen Zusammensetzungen zur Behandlung von keratinhaltigen Materialien, insbesondere Haut, Nägel und Haaren, verwendet werden (vgl. die amerikanische Patentanmeldung US 2005/170306 A1 ).

Die keratinbindenden Polypeptide können modifiziert werden, indem sie mit so genannten Effektormolekülen, wie Enzyme, Farbstoffe, Reaktivfarbstoffe, UV-Filter,

Antioxidantien, Carotinoide, Fungizide, Insektizide, Biozide, Vitamine oder

Provitamine, verknüpft werden. Dabei kann die Verknüpfung durch kovalente

Bindungen erfolgen, wobei die Effektormoleküle über bifunktionelle verknüpfende

Gruppen ("Linker"), mit den C- oder N-Termini verknüpft sein können. Dabei können auch zwischen den Effektormolekülen und Polypeptiden abstandshaltende Gruppen

("Spacerelemente") eingebaut sein. Beispiele für Spacerelemente sind Alkylketten,

Phenylreste, Ethylenoxidreste, Polyethylenoxidreste, Polyesterreste, Polyamidreste,

Polyurethanreste Polyacrylsäurereste, oder Peptidgruppen, die beispielsweise Prolin,

Lysin, Glycin, Alanin und Serin enthalten (vgl. die internationalen Patentanmeldungen WO 2005/115306 A2, WO 2007/059076, WO 2007/0601 16 und WO 2007/063024).

Die keratinbindenden Polypeptide können aber auch mit Effektorpolypeptiden verknüpft werden, wodurch so genannte chimäre Polypeptide resultieren. Beispiele für hierfür geeignete Effektorpolypeptide sind Enzyme, Antikörper, Effektormoleküle bindende Proteine, Fluoreszenzproteine, antimikrobielle Peptide und selbstassemblierende Proteine (vgl. die internationale Patentanmeldung WO 2007/060117 A2).

Da für die Herstellung der bekannten Konjugate aus keratinbindenden Polypeptiden und Effektormolekülen bifunktionelle Ausgangsstoffe für Linker sowie gegebenenfalls Spacerelemente verwendet werden, ist die Anzahl von Effektormolekülen, die mit einem gegebenen keratinbindenden Polypeptid verknüpft werden können, vergleichsweise gering.

Aus der internationalen Patentanmeldung WO 2005/115457 A2 sind Komplexe aus biologisch aktiven Reagenzien wie Mesochlorin e6-monoethylendiamin-dinatriumsalz und subzellulären zielsuchenden ("targeting") Gruppen wie Gruppen, die sich von Steroidhormonen ableiten, bekannt. Diese werden eingesetzt, um biologisch aktive Moleküle gezielt zum Zellkern zu transportieren ("drug targeting"). Die Steroidhormon- Gruppen binden an die korrespondierenden Rezeptoren von Zellkernen und leiten so die biologisch aktiven Reagenzien gezielt an die Stellen in den Zellen, wo sie ihre Wirkung entfalten sollen.

Die Verknüpfung zwischen biologisch aktivem Reagenz und Targeting-Gruppe erfolgt beispielsweise durch Lysin. Die Komplexe können über Spacer mit Polymeren, wie (Meth)Acrylat(co)polymerisate, Vinyl(co)polymerisate, Allyl(co)polymerisate Polyethylenimine, Poly(L-glutaminsäure), Poly(L-lysin), Polyethylenglykole und Polyethylenglykolcopolymere, verbunden sein. Die resultierenden Konjugate können wiederum über geeignete Linker mit zellulären zielsuchenden Gruppen, wie polyklonale und monoklonale Antikörper, Phagen-Display-Antikörper, Ribosomen- Display-Verbindungen oder Antikörperfragmente, verknüpft sein.

Die Verknüpfung mit keratinbindenden Polypeptiden wird nicht beschrieben. Es finden sich auch keinerlei Anregungen oder Hinweise darauf, ob dieses Verfahren überhaupt auf die Herstellung von Konjugaten aus keratinbindenden Polypeptiden, Polymeren und Effektormolekülen übertragen werden kann. Insbesondere ist es für kosmetische Anwendungen kein Ziel, mit einem systemischen Wirkstoff den Zellkern zu adressieren.

Aus der internationalen Patentanmeldung WO 2007/031734 A1 sind Kammpolymere bekannt, die dazu dienen Effektormoleküle an Antikörper und Antikörperfragmente zu binden. Die Kammpolymere werden hergestellt, indem man olefinisch ungesättigte Monomere mit geeigneten funktionellen Gruppen wie N- Hydroxysuccinimidmethacrylat mithilfe eines Initiators, der eine Gruppe enthält, die

mit einem Antikörper oder Antikörperfragment verknüpft werden kann oder die in eine solche Gruppe umgewandelt werden kann, polymerisiert. Anschließend werden die resultierenden Polymere mit Effektormolekülen, die geeignete Linker-Gruppen wie selbstopfernde Gruppen mit endständiger primärer Aminogruppe enthalten, und mit hydrophilen monomeren, oligomeren oder polymeren Verbindungen, die eine geeignete endständige funktionelle Gruppe wie eine primäre Aminogruppe aufweisen, umgesetzt. Sofern die Kammpolymere im Initiatorrest bereits eine Gruppe enthalten, die mit einem Antikörper oder Antikörperfragment verknüpft werden kann, werden die beiden Ausgangsprodukte direkt zu den Konjugaten umgesetzt. Enthält dagegen der Initiatorrest eine Gruppe wie eine 2-(tert.-Butyldithio)-eth-1-yl-Gruppe, die in eine verknüpfende Gruppen wie eine Thiolgruppe umgewandelt werden kann, erfolgt zunächst die entsprechende Umsetzung, wonach die verknüpfende Gruppe mit einem bifunktionellen Linker-Molekül, beispielsweise mit einem Bismaleinimid, umgesetzt wird. Anschließend werden die resultierenden Kammpolymere mit den Antikörpern oder den Antikörperfragmenten zu den Konjugaten verknüpft.

Das in der internationalen Patentanmeldung WO 2007/031734 A1 beschriebene Verfahren ist sehr aufwändig. Es finden sich außerdem keinerlei Anregungen und Hinweise darauf, ob dieses Verfahren überhaupt auf die Herstellung von Konjugaten aus keratinbindenden Polypeptiden, Polymeren und Effektormolekülen übertragen werden kann.

Die Frage, ob die bekannten Verfahren zur Herstellung von Konjugaten aus Effektormolekülen, Polymeren und Polypeptiden überhaupt mit keratinbindenden Polypeptiden durchgeführt werden können, ist noch schwieriger zu beantworten, wenn man bedenkt, dass Polypeptide durch Polymere häufig denaturiert werden und aus ihren wässrigen Lösungen oder Dispersionen ausflocken und damit unbrauchbar werden. Dies liegt an den zahlreichen komplexen physikalischen und chemischen Wechselwirkungen zwischen den Polypeptiden und den Polymeren, die dazu führen, dass sich das Verhalten solcher Systeme nicht mehr vorhersagen lässt.

Aufgabe

Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zu Grunde, neue keratinbindende Polypeptidwirkstoffe in der Form von Konjugaten aus Polymeren und keratinbindenden Polypeptiden sowie gegebenenfalls Effektormolekülen zu finden.

Die neuen Konjugate sollen in einfacher Weise sehr gut reproduzierbar und in hohen Ausbeuten herstellbar sein.

Wenn zu ihrer Herstellung Effektormoleküle verwendet werden, sollen die Konjugate die von den Effektormolekülen abgeleiteten Effektorgruppen in hohen

Konzentrationen enthalten. Dabei sollen die neuen Konjugate die unterschiedlichsten

Effektorgruppen enthalten können. Die neuen Konjugate beziehungsweise die hierin enthaltenen Effektorgruppen sollen eine besonders hohe Wirksamkeit, insbesondere an und in Haut, Nägeln und Haaren, entfalten, ohne dass dabei die Haut, Nägel und Haare geschädigt werden.

Des Weiteren lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zu Grunde, neue kosmetische oder pharmazeutische Zusammensetzungen bereitzustellen, die keratinbindende Polypeptidwirkstoffe enthalten oder hieraus bestehen.

Außerdem lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zu Grunde, ein neues Verfahren zur Herstellung von keratinbindenden Polypeptidwirkstoffen in der Form von Konjugaten aus Polymeren und keratinbindenden Polypeptiden sowie gegebenenfalls Effektormolekülen zu finden. Das neue Verfahren soll in einfacher und sehr gut reproduzierbarer Weise durchführbar sein und die betreffenden Konjugate in hohen Ausbeuten liefern. Dabei soll es nicht mehr zu unerwünschten Wechselwirkungen zwischen den Polymeren und den keratinbindenden Polypeptiden kommen, die zur Bildung von nicht mischbaren flüssigen Phasen oder zur Denaturierung und zum Ausflocken der Polypeptide führen.

Sollen Effektormoleküle verwendet werden, soll es das neue Verfahren ermöglichen, eine große Anzahl von Effektormolekülen in die Konjugate einzubinden, so dass besonders hohe Konzentrationen an Effektorgruppen resultieren. Darüber hinaus soll das neue Verfahren mit besonders vielen unterschiedlichen Effektormolekülen durchgeführt werden können. Nicht zuletzt sollen die mithilfe des neuen Verfahrens hergestellten Konjugate beziehungsweise die hierin enthaltenen Effektorgruppen eine ganz besonders hohe Wirksamkeit, insbesondere an und in Haut, Nägeln und Haaren, entfalten.

Nicht zuletzt lag der vorliegenden Aufgabe zu Grunde, neue Verwendungen im Rahmen der Modifizierung von Keratin und Keratin enthaltenden Materialien und der kosmetischen Behandlung von Keratin enthaltenden Materialien zu finden, bei denen

nur noch vergleichsweise geringe Mengen an Polypeptidwirkstoffen eingesetzt werden müssen und bei denen die Haut, Nägel und Haare nicht geschädigt werden.

Erfindungsgemäße Lösung

Demgemäß wurden die neuen keratinbindenden Polypeptidwirkstoffe in der Form von Konjugaten (A'B'C), zumindest umfassend

(A') mindestens eine Polypeptidsequenz, abgeleitet von mindestens einem keratinbindenden Polypeptid (A),

(B') mindestens eine Polymerkette, die von mindestens einem wasserlöslichen oder wasserdispergierbaren, seitenständige und/oder endständige reaktive funktionelle Gruppen (b1 ) tragenden Polymer (B) abgeleitet ist, das danach ausgewählt ist, dass es zusammen mit dem zum Konjugat (A'B'C) umzusetzenden keratinbindenden Polypeptid (A) im Normzustand eine homogene wässrige Lösung oder Dispersion, worin das Polypeptid (A) noch immer eine keratinbindende Aktivität aufweist, bildet, und

(C) mindestens eine Linkergruppe, die die Polymerkette (B') mit der Polypeptidsequenz (A) verbindet,

gefunden.

Im Folgenden werden die neuen keratinbindenden Polypeptidwirkstoffe in der Form von Konjugaten (A'B'C) als »erfindungsgemäße Polypeptidwirkstoffe« bezeichnet.

Außerdem wurde das neue Verfahren zur Herstellung von keratinbindenden Polypeptidwirkstoffen in der Form von Konjugaten (A'B'C) aus keratinbindenden Polypeptiden (A), Polymeren (B) und Linkermolekülen (C) gefunden, bei dem man

(1 ) mindestens ein wasserlösliches oder wasserdispergierbares, seitenständige und/oder endständige reaktive funktionelle Gruppen (b1 ) tragendes Polymer (B) auswählt, das zusammen mit dem zum Konjugat (A'B'C) umzusetzenden keratinbindenden Polypeptid (A) im Normzustand eine homogene wässrige

Lösung oder Dispersion, worin das Polypeptid (A) noch immer eine keratinbindende Aktivität aufweist, zu bilden vermag,

(2) das ausgewählte Polymer (B) mit mindestens einem Typ von Linkermolekül (C) zu einem Polymer (B ¹ C), enthaltend mindestens eine seitenständige und/oder mindestens eine endständige Linkergruppe (C), enthaltend mindestens eine reaktive funktionelle Gruppe (c2), umsetzt und

(3) das Polymer (B ¹ C) mit dem keratinbindenden Polypeptid (A) zum Konjugat (A ¹ B ¹ C) umsetzt.

Im Folgenden wird das neue Verfahren zur Herstellung von keratinbindenden Polypeptidwirkstoffen in der Form von Konjugaten (A'B'C) aus keratinbindenden Polypeptiden (A), Polymeren (B) und Linkermolekülen (C) als »erfindungsgemäßes Herstellverfahren« bezeichnet.

Des Weiteren wurden die neuen kosmetischen und pharmazeutischen Zusammensetzungen gefunden, die die erfindungsgemäßen Polypeptidwirkstoffe oder die nach dem erfindungsgemäßen Herstellverfahren hergestellten Polypeptidwirkstoffe enthalten oder hieraus bestehen und die im Folgenden als »erfindungsgemäße Zusammensetzungen« bezeichnet werden.

Nicht zuletzt wurden die neue Verwendung der erfindungsgemäßen Polypeptidwirkstoffe und der nach dem erfindungsgemäßen Herstellverfahren hergestellten Polypeptidwirkstoffe zur Modifikation von Keratin und keratinhaltigen Materialien sowie die neue Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zur kosmetischen Behandlung keratinhaltiger Materialien gefunden.

Im Folgenden werden die neuen Verwendungen zusammenfassend als »erfindungsgemäße Verwendung« bezeichnet.

Vorteile der Erfindung

Im Hinblick auf den Stand der Technik war es überraschend und für den Fachmann nicht vorhersehbar, dass die Aufgabe, die der vorliegenden Erfindung zu Grunde lag, mithilfe der erfindungsgemäßen Polypeptidwirkstoffe, des erfindungsgemäßen Herstellverfahrens, der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und der erfindungsgemäßen Verwendung gelöst werden konnte.

Insbesondere war es überraschend, dass die erfindungsgemäßen Polypeptidwirkstoffe beziehungsweise die Konjugate in einfacher Weise sehr gut reproduzierbar herstellbar waren.

Sofern von Effektormolekülen abgeleitete Effektorgruppen mitverwendet wurden, enthielten die Konjugate diese in hohen Konzentrationen. Dabei konnten die erfindungsgemäßen Polypeptidwirkstoffe die unterschiedlichsten Effektorgruppen enthalten. Die erfindungsgemäßen Polypeptidwirkstoffe beziehungsweise die hierin enthaltenen Effektorgruppen entfalteten eine besonders hohe Wirksamkeit, insbesondere an und in Haut, Nägeln und Haaren, ohne dass dabei die Haut, Nägel und Haare geschädigt wurden.

Außerdem war es überraschend, dass das erfindungsgemäße Herstellverfahren zur Herstellung von keratinbindenden Polypeptidwirkstoffen in der Form von Konjugaten aus Polymeren und keratinbindenden Polypeptiden, insbesondere von erfindungsgemäßen Polypeptidwirkstoffen, in einfacher und sehr gut reproduzierbarer

Weise durchführbar war. Dabei kam es nicht mehr zu unerwünschten

Wechselwirkungen zwischen den Polymeren und den keratinbindenden Polypeptiden, die ansonsten zur Bildung von nicht mischbaren flüssigen Phasen oder zur

Denaturierung und zum Ausflocken der Polypeptide führen.

Des Weiteren ermöglichte es das erfindungsgemäße Herstellverfahren, im Bedarfsfall eine große Anzahl von Effektormolekülen in Polypeptidwirkstoffe, insbesondere in die erfindungsgemäßen Polypeptidwirkstoffe, einzubinden, so dass besonders hohe Konzentrationen an Effektorgruppen resultierten. Darüber hinaus konnte das erfindungsgemäße Herstellverfahren mit besonders vielen unterschiedlichen Effektormolekülen durchgeführt werden. Nicht zuletzt entfalteten die mithilfe des erfindungsgemäßen Herstellverfahrens hergestellten Polypeptidwirkstoffe, insbesondere die erfindungsgemäßen Polypeptidwirkstoffe, beziehungsweise die hierin enthaltenen Effektorgruppen eine ganz besonders hohe Wirksamkeit, insbesondere an und in Haut, Nägeln und Haaren.

Insbesondere ermöglichte das erfindungsgemäße Herstellverfahren die einfache Herstellung von erfindungsgemäßen Polypeptidwirkstoffen, deren Wirkung auf der komplementären Wirkung verschiedener Effektormoleküle beziehungsweise der

hiermit hergestellten Effektorgruppen beruht, wie beispielsweise Gemische aus Effektorgruppen, die UV-A- und UV-B-Filter sind.

Ganz besonders überraschend war, dass sich die erfindungsgemäßen Polypeptidwirkstoffe und die nach dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren hergestellten Polypeptidwirkstoffe im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendungen hervorragend als kosmetische oder pharmazeutische Zusammensetzungen oder zu deren Herstellung eigneten. Außerdem eigneten sie sich hervorragend für die Modifizierung von Keratin und keratinhaltigen Materialien. Dabei waren sie insbesondere zur kosmetischen Behandlung von keratinhaltigen Materialien, vorzugsweise zur kosmetischen Behandlung menschlicher und tierischer Haut, Haare und Nägel, insbesondere in der Form von Haut-, Haar- und Nagelpflegemitteln, -reinigungsmitteln, -Schutzmitteln oder -färbemitteln, dekorativen Kosmetika oder Haargelen hervorragend geeignet.

Bei alledem ließen sich die erfindungsgemäßen Polypeptidwirkstoffe und Zusammensetzungen sowie die nach dem erfindungsgemäßen Herstellverfahren hergestellten Polypeptidwirkstoffe einfach applizieren und wiesen eine besonders hohe Verweildauer auf Haut, Haaren und Nägeln auf.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die erfindungsgemäßen Polypeptidwirkstoffe haben eine hohe Affinität zu Keratin und binden sich daher hieran. Die erfindungsgemäßen Polypeptidwirkstoffe gehören daher zu der Gruppe der keratinbindenden Polypeptide.

Die Bezeichnung »Wirkstoff« weist darauf hin, dass die erfindungsgemäßen Polypeptidwirkstoffe eine bestimmte vorhersehbare Wirkung, bevorzugt eine biologische, physikalische oder physiologische, schützende, vorbeugende und/oder pflegende Wirkung insbesondere auf Haut, Haar und/oder Nägeln aufweisen oder einen kosmetisch dekorativen Effekt besitzen.

»Polypeptid« im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet ein aus Aminosäuremolekülen aufgebautes Makromolekül, indem die Aminosäuren in linearer Folge über Peptidbindungen miteinander verknüpft sind. Ein Polypeptid kann aus wenigen Aminosäuren (ca. 10 bis 100) aufgebaut sein, umfasst aber auch Proteine die in der Regel aus mindestens 100 Aminosäuren aufgebaut sind, aber auch

mehrere tausend Aminosäuren umfassen können. Bevorzugt umfassen Polypeptide mindestens 20, 30, 40 oder 50, besonders bevorzugt mindestens 60, 70, 80 oder 90, ganz besonders bevorzugt mindestens 100, 125, 150, 175 oder 200, am meisten bevorzugt mindestens über 200 Aminosäuren, wobei die Obergrenze bei mehreren tausend Aminosöuren liegen kann.

»Keratin« im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet aus seilförmigen Proteinkomplexen aufgebaute Intermediärfilamente. Intermediärfilamente sind aus vielen gleichartigen Proteinen (Monomeren) aufgebaut, die sich parallel zu einer röhrenförmigen Struktur zusammenlagern. Intermediärfilamente sind zu größeren Bündeln (Tonofibrillen) verbunden. Intermediärfilamente bilden mit den Mikrotubuli und Actinfilamenten das Cytoskelett der Zelle. Man unterscheidet fünf Typen von Intermediärfilamenten: saure und basische Keratine, Desmine, Neurofilamente und Lamine. Speziell bevorzugt im Sinne der vorliegenden Erfindung sind die in den Epithelien (ein- oder mehrlagige Zellschichten, die alle äußeren Körperoberflächen der vielzelligen tierischen Organismen bedecken) vorkommenden sauren und basischen Keratine. „Keratin" oder "Keratine" (auch: Hornsubstanz, Skieroprotein) bedeuten ein Eiweiß, das für Stabilität und Form der Zellen verantwortlich ist. Dieses Protein ist Bestandteil von Säugetierhaut, -haar und -Nägeln. Die Festigkeit von Keratin wird durch Faserbildung verstärkt: die einzelnen Aminosäureketten bilden eine rechtsgängige Alpha-Helix, je drei dieser Helices bilden eine linksgängige Superhelix (= Protofibrille). Elf Protofibrillen vereinigen sich zu einer Mikrofibrille - diese vereinigen sich ihrerseits zu Bündeln und bilden Makrofibrillen aus, die z.B. die Zellen des Haares umgeben.

»Keratinbindendes Polypeptid« meint ein Polypeptid oder ein Protein, welches die Eigenschaft besitzt an Keratin, im Sinne der oben gegebenen Definition, zu binden. Somit sind keratinbindende Polypeptide auch Intermediärfilament-assoziierte Proteine. Diese keratinbindenden Poylpeptide haben eine Bindungsaffinität gegenüber dem Keratin bzw. den aus Keratin bestehenden Makrostrukturen wie Protofibrillen, Mikrofibrillen oder Makrofibrillen. Ferner sind unter keratinbindenden Polypeptiden solche Polypeptide zu verstehen, die eine Bindungsaffinität zu Haut, Haar und/oder Finger- bzw. Fußnägeln von Säugetieren besitzen.

»Keratinbindende Polypeptide« sind ferner Polypeptide, die innerhalb eines Säugetierorganismus eine mit der Bindung von Keratin, Keratinfasern, Haut, Haar oder Nägeln verbundene biologische Funktion besitzen. »Keratinbindende

Polypeptide« meint ebenfalls die für die eigentliche Bindung an das Keratin, die Keratinfasern, die Haut, dass Haar oder die Nägel notwendigen Bindungsmotive oder Proteindomänen. Die Bindung des keratinbindenden Polypeptids an Keratin kann in üblicher und bekannter Weise (vgl. die internationale Patentanmeldung WO 2007/0601 16 A2, Seite 83, Zeile 17, bis Seite 86, Zeile 8) getestet werden. Keratinbindende Polypeptide sind solche Polypeptide, die in den üblichen und bekannten quantitativen Keratinbindungstests ca. 10%, 20%, 30%, 40% oder 50%, bevorzugt 50%, 60%, 70%, 80% oder 90%, besonders bevorzugt 100%, 125%, 150%, ganz besonders bevorzugt 200%, 300% oder 400%, am meisten bevorzugt 500%, 600%, 700% oder 1000% oder mehr der Keratinbindungkapazität des Desmoplakin (SEQ ID No.: 2), bevorzugt der Keratin-Bindedomäne B des Desmoplakin (SEQ ID No.: 4), aufweisen.

Die erfindungsgemäßen Polypeptidwirkstoffe liegen in der Form von Konjugaten (A'B'C), vorzugsweise in der Form von Konjugaten (A'B'C'D ¹ ), vor.

Unter »Konjugaten« versteht man ganz allgemein die durch nicht näher spezifizierte molekulare Verknüpfung zweier oder mehrerer verschiedener chemischer Substanzen entstehenden Produkte (vgl. Römpp Online 2007, »Konjugate«).

Die erfindungsgemäßen Konjugate (A'B'C), vorzugsweise die erfindungsgemäßen Konjugate (A'B'C'D'), umfassen mindestens eine, insbesondere eine, Polypeptidsequenz (A'), die von mindestens einem, insbesondere einem, keratinbindenden Polypeptid (A) abgeleitet ist.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet »abgeleitet«, dass die betreffende Struktureinheit eines erfindungsgemäßen Konjugats (A'B'C), insbesondere eines Konjugate (A'B'C'D'), - hier die Polypeptidsequenz (A') - aus einem Ausgangsprodukt - hier das Polypeptid (A) - hergestellt worden ist, wobei die Strukturmerkmale des Ausgangsprodukts, die für die chemischen und physikalischen Eigenschaften sowie die biologischen und physiologischen Wirkungen - hier z.B. die Bindungsaffinität zu Keratin - maßgeblich sind, im wesentlichen oder völlig erhalten bleiben.

Vorzugsweise leiten sich die Polypeptidsequenzen (A') von Keratinbindenden Polypeptiden (A) ab, die

a) mindestens eine der Sequenzen gemäß SEQ ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 112, 114, 116, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170 umfassen, oder

b) einem Polypeptid entsprechen, welches mindestens zu 40%, 45% oder 50%, vorzugsweise mindestens 55%, 60%, 65% oder 70%, besonders bevorzugt mindestens 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93% oder 94%, ganz besonders bevorzugt mindestens 95% oder 96% identisch ist mit wenigstens einer der Sequenzen gemäß SEQ ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136,

138, 140, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170 und in der Lage ist Keratin zu binden.

Außerdem leiten sich die Polypeptidsequenzen (A') vorzugsweise von keratinbindenden Polypeptiden (A) ab, die von Nukleinsäuremolekülen kodiert werden, umfassend mindestens ein Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, umfassend die in SEQ ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44,

46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 1 12, 114, 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 146, 150, 153, 156, 157,

158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170 gezeigte Sequenz;

d) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz, gezeigt in SEQ ID No.: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97, 99, 101 , 103, 105, 107, 109, 1 11 , 113, 115, 1 17, 119, 121 , 123, 125, 127, 129, 131 , 133, 135, 137 , 139, 145, 149, 152,

159, 161 , 163, 165, 167 oder 169, umfasst;

e) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid gemäß der Sequenzen SEQ ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 100, 102, 104, 106, 108, 110, 1 12, 114, 1 16, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 146, 150, 153, 156, 157,

158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170 kodiert;

f) Nukleinsäuremolekül, mit einer Nukleinsäuresequenz, entsprechend wenigstens einer der Sequenzen gemäß SEQ ID No.: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57,

59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97, 99,

101 , 103, 105, 107, 109, 1 1 1 , 1 13, 1 15, 1 17, 119, 121 , 123, 125, 127, 129,

131 , 133, 135, 137 , 139, 145, 149, 152, 159, 161 , 163, 165, 167 oder 169 oder ein davon durch Substitution, Deletion oder Insertion abgeleitetes Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, welches mindestens zu 40%,

45% oder 50%, vorzugsweise mindestens 55%, 60%, 65% oder 70%, besonders bevorzugt mindestens 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93% oder 94%, ganz besonders bevorzugt mindestens 95% oder 96% identisch ist mit wenigstens einer der Sequenzen gemäß SEQ ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58,

60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 100,

102, 104, 106, 108, 1 10, 1 12, 1 14, 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130,

132, 134, 136, 138, 140, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170 und in der Lage ist an Keratin zu binden;

g) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, welches von einem monoklonalen Antikörper, gerichtet gegen ein Polypeptid welches durch die Nukleinsäuremoleküle gemäß (a) bis (c) kodiert wird, erkannt wird;

h) Nukleinsäuremolekül, kodierend für ein keratinbindendes Protein, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (c) hybridisiert;

i) Nukleinsäuremolekül, kodierend für ein keratinbindendes Protein, das aus einer DNA-Bank unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente von mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt,

50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden kann; und

j) Nukleinsäuremolekül, welches durch Rückübersetzung einer der in den Sequenzen SEQ ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30,

32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72,

74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 100, 102, 104, 106, 108, 110,

1 12, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140,

146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170 gezeigten Aminosäuresequenzen erzeugt werden kann.

Hier und im Folgenden haben weitere wichtige Fachausdrücke die folgende Bedeutung.

»Nukleinsäure« oder »Nukleinsäuremolekül« meint Deoxyribonukleotide, Ribonukleotide oder Polymere oder Hybride derselben in einzel- oder doppelsträngiger Form, in Sense- oder Antisenseorientierung. Der Begriff Nukleinsäure oder Nukleinsäuremolekül kann verwendet werden um ein Gen, DNA, cDNA, mRNA, Oligonukleotid oder Polynukleotid zu beschreiben.

»Nukleinsäuresequenz« meint eine aufeinander folgende und miteinander verknüpfte Abfolge von Deoxyribonukleotiden oder Ribonukleotiden eines Nukleinsäuremoleküls gemäß der oben gegebenen Definiton, wie sie durch Verwendung von verfügbaren DNA/RNA Sequenzierungstechniken ermittelt und in Form einer Liste von Abkürzungen, Buchstaben oder Wörtern, welche Nukleotide repräsentieren, abgebildet oder dargestellt werden kann.

»Antikörper« im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Eiweißstoffe, die der Mensch und die kiefertragenden Wirbeltiere zur Abwehr von Antigenen (Infektionserregern oder körperfremdem biologischem Material) produzieren. Sie sind zentraler Bestandteil des Immunsystems höherer Eukaryonten und werden von einer Klasse von weißen Blutkörperchen, den B-Zellen sezerniert. Sie kommen im Blut und in der extrazellulären Flüssigkeit der Gewebe vor.

»Rückübersetzung« im Sinne der vorliegenden Erfindung meint die übersetzung einer Proteinsequenz in eine für dieses Protein kodierende Nukleinsäuresequenz. Somit handelt es sich bei der Rückübersetzung um einen Prozess der Dekodierung

einer Aminosäuresequenz in die dazu korrespondierende Nukleinsäuresequenz. übliche Methoden basieren auf der Erstellung von Organismen spezifischen Codon- Verwendungstabellen, welche durch computergestütze Sequenzvergleiche erzeugt werden. Unter Verwendung der Codon-Verwendungstabellen können die für einen bestimmten Organismus am häufigsten für eine bestimmte Aminosäure verwendeten Codons ermittelt werden. Proteinrückübersetzung kann unter Verwendung von dem Fachmann bekannten und für diesen Zweck speziell erzeugter Computerprogrammen durchgeführt werden (Andres Moreira and Alejandro Maass. TIP: protein backtranslation aided by genetic algorithms. Bioinformatics, Volume 20, Number 13 Pp. 2148-2149 (2004); G Pesole, M Attimonelli, and S Liuni. A backtranslation method based on codon usage strategy. Nucleic Acids Res. 1988 March 11 ; 16(5 Pt A): 1715-1728).

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, leiten sich die Polypeptidsequenzen (A) von Desmoplakinen (A) gemäß der Sequenzen SEQ ID No.: 2, 42, 44, 46, 48, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164 oder 166, und/oder von Plakophillinen (A) gemäß der Sequenzen SEQ ID No.: 18, 20, 26, 28, 32, 34, 36, und/oder von Plakoglobinen (A) gemäß der Sequenzen mit der SEQ ID No.: 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, und/oder das Periplakin (A) gemäß der Sequenz mit der SEQ ID No.: 86, und/oder von Envoplakinen (A) gemäß der Sequenzen mit der SEQ ID No.: 90, 92, 94, 96, 98, 102, 104, 105 und/oder der Sequenzen gemäß SEQ ID No.: 138 und 140 ab. Bevorzugte keratinbindende Domänen sind die in den Sequenzen SEQ ID Nos: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170 abgebildeten Desmoplakin-Polypeptide (A), sowie deren funktionelle äquivalente. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden im die in den Sequenzen SEQ ID No.: 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 und/oder 170 abgebildeten keratinbindenden Poylpeptide (A) im erfindungsgemäßen Herstellverfahren eingesetzt.

Mit umfasst sind ebenfalls funktionale äquivalente der konkret offenbarten, keratinbindenden Polypeptide (A) und die hier von abgeleiteten Polypeptidsequenzen (A').

»Funktionale äquivalente« oder Analoga der konkret offenbarten, keratinbindenden Polypeptide (A) sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung davon verschiedene

Polypeptide (A), welche weiterhin die gewünschte biologische Aktivität, wie z.B.

Keratinbindung, besitzen. So versteht man beispielsweise unter funktionalen

äquivalenten von keratinbindenden Polypeptiden (A) solche Polypeptide, die unter ansonsten vergleichbaren Bedingungen, in den in den üblichen und bekannteren quantitativen Keratinbindungstests ca.10%, 20%, 30%, 40% oder 50%, bevorzugt 60%, 70%, 80% oder 90%, besonders bevorzugt 100%, 125%, 150%, ganz besonders bevorzugt 200%, 300% oder 400%, am meisten bevorzugt 500%, 600%, 700% oder 1000% oder mehr der Keratinbindungskapazität der unter den SEQ ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 1 12, 114, 116, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136 138, 140, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170 dargestellten Polypeptide (A) aufweisen.

Unter funktionalen äquivalenten versteht man insbesondere auch Muteine, welche in wenigstens einer Sequenzposition der oben genannten Aminosäuresequenzen (A) eine andere als die konkret genannte Aminosäure aufweisen, aber trotzdem eine der oben genannten biologischen Aktivitäten besitzen. Funktionale äquivalente umfassen somit die durch eine Mutation erhältlichen Muteine, wobei die genannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einem Mutein mit dem erfindungsgemäß erforderlichen Eigenschaftsprofil führen.

»Mutation« im Sinne der vorliegenden Erfindung meint die Veränderung der Nukleinsäureabfolge einer Genvariante in einem Plasmid oder im Genom eines Organismus. Mutationen können z.B als Folge von Fehlern bei der Replikation entstehen oder durch Mutagene hervorgerufen werden. Die Rate der Spontanmutationen im Zellgenom von Organismen ist sehr gering, allerdings sind dem Fachmann eine Vielzahl von biologischen, chemischen oder physikalischen Mutagenen bekannt.

Mutationen umfassen Substitutionen, Insertionen, Deletionen eines oder mehrerer Nukleinsäurereste. Unter Substitutionen versteht man den Austausch von einzelnen Nukleinsäurebasen; dabei unterscheidet man zwischen Transitionen (Substitution einer Purin- gegen eine Purinbase bzw. einer Pyrimidin- gegen eine Pyrimidinbase) und Transversionen (Substitution einer Purin- gegen eine Pyrimidinbase oder umgekehrt).

Unter Addition bzw. Insertion versteht man den Einbau von zusätzlichen Nukleinsäureresten in die DNA, wobei es zu Verschiebungen des Leserahmens

kommen kann. Bei derartigen Leserahmenverschiebungen unterscheidet man zwischen „in frame" Insertionen/Addtitionen und „out-of-frame" Insertionen. Bei den „in-frame" Insertionen/Additionen bleibt der Leserahmen erhalten und ein um die Anzahl der von den inserierten Nukleinsäuren kodierten Aminosäuren vergrößertes Polypeptid (A) entsteht. Bei „out-of-frame" Insertionen/Additionen geht der ursprüngliche Leserahmen verloren und die Bildung eines vollständigen und funktionstüchtigen Polypeptids (A) ist nicht mehr möglich.

Deletionen beschreiben den Verlust von einem oder mehreren Basenpaaren, die ebenfalls zu „in-frame" oder „out-of-frame" Verschiebungen des Leserahmens und den damit verbundenen Folgen bezüglich der Bildung eines intakten Proteins führen.

Die zur Erzeugung von zufälligen oder gezielten Mutationen verwendbaren mutagenen Agenzien (Mutagene) und die anwendbaren Methoden und Techniken sind dem Fachmann bekannt. Deratige Methoden und Mutagene sind z.B. beschrieben bei A.M. van Harten [(1998), "Mutation breeding: theory and practical applications", Cambridge University Press, Cambridge, UK], E Friedberg, G Walker, W Siede [(1995), „DNA Repair and Mutagenesis", Blackwell Publishing], oder K. Sankaranarayanan, J. M. Gentile, L. R. Ferguson [(2000) „Protocols in Mutagenesis", Elsevier Health Sciences].

Für die Einführung von gezielten Mutationen können geläufige molekulabiologische Methoden und Verfahren wie z.B. der vitro Mutagenese Kits, LA PCR in vitro Mutagenesis Kit (Takara Shuzo, Kyoto), QuikChange® Kit der Firma Stratagene oder PCR Mutagenesen unter Verwendung geeigneter Primer angewendet werden.

Wie bereits oben aufgeführt, gibt es eine Vielzahl von chemischen physikalischen und biologischen Mutagenen.

Chemische Mutagene können nach Wirkmechanismus unterteilt werden. So gibt es Basenanaloga (z.B. 5-Bromouracil, 2-Aminopurin), mono- und bifunktionale alkylierende Agentien (z.B. monfunktionale wie Ethylmethylsulfonat, Dimethylsulfat, oder bifunktionale wie Dichlorethylsulfit, Mitomycin, Nitrosoguanidine, Dialkylnitrosamine, N-Nitrosoguanidinderivate) oder interkalierende Substanzen (z.B. Acridine, Ethidiumbromid).

Somit können sich die Polypeptidsequenzen (A') auch von solchen Polypeptiden (A) ableiten, die man in Folge einer Mutation eines Polypeptides (A) z.B. gemäß SEQ ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 1 12, 1 14, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136 138, 140, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170 erhält.

Beispiele für geeignete Aminosäuresubstitutionen sind der Tabelle 1 zu entnehmen:

Ursprünglicher Rest Beispiele der Substitution

AIa Ser

Arg Lys

Asn GIn; His

Asp GIu

Cys Ser oder AIa

GIn Asn

GIu Asp

GIy Pro

His Asn; GIn

Ne Leu; VaI

Leu Ne; VaI

Lys Arg; GIn; GIu

Met Leu; Ne

Phe Met; Leu; Tyr

Ser Thr

Thr Ser

Trp Tyr

Tyr Trp; Phe

VaI Ne; Leu

Tabelle 1 : Geeignete Aminosäuresubstitutionen

Bekannt ist, dass in SEQ ID No.: 2 das an Position 2849 natürlich vorliegende Serin z.B. gegen Glycin ausgetauscht werden kann, um eine Phosphorylierung an dieser Position zu umgehen (Fontao L, Favre B, Riou S, Geerts D, Jaunin F, Saurat JH, Green KJ, Sonnenberg A, Borradori L., Interaction of the bullous pemphigoid antigen 1 (BP230) and desmoplakin with intermediate filaments is mediated by distinct

sequences within their COOH terminus., Mol Biol Cell. 2003 May;14(5):1978-92. Epub 2003 Jan 26).

Funktionale äquivalente im obigen Sinne sind auch »Präkursoren« der beschriebenen Polypeptide sowie funktionale Derivate und Salze der Polypeptide (A).

»Präkursoren« sind dabei natürliche oder synthetische Vorstufen der Polypeptide (A) mit oder ohne gewünschte biologische Aktivität.

Unter dem Ausdruck »Salze« versteht man sowohl Salze von Carboxylgruppen als auch Säureadditionssalze von Aminogruppen der Proteinmoleküle (A). Salze von Carboxylgruppen können in an sich bekannter Weise hergestellt werden und umfassen anorganische Salze, wie zum Beispiel Natrium-, Calcium-, Ammonium-, Eisen- und Zinksalze, sowie Salze mit organischen Basen, wie zum Beispiel Amine wie Triethylamin, Arginin, Lysin, Piperidin und dergleichen. Säureadditionssalze, wie zum Beispiel Salze mit Mineralsäuren, wie Salzsäure oder Schwefelsäure und Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure und Oxalsäure können ebenfalls verwendet werden.

Funktionale äquivalente umfassen natürlich auch Polypeptide (A), die aus anderen Organismen zugänglich sind, sowie natürlich vorkommende Varianten (Allele) derselben. Beispielsweise lassen sich durch Sequenzvergleiche Bereiche homologer Sequenzregionen bzw. konservierte Bereiche festlegen. Unter Verwendung dieser Sequenzen können DNA Datenbanken (z.B. genomische oder cDNA-Datenbanken) unter Anwendung bioinformatischer Vergleichsprogramme nach äquivalenten Enzymen durchmustert werden. Geeignete Computerprogramme und öffentlich zugängliche Datenbanken sind dem Fachmann bekannt.

Diese Alignments bekannter Proteinsequenzen (A) können beispielsweise mit einem Computerprogramm wie Vector NTI 8 (Version vom 25. September 2002) der Firma InforMax Inc. durchgeführt werden.

Funktionale äquivalente sind außerdem Fusionsproteine, welche eine der oben genannten Polypeptidsequenzen (A') oder davon abgeleitete funktionale äquivalente und wenigstens eine weitere, davon funktionell verschiedene, heterologe Sequenz in funktioneller N- oder C-terminaler Verknüpfung (d.h. ohne gegenseitige wesentliche

funktionelle Beeinträchtigung der Fusionsproteinteile) aufweisen. Nichtlimitierende Beispiele für derartige heterologe Sequenzen sind z.B. Signalpeptide oder Enzyme.

Mitumfasste funktionale äquivalente sind Homologe zu den konkret offenbarten Proteinen (A). Diese besitzen wenigstens 40%, 45% oder 50%, vorzugsweise mindestens 55%, 60%, 65% oder 70%, besonders bevorzugt mindestens 75%, 80%,

85%, 90%, 91 %, 92%, 93% oder 94%, ganz besonders bevorzugt mindestens 95% oder 96% Homologie zu einer der konkret offenbarten Aminosäuresequenzen (A), berechnet unter Verwendung der in den Definition offenbarten Computerprogrammen und Computeralgorithmen.

In einer Ausführungsform werden die stringenten Hybridisierungsbedingungen wie folgt gewählt:

Es wird ein Hybridisierungspuffer gewählt, der Formamid, NaCI und PEG 6000 enthält. Die Anwesenheit von Formamid im Hybridisierungspuffer destabilisiert den Doppelstrang der Nukleinsäuremoleküle, wodurch die Hybridisierungstemperatur auf 42°C gesenkt werden kann, ohne dadurch die Stringenz zu erniedrigen. Die Verwendung von Salz im Hybridisierungspuffer erhöht die Renaturierungsrate einer Duplex, bzw. die Hybridisierungseffizienz. Obwohl PEG die Viskosität der Lösung erhöht, was einen negativen Einfluß auf Renaturierungsraten besitzt, wird durch die Anwesenheit des Polymers in der Lösung die Konzentration der Sonde im verbleibenden Medium erhöht, was die Hybridisierungsrate steigert. Die Zusammensetzung des Puffers ist wie folgt:

Hybridisierungspuffer

250 mM Natriumphosphat-Puffer pH 7,2

1 mM EDTA

7 % SDS (g/v)

250 mM NaCI

10 μg/ml ssDNA

5 % Polyethylenglykol (PEG) 6000

40 % Formamid Tabelle 2: Hybridisierungspuffer

Die Hybridisierungen werden bei 42°C über Nacht durchgeführt. Die Filter werden am nächsten Morgen 3x mit 2xSSC + 0,1 % SDS für jeweils ca. 10 min. gewaschen.

Im Falle einer möglichen Proteinglykosylierung umfassen funktionale äquivalente auch die Proteine (A) des oben bezeichneten Typs in deglykosylierter bzw. glykosylierter Form sowie durch Veränderung des Glykosylierungsmusters erhältliche abgewandelte Formen.

Im Falle einer möglichen Proteinphosphorylierung umfassen funktionale äquivalente auch die Proteine (A) des oben bezeichneten Typs in dephosphorylierter bzw. phosphorylierter Form sowie durch Veränderung des Phosphorylierungsmusters erhältliche abgewandelte Formen.

Homologe der Polypeptide (A) können durch Screening kombinatorischer Banken von Mutanten, wie z.B. Verkürzungsmutanten, identifiziert werden. Beispielsweise kann eine Bank von Protein-Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf Nukleinsäureebene erzeugt werden, wie z.B. durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Herstellung von Banken potentieller Homologer aus einer degenerierten Oligonukleotidsequenz verwendet werden können. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem DNA-Syntheseautomaten durchgeführt werden, und das synthetische Gen kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Die Verwendung eines degenerierten Gensatzes ermöglicht die Bereitstellung sämtlicher Sequenzen in einem Gemisch, die den gewünschten Satz an potentiellen Proteinsequenzen kodieren. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind dem Fachmann bekannt (z.B. Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 1 1 :477).

Im Stand der Technik sind mehrere Techniken zum Screening von Genprodukten kombinatorischer Banken, die durch Punktmutationen oder Verkürzung hergestellt worden sind, und zum Screening von cDNA-Banken auf Genprodukte mit einer ausgewählten Eigenschaft bekannt. Die am häufigsten verwendeten Techniken zum Screening großer Genbanken, die einer Analyse mit hohem Durchsatz unterliegen, umfassen das Klonieren der Genbank in replizierbare Expressionsvektoren, Transformieren der geeigneten Zellen mit der resultierenden Vektorenbank und Exprimieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, unter denen der Nachweis der gewünschten Aktivität die Isolation des Vektors, der das Gen kodiert, dessen Produkt nachgewiesen wurde, erleichtert. Recursive-Ensemble-Mutagenese (REM), eine Technik, die die Häufigkeit funktioneller Mutanten in den Banken

vergrößert, kann in Kombination mit den Screeningtests verwendet werden, um Homologe zu identifizieren (Arkin und Yourvan (1992) PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331).

Auch die Durchmusterung von physikalisch verfügbaren cDNA- oder genomischen- DNA Bibliotheken anderer Organismen unter Verwendung der unter SEQ ID No.: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 145, 149, 152, 159, 161, 163, 165, 167 und/oder 169 beschriebenen Nukleinsäuresequenz oder Teilen derselben als Sonde, ist ein dem Fachmann geläufiges Verfahren, um Homologe in anderen Arten zu identifizieren. Dabei haben die von der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No.: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 145, 149, 152, 159, 161, 163, 165, 167 und/oder 169 abgeleiteten Sonden eine Länge von mindestens 20 bp, bevorzugt mindestens 50 bp, besonders bevorzugt mindestens 100 bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 200 bp, am meisten bevorzugt mindestens 400 bp. Die Sonde kann auch ein oder mehrere Kilobasen lang sein, z.b.1 Kb, 1,5 Kb oder 3 Kb. Für die Durchmusterung der Bibliotheken kann auch ein zu den unter SEQ ID No.: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 145, 149, 152, 159, 161, 163, 165, 167 und/oder 169 beschriebenen Sequenzen komplementärer DNA-Strang, oder ein Fragment desselben mit einer Länge zwischen 20 Bp und mehreren Kilobasen eingesetzt werden. Die zu verwendenden Hybridisierungsbedingungen sind oben beschrieben.

Es können aber auch solche DNA Moleküle verwendet werden, die unter Standardbedingungen mit den durch SEQ ID No.: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 145, 149, 152, 159, 161, 163, 165, 167 und/oder 169 beschriebenen und für keratinbindende Polypeptide (A) kodierenden Nukleinsäuremoleküle, der zu diesen komplementären

Nukleinsäuremolekülen oder Teilen der vorgenannten, hybridisieren und als vollständige Sequenzen für Polypeptide (A) kodieren, die über die gleichen Eigenschaften wie die unter SEQ ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 1 12, 1 14, 116, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170 beschriebenen Polypeptide (A) verfügen.

Besonders bevorzugt leiten sich die Polypeptidsequenzen (A) von keratinbindenden Polypeptiden (A) ab, die mindestens eine der Polypeptidsequenzen, wie gezeigt in SEQ ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 100, 102, 104, 106, 108, 110, 1 12, 1 14, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170, umfassen, mit der Maßgabe, dass die Keratinbindung der genannten Polypeptide mindestens 10 %, 20%, 30%, 40% oder 50%, bevorzugt 60%, 70%, 80% oder 90%, besonders bevorzugt 100% des Wertes beträgt, den die entsprechenden Polypeptidsequenzen, wie gezeigt in SEQ ID No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 112, 1 14, 116, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170, aufweisen.

Im Folgenden ist die Bedeutung der Sequenzen im überblick dargestellt:

Sequenzen SEQ ID No.: Sequenztyp Sequenzbeschreibung

1 Nukleinsäure Homo sapiens Desmoplakin_Accession No. N M_004415

2 Protein Homo sapiens Desmoplakin_Accession No. NM_004415

Homo sapiens Desmoplakin_Accession No. NM_004415

3 Nukleinsäure Domäne B

Homo sapiens Desmoplakin_Accession No. NM_004415

4 Protein Domäne B

5 Nukleinsäure Homo sapiens Desmoplakin_Accession No. NM_004415

Domäne B-1

Homo sapiens Desmoplakin_Accession No. NM_004415 Protein Domäne B-1

Homo sapiens Desmoplakin_Accession No. NM_004415 Nukleinsäure Domäne B-2

Homo sapiens Desmoplakin_Accession No. NM_004415 Protein Domäne B-2

Homo sapiens Desmoplakin_Accession No. NM_004415 Nukleinsäure Domäne C

Homo sapiens Desmoplakin_Accession No. NM_004415 Protein Domäne C

Homo sapiens Desmoplakin_Accession No. NM_004415 Nukleinsäure Domäne C- 1

Homo sapiens Desmoplakin_Accession No. NM_004415 Protein Domäne C- 1

Homo sapiens Desmoplakin_Accession No. NM_004415 Nukleinsäure Domäne C-2

Homo sapiens Desmoplakin_Accession No. NM_004415 Protein Domäne C-2 Nukleinsäure H.sapiens_Filaggrin_Accession No. CAI19595 Protein H.sapiens_Filaggrin_Accession No. CAI19596

Homo sapiens plakophilin 1 ACCESSION N M_001005337, Nukleinsäure transcript variant 1 a

Homo sapiens plakophilin 1 ACCESSION N M_001005337, Protein transcript variant 1 a

Homo sapiens plakophilin 1 ACCESSION NM_000299, Nukleinsäure transcript variant 1 b

Homo sapiens plakophilin 1 ACCESSION NM_000299, Protein transcript variant 1 b

Mus musculus plakophilin 2 ACCESSION NM_026163 Nukleinsäure NM_027894

Mus musculus plakophilin 2 ACCESSION NM_026163 Protein NM_027895 Nukleinsäure Mus musculus plakophilin 1 ACCESSION NM_019645 Protein Mus musculus plakophilin 1 ACCESSION NM_019646 Nukleinsäure Bos taurus plakophilin 1 partial mRNA, ACCESSION

XM_868348

Bos taurus plakophilin 1 partial mRNA, ACCESSION Protein XM_868349

Canis familiaris similar to plakophilin 1 isoform 1 a, Nukleinsäure ACCESSION XM_851528

Canis familiaris similar to plakophilin 1 isoform 1 a, Protein ACCESSION XM_851529 Nukleinsäure Danio rerio similar to Plakophilin 1 ACCESSION XM_695832 Protein Danio rerio similar to Plakophilin 1 ACCESSION XM_695833

Rattus norvegicus similar to plakophilin 1 , ACCESSION Nukleinsäure XM_222666

Rattus norvegicus similar to plakophilin 1 , ACCESSION Protein XM_222667

Pan troglodytes similar to Plakophilin 1 , ACCESSION Nukleinsäure XM_514091

Pan troglodytes similar to Plakophilin 1 , ACCESSION Protein XM_514092

Gallus gallus similar to plakophilin 1 , ACCESSION Nukleinsäure XM_419240

Gallus gallus similar to plakophilin 1 , ACCESSION Protein XM_419241

Xenopus laevis similar to plakophilin 4, ACCESSION Nukleinsäure BI390496

Xenopus laevis similar to plakophilin 4, ACCESSION Protein BI390497

Homo sapiens desmoplakin, transcript variant 2, ACCESSION Nukleinsäure N M_001008844

Homo sapiens desmoplakin, transcript variant 2, ACCESSION Protein N M_001008845 Nukleinsäure Mus musculus desmoplakin, ACCESSION XM_621314 Protein Mus musculus desmoplakin, ACCESSION XM_621315

Rattus norvegicus similar to desmoplakin isoform II, Nukleinsäure ACCESSION XM_225259

Rattus norvegicus similar to desmoplakin isoform II, Protein ACCESSION XM_225260 Nukleinsäure Pan troglodytes desmoplakin, ACCESSION XM_518227

Protein Pan troglodytes desmoplakin, ACCESSION XM_518228

Gallus gallus similar to Desmoplakin, ACCESSION Nukleinsäure XM_418957

Gallus gallus similar to Desmoplakin, ACCESSION Protein XM_418958

Homo sapiens junction plakoglobin (JUP), transcript variant 2, Nukleinsäure ACCESSION NM_021991

Homo sapiens junction plakoglobin (JUP), transcript variant 2, Protein ACCESSION NM_021992

Mus musculus, plakoglobin; gamma-catenin, ACCESSION Nukleinsäure NM_010593

Mus musculus, plakoglobin; gamma-catenin, ACCESSION Protein NM_010594

Rattus norvegicus gamma-catenin (plakoglobin), ACCESSION Nukleinsäure NM_031047

Rattus norvegicus gamma-catenin (plakoglobin), ACCESSION Protein NM_031048

Danio rerio armadillo protein family; plakoglobin, ACCESSION Nukleinsäure NM_131 177

Danio rerio armadillo protein family; plakoglobin, ACCESSION Protein NM_131 178

Xenopus tropicalis junction plakoglobin, ACCESSION Nukleinsäure BC064717

Xenopus tropicalis junction plakoglobin, ACCESSION Protein BC064718

Canis familiaris similar to junction plakoglobin isoform 10, Nukleinsäure ACCESSION XM_856625

Canis familiaris similar to junction plakoglobin isoform 10, Protein ACCESSION XM_856626 Nukleinsäure Xenopus laevis Jup protein, ACCESSION BC0941 16 Protein Xenopus laevis Jup protein, ACCESSION BC0941 17

Bos taurus junction plakoglobin, ACCESSION Nukleinsäure NM_001004024

Bos taurus junction plakoglobin, ACCESSION Protein N M_001004025 Nukleinsäure Sus scrofa plakoglobin, ACCESSION NM_214323

Protein Sus scrofa plakoglobin, ACCESSION NM_214324 Nukleinsäure Danio rerio junction plakoglobin, ACCESSION BC058305 Protein Danio rerio junction plakoglobin, ACCESSION BC058306

Saccharomyces cerevisiae, plakoglobin/armadillo/beta-catenin, Nukleinsäure ACCESSION AF005267

Saccharomyces cerevisiae, plakoglobin/armadillo/beta-catenin, Protein ACCESSION AF005268

Homo sapiens plectin 1 , intermediate filament binding protein, Nukleinsäure ACCESSION NM_201380

Homo sapiens plectin 1 , intermediate filament binding protein, Protein ACCESSION NM_201381

Mus musculus plectin 1 (Pleci), transcript variant 11 , mRNA, Nukleinsäure ACCESSION NM_201394 XM

Mus musculus plectin 1 (Pled), transcript variant 11 , mRNA, Protein ACCESSION NM_201394 XM

Bos taurus similar to plectin 1 isoform 1 (LOC510991 ), Nukleinsäure ACCESSION XM_588232

Bos taurus similar to plectin 1 isoform 1 (LOC510991), Protein ACCESSION XM_588233

Canis familiaris similar to plectin 1 isoform, ACCESSION Nukleinsäure XM_539204

Canis familiaris similar to plectin 1 isoform, ACCESSION Protein XM_539205

Trypanosoma cruzi, plectin-like protein, ACCESSION Nukleinsäure XM_809849

Trypanosoma cruzi, plectin-like protein, ACCESSION Protein XM_809850 Nukleinsäure Rattus norvegicus plectin, ACCESSION X59601 Protein Rattus norvegicus plectin, ACCESSION X59602 Nukleinsäure Cricetulus griseus plectin, ACCESSION AF260753 Protein Cricetulus griseus plectin, ACCESSION AF260754 Nukleinsäure Homo sapiens periplakin, ACCESSION NM_002705 Protein Homo sapiens periplakin, ACCESSION NM_002706

Mus musculus periplakin , ACCESSION NM_008909 Nukleinsäure XM_358905 Protein Mus musculus periplakin , ACCESSION NM_008909

XM_358906

89 Nukleinsäure Homo sapiens envoplakin, ACCESSION NM_001988

90 Protein Homo sapiens envoplakin, ACCESSION NM_001989

Mus musculus envoplakin, ACCESSION NM_025276

91 Nukleinsäure XM_283024

Mus musculus envoplakin, ACCESSION NM_025276

92 Protein XM_283025

93 Nukleinsäure Bos taurus similar to Envoplakin, ACCESSION XM_587641

94 Protein Bos taurus similar to Envoplakin, ACCESSION XM_587642

Canis familiaris similar to Envoplakin, ACCESSION

95 Nukleinsäure XM_540443

Canis familiaris similar to Envoplakin, ACCESSION

96 Protein XM_540444

97 Nukleinsäure Danio rerio similar to Envoplakin, ACCESSION XM_687958

98 Protein Danio rerio similar to Envoplakin, ACCESSION XM_687959

Rattus norvegicus, similar to envoplakin, db_xref

99 Nukleinsäure GenelD:303687

Rattus norvegicus, similar to envoplakin, db_xref

100 Protein GenelD:303688

Pan troglodytes similar to Envoplakin, ACCESSION

101 Nukleinsäure XM_511692

Pan troglodytes similar to Envoplakin, ACCESSION

102 Protein XM_511693

103 Nukleinsäure Human bullous pemphigoid antigen, ACCESSION M63618

104 Protein Human bullous pemphigoid antigen, ACCESSION M63619

Mus musculus bullous pemphigoid antigen 1 (Bpagi),

105 Nukleinsäure ACCESSION AF396877

Mus musculus bullous pemphigoid antigen 1 (Bpagi),

106 Protein ACCESSION AF396878

107 Nukleinsäure Mus musculus trichohyalin-like 1 , ACCESSION NM_027762

108 Protein Mus musculus trichohyalin-like 1 , ACCESSION NM_027763

Bos taurus similar to trichohyalin-like 1 , ACCESSION

109 Nukleinsäure XM_597026

Bos taurus similar to trichohyalin-like 1 , ACCESSION

110 Protein XM_597027

11 1 Nukleinsäure Homo sapiens trichohyalin-like 1 , ACCESSION

N M_001008536 XM_060104

Homo sapiens trichohyalin-like 1 , ACCESSION

112 Protein NM_001008536 XM_060105

Strongylocentrotus purpuratus similar to Trichohyalin,

113 Nukleinsäure ACCESSION XM_793822

Strongylocentrotus purpuratus similar to Trichohyalin,

114 Protein ACCESSION XM_793823

Trypanosoma cruzi trichohyalin, putative, ACCESSION

115 Nukleinsäure XM_809758

Trypanosoma cruzi trichohyalin, putative, ACCESSION

116 Protein XM_809759

Giardia lamblia ATCC 50803 trichohyalin, ACCESSION

117 Nukleinsäure XM_765825

Giardia lamblia ATCC 50803 trichohyalin, ACCESSION

118 Protein XM_765826

Aspergillus fumigatus Af293, trichohyalin, ACCESSION

119 Nukleinsäure XM_748643

Aspergillus fumigatus Af293, trichohyalin, ACCESSION

120 Protein XM_748644

121 Nukleinsäure O.cuniculus trichohyalin, ACCESSION Z19092

122 Protein O.cuniculus trichohyalin, ACCESSION Z19093

Pan troglodytes similar to Trichohyalin, ACCESSION

123 Nukleinsäure XM_526770

Pan troglodytes similar to Trichohyalin, ACCESSION

124 Protein XM_526771

125 Nukleinsäure Human trichohyalin (TRHY), ACCESSION L09190

126 Protein Human trichohyalin (TRHY), ACCESSION L09191

Mus musculus small proline-rich protein 3, ACCESSION

127 Nukleinsäure NM_01 1478

Mus musculus small proline-rich protein 3, ACCESSION

128 Protein NM_011479

Homo sapiens small proline-rich protein 2B (SPRR2B),

129 Nukleinsäure ACCESSION NM_001017418

Homo sapiens small proline-rich protein 2B (SPRR2B),

130 Protein ACCESSION NM_001017419

131 Nukleinsäure Mus musculus hair follicle protein AHF, ACCESSION

XM_485271

Mus musculus hair follicle protein AHF, ACCESSION

132 Protein XM_485272

Homo sapiens epiplakin 1 (EPPK1 ), ACCESSION

133 Nukleinsäure NM_031308 XM_372063

Homo sapiens epiplakin 1 (EPPK1 ), ACCESSION

134 Protein NM_031308 XM_372064

Mus musculus epiplakin 1 , ACCESSION NM_144848

135 Nukleinsäure NM_173025

Mus musculus epiplakin 1 , ACCESSION NM_144848

136 Protein NM_173026

Mus musculus structural protein FBF1 , ACCESSION

137 Nukleinsäure AF241249

Mus musculus structural protein FBF1 , ACCESSION

138 Protein AF241250

Streptococcus mutans spaP gene for antigen l/l I, ACCESSION

139 Nukleinsäure X17390

Streptococcus mutans spaP gene for antigen l/l I, ACCESSION

140 Protein X17391

141 Nukleinsäure Sequenz des PCR-Primers Bag 43

142 Nukleinsäure Sequenz des PCR-Primers Bag 44

143 Nukleinsäure Sequenz des PCR-Primers Bag 53

144 Nukleinsäure Sequenz des PCR-Primers Bag 51

DNA-Fragment welches mittels der PCR-Primer Lib148 (SEQ

145 Nukleinsäure ID No.: 147) und Lib149 (SEQ ID No.: 148) amplifiziert wurde

Translationsprodukt des Nukleinsäuremoleküls SEQ ID No.:

146 Protein 145

147 Nukleinsäure Sequenz des PCR-Primers Lib148

148 Nukleinsäure Sequenz des PCR-Primers Lib149

DNA-Fragment welches mittels der PCR-Primer Lib149 (SEQ

149 Nukleinsäure ID No.: 148) und Lib150 (SEQ ID No.:151) amplifiziert wurde.

Translationsprodukt des Nukleinsäuremoleküls SEQ ID No.:

150 Protein 149

151 Nukleinsäure Sequenz des PCR-Primers Lib150

DNA-Fragment welches mittels der PCR-Primer Lib151 (SEQ

152 Nukleinsäure ID No.:156 ) und Lib152 (SEQ ID No.: 157) amplifiziert wurde

Translationsprodukt des Nukleinsäuremoleküls SEQ ID No.:

153 Protein 152

154 Nukleinsäure Sequenz des PCR-Primers Lib151

155 Nukleinsäure Sequenz des PCR-Primers Lib152

KBD-B_3_Homo sapiens Desmoplakin_Accession No.

156 Protein NM_004415 Domäne B-3

KBD-B_4 Homo sapiens Desmoplakin_Accession No.

157 Protein NM_004415 Domäne B-4

KBD-B_5 Homo sapiens Desmoplakin_Accession No.

158 Protein NM_004415 Domäne B-5

KBD-B_6 Homo sapiens Desmoplakin_Accession No.

159 Nukleinsäure NM_004415 Domäne B-5

KBD-B_6 Homo sapiens Desmoplakin_Accession No.

160 Protein NM_004415 Domäne B-5

161 Nukleinsäure Homo sapiens trichoplein, BC004285

162 Protein Homo sapiens trichoplein, BC004285

H. sapiens Desmoplakin_Accession No. NM_004415 mit

163 Nukleinsäure Nukleinsäureaustauschen im Verlgeich zu SEQ ID No.: ID 1

Homo sapiens Desmoplakin_Accession No. NM_004415 mit Aminosäureaustauschen an den Positionen 905, 2687 und

164 Protein 2688 im Verlgeich zu SEQ ID No.: ID 2

KBD-B_7 Homo sapiens Desmoplakin_Accession No.

165 Nukleinsäure NM_004415 Domäne B-7

KBD-B_7 Homo sapiens Desmoplakin_Accession No.

166 Protein NM_004415 Domäne B-7

KBD-D mit N-terminalem Histidinanker , H. sapiens Plakophilin

167 Nukleinsäure 1 a ACCESSION NMJ)01005337

KBD-D mit N-terminalem Histidinanker , H. sapiens Plakophilin

168 Protein I aACCESSION NP_001005337

KBD-D Aminosäuren 1-273 mit C-terminalem Histidinanker , H.

169 Nukleinsäure sapiens Plakophilin I a ACCESSION N M_001005337

BD-D Aminosäuren 1-273 mit C-terminalem Histidinanker , H.

170 Protein sapiens Plakophilin 1 a ACCESSION NP_001005337

Bevorzugt leiten sich die Polypeptidsequenzen (A') von Polypeptiden (A) ab, die für den gewünschten Organismus eine hochspezifische Affinität besitzen. Für Anwendungen in der Hautkosmetik werden demzufolge Polypeptidsequenzen (A') bevorzugt eingesetzt, die sich von keratinbindenden Polypeptiden (A) ableiten, die zu dem humanen Haut-Keratin eine besonders hohe Affinität haben. Für Anwendungen in der Haarkosmetik werden solche Polypeptidsequenzen (A') bevorzugt, die sich von keratinbindenden Polypeptiden (A) ableiten, die zu humanem Haarkeratin eine besonders hohe Affinität haben.

Für Anwendungen auf dem Haustiergebiet werden, neben den Polypeptidsequenzen (A'), die sich von den beschriebenen Polypeptiden (A) (SEQ ID No. No.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 1 12, 114, 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 146, 150, 153, 156, 157, 158, 160, 162, 164, 166, 168 oder 170) ableiten, entsprechend solche Polypeptidsequenzen (A) bevorzugt, die sich von keratinbindenden Polypeptiden (A) ableiten, die zu dem entsprechenden Keratin, beispielsweise Hundekeratin oder Katzenkeratin eine besonders hohe Affinität besitzen.

Die Polypeptidsequenzen (A') können sich aber auch von mehr als einem keratinbindenden Polypeptid (A) ableiten. Beispielsweise können sie sich von einem keratinbindenden Polypeptid (A), das eine hohe Bindungsaffinität zu humanem Hautkeratin besitzt, in Verbindung mit einem anderen keratinbindenden Polypeptid (A), das eine hohe Affinität zu humanem Haarkeratin besitzt, ableiten. Sie können sich auch von Chimären Polypeptiden (A) ableiten, die mehrere Kopien der gleichen (oder auch verschiedenen) keratinbindenden Polypeptide (A) oder deren keratinbindenden Domänen enthalten. Dadurch kann eine besonders effektive Keratinbindung erzielt werden.

Vorteilhafte keratinbindende Polypeptide (A), die sich für die Herstellung von Polypeptidsequenzen (A') besonders gut eignen, sind bekannt. Beispielsweise enthalten Desmoplakine und Plectine (A) keratinbindende Domänen (Fontao L, Favre B, Riou S, Geerts D, Jaunin F, Saurat JH, Green KJ, Sonnenberg A, Borradori L., Interaction of the bullous pemphigoid antigen 1 (BP230) and desmoplakin with intermediate filaments is mediated by distinct sequences within their COOH terminus., Mol Biol Cell. 2003 May; 14(5): 1978-92. Epub 2003 Jan 26; Hopkinson SB, Jones JC,

The N terminus of the transmembrane protein BP180 interacts with the N-terminal domain of BP230, thereby mediating keratin cytoskeleton anchorage to the cell surface at the Site of the hemidesmosome, Mol Biol Cell. 2000 Jan; 1 1 (1 ):277-86).

Beispiele besonders gut geeigneter, keratinbindender Polypeptiddomänen sind in den Poylpeptidsequenzen (A'), die sich von Desmoplakinen, Plakophilinen, Plakoglobinen, Plectinen, Periplakinen, Envoplakinen, Trichohyalinen, Epiplakinen oder Haarfollikelproteinen (A) ableiten, vorhanden.

Die erfindungsgemäßen Konjugate (A'B'C), insbesondere die erfindungsgemäßen Konjugate (A'B'C'D ¹ ), enthalten im statistischen Mittel mindestens eine Polymerkette (B').

Die Polymerkette (B') leitet sich im vorstehend aufgeführten Sinne von mindestens einem, insbesondere einem, wasserlöslichen oder wasserdispergierbaren, seitenständige und/oder endständige, reaktive funktionelle Gruppen (b1 ) tragenden Polymer (B) ab.

Für die vorliegende Erfindung ist es wesentlich, dass das Polymer (B) danach ausgewählt ist, dass es zusammen mit dem zum Konjugat (A'B'C), insbesondere zum

Konjugat (A'B'C'D'), umzusetzenden keratinbindenden Polypeptid (A) im Normzustand

- vorzugsweise nach DIN 1343: 1990-01 definiert - eine homogene wässrige Lösung oder Dispersion, worin das Polypeptid (A) noch immer eine keratinbindende Aktivität aufweist bildet. Vorzugsweise liegt die keratinbindende Aktivität des gelösten oder dispergierten Polypeptids (A) bei mindestens 75% der Aktivität derselben Menge an unbehandeltem Polypeptid (A).

Demnach kann sich die Polymerkette (B') von jedwedem üblichen und bekannten Polymeren (B) ableiten, solange dieses das vorstehend beschriebene Eigenschaftsprofil aufweist. Vorzugsweise leitet sich die Polymerkette (B') von einem Polymer (B) ab, das aus der Gruppe, bestehend aus wasserlöslichen oder wasserdispergierbaren Polyamiden, Polycarbonaten, Polyurethanen, Polyharnstoffen, Polyglycerinen und Poly(hydroxylalkylacrylat)-Polyalkylenoxid-

Blockmischpolymerisaten, insbesondere Poly(hydroxylethylacrylat)-Polyalkylenoxid- Blockmischpolymerisaten, ausgewählt ist.

Als reaktive funktionelle Gruppen (b1 ) kommen übliche und bekannte reaktive funktionelle Gruppen der Organischen Chemie in Betracht. Wesentlich für deren Auswahl ist, dass sie die Lagerstabilität der Polymeren (B) nicht beeinträchtigen und unter milden Bedingungen, vorzugsweise unter 50 ⁰ C, insbesondere im Normzustand, mit den nachstehend beschriebenen komplementären reaktiven funktionellen Gruppen (c1) und (d1 ) rasch reagieren, ohne dass es dabei in merklichem Ausmaß zu Nebenreaktionen oder Zersetzungserscheinungen kommt.

Vorzugsweise werden die reaktiven funktionellen Gruppen (b1 ) aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxylgruppen, Aminogruppen, Carbonylgruppen und Säuregruppen, insbesondere Carbonsäuregruppen und aktivierten Carbonsäuregruppen, wie nachstehend beschrieben, ausgewählt.

Die Polymerkette (B') kann sich dabei von einem linearen, kammförmig verzweigten, hyperverzweigten oder dendrimeren Polymeren (B) ableiten. Insbesondere leitet sie sich von einem hyperverzweigten Polymer (B) ab.

Beispiele besonders vorteilhafter Polymerer (B), die sich besonders gut für die Herstellung der Polymerketten (B') eignen, sind aus den internationalen Patentanmeldungen WO 2005/026234 A1 , insbesondere Seite 3, Seite 1 1 , bis Seite 15, Zeile 10, in Verbindung mit Tabelle 1 , Seiten 16 bis 19, und WO 2007/00601 19 A, insbesondere Seite 5, Zeile 1 , bis Seite 29, Zeile 8, bekannt.

In den erfindungsgemäßen Konjugaten (A'B'C), insbesondere in den erfindungsgemäßen Konjugaten (A'B'C'D ¹ ), ist die Polymerkette (B') mit der Polypeptidsequenz (A) über mindestens eine Linkergruppe (C) verbunden.

Die Linkergruppe (C) leitet sich im vorstehend genannten Sinne von einem Linkermolekül (C) ab, das mindestens eine, insbesondere eine, komplementäre reaktive funktionelle Gruppe (d ) und mindestens eine, insbesondere eine, komplementäre reaktive funktionelle Gruppe (c2) enthält.

Die reaktiven funktionellen Gruppen (d) und (c2) können über eine kovalente Bindung, beispielsweise eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung, miteinander verknüpft sein. In diesem Falle besteht das Linkermolekül (C) aus diesen beiden Gruppen.

Indes sind die reaktiven funktionellen Gruppen (c1 ) und (c2) vorzugsweise über eine permanente Spacergruppe (c3) miteinander verknüpft. Bevorzugt werden die nachstehend beschriebenen permanenten Spacergruppen (d2) verwendet.

Bevorzugt werden die komplementären reaktiven funktionellen Gruppen (c1 ) aus der Gruppe der nachstehend beschriebenen, komplementären reaktiven funktionellen Gruppen (d1 ) ausgewählt.

Bevorzugt handelt es sich bei den komplementären reaktiven funktionellen Gruppen (c2) um sulfhydrylreaktive Gruppen, d.h. SH-reaktive Gruppen. Besonders bevorzugt werden die sulfhydrylreaktiven Gruppen (c2) aus der Gruppe, bestehend aus Maleinimidgruppen, Pyridiyldisulfidgruppen, alpha-Haloacetylgruppen,

Vinylsulfongruppen und Sulfatoalkylsulfongruppen, ausgewählt. Insbesondere werden Maleinimidgruppen (c2) verwendet.

Beispiele besonders vorteilhafter Linkermoleküle (C), von denen sich besonders gut geeignete Linkergruppe (C) ableiten, sind Maleinimidocaproylchlorid, Maleinimidopropionsäure-N-succinimidylester sowie die in der internationalen Patentanmeldung WO 2007/0601 16 A2, Seite 13, Zeile 25, bis Seite 15, Zeile 11 , beschriebenen Linkermoleküle (C), insbesondere Maleinimidopentanol.

Vorzugsweise ist die Linkergruppe (C) über kovalente Bindungen mit der Polymerkette (B') verbunden. Bevorzugt resultieren diese kovalente Bindungen aus der Umsetzung einer in dem entsprechenden Linkermolekül (C) befindlichen, komplementären reaktiven funktionellen Gruppe (d ) mit einer in dem entsprechenden Polymer (B) befindlichen, reaktiven funktionellen Gruppe (b1 ).

Vorzugsweise ist die Linkergruppe (C) ebenfalls über kovalente Bindungen mit der Polypeptidsequenz (A') verbunden. Bevorzugt resultieren diese kovalente Bindungen aus der Umsetzung einer in dem entsprechenden Linkermolekül (C) befindlichen, reaktiven funktionellen Gruppe (c2) mit einer in dem entsprechenden keratinbindenden Polypeptid (A) befindlichen, komplementären reaktiven funktionellen Gruppe (a1 ).

Bevorzugt handelt es sich bei den komplementären reaktiven funktionellen Gruppen (a1) um Aminogruppen und/oder Thiolgruppen, vorzugsweise Thiolgruppen. Insbesondere sind die Thiolgruppen (a1) an Cysteinreste gebunden.

Für die erfindungsgemäßen Konjugate (A'B'C) ergeben sich besondere Vorteile, wenn sie im statistischen Mittel mindestens eine Effektorgruppe (D') an die Polymerkette (B') gebunden enthalten, so dass die erfindungsgemäßen Konjugate (A'B'C'D ¹ ) resultieren.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet »Effektorgruppe« eine Gruppe oder einen Rest, der eine bestimmte vorhersehbare Wirkung, bevorzugt eine biologische, physikalische oder physiologische, schützende, vorbeugende und/oder pflegende Wirkung auf Haut, Haare und/oder Nägel aufweist oder einen kosmetischen dekorativen Effekt besitzt.

Bis auf die keratinbindende Wirkung beruhen die sonstigen Wirkungen der erfindungsgemäßen Polypeptidwirkstoffe in hohem Maße oder ausschließlich auf den jeweils vorhandenen Effektorgruppen (D').

Vorzugsweise ist die Effektorgruppe (D') über kovalente Bindungen an die Polymerkette (B') gebunden. Bevorzugt werden dabei die kovalenten Bindungen durch die Umsetzung einer in einem entsprechenden Effektormolekül (D) befindlichen, komplementären reaktiven funktionellen Gruppe (d1 ) mit der in einem entsprechenden Polymer (B) befindlichen, reaktiven funktionellen Gruppen (b1 ) geknüpft. Dies bedeutet, dass sich die Effektorgruppe (D') im vorstehend definierten Sinne von dem entsprechenden Effektormolekül (D) ableitet.

An und für sich kommen alle organischen, anorganischen, metallorganischen und biochemischen Gruppen oder Reste, die einen chemischen, physikalischen, physiologischen, toxikologischen, pharmakologischen, biologischen oder irgendeinen anderen Effekt zeigen, als Effektorgruppen (D') in Betracht.

Vorzugsweise leiten sich die Effektorgruppen (D') von einem Effektormolekül (D), ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus proteinartigen Effektormolekülen und nicht-proteinartigen Effektormolekülen, ab.

Bevorzugt werden die nicht-proteinartigen Effektormoleküle (D) aus der Gruppe, bestehend aus Farbstoffen, Pigmenten, Lichtschutzmitteln, Vitaminen, Provitaminen,

Antioxidantien, Peroxidzersetzern, Repellentwirkstoffen, Fettsäuren, Conditioner, radioaktive und nicht radioaktive Metallionen enthaltenden Verbindungen,

Cyclodextrinen, Hormonen, Diagnostika, Pharmazeutika, antimikrobiellen Verbindungen, Insektiziden, Akariziden und Fungiziden, ausgewählt.

Bevorzugt werden die proteinartigen Effektormoleküle (D) aus der Gruppe, bestehend aus Enzymen, Antikörpern, Antikörperfragmenten und nicht enzymatisch wirkenden, proteinartigen Effektormolekülen, ausgewählt.

Bevorzugt werden die nicht enzymatisch wirkenden, proteinartigen Effektormoleküle (D) aus der Gruppe, bestehend aus antimikrobiellen Peptiden, selbstassemblierenden Proteinen, Hydrophobinen, Kollagen, Carotinoid bindenden Proteinen, Schwermetalle bindenden Proteinen, Odorantien bindenden Proteinen und Fluoreszenzproteinen, ausgewählt.

Beispiele vorteilhafter Effektormoleküle (D), die sich besonders gut für die Herstellung von Effektorgruppen (D') eignen, sind aus den internationalen Patentanmeldungen

WO 2007/0601 16 A2, Seite 18, Zeile 24, bis Seite 25, Zeile 6, sowie Seite 94, Zeile 24, bis Seite 102, Zeile 3;

- WO 2005/115306 A2, Seite 26, 5. Absatz, "Effektormoleküle (U)", bis Seite 36, 3. Absatz;

WO 2007/0601 17 A2, Seite 22, Zeile 45, bis Seite 26, Zeile 25;

- WO 2007/063024 A2, Seite 27, Zeile 12, bis Seite 38, Zeile 16, sowie Seite 84, Zeile 29, bis Seite 148, Ende der Tabelle;

WO 2007/031734 A1 , Seite 8, Zeile 7, bis Seite 10, Zeile 3; oder

- WO 2007/059076 A2, Seite 19, Zeile 19, bis Seite 20, Zeile 14;

bekannt.

Die komplementären reaktiven funktionellen Gruppen (d1 ) können bereits in den Effektormolekülen (D) vorhanden sein oder nachträglich durch chemische Reaktionen eingebracht werden.

Bevorzugt werden die komplementären reaktiven funktionellen Gruppen (d1 ) des Effektormoleküls (D) aus der Gruppe, bestehend aus Säuregruppen, Säurehalogenidgruppen, Säureanhydridgruppen, aktivierten Säuregruppen, Hydroxylgruppen und Aminogruppen, ausgewählt.

Besonders bevorzugt sind die Säuregruppen (d1 ) Carbonsäuregruppen, die Säurehalogenidgruppen (d1 ) Carbonsäurechloridgruppen, die Säureanhydridgruppen (d1) cyclische Carbonsäureanhydridgruppen oder symmetrische oder gemischte Carbonsäureanhydridgruppen und die aktivierten Säuregruppen (d1) aktivierte Carbonsäuregruppen.

Ganz besonders bevorzugt werden die aktivierten Carbonsäuregruppen (d1 ), die mit Vorteil auch als aktivierte Carbonsäuregruppen (b1) in den Polymeren (B) verwendet werden können, aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxysuccinimidestergruppen, Pentafluorphenolcarbonsäureestergruppen, Thiophenolcarbonsäureestergruppen, Carbonsäureimidazolidgruppen, N-Carbonyl-4-dimethylaminopyridiniumgruppen und N-Methylpyridiniumhalogenid-2-hydroxy-carbonsäureestergrupp en, ausgewählt oder sie werden in situ, insbesondere mithilfe einer aktivierenden Verbindung oder einer Mischung aktivierender Verbindungen, gebildet.

Insbesondere wird die aktivierende Verbindung aus der Gruppe, bestehend aus Carbodiimiden, insbesondere Dicyclohexylcarbodiimid, Diisopropylcarbodiimid, N'-(3- Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimid-hydrochlorid und Carbonyldiimidazol; Uroniumverbindungen, insbesondere O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'- tetramethyluronium-hexafluorophosphat (HBTU) und O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)- N,N,N',N'-tetramethyluronium-hexafluorophosphat (HATU);

Phosphoniumverbindungen, insbesondere (Benzotriazol-1 -yloxy)-tris-(dimethylamino)- phosphonium-hexafluorophosphat (BOP), Brom-tris-(dimethylamino)phosphonium- hexafluorophosphat (BroP) und (Benzotriazol-i-yloxy)-tripyrrolidinophosphonium- hexafluorophosphat (PyBOP); N,N-Dimethylaminopyridin; N-Hydroxysuccinimid; Pentafluorphenol und N-Hydroxybenzotriazol, ausgewählt.

Die Effektorgruppe (D') kann aber auch von Effektormolekülen (D) abgeleitet sein, deren komplementäre reaktive funktionelle Gruppen (d1 ) über abstandshaltende Gruppen oder Spacergruppen (d2) mit den für den gewünschten Effekt alleine oder hauptsächlich verantwortlichen Gruppen in den Effektormolekülen (D) verbunden sind.

Dabei können die Effektormoleküle (D) mit Spacergruppen (d2) unterschiedliche Grundstrukturen aufweisen.

Im einfachsten Fall kann das Effektormolekül (D) mindestens eine, insbesondere eine, Spacergruppe (d2) aufweisen, die jeweils mindestens eine, insbesondere eine, komplementäre reaktive funktionelle Gruppe (d1 ) mit der für den gewünschten Effekt alleine oder hauptsächlich verantwortlichen Gruppe verknüpft.

Das Effektormolekül (D) kann aber auch eine Spacergruppe (d2) aufweisen, die mindestens eine, insbesondere eine, komplementäre reaktive funktionelle Gruppe (d1 ) mit mindestens zwei der für den gewünschten Effekt alleine oder hauptsächlich verantwortlichen Gruppen verknüpft. Dabei können die für den gewünschten Effekt alleine oder hauptsächlich verantwortlichen Gruppen und/oder ihre Effekte gleich oder von einander verschieden sein. Dabei kann der Fachmann die die für den gewünschten Effekt alleine oder hauptsächlich verantwortlichen Gruppen derart auswählen, dass sich vorteilhafte additive, insbesondere synergistische, Effekte ergeben.

Die Spacergruppe (d2) kann permanent sein. Dies bedeutet, dass sie unter den chemischen und physikalischen Bedingungen der Herstellung, insbesondere nach dem erfindungsgemäßen Herstellverfahren, der Lagerung und der Verwendung, insbesondere der erfindungsgemäßen Verwendung, inert ist, d.h. sie verändert sich unter diesen Bedingungen nicht oder nur unmerklich langsam.

Beispiele geeigneter Spacergruppen (d2) sind zwei- oder mehrbindige Gruppen, die aliphatische, cycloaliphatische und/oder aromatische Gruppen enthalten oder hieraus bestehen.

Die aliphatischen, cycloaliphatischen und/oder aromatischen Gruppen können mit Resten substituiert sein, die im vorstehend genannten Sinne inert sind. Die Substituenten können den Spacergruppen (d2) hydrophile oder hydrophobe Eigenschaften verleihen.

Beispiele geeigneter Substituenten sind Fluor- und Chloratome, Nitrilgruppen und Nitrogruppen.

Außerdem können die aliphatischen, cycloaliphatischen und/oder aromatischen Gruppen über übliche und bekannte verknüpfende Gruppen der organischen Chemie, die im vorstehend genannten Sinne inert sind, miteinander verbunden sein. Auch diese verknüpfenden Gruppen können den Spacergruppen (d2) hydrophile oder hydrophobe Eigenschaften verleihen.

Beispiele geeigneter verknüpfender Gruppen sind Carbonsäureester-, Carbonsäureamid-, Harnstoff-, Urethan-, Thioether-, Disulfid- und Ethergruppen.

Die Spacergruppe (d2) kann aber auch durch chemische Reaktionen gespalten oder im Sinne einer Selbstopferung abgebaut werden. Die Spaltung oder der Abbau kann die Effektormoleküle (D) im Sinne eines "slow release" oder "controlled release" an den Stellen, an denen sie wirksam werden sollen, wieder freisetzen.

Die chemischen Reaktionen können enzymatisch, beispielsweise durch die Wirkung von Enzymen, insbesondere hauteigener Enzyme, wie Esterasen, Lipasen oder Glucosidasen, oder durch Umgebungsbedingungen, wie Feuchtigkeit änderung des pH-Wertes oder energiereiche Strahlung, insbesondere elektromagnetische Strahlung wie Infrarot, nahes Infrarot (NIR), sichtbares Licht, UV-Strahlung, Röntgenstrahlung oder Gammastrahlung, und Korpuskularstrahlung wie Elektronenstrahlung, Betastrahlung oder Alphastrahlung, initiiert und/oder katalysiert werden.

Dabei stellt die Selbstopferung ("self-immolation") gewissermaßen einen Extremfall der Spaltung dar, bei dem die Spacergruppe (d2) aufgrund eines einzigen chemischen "Anstoßes" wieder komplett in ihre Ausgangsprodukte zerfällt. Beispiele geeigneter selbstopfernder Spacergruppen sind aus der internationalen Patentanmeldung WO 2007/031734 A1 , Seite 7, Zeile 13 bis 25, bekannt.

In den erfindungsgemäßen Polypeptidwirkstoffen (A'B'C) oder (A'B'C'D ¹ ) können die Mengenverhältnisse der Polypeptidsequenzen (A'), der Polymerketten (B'), der

Effektorgruppen (D') und der Linkergruppen (C) außerordentlich breit variieren und hervorragend den Erfordernissen des Einzelfalls angepasst werden. Insbesondere richten sich die Mengenverhältnisse nach den Molekulargewichten der einzelnen

Bestandteile (A'), (B'), (C) sowie gegebenenfalls (D') und der Anzahl der reaktiven funktionellen Gruppen (a1 ) und (b1). Die Anzahl der reaktiven funktionellen Gruppen

(a1) bestimmt im Einzelfall, mit wie vielen Polymerketten (B') eine gegebene

Polypeptidsequenz (A') allerhöchstens verknüpft sein kann. Die Anzahl der reaktiven

funktionellen Gruppen (b1) legt im Einzelfall die maximale Anzahl von Effektorgruppen (D') fest, die an eine gegebene Polymerkette (B') gebunden sein können. Der Fachmann kann daher die Mengenverhältnisse der Ausgangsprodukte (A), (B), (C) und (D), die er für die Herstellung eines bevorzugten erfindungsgemäßen Konjugats (A'B'C'D ¹ ) verwenden muss, in einfacher Weise berechnen. Gegebenenfalls kann er auch das Mengenverhältnis abschätzen und einige wenige orientierende Versuche zur Optimierung durchführen.

Die erfindungsgemäßen Polypeptidwirkstoffe können mithilfe üblicher und bekannter Verfahren der Organischen Chemie und Biochemie hergestellt werden. Vorzugsweise werden sie jedoch mithilfe des erfindungsgemäßen Herstellverfahrens gewonnen.

Das erfindungsgemäße Herstellverfahren geht im ersten Verfahrenschritt von der Auswahl eines wasserlöslichen oder wasserdispergierbaren, seitenständige und/oder endständige reaktive funktionelle Gruppen (b1 ) tragenden Polymers (B) aus. Die Auswahl wird danach getroffen, ob das Polymer (B) mit dem zu einem Konjugat (A'B'C), insbesondere einem Konjugat (A'B'C'D'), umzusetzenden keratinbindenden Polypeptid (A) im Normzustand, wie vorstehend definiert, eine homogene wässrige Lösung oder Dispersion, worin das Polypeptid (A) noch immer eine keratinbindende Aktivität, wie vorstehend beschrieben, aufweist, zu bilden vermag.

Im zweiten Verfahrenschritt wird das ausgewählte Polymer (B) mit mindestens einem Typ von Linkermolekülen (C) zu einem Polymer (B'C), enthaltend mindestens eine seitenständige und/oder mindestens eine endständige Linkergruppe (C) mit mindestens einer reaktiven funktionellen Gruppe (c2), umgesetzt.

Vorzugsweise wird in diesem Verfahrenschritt das ausgewählte Polymer (B) noch mit mindestens einem Typ von Effektormolekülen (D), enthaltend mindestens eine komplementäre reaktive funktionelle Gruppe (d1), die mit den reaktiven funktionellen Gruppen (b1) reagieren kann, so dass ein Polymer (B ¹ CD') resultiert. Dabei kann das ausgewählte Polymer (B) gleichzeitig mit (C) und (D) umgesetzt werden. Es ist aber auch möglich, das ausgewählte Polymer (B) zunächst mit (C) und anschließend mit (D) oder alternativ zunächst mit (D) und anschließend mit (C) umzusetzen.

Im dritten Verfahrenschritt wird das Polymer (B'C), vorzugsweise das Polymer (B ¹ CD'), mit einem keratinbindenden Polypeptid (A) zu einem Konjugat (A'B'C), vorzugsweise zu einem Konjugat (A'B'C'D'), umgesetzt.

Bevorzugt werden im zweiten Verfahrenschritt die vorstehend beschriebenen Polymere (B) und die vorstehend beschriebenen Linkermoleküle (C) sowie vorzugsweise die vorstehend beschriebenen Effektormoleküle (D) eingesetzt, so dass ein Polymer (B ¹ C), vorzugsweise ein Polymer (B ¹ CD'), resultiert, das mindestens eine seitenständige und/oder mindestens eine endständige Linkergruppe (C) mit mindestens einer reaktiven funktionellen Gruppe (c2) sowie vorzugsweise mindestens eine seitenständige und/oder mindestens eine endständige Effektorgruppe (D') enthält.

Im dritten Verfahrenschritt werden das resultierende Polymer (B'C), vorzugsweise das Polymer (B ¹ CD'), mit dem keratinbindenden Polypeptid (A) umgesetzt, indem man die hierin vorhandenen reaktiven funktionellen Gruppen (c2) mit den komplementären reaktiven funktionellen Gruppen (a1 ) des keratinbindenden Polypeptids (A) reagieren lässt.

Das erfindungsgemäße Herstellverfahren weist keine methodischen Besonderheiten auf, sondern kann in Lösung in Vorrichtungen, wie sie in der Organischen Chemie und/oder Biochemie in üblich und bekannt sind, durchgeführt werden. Dabei kann die Umsetzung im zweiten Verfahrenschritt in einem wässrigen oder einem organischen Medium oder einem wässrig/organischen Medium durchgeführt werden. Vorzugsweise werden als organische Medien wassermischbare, aprotisch polare organische Lösemittel wie Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, N-Methylpyrrolidon oder Tetrahydrofuran verwendet. Die Reinigung des im zweiten Verfahrenschritt resultierenden Polymeren (B'C), vorzugsweise des Polymeren (B ¹ CD'), kann ebenfalls in üblicher und bekannter Weise insbesondere durch Diafiltration bzw. Dialyse gegen deionisiertes Wasser erfolgen, wobei eine wässrige Lösung oder Dispersion des gereinigten Polymeren (B'C), vorzugsweise des gereinigten Polymeren (B ¹ CD'), resultiert. Vorzugsweise erfolgt die Umsetzung im dritten Verfahrenschritt in einem wässrigen Medium, bevorzugt in einem gepufferten wässrigen Medium, insbesondere in einem Phosphatpuffer. Die Reinigung des resultierenden Konjugats (A'B'C), vorzugsweise des resultierenden Konjugats (A'B'C'D ¹ ) kann ebenfalls in üblicher und bekannter Weise insbesondere durch Diafiltration oder Dialyse gegen deionisiertes Wasser erfolgen.

Die erfindungsgemäßen Polypeptidwirkstoffe und die nach dem erfindungsgemäßen Herstellverfahren hergestellten keratinbindenden Polypeptidwirkstoffe bieten überraschende Vorteile und können außerordentlich vielseitig eingesetzt werden.

Die erfindungsgemäßen Polypeptidwirkstoffe und die nach dem erfindungsgemäßen Herstellverfahren hergestellten keratinbindenden Polypeptidwirkstoffe bieten ganz besondere Vorteile, wenn sie im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung für die Modifizierung von Keratin und keratinhaltigen Materialien verwendet werden. Zu diesem Zweck können sie in der Form von kosmetischen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen, die sie enthalten oder die hieraus bestehen, verwendet werden. Bevorzugt werden diese erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zur kosmetischen Behandlung keratinhaltiger Materialien, insbesondere zur kosmetischen Behandlung menschlicher und tierischer, Haut, Haare und Nägel, verwendet. Die hierfür verwendeten erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind daher insbesondere hervorragende Haut-, Haar- und Nagelpflegemittel, -reinigungsmittel, - Schutzmittel oder -färbemittel oder dekorative Kosmetika.

Die besonderen Vorteile der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen lassen sich vor allem darauf zurückzuführen, dass die erfindungsgemäßen Polypeptidwirkstoffe und die nach dem erfindungsgemäßen Herstellverfahren gewonnenen Polypeptidwirkstoffe mit einer außerordentlich großen Anzahl unterschiedlichster Hilfs- und Zusatzstoffe, wie sie insbesondere auf dem Gebiet der Pharmazie und der Kosmetik verwendet werden, kombiniert werden können, so dass sich ein ganz besonders breites Anwendungsspektrum ergibt.

Beispiele geeigneter Hilfs- und Zusatzstoffe, die mit den erfindungsgemäßen Polypeptidwirkstoffen und den nach dem erfindungsgemäßen Herstellverfahren gewonnenen Polypeptidwirkstoffen kombiniert werden können, sowie vorteilhafte Mengenverhältnisse, sind aus den internationalen Patentanmeldungen

WO 2005/1 15306 A2, Seite 39, sechster Absatz, bis Seite 42, Ende des dritten Absatzes;

WO 2007/060166 A2, Seite 37, Zeile 20, bis Seite 56, Zeile 38;

WO 2007/0601 17 A2, Seite 30, Zeile 9, bis Seite 62, Zeile 43;

WO 2007/059076 A2, Seite 23, Zeile 24, bis Seite 27, Zeile 3; und

WO2007/063024 A2, Seite 47, Zeile 11 , bis Seite 54, Zeile 23.

Auf die zitierten Passagen wird hier ausdrücklich Bezug genommen.

Beispiele und Vergleichsversuch

Beispiel 1 und Vergleichsversuch V1

Die Auswahl der wasserlöslichen oder wasserdispergierbaren Polymeren (B1 ) bis (B6)

Beispiel 1 :

Die folgenden wasserlöslichen oder wasserdispergierbaren Polymeren (B) wurden auf ihre Eignung zur Herstellung der Polymerketten (B') von Konjugaten (A'B'C) und (A'B'C'D ¹ ) getestet:

(B1 ) Wasserlösliches, hydroxylgruppenhaltiges, verzweigtes Polycarbonat eines zahlenmittleren Molekulargewichts von 2.650 Dalton, eines massenmittleren Molekulargewichts von 5.500 Dalton und einer Hydroxylzahl von 146 mg KOH/g, hergestellt aus Trimethylolpropan und Ethylenoxid im Molverhältnis 1 : 12 gemäß der internationalen Patentanmeldung WO 2005/026234 A1.

(B2) Wasserdispergierbares, hydroxylgruppenhaltiges, verzweigtes Polycarbonat eines zahlenmittleren Molekulargewichts von 2.150 Dalton, eines massenmittleren Molekulargewichts von 7.400 Dalton und einer Hydroxylzahl von 265 mg KOH/g, hergestellt aus Trimethylolpropan und Ethylenoxid im Molverhältnis 1 : 3 gemäß der internationalen Patentanmeldung WO

2005/026234 A1.

(B3) Wasserlösliches, primäre Aminogruppen enthaltendes Poly(L-lysin) eines zahlenmittleren Molekulargewichts von 4.500 Dalton, eines massenmittleren Molekulargewichts von 17.500 Dalton und einer Aminzahl von 180 mg KOH/g, hergestellt gemäß der internationalen Patentanmeldung WO 2007/060119 A1.

(B4) Wasserlösliches, hydroxylgruppenhaltiges Polyglycerin eines massenmittleren Molekulargewichts und 5.000 Dalton und einer Hydroxylzahl von 642 mg KOH/g der Firma Hyperpolymers.

(B5) Wasserlösliches, hydroxylgruppenhaltiges Polyhydroxyethylacrylat-

Polyethylenglykolmonomethylether-Blockmischpolymerisat eines zahlenmittleren Molekulargewichts von 4.400 Dalton und einer Hydroxylzahl von 214 mg KOH/g.

(B6) Wasserlösliches, primäre Aminogruppen enthaltendes Poly(L-lysin) eines zahlenmittleren Molekulargewichts von 4.200 Dalton, eines massenmittleren Molekulargewichts von 6.500 Dalton und einer Aminzahl von 430 mg KOH/g, hergestellt gemäß WO2007/0601 19.

Um zu prüfen, ob die Polymeren (B1 ) bis (B6) für die Herstellung von Polypeptidwirkstoffstoffen in der Form von Konjugaten (A'B'C) und (A'B'C'D ¹ ) geeignet waren, wurden wässrige Lösungen der Polymeren (B1 ), (B2), (B4), (B5) und (B6) (jeweils 30 mg/mL) sowie eine wässrige Dispersion des Polymeren (B3) (30 mg/mL) hergestellt. Jeweils 50 μl_ der wässrigen Lösungen der Polymeren (B1), (B2), (B4), (B5) und (B6) sowie der wässrigen Dispersion des Polymeren (B3) wurden mit jeweils 100 μL einer Lösung des keratinbindenden Polypeptids (A) mit einer Konzentration von 28 mg/ml (keratinbindende Domäne KBD-B mit der Sequenz SEQ ID No.: 166) in Phosphatpuffer (0,1 mol/L; pH-Wert = 8; Dinatriumhydrogenphosphat und Natriumdihydrogenphosphat im Molverhältnis 1 : 1 ) im Normzustand vermischt.

Die resultierenden Lösungen (AB1 ), (AB2), (AB4), (B5) und (B6) sowie die Dispersion (AB3) wurden etwa eine Stunde im Normzustand stehen gelassen. Nach dieser Zeit war keine Entmischung unter Bildung mehrerer Phasen zu beobachten. Die Bindungsaktivitäten des keratinbindenden Polypeptids (A) in den Lösungen (AB1), (AB2), (AB4), (B5) und (B6)), in der Dispersion (AB3) sowie in der reinen Lösung (A) des keratinbindenden Polypeptids (A) an menschliches Haar wurde nach dem quantitativen Tests gemäß der internationalen Patentanmeldung WO 2007/0601 16 A2, "Beispiel 10: Bindung an Haar (Quantitativ)", Seite 84, Zeile 46, bis Seite 85, Zeile 45, gemessen. Es zeigte sich, dass die Bindungsaktivitäten völlig vergleichbar waren. Dies bedeutete, dass die Bindungsaktivitäten des keratinbindenden Polypeptids (A) in den Lösungen (AB1), (AB2), (AB4), (B5) und (B6) und in der Dispersion (AB3) mehr

als 75% der Bindungsaktivität der gleichen Menge des keratinbindenden Polypeptids (A) in seiner reinen Lösung (A) betrugen.

Die Polymeren (B1 ) bis (B6) waren daher hervorragend für die Herstellung Polypeptidwirkstoffen in der Form von Konjugaten (ABC) und (A'B'C'D ¹ ) geeignet.

Vergleichsversuch V1 :

Beispiel 1 wurde wiederholt, nur dass anstelle der Polymeren (B1 ) bis (B6) die folgenden Polymeren verwendet wurden:

(V1 1 ) wässrige Lösung eines modifizierten hochmolekularen Polyethylenimins (HM Polyimin® der Firma BASF SE);

(V12) wässrige Lösung eines hochmolekularen Polyethylenimins (Polyimin® P der Firma BASF SE);

(V13) wässrige Lösung eines modifizierten hochmolekularen Polyethylenimins

(Polyimin® SK der Firma BASF SE);

(V14) wässrige Lösung eine Copolymerisats von Vinylformamid und Vinylamin eines

Hydrolysegrades >90% (Lupamin® 5095 der Firma BASF SE) und

(V15) wässrige Lösung eines hoch kationischen Polyvinylamins (Catiofast® der Firma BASF SE).

Im Gegensatz zu den Lösungen (AB1), (AB2), (AB4), (B5) und (B6) und der Dispersion (AB3) des Beispiels 1 kam es bei den wässrigen Gemischen (AV1 1 ) bis (AV15) bereits nach wenigen Minuten zu einer Bildung zweier Phasen, so dass die Bindungsaktivität des keratinbindenden Polypeptids (A) in diesen Gemischen an menschliches Haar nicht bestimmt werden konnte. Insgesamt waren die Polymeren (V1 1) bis (V15) für die Herstellung von Konjugaten mit keratinbindenden Polypeptiden (A) nicht geeignet.

Beispiel 2

Die Herstellung von mit Linkergruppen (C) funktionalisierten Polymeren (B)

Die Eignung der gemäß Beispiel 1 ausgewählten Polymeren (B) für die Herstellung von funktionalisierten Polymeren (B ¹ C) als Vorprodukte für die Herstellung von Konjugaten (A'B'DC), wurde anhand der ausgewählten Polymeren (B3), (B4) und (B5) getestet. Diese wurden zu den funktionalisierten Polymeren (B3'C), (B4'C) und (B5'C) umgesetzt. Dazu wurden die ausgewählten Polymeren (B3), (B4) und (B5) mit dem Linkermolekül (C) Maleinimidocaproylchlorid umgesetzt. Anschließend wurde der Gehalt an Maleinimidgruppen (c2) in den funktionalisierten Polymeren (B3'C), (B4'C) und (B5'C) quantitativ bestimmt.

Quantitative Bestimmung der Maleinimidgruppen der Linkergruppen (C):

Zur quantitativen Bestimmung der Maleinimidgruppen der Linkergruppen (C) der Polymeren (B3'C), (B4'C) und (B5'C) wurden die folgenden Lösungen jeweils frisch angesetzt und durch Verdünnen mit Wasser auf erwartete Maleinimidgehalte von 0,5 bis 1 ,5 μmol/ml eingestellt:

Phosphatpuffer: 0,1 mol/L, pH-Wert 8; Mischung aus Dinatriumhydrogenphosphat und Natriumdihydrogenphosphat im Molverhältnis 1 : 1 ;

Maleinimidlösung (Ml): 2 μmol/ml; 19,81 mg Ml 98%ig in 100 ml deionisiertem Wasser;

- Cysteinlösung (Cys): 2 μmol/ml; 24,35 mg Cys 99,5%ig in 100 ml Phosphatpuffer; und

Ellmans-Reagenz (ER): 4 mg/ml; 40,4 mg ER 90% ig in 10 ml Phosphatpuffer.

Zur Kalibrierung wurden 0, 25, 100 150 und 250 μl der Cysteinlösung in Einwegküvetten (Ratiolab® Makro 10x10x45 mm, Schichtdicke 10 mm) mit jeweils 50 μl ER versetzt und mit Puffer auf 3,0 ml aufgefüllt. Der Inhalt der Küvetten wurde kräftig geschüttelt und während 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. In einem Spektralphotometer (Beckmann DU 640) wurde die Absorption bei 412 nm gegen den Nullwert ohne Cys gemessen. Die erhaltenen Werte wurden als Eichgerade aufgetragen. Die Steigung der Eichgerade betrug 0,005 ± 0,0005 und der Y-Achsenabschnitt 0,00 ± 0,02.

Die Messung der Proben der Polymeren (B3'C), (B4'C) und (B5'C) wurde wie folgt durchgeführt.

Für eine Probenreihe wurden jeweils 10, 30 und 50 μl einer Polymerlösung (B ¹ C) in ein Probengefäß gegeben. Zu den Proben wurden jeweils 50 μl Ml-Lösung zupipettiert. Die resultierenden Lösungen wurden kräftig geschüttelt und während 2,5 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Anschließend wurden 50 μl Cys- Lösung zupipettiert. Die resultierenden Lösungen wurden erneut kräftig geschüttelt und weitere 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Anschließend wurden zu den Proben jeweils 50 μl ER-Lösung zupipettiert und die gewünschte Menge Pufferlösung hinzu gegeben. Die resultierenden Lösungen wurden erneut kräftig geschüttelt und weitere 5 Minuten Raumtemperatur stehen gelassen. Anschließend wurde die jeweilige Absorption bei 412 nm gegen einen Nullwert aus unbehandeltem Polymer in gleicher Konzentration von ER und Phosphatpuffer gemessen.

Beispiel 2.1 : Die Herstellung von funktionalisierten Polymeren (B3'C)

Beispiel 2.1.1 : Zu einer Lösung von 1 g des Polymeren (B3) in 10 ml Dimethylsulfoxid wurden 1 ,55 g Maleinimidocaproylchlorid hinzu gegeben. Die resultierende Mischung wurde während 21 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Es bildete sich eine schwach gelbliche, klare Lösung, die in einen Dialyseschlauch (Ausschlussgröße: 3,5 kDa) gefüllt und gegen deionisiertes Wasser dialysiert wurde. Es wurden 45 ml einer hellbraunen, trüben Lösung mit wenig dunklem, flockigem Niederschlag erhalten. Die quantitative Bestimmung der Maleinimidgruppen ergab einen Gehalt von 37 nmol/mg Polymer.

Beispiel 2.1.2: Zu einer Lösung von 0,5 g des Polymeren (B3) und 0,68 g Triethylamin in 5 ml Dimethylsulfoxid wurden 0,78 g Maleinimidocaproylchlorid hinzu gegeben. Die resultierende Mischung wurde während 21 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Es bildete sich eine dunkelbraune, trübe Lösung, die in einen Dialyseschlauch (Ausschlussgröße: 3,5 kDa) gefüllt und gegen deionisiertes Wasser dialysiert wurde. Es wurden 40 ml einer hellbraunen, trüben Lösung mit wenig dunklem, flockigem Niederschlag erhalten. Die quantitative Bestimmung der Maleinimidgruppen ergab einen Gehalt von 30 nmol/mg Polymer.

Beispiel 2.1.3:

Zu einer Lösung von 1 g des Polymeren (B3) und 1 ,38 g Triethylamin in 10 ml

Dimethylsulfoxid wurden 1 ,55 g Maleinimidocaproylchlorid hinzu gegeben. Die resultierende Mischung wurde während 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Es bildete sich eine dunkelbraune, trübe Lösung, die in einen Dialyseschlauch

(Ausschlussgröße: 3,5 kDa) gefüllt und gegen deionisiertes Wasser dialysiert wurde.

Es wurden 53 ml einer hellbraunen Lösung mit wenig dunklem Niederschlag erhalten.

Die quantitative Bestimmung der Maleinimidgruppen ergab einen Gehalt von 40 nmol/mg Polymer.

Beispiel 2.2: Die Herstellung von funktionalisierten Polymeren (B4'C)

Beispiel 2.2.1 : Zu einer Lösung von 2 g des Polymeren (B4) in 5 ml Dimethylformamid wurde 1 g Maleinimidocaproylchlorid hinzu gegeben. Die resultierende Mischung wurde während 17 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Es bildete sich eine schwach gelbliche, klare Lösung, die in einen Dialyseschlauch (Ausschlussgröße: 3,5 kDa) gefüllt und gegen deionisiertes Wasser dialysiert wurde. Es wurden 22,5 ml einer schwach gelblichen, trüben Lösung mit wenig Niederschlag erhalten. Die quantitative Bestimmung der Maleinimidgruppen ergab einen Gehalt von 430 nmol/mg Polymer.

Beispiel 2.2.2:

Zu einer Lösung von 3 g des Polymeren (B4) in 5 ml Dimethylformamid wurden 0,78 g Maleinimidocaproylchlorid hinzu gegeben und während 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Es bildete sich eine schwach gelbliche, klare Lösung, die in einen Dialyseschlauch (Ausschlussgröße: 3,5 kDa) gefüllt und gegen deionisiertes Wasser dialysiert wurde. Es wurden 42 ml einer fast farblosen, leicht trüben Lösung erhalten. Die quantitative Bestimmung der Maleinimidgruppen ergab einen Gehalt von 200 nmol/mg Polymer.

Beispiel 2.2.3:

Zu einer Lösung von 2 g des Polymeren (B4) in 5 ml Dimethylformamid wurden 2,66 g Maleinimidocaproylchlorid hinzu gegeben. Die resultierende Mischung wurde während 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Es bildete sich eine schwach gelbliche, klare Lösung, die in einen Dialyseschlauch (Ausschlussgröße: 3,5 kDa) gefüllt und gegen deionisiertes Wasser dialysiert wurde. Es wurden 22,5 ml einer fast

farblosen, trüben Lösung mit etwas Niederschlag erhalten. Für die quantitative Bestimmung der Maleinimidgruppen wurden 0,212 ml der in einem Ultraschallbad homogenisierten Suspension mit 1 ml Tetrahydrofuran in Lösung gebracht und mit deionisiertes Wasser auf 3 ml verdünnt (Gehalt an Tetrahydrofuran: 30%). Die quantitative Bestimmung der Maleinimidgruppen ergab einen Gehalt von 830 nmol/mg Polymer.

Beispiel 2.3: Die Herstellung eines funktionalisierten Polymeren (B5'C)

Zu 10 g einer 30-prozentigen Lösung des Polymeren (B5) im Tetrahydrofuran wurden 0,46 g Maleinimidocaproylchlorid hinzu gegeben. Die resultierende Mischung wurde während 17 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Es resultierte eine fast farblose Lösung, die in einen Dialyseschlauch (Ausschlussgröße: 3,5 kDa) gefüllt und gegen deionisiertes Wasser dialysiert wurde. Es wurden 26 ml einer schwach gelblichen, trüben Lösung erhalten. Die quantitative Bestimmung der Maleinimidgruppen ergab einen Gehalt von 470 nmol/mg Polymer.

Beispiel 2 untermauert, dass sich die ausgewählten Polymere (B) sehr gut mit Linkergruppen (C) funktionalisieren ließen, was eine Grundvoraussetzung für die Herstellung von Konjugaten (A ¹ B ¹ C) und (A'B'C'D ¹ ) ist.

Beispiel 3

Die Herstellung von mit Linkergruppen (C) und Effektorgruppen (D') funktionalisierten Polymeren (B)

Die Eignung der gemäß Beispiel 1 ausgewählten Polymeren (B) für die Herstellung von funktionalisierten Polymeren (B ¹ CD') als Vorprodukte für die Herstellung von Konjugaten (A'B'C'D'), wurde anhand der ausgewählten Polymeren (B3), (B4), (B5) und (B6) getestet. Diese wurden zu den funktionalisierten Polymeren (B3'CD'), (B4'CD'), (B5'CD') und (B6'CD') umgesetzt. Dazu wurden die ausgewählten Polymeren (B3), (B4), (B5) und (B6) jeweils mit einem Linkermolekül (C) und einem Effektormolekül (D) umgesetzt. Anschließend wurde der Gehalt an Maleinimidgruppen (c2) in den funktionalisierten Polymeren (B4'D'C) und (Bδ'D'C) quantitativ bestimmt.

Beispiel 3.1 : Die Herstellung des funktionalisierten Polymers (B3'CD')

Eine Lösung von 32 mg Remazol Brilliantrot F3B (Dystar) in 1 ml Wasser wurde mit 0.1 N NaOH auf pH 11 eingestellt und während 5 Minuten nachgerührt. Eine Lösung von 15 mg Polymer (B3) in 0.5 mL Wasser wurde zugegeben und während einer Stunde bei RT gerührt. Die resultierende klare, tiefrote Lösung wurde in einen Dialyseschlauch (Ausschlussgröße 3.5 kDa) gefüllt und gegen deionisiertes Wasser dialysiert. Man erhielt 3.8 ml einer klaren, dunkelroten Lösung. 3 ml dieser Lösung wurden zu einer Lösung von 6 mg 3-Maleinimidopropionsäure-N- Hydroxysuccinimidylester in 1.5 ml Dimethylformamid getropft und während 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die resultierende Lösung wurde wiederum gegen deionisiertes Wasser dialysiert (Ausschlussgröße 3.5 kDa). Erhalten wurden 13 ml einer klaren, dunkelroten Lösung. Eine quantitative Bestimmung der Maleinimidgruppen war nicht möglich, da die Farbe des Remazols den Ellman-Test störte.

Beispiel 3.2: Die Herstellung des funktionalisierten Polymers (B4'C'D')

Zu einer Lösung von 4 g des Polymeren (B4) in 5 ml Dimethylformamid wurden 0,94 g p-Methoxyzimtsäurechlorid hinzu gegeben. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden 0,55 g Maleinimidocaproylchlorid hinzu gegeben. Die resultierende schwach gelbliche Lösung wurde während 72 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die resultierende Lösung wurde in einem Dialyseschlauch (Ausschlussgröße 3,5 kDa) gegen deionisiertes Wasser dialysiert. Man erhielt 79 ml einer weißen, trüben Lösung mit wenig ausgefallenem weißem Feststoff. Zur Vorbereitung der quantitativen Bestimmung des Gehalts an Maleinimidgruppen wurden 71 1 μl der in einem Ultraschallbad homogenisierten Suspension mit 1 ml Tetrahydrofuran vollständig in Lösung gebracht und mit deionisiertem Wasser auf 3 ml verdünnt, wodurch ein Tetrahydrofuran-Gehalt von etwa 30% resultierte. Die quantitative Bestimmung erfolgte, wie in Beispiel 2 beschrieben. Sie ergab einen Gehalt von 500 nmol/mg Polymer. Die p-Methoxyzimtsäureestergruppen wurden UV-spektroskopisch nachgewiesen (λ _ma χ = 305 nm).

Beispiel 3.3: Die Herstellung des funktionalisierten Polymers (Bδ'C'D ¹ )

2 g einer 30%igen Lösung des Polymers (B5) in Tetrahydrofuran wurden mit 136,8 mg p-Methoxyzimtsäurechlorid versetzt. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde während 22 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden 31 ,3 mg

Maleinimidocaproylchlorid hinzu gegeben. Die resultierende schwach gelbliche Lösung wurde während 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die resultierende Lösung wurde in einem Dialyseschlauch (Ausschlussgröße 3,5 kDa) gegen deionisiertes Wasser dialysiert. Es es wurden 33 ml einer schwach gelblichen Lösung mit wenig ausgefallenem weißem Feststoff erhalten. Zur Vorbereitung der quantitativen Bestimmung des Gehalts an Maleinimidgruppen wurden 2,5 ml der in einem Ultraschallbad homogenisierten Suspension mit 0,3 ml Tetrahydrofuran vollständig in Lösung gebracht und mit deionisiertem Wasser auf 3 ml verdünnt, wodurch ein Tetrahydrofuran-Gehalt von etwa 10% resultierte. Die quantitative Bestimmung ergab einen Gehalt von 250 nmol/mg Polymer. Die p- Methoxyzimtsäureestergruppen wurden UV-spektroskopisch nachgewiesen (λ _ma χ = 305 nm).

Beispiel 3. 4: Die Herstellung des funktionalisierten Polymers (Bθ'C'D ¹ )

Eine Mischung von 0,82 g Remazol Brilliantrot F3B (Dystar) in 5 mL Wasser wurde mit 0.1 N NaOH auf pH 11 eingestellt und während 5 Minuten nachgerührt. Eine Lösung von 500 mg Polymer (B6) in 5 ml Dimethylformamid wurde hinzu zugegeben. Die resultierende Mischung wurde während 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von 1 16 mg 3-Maleinimidopropionsäure-N- Hydroxysuccinimidylester in 2 ml Dimethylformamid zugegeben. Die resultierende Mischung wurde während 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Es bildete sich tiefrote Lösung, die gegen deionisiertes Wasser dialysiert (Ausschlussgröße 3.5 kDa) wurde. Erhalten wurden 31 ml einer tiefroten Lösung. Eine quantitative Bestimmung der Maleinimidgruppen war nicht möglich, da die Farbe des Remazols den Ellman- Test störte.

Das Beispiel 3 untermauert, dass sich die ausgewählten Polymere (B) sehr gut mit Linkergruppen (C) und mit Effektorgruppen (D') funktionalisieren ließen, was eine Grundvoraussetzung für die Herstellung von Konjugaten (A'B'C'D ¹ ) ist.

Beispiel 4

Die Herstellung von Konjugaten (A'B3'C)

Für die Herstellung der Polypeptidsequenz (A) des Konjugate (AB3'C') wurde SEQ ID No.: 166, KBD-B_7 Homo sapiens Desmoplakin_Accession No. NM_004415

Domäne B-7, als Polypeptid (A) verwendet. Das Polypeptid (A) wird im Folgenden als KBD-B gezeichnet.

Für die Herstellung der Konjugate (A'B3'C) wurde das Polymer (B3'D') des Beispiels 2.1.3 in der Form seiner Lösung in Dimethylsulfoxid mit einer Konzentration von 8 mmol/ml verwendet. Die Lösung (B3'C) wurde in den Mischungsverhältnissen 10 : 1 ,

5 : 1 , 2 : 1 , und 1 : 1 (Kopplungsansätze 1 bis 4) an jeweils 1 mg/ml KBD-B in 10 ml

Phosphatpuffer gekoppelt. Nach einer Inkubationszeit von jeweils einer Stunde bei

Raumtemperatur wurde der Kopplungserfolg durch SDS-PAGE (sodium dodecylsulate Polyacrylamide gel electrophoresis) von jeweils einem Aliquot der

Kopplungsansätze 1 bis 4 im Vergleich mit reiner KBD-B und einem Marker überprüft.

Nach der SDS-PAGE wies die unbehandelte KBD-B-Probe zwei separate Banden der relativen molekularen Masse von etwa 30.000 und etwa 60.000 auf. Dabei handelte es sich um die Banden der monomeren und der dimeren Form des Proteins. Der Kopplungsansatz 4 (Mischungsverhältnis 1 : 1) wies ebenfalls Banden bei den relativen Molmassen von 30.000 und 60.000 auf. Indessen nahm der Hintergrundschmier im Vergleich zur unbehandelten KBD-B-Probe im Gel signifikant an Intensität zu. Einen vergleichbaren Schmier wies die Lösung des Polymeren (B3'C) in keinem der durchgeführten Kopplungsansätze auf, so dass ausgeschlossen werden konnte, dass ungekoppeltes Polymer (B3'C) als Schmier auf dem SDS-GeI erschien. Weiterhin zeigten die Kopplungsansätze 1 bis 4 einen sukzessiv stärkeren Hintergrundschmier bei gleichzeitiger Abnahme der Intensität der separaten Banden bei den relativen Molmassen von 30.000 und 60.000. Diese Ergebnisse zeigten, dass eine Kopplung des Polymers an KBD-B stattgefunden hatte und dass sich daher die Größe der KBD-B, wie in der SDS-PAGE gezeigt, sich verändert und "verschmiert" hatte. Bei einer erfolgreichen Kopplung stand dieses Ergebnis zu erwarten, weil die relative Molmasse des Polymers (B3'C) ebenfalls streute.

Um zu testen, ob die Konjugate (A'B3'C) der Kopplungsansätze 1 bis 4 in der Lage waren, an Haare zu binden, wurden jeweils 100 μg der Konjugate in einem Volumen von 1 ml PBS (phosphate buffered saline, pH 7,5) mit 0,05% Tween® 20 (Polysorbat 20) an 20 mg Haar gebunden. Nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurde ungebundenes Konjugat vom Haar gewaschen. Im Anschluss daran wurden die gebundenen Konjugate durch Zugabe von 500 μl 1 %iger Natriumdodecylsulfatlösung vom Haar eluiert. Die Eluate wurden durch ViVaSpin2® -

Kartuschen der Firma Sartorius auf etwa 20 μl aufkonzentriert und durch SDS-PAGE analysiert.

Es zeigte sich, dass in der SDS-PAGE der eluierten Konjugate (A'B3'C) der Kopplungsansätze der 1 bis 4 jeweils ein blau gefärbter Bereich oberhalb der KBD-B- Bande vorhanden war, der in der SDS-PAGE der nicht gekoppelten KBD-B fehlte. Dieser blau gefärbte Bereich war daher dem jeweiligen Konjugat (A'B3'D') zuzuordnen und belegte, dass die Konjugate (A'B3'C) der Kopplungsansätze 1 bis 4 ans Haar binden konnten. Außerdem zeigten die Daten aus der SDS-PAGE, dass die Bande der nicht gekoppelten KBD-B umso stärker war, je weniger Polymer (B3'C) zur Kopplung eingesetzt worden war. Dies spiegelte die sinkende Beladung der KBD-B mit dem Polymer (B3'C) wieder. Insgesamt wurde für alle Kopplungsansätze 1 bis 5 unabhängig vom Mischungsverhältnis eine mit der Ausgangslösung vergleichbare Bindungsaktivität bezüglich menschlichen Haars festgestellt.

Beispiel 5 und 6

Die Herstellung von Konjugaten (A'B4'C) (Beispiel 5) und von Konjugaten (A'B5'C) (Beispiel 6)

Beispiel 4 wurde wiederholt, nur dass anstelle der Lösung des Polymers (B3'C) des Beispiels 2.1.3 in Dimethylsulfoxid

bei Beispiel 5 die Lösung des Polymers (B4'C) des Beispiels 2.2.3 in Dimethylformamid und

bei Beispiel 6 die Lösung des Polymers (B5'C) des Beispiels 2.3 in Tetrahydrofuran

verwendet wurde. Die erhaltenen Ergebnisse betreffend die Kopplung mit KBD-B und die Bindung der Konjugate A'B4'C des Beispiels 5 sowie der Konjugate A'B5'C des Beispiels 6 an menschliches Haar waren in vollem Umfang mit den betreffenden Ergebnissen des Beispiels 4 vergleichbar.

Beispiel 7

Die Herstellung von Konjugaten (A'B4'C'D')

Die Lösung des Polymers (B4'C'D') des Beispiels 3.2 in Tetrahydrofuran/Wasser (Konzentration: 8 mmol/ml) wurde in den Mischungsverhältnissen 5 : 1 , 2 : 1 , 1 : 1 , 1 : 2 und 1 : 5 (Kopplungsansätze 1 bis 5) an jeweils 1 mg/ml KBD-B in 10 ml Phosphatpuffer gekoppelt. Nach einer Inkubationszeit von jeweils einer Stunde bei Raumtemperatur wurde der Kopplungserfolg durch SDS-PAGE (sodium dodecylsulate Polyacrylamide gel electrophoresis) von jeweils einem Aliquot der Kopplungsansätze 1 bis 5 im Vergleich mit reiner KBD-B und einem Marker überprüft.

Es zeigte sich, dass in den SDS-PAGE bei den Kopplungsansätzen 1 bis 5 oberhalb der KBD-B-Bande blau gefärbte Bereiche auftraten, die den Konjugaten (A'B4'C'D') zugeordnet werden konnten. Diese Bereiche nahmen ab, je weniger Polymer

(B4'C'D') im Verhältnis zur KBD-B in der Kopplungsreaktion eingesetzt worden war.

Gleichzeitig nahm die Menge der KBD-B-Oligomeren zu, da das Polymer (B4'C'D') mehrere Linkergruppen (C) pro Molekül aufwies und somit die KBD-B-Monomere zu Di- und Trimeren verband.

Um zu testen, ob die Konjugate (A'B4'C'D') in der Lage waren, an Haare zu binden, wurden jeweils 100 μg der Konjugate in einem Volumen von 1 ml PBS (phosphate buffered saline, pH 7,5) mit 0,05% Tween® 20 (Polysorbat 20) an 20 mg Haar gebunden. Nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurde ungebundenes Konjugat vom Haar gewaschen. Im Anschluss daran wurden die gebundenen Konjugate durch Zugabe von 500 μl 1 %iger Natriumdodecylsulfatlösung vom Haar eluiert. Die Eluate wurden durch ViVaSpin2®-Kartuschen der Firma Sartorius auf etwa 20 μl aufkonzentriert und durch SDS-PAGE analysiert.

Erneut zeigte es sich, dass in der SDS-PAGE der eluierten Konjugate der Kopplungsansätze der 1 bis 5 jeweils ein blau gefärbter Bereich oberhalb der KBD-B- Bande vorhanden war, der in der SDS-PAGE der nicht gekoppelten KBD-B fehlte. Dieser blau gefärbte Bereich war daher dem jeweiligen Konjugat (A'B4'C'D') zuzuordnen und belegte, dass die Konjugate (A'B4'C'D') der Kopplungsansätze 1 bis 5 ans Haar binden konnten. Außerdem zeigten die Daten aus der SDS-PAGE, dass die Bande der nicht gekoppelten KBD-B umso stärker war, je weniger Polymer (B4'C'D') zur Kopplung eingesetzt worden war. Dies spiegelte die sinkende Beladung der KBD-B mit dem Polymer (B4'C'D') wieder. Insgesamt wurde für alle Kopplungsansätze 1 bis 5 unabhängig vom Mischungsverhältnis eine mit der Ausgangslösung vergleichbare Bindungsaktivität bezüglich menschlichen Haars festgestellt.