技术领域

本发明属于生物科学和药物载体领域，特别涉 及一种具有协同靶向诊 疗鼻咽癌功能的多肽和携带此多肽的纳米颗粒 及其应用。 背景技术

鼻咽癌是来源于鼻咽上皮的高度恶性肿瘤，它 极易侵犯颅底等重要结 构，并能较早地发生颈部淋巴结转移和远处转 移。由于鼻咽癌恶性程度高， 发病部位比较特殊， 使其手术治疗较难实施。 因此， 临床上的鼻咽癌治疗 主要以放射治疗为主并配合全身化学药物治疗 。然而， 传统的放疗与化疗 均具有较为严重的毒副作用，且放疗仅适用于 肿瘤原发灶及其前哨淋巴结 转移的治疗， 而不适合远处转移灶的治疗。 由于治疗手段的局限性， 致使 鼻咽癌总的五年生存率一直徘徊在 60%左右。

单克隆抗体药物在肿瘤治疗方面已经展示了良 好的临床应用前景。单 克隆抗体与放射性核素、药物或毒素形成的偶 联物， 对肿瘤细胞具有靶向 的特异性杀伤作用。此外， 一些肿瘤标志物特异性的单克隆抗体本身也具 有显著的肿瘤治疗作用， 例如作用于肿瘤细胞的表皮生长因子 HER-2/neu 抗体 Hercepti n, 它作为靶向药物治疗 HER-2阳性转移乳腺癌已取得了很 好的疗效。 然而， 单克隆抗体在实际临床应用中尚存在以下几个 缺陷： 临 床研究的单抗药物多数使用小鼠制备，存在免 疫原性问题；抗体分子量大， 对肿瘤的穿透力低， 使得大体积实体肿瘤的治疗效果仍不十分理想 ； 肿瘤 治疗所需的抗体量很大， 产品纯度要求高， 因此生产成本极高； 由于肿瘤 的异质性，使用单克隆抗体单一地通过抑制或 杀死表达某种受体的肿瘤细 胞， 并不代表着肿瘤的治愈。 由此可知， 治疗高恶性度的鼻咽癌， 单纯使 用单克隆抗体作为靶向分子， 很难获得理想的效果。

多肽作为肿瘤标志物分子的特异性配体， 一直是研究者们关注的热 点。 相对于单克隆抗体， 多肽具有尺寸小、 组织穿透性好、 低免疫原性和 造价低等优点， 可以很大程度上克服抗体制剂的缺陷。 然而， 相对较弱的 肿瘤亲和力和短的半衰期， 限制了靶向肽在生物活体内的应用。基于纳米 技术的多价策略， 可明显延长靶向肽的体内有效循环时间， 并大大提高其 与特异受体结合的亲合力， 从而达到显著增强多肽的生物学效应的目的。

为此，我们使用前期工作中发明的一种具有多 价效应和纳米尺寸效应 的多肽荧光探针的构建方法，制备了基于四聚 体远红荧光蛋白的八价多肽 纳米荧光探针。通过此方法可快速准确地筛选 与鉴定多肽的肿瘤靶向性及 其抗肿瘤生物学效应。 然而， 由于远红色荧光蛋白为外源蛋白， 其免疫原 性限制了它的临床使用。 因此， 迫切需要发展一种能有效运输靶向肽的纳 米载体， 而又不影响其靶向性与治疗效果。

鼻咽癌是由环境因素与宿主遗传基因等因素共 同参与的多步骤交互 作用而逐步形成的复杂性疾病。 放疗和辅助化疗综合治疗的临床研究表 明， 鼻咽癌是一种对化疗相对敏感的肿瘤， 多种抗癌药物单用或联合使用 均有一定的疗效。 以顺铂和 5-氟尿嘧啶 （5-FU) 等为主要的水溶性化疗 药物能显著改善患者的预后。但是不管单独给 药还是联合给药方案， 静脉 给药的顺铂和 5-FU都具有半衰期短、 缺乏选择性的缺点， 从而增加了其 毒副作用。 姜黄素 （Curcurai n ) 和紫杉醇是两种具有代表性的抗癌中药。 姜黄素是从草本植物姜黄根茎中提取的一种酚 性色素，有着广泛的药理作 用， 众多研究证实， 姜黄素可以抑制多种肿瘤细胞的生长。 还可以增强肿 瘤微环境 NK细胞的招募， 从而提高机体的免疫力。紫杉醇从 1992年美国 FDA批准首次进入临床用于治疗卵巢癌以来， 也被应用于晚期鼻咽癌的治 疗。 研究发现， 紫杉醇也具有增强肿瘤微环境 NK细胞的招募和激活树突 细胞的抗原提呈能力， 从而提高机体对肿瘤的免疫。 由于姜黄素与紫杉醇 都为脂溶性药物， 被动运输方式很难直接被肿瘤组织细胞摄取， 且有很强 的静脉毒副作用， 导致其目前临床应用效果欠佳。 目前， 针对鼻咽癌靶向 治疗的纳米药物在国内还是一片空白。

纳米载体是将成像对比剂和药物靶向运输到肿 瘤，实现肿瘤特异性成 像诊断与靶向治疗的有效手段。已有研究者发 明了一种仿高密度脂蛋白的 多肽-脂质纳米颗粒（专利号： （W0/2009073984 ) ， 它是利用具有 α 螺旋 结构的功能多肽 R4F 与磷脂和胆固醇脂相互作用而形成的， 其粒径小于 30 nm。这种纳米颗粒主要是基于多肽的功能靶向 B型清道夫受体（SR-B l ) 高表达的细胞。 然而， 由于机体正常的组织细胞 （如肝细胞） 也高表达 SR-B1 ,故此纳米颗粒在肿瘤与正常组织之间分布的� �比度不太理想，在运 输化疗药物的时候可能具有潜在的毒副作用。 此外， 该专利中的纳米颗粒 本身仅做为靶向运输的工作， 而其本身并未涉及到肿瘤治疗之功效。

综上所述，发展一种携带具有协同靶向与治疗 功能的多肽的超小粒径 ( <40 nm ) 纳米颗粒， 并同时装载有成像对比剂和化疗药物分子， 用于鼻 咽癌的高特异性同步诊断与治疗，将会成为极 具临床应用潜力的鼻咽癌靶 向纳米药物。

发明内容

本发明的目的是为解决上述问题而提供了一种 具有靶向治疗鼻咽癌 作用的多肽（LTVSPWYLTVSPWY )和一种具有协同靶向与治疗鼻咽癌功能和 控制脂质纳米颗粒尺寸功能的多肽 （简称为 dtTP _NP 。） ， 以及携带 dtTP _NPC 多肽的纳米颗粒（简称为 dtDTNP _NPe ) ， 并展示了其应用。 上述多肽和纳米 颗粒能够高效特异性地靶向鼻咽癌， 并且显著性地抑制鼻咽癌肿瘤的生 长， 可以应用于临床治疗。

本发明所采用的技术方案是：

将一种具有靶向治疗鼻咽癌作用的多肽， 与另一种具有 α 螺旋结构 的鼻咽癌靶向治疗多肽 （该 α 螺旋多肽具有靶向治疗鼻咽癌作用并能与 磷脂相互作用形成 α 螺旋结构的多肽） ， 通过连接多肽以共价键的形式 串连。它同时具有协同靶向与治疗鼻咽癌的功 能和控制脂质纳米颗粒尺寸 的功能。

一种具有协同靶向诊疗鼻咽癌功能的多肽的氨 基酸序列为

FAEKFKEAVKDYFAKFTOGSGLTVSPWYLTVSPWY。

优选地， 所述具有靶向治疗鼻咽癌作用的多肽的氨基酸 序列为 LTVSPWYLTVSPWY o

一种具有协同靶向诊疗鼻咽癌功能的纳米颗粒 ，所述纳米颗粒由三部 分物质组成： 1 ) 多肽： 同时具有协同靶向治疗鼻咽癌的功能和控制脂 质 纳米颗粒尺寸的功能； 2 ) 磷脂和胆固醇脂： 组成纳米颗粒的壳和维持稳 定的球形纳米结构； 3 )装载物： 成像对比剂、 药物分子或者两者的结合， 成像对比剂为胆固醇脂修饰的荧光染料分子（ Di R-BOA和 Fluo-BOA ) 、 药 物分子为紫杉醇、 姜黄素。

本发明具有以下优点-

1 ) 理化特性优良： 利用动态激光光散射方法测得纳米颗粒的平均 粒 径为 14. 6 nm左右。 纳米颗粒的粒径均一、 分散性好、 无聚集现象。

2 ) 生物相容性好： 制备该纳米颗粒所使用的原料为磷脂、 胆固醇脂 和具有协同靶向与治疗鼻咽癌功能的多肽等材 料，这些原材料都已用于临 床试验， 具有良好的生物相容性。

3 ) 制备工艺简单， 便于规模化生产。

4 ) 靶向效果好： 在细胞水平， 本发明的纳米颗粒 dtDTNP _NPC ， 相对于 α 螺旋多肽形成的纳米颗粒（简称 ΝΡ )靶向能力更强， 而且相对于肝癌、 He la等癌细胞， 它能更容易被鼻咽癌 （如 5-8F、 SUNE-1等细胞） 摄取； 在体水平， 本发明的 dtDTNP _NPe 纳米颗粒在尾静脉注射鼻咽癌 5-8F荷瘤裸 鼠 12 h后， 选择性地靶向和蓄积到肿瘤部位。 5 )治疗效果好： 在细胞水平， 本发明的纳米颗粒与鼻咽癌 5-8F细胞 孵育 l h后， 能显著性地诱导细胞死亡； 在活体动物实验中， 本发明的纳 米颗粒由于协同靶向效应和实体瘤的 EPR效应 （enhanced permeab i l i ty and retent ion effect ) ， 使其在鼻咽癌组织中的蓄积能力和被鼻咽癌细 胞摄取的能力大大提高， 从而对肿瘤的生长具有很好的抑制效果。

6 ) 毒副作用低： 动物实验研究结果显示， 本发明的 dtDTNP 纳米颗 粒在鼻咽癌 5-8F细胞皮下接种于裸鼠后的第三天， 开始隔天尾静脉注射 直至第 14天， 相对于 PBS对照组， 体重没有发生明显的变化。

7 ) 功能可扩展： 本发明的纳米颗粒除了可以更换不同肿瘤靶向 治疗 多肽用以针对不同的肿瘤进行靶向治疗外，还 可以在其核心装载用于疾病 诊疗的染料分子 （DiR-BOA )和脂溶性药物分子（如紫杉醇和姜黄素等） ， 实现肿瘤协同靶向治疗与免疫治疗功效的完美 结合。 附图说明

下面结合附图和实施方式对本发明做进一步详 细的说明。

图 1为实施例 1中 Octa-FNP荧光纳米探针对不同肿瘤细胞孵育 3 h 后激光共聚焦成像结果；

图 2为实施例 1中 Octa-FNP荧光纳米探针对不同肿瘤细胞孵育 3 h 后 FACS流式定量结果；

图 3为实施例 2中 FPLC系统纯化 2个合成单位核心装载 0. 4 μ mol 荧光染料 DiR-BOA 的 dtDTNP _NPC 纳米颗粒 [描述为： 0. 4 μ mol (DiR-BOA) dtDTNP _NPC 时]的双波段吸收-洗脱体积曲线图；

图 4 为实施例 2 中 FPLC 系统纯化 2 个合成单位的 0. 45 μ πιο1 (DiR-BOA) dtDTNP _NPC 纳米颗粒时的双波段吸收-洗脱体积曲线� �；

图 5 为实施例 2 中 FPLC 系统纯化 2 个合成单位 0. 5 u mol

(DiR-BOA) dtDTNP _NPC 纳米颗粒时的双波段吸收 -洗脱体积曲线图； 图 6为实施例 2中 FPLC系统纯化 1个合成单位核心装载 0. 1 μ mol 胆固醇酯的 dtDTNP 纳米颗粒时的双波段吸收-洗脱体积曲线图；

图 7为实施例 2中动态激光光散射 （DLS ) 系统测量 dtDTNP _NPC 纳米颗 粒的纳米粒径分布图；

图 8为实施例 2中圆二色谱仪对 dtDTNP _NP fi米颗粒中多肽 ct 螺旋结 构的测定曲线；

图 9为实施例 2中圆二色谱仪对 NP纳米颗粒中多肽 α 螺旋结构的测 定曲线；

图 10为实施例 3中（Fluo-B0A) dtDTNP _NPe 纳米颗粒与 5-8F-mRFP和肺 癌细胞 LLC分别孵育 1 h后的激光共聚焦成像结果；

图 1 1为实施例 3中（DiR-B0A) dtDTNP _NPe 纳米颗粒与鼻咽癌 5-8F细胞 孵育 1 h后流式细胞仪检测的直方图；

图 12为实施例 3中（DiR-B0A) dtDTNP _NPe 纳米颗粒与鼻咽癌 5-8F细胞 孵育 1 h后流式细胞仪检测的荧光定量结果；

图 13为实施例 3中（DiR-B0A) dtDTNP _NPC 和（DiR-BOA) NP纳米颗粒与

5- 8F和人成纤维肉瘤细胞 HT 1080分别孵育 1 h后的激光共聚焦成像结果； 图 14为实施例 3中（DiR-BOA) dtDTNP _NP ^D (DiR-BOA) NP纳米颗粒与鼻 咽癌 5-8F细胞孵育 1 h后流式细胞仪检测的直方图；

图 15为实施例 3中（DiR-BOA) dtDTNP _NP n (DiR-BOA) NP纳米颗粒与鼻 咽癌 5-8F细胞孵育 1 h后流式细胞仪检测的荧光定量结果；

图 16为实施例 3中（DiR- BOA) dtDTNP _NPC 纳米颗粒与 ⁵ - ⁸ F、 HONE- 1、

6- 10B、 CNE2、 SUNE-1及 CNE-1鼻咽癌细胞和 HT1080、 Hela、 BXPC-3及 MCF-7肿瘤细胞在 37 。(：孵育 3 h后， 细胞摄取量的荧光定量结果。

图 17为实施例 3中（DiR-B0A) dtDTNP _NPe 纳米颗粒与鼻咽癌 5-8F细胞 孵育 1 h后， 用 Annexin V-FITC/PI凋亡试剂鉴定细胞的死亡方式的激光 共聚焦成像结果； 图 18为实施例 3中 （DiR-BOA) NP纳米颗粒与鼻咽癌 5-8F细胞孵育 1 h后， 用 Annex in V-FITC/PI凋亡试剂鉴定细胞的死亡方式的激光共 聚焦 成像结果；

图 19为实施例 3中（DiR-B0A) dtDTNP _NPe 纳米颗粒与鼻咽癌 5-8F肿瘤 孵育 1 h后， 用流式细胞仪和 Annexin V-FITC/PI凋亡试剂定量检测细胞 的死亡数量和鉴定死亡方式的结果：

图 20为实施例 3中（DiR-BOA) dtDTNP _NP n (DiR-BOA) NP纳米颗粒与鼻 咽癌 5-8F肿瘤孵育 1 h后， Annex in V-FITC/PI凋亡试剂对细胞死亡比 例和方式的定量检测；

图 21为实施例 4中尾静脉注射 2. 5 nmol (DiR-BOA) dtDTNP _NPe 纳米颗 粒后的 3 h、 6 h、 12 h、 24 h、 48 h、 72 h和 96 h整体荧光成像结果； 图 22为实施例 4中尾静脉注射 2. 5 nmol (Di R-BOA) NP的 24 h和 48 h的整体荧光成像结果；

图 23为实施例 4中尾静脉注射 2. 5 nmol (DiR-BOA) dtDTNP _NPC 纳米颗 粒 48 h后各脏器的整体荧光成像结果；

图 24为实施例 4中尾静脉注射 2. 5 nmol (DiR-BOA) NP纳米颗粒 48 h 后各脏器的整体荧光成像结果；

图 25为实施例 4中尾静脉注射 2. 5 nmol (DiR-BOA) dtDTNP _NPe 纳米颗 粒 48 h后肿瘤组织冰冻切片的荧光成像结果；

图 26为实施例 5中在裸鼠皮下接种 5-8F或 LLC肿瘤细胞，第三天后 隔天尾静脉注射 2. 5 nmol dtDTNP _NPe 纳米颗粒或 PBS直至 14天， 肿瘤体 积变化的曲线图；

图 27为实施例 5中在裸鼠皮下接种 5-8F肿瘤细胞，第三天后隔天尾 静脉注射 2. 5 nmol NP纳米颗粒或 PBS直至 14天， 肿瘤体积变化的曲线 图；

图 28为实施例 5中在裸鼠皮下接种 5-8F或 LLC肿瘤细胞，第三天后 隔天尾静脉注射 2. 5 nmol dtDTNP _NPe 纳米颗粒或 PBS直至 14天， 实验组 与对照组荷瘤裸鼠体重变化的曲线图。

图 29为实施例 5中在裸鼠皮下接种 5-8F肿瘤细胞，第三天后隔天尾 静脉注射 2. 5 nmol NP纳米颗粒或 PBS直至 14天， 实验组与对照组荷瘤 裸鼠体重变化的曲线图。

图 30为实施例 7中鼻咽癌 5-8F细胞与装载有姜黄素（curcumin)的 dtDTNP _NPCj 游离姜黄素孵育 1 h后的细胞激光共聚焦成像结果。 具体实施方式

实施例 1

本实施实例中我们使用前期工作中发明的一种 具有多价效应和纳米 尺寸效应的多肽荧光探针的构建方法，制备了 基于四聚体远红荧光蛋白的 多肽八价纳米荧光探针。 为了对多肽 LTVSPWYLTVSPWY 的肿瘤靶向性进行 筛选与鉴定， 我们利用该探针对不同类型的肿瘤细胞系进行 检验与筛选。 结果如图 1所示， 多肽 LTVSPWYLTVSPWY不仅对鼻咽癌细胞有很好的靶向 性， 而且能有效地诱导肿瘤细胞的死亡。 图 2为 Octa-FNP荧光纳米探针 对不同肿瘤细胞孵育 3 h后 FACS流式定量结果， 可以很明显看到， 相对 应肝癌和宫颈癌等很多癌细胞， 基于 LTVSPWYLTVSPWY多肽的八价纳米荧 光探针更容易被鼻咽癌 （如 5-8F细胞、 SUNE-1细胞和 H0NE-1细胞等） 摄取。 实施例 2

本实施例中， 我们将具有鼻咽癌特异性靶向与治疗功能的两 种多肽 LTVSPWYLTVSPWY和 FAEKFKEAVKDYFAKFWD通过 GSG序列相连， 形成一条具 有协同靶向与治疗鼻咽癌功能的新型多肽（简 称为 dtTP a

dual -_targe ted _therapeut ic peptide for Nasopharyngeal c_arcinoma)。 其完整氨基酸序列为序列表中 SEQ ID NO.1所述。

利用 dtTP _NPC 制备的具有协同靶向诊疗鼻咽癌功能的纳 米颗粒 （简称 dtDTNP _N pc, a dual -targe ted diagnostic and _therapeutic nano^article for Nasopharyngeal carcinoma) ， 其步骤为：

1 ) 将 3 μ mol DMPC

( 1, 2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 、 0.225 mol Di -BOA (或 0.1 μ mol Cholesteryl oleate ， 简称 C.0) 的氯仿溶液在 玻璃试管中充分混合， 并用封口膜将试管口封死；

2) 在稳定的氮气流中将试管内的氯仿吹干， 使步骤 1) 中的混合物 能够在试管底部形成一层薄膜；

3) 将试管放入真空干燥器中真空干燥 1 h;

4) 向试管中加入 1 ml的磷酸缓冲液， 利用涡旋震荡仪稍稍振荡；

5) 将试管在 48 °C水浴中超声 30-60 min, 以溶液变澄清为准；

6) 使用注射器向密封的试管中加入含有 0.36 μηιοΐ dtTP _NPC 多肽的 PBS溶液， 混匀后密封， 4 °C放置过夜；

7) 次日， 使用 FPLC系统纯化， 收集富含 dtDTNP _NP 。纳米颗粒的溶液， 并浓缩备用；

为了研究 dtDTNP _NP 。纳米颗粒的肿瘤特异靶向能力，选择核 心装载荧光 染料 DiR-BOA (—种经过胆固醇酯修饰的近红外荧光染料， 激发和发射波 长分别为 748 nm和 780 nm) ， 使得纳米颗粒同时具有协同靶向诊断与治 疗鼻咽癌的功能。我们通过调整荧光染料 DiR-BOA与多肽和磷脂之间的配 比， 获得了合适粒径并有一定装载量的 dtDTNP _Nre 纳米颗粒。 FPLC纯化结 果如图 3至图 4所示。 图 3为 FPLC系统纯化 2个合成单位 0.4 u mol (DiR-BOA) dtDTNP _NPC 纳米颗粒时的双波段吸收-洗脱体积曲线� �，此合成比 例在 118min左右有非常多游离的多肽， 并且荧光染料 DiR-BOA的吸收峰 值非常低， 表明装载荧光染料 DiR-BOA的效率非常低。将 2个纳米颗粒合 成单位核心装载的荧光染料 DiR-BOA摩尔量调整为 0.45 μ πιοΐ时， 得到 结果如图 4所示。 此合成比例， 得到的纳米颗粒大部分都在 55.52 min出 峰， 尽管在 42.56 min有一个极小的峰， 但是相比较最佳纳米颗粒出峰的 积分面积来说此比例是非常小的， 而且几乎没有游离多肽。如果将 2个纳 米颗粒合成单位核心装载的荧光染料 DiR-BOA量调整为 0.5 μ mol时， 如 图 5所示， 纳米颗粒最佳出峰时间由原来的 55.52 min提前到 50.08 min， 原来在 42.56 min时出小峰也变为在 41.60 min时出大峰了，且在 118 min 时又出现了非常多的游离多肽。 因此， 此配比下所合成的纳米颗粒效率大 大降低。 由此， 合成具有合适粒径的（DiR-BOA) dtDTNP ^纳米颗粒， 其各 组分最佳酉己比为： 6 μ mol DMPC, 0.45 μ mol DiR-BOA, 0.72 μ mol dtTP _NPC 多肽。

为了研究多肽协同靶向治疗鼻咽癌的功能，使 用胆固醇酯替代近红外 荧光染料 DiR-BOA同样可以得到合适粒径的纳米颗粒。 FPLC纯化结果如 图 6， 得到的纳米颗粒出峰时间为 59.60 min, 118 min时仅有很少的游 离多肽， 这说明上述优化配比是适合胆固醇酯的。其原 料配比为： 3 μ η,οΐ DMPC、 0. 1 μ mol C.0、 0.36 μ mol dtTP _NPC 多肽。

使用动态激光光散射 （DLS) 系统测量上述纯化的 dtDTNP _NPe 纳米颗粒 的粒径， 结果如图 7所示， 平均粒径为 14.60 士 1.64 nm， 且粒径均一、 单分散性好。 图 8为圆二色谱仪对 dtDTNP 纳米颗粒中多肽 α 螺旋结构 的测定， 相比较图 9的 ΝΡ圆二色谱结果，合成的 dtDTNP _NPe 纳米颗粒具有 更强的 α 螺旋结构。 实施例 3

实施例 2中制备核心装载荧光染料 Fluo-BOA或 DiR-BOA的 dtDTNP _NPC 纳米颗粒， 其肿瘤细胞的靶向性验证结果如图 10 所示。 2 u mol (Fluo-BOA) dtDTNP ^纳米颗粒与鼻咽癌细胞 5-8F和肺癌 LLC细胞孵育 1 h 后进行激光共聚焦成像，结果显示 dtDTNP _NPe 纳米颗粒更容易被鼻咽癌 5-8F 细胞摄取。 同时将 2 mol (DiR-B0A) dtDTNP _NPC 和（DiR-BOA) NP与鼻咽癌 细胞 5-8F和人成纤维肉瘤细胞 HT1080孵育 1 h后进行激光共聚焦成像。 流式结果显示，相比较空白组，（DiR-B0A) dtDTNP _NPe 纳米颗粒处理过的 5-8F 细胞其荧光强度大大提高 （如图 1 1 和 12 所示） 。 相比较 NP， (DiR-BOA) dtDTNP _NP e纳米颗粒靶向肿瘤细胞的能力又如何呢� � 图 13成像结 果显示， dtDTNP _NPe 能够选择性被 5-8F细胞摄取， 这说明它具有鼻咽癌细 胞的选择性靶向能力。 为了定量测定鼻咽癌细胞摄取（Di R-B0A) dtDTNP _NPC 纳米颗粒的能力， 将含 8 μ πιοΐ 多肽的（DiR-B0A) dtDTNP _Nre 纳米颗粒和 (DiR-BOA) NP与 5-8F细胞孵育 1 h后， 进行流式细胞仪检测。 如图 14和 图 15结果所示， 相比（DiR-BOA) NP来说， （DiR-BOA) dtDTNP _NPe 纳米颗粒孵 育的鼻咽癌 5-8F细胞， 其荧光强度大大提高， 是（Di R-BOA) NP的~9倍。 为了研究 dtDTNP _NPe 的选择靶向性， 将（DiR-B0A) dtDTNP _NPe 纳米颗粒与 5-8F、 H0NE-1、 6-10B、 CNE2、 SUNE-1及 CNE-1鼻咽癌细胞和 HT1080、 Hela、 BXPC-3 及 MCF-7 肿瘤细胞在 37 °C 孵育 3 h， 如图 16 所示， (DiR-B0A) dtDTNP _NPC 可以选择靶向鼻咽癌 5-8F和 SUNE-1细胞。

为了研究 dtDTNP _NPe 纳米颗粒是诱导鼻咽癌 5-8F细胞凋亡还是坏死， 2 u mol (Di R-BOA) dtDTNP ^和（DiR-BOA) NP纳米颗粒与鼻咽癌 5-8F细胞 孵育 1 h后， 再用 Annexin V-FITC/PI试剂定量检测细胞的 FITC/PI荧光 信号。 图 17和 18为激光共聚焦成像检测 DiR-B0A、 FITC和 PI三种荧光 信号的结果。相比较（Di R-BOA) NP对照组， (DiR-BOA) dtDTNP _NPC 处理组 Di R 通道呈示出很强的荧光信号； 同时， PI通道部分细胞也表现出强 PI信号， 标志着部分细胞的死亡； 而 FITC 通道的信号荧光较弱， 由此初步判断 (DiR-BOA) dtDTNP _NPe 纳米颗粒诱导的是鼻咽癌 5-8F细胞坏死。使用流式细 胞仪进一步定量检测（DiR-BOA) dtDTNP _NPe 纳米颗粒作用的细胞在 FITC 和 PI 通道的荧光信号强度。 图 19结果显示（DiR-BOA) dtDTNP _Nrc 可以诱导鼻 咽癌 5-8F细胞发生凋亡。 为了定量研究 dtDTNP _NPe 诱导 5-8F细胞凋亡的 效果， 将含 8 μ ιηοΐ多肽的 （DiR-BOA) dtDTNP ^和（DiR-BOA) NP纳米颗粒 与鼻咽癌 5-8F细胞孵育 1 h， 然后用 Annexin V-FITC/PI试剂进行复染， 最后通过流式细胞仪检测 FITC ( FL1 ) /PI ( FL3 ) 通道的细胞荧光强度来 判定凋亡或坏死的细胞数量。 图 20结果显示， 相对于（DiR-BOA) NP对照 组， （DiR-B0A) dtDTNP _NPe 纳米颗粒孵育过的肿瘤细胞， FL1与 FL3通道都 有很强的信号， 表明（DiR-B0A) dtDTNP _NPe 纳米颗粒主要是通过坏死机制来 杀死鼻咽癌 5-8F细胞的。 实施例 4

实施例 2中制备的（DiR-BOA) dtDTNP _NP c纳米颗粒在体靶向性评价。 将 1 X 10 ⁶ 个 5-8F细胞接种到裸鼠皮下构建鼻咽癌荷瘤裸鼠� �型。 当 5-8F肿瘤体积达到 0. 5 cm ³ 时， 对荷瘤裸鼠进行整体荧光成像， 一般设定 4个曝光时间点。 然后尾静脉注射 2. 5 nmol (DiR-BOA) dtDTNP _NPC 和 (DiR- B0A) NP纳米颗粒。 尾静脉注射后的 3 h、 6 h、 12 h、 24 h、 48 h、 72 h和 96 h进行整体荧光成像， 选择的曝光时间与尾静脉注射之前的相 同。 整体荧光成像系统使用的是氙灯光源， 716/40 nm的激发滤光片， 接 收滤光片为 800FS40-25带通滤光片。为了获得更好的信噪比� �使用 685/40 nm激发滤光片以采集来源于组织的自发荧光， 并在后续的图像处理中扣 除自发荧光对荧光信号的干扰。 如图 21所示， （DiR-BOA) dtDTNP _NPe 纳米颗 粒在尾静脉注射 24h时就能有效地蓄积于 5-8F肿瘤， 48h时 5-8F肿瘤处 的荧光信号最强， 而在 72 h后 5-8F肿瘤与正常组织之间具有最佳的信噪 比。 但（DiR-BOA) NP实验组在尾静脉注射后 24 h和 48 h， 肿瘤部位均没 有探测到荧光信号 （如图 22所示） 。 活体动态荧光成像结果充分证实了 dtDTNP _NPe 纳米颗粒的肿瘤靶向标记能力。 尾静脉注射纳米颗粒 48 h后取 出各脏器进行整体荧光成像， 进一歩显示， （DiR-BOA) dtDTNP _NPe 实验组主 要在肿瘤部位进行靶向蓄积 （如图 23所示） ， 而（DiR-BOA) NP除了在肿 瘤部位有部分富集外， 肝、 脾和肺都有很强的富集 （如图 24所示） 。 为 了研究（DiR-BOA) dtDTNP _NPC 的穿透能力， 将 （DiR-BOA) dtDTNP _NP ft米颗粒 处理组的肿瘤进行冰冻切片，如图 25所示，肿瘤部位有非常强的 DiR-BOA 荧光信号， 这说明纳米颗粒 dtDTNP _NP 。对鼻咽癌实体瘤有非常强的穿透能 力。 实施例 5

实施例 2中制备的 dtDTNP _Nrc 纳米颗粒对鼻咽癌肿瘤治疗效果的在体 评价。

构建鼻咽癌 5-8F和肺癌 LLC的裸鼠皮下模型丄 LC肿瘤作为 dtDTNP _NPC 纳米颗粒靶向的阴性对照组。 消化 5-8F和 LLC细胞， 使用灭菌的 PBS漂 洗两次后进行细胞计数，裸鼠接种 5-8F细胞的数目为 1 X 10 ⁶ 个 /只， 接种 后的荷瘤裸鼠随机共分为 PBS对照组、 dtDTNP _NP ^B NP纳米颗粒 5-8F肿瘤 治疗组； LLC肿瘤对照组的裸鼠皮下接种 LLC细胞 2 X 10 ⁶ 个 /只。 这三组 荷瘤裸鼠每组的数量为 5只。在肿瘤细胞皮下接种后第 3天， 即开始尾静 脉注射 dtDTNP _NP 。进行治疗， 给药频率为隔天尾静脉注射一次。

PBS组为尾静脉注射等体积的无菌 PBS， 即注射量为 0. 25 ml/只。 5-8F肿瘤治疗组尾静脉注射剂量为含 10 nmol多肽的 dtDTNP _NPe 和 NP 纳米颗粒。

LLC肿瘤治疗对照组的尾静脉注射剂量为含 10 nmol多肽的 dtDTNP _NPC 纳米颗粒。

皮下接种肿瘤细胞的裸鼠， 在第 3天和第 4天时肿瘤的体积都为零， 第五天时肿瘤才开始长出来。 肿瘤体积的计算公式为 V=0. 5 X LX HX H。

如图 26所示， 经过 3轮的 dtDTNP _NPe 给药后， 5-8F肿瘤治疗组与 PBS 对照组相比， 已表现出明显的肿瘤生长被抑制的现象。 经过 5 轮的 dtDTNP ^给药后， 5-8F肿瘤的生长依然处于被抑制状态， 而 LLC肿瘤的 体积已明显增大， 这说明 dtDTNP 纳米颗粒对鼻咽癌 5-8F肿瘤具有选择 性抑制效果。 但是 NP处理组的肿瘤与 PBS对照组没有显著性的差异 （如 图 27所示） 。 在荷瘤裸鼠的体重变化方面， 经过 6轮治疗， 如图 28和 29所示， dtDTNP _NP n NP治疗组的荷瘤鼠体重与 PBS对照组之间无明显的 差异， 表明该治疗浓度下的 dtDTNP 纳米颗粒对荷瘤裸鼠本身没有明显 的毒副作用。 实施例 6

将实施例 2中制备 dtDTNP 所用的胆固醇油酸酯， 部分替换为脂溶 性药物紫杉醇 （PTX-0L ) 。 利用磷脂、 dtTP _Nrc 多肽与紫杉醇进行混合， 形 成（PTX-OL) dtDTNP _Nrc 纳米颗粒， 可实现鼻咽癌的协同靶向联合治疗的效 果。 实施例 7

将实施例 2中制备 dtDTNP 所用的胆固醇油酸酯， 部分替换为脂溶 性药物姜黄素 （Curcumin ) 。 利用磷脂、 dtTP _NP 。多肽与姜黄素进行混合形 成（Cur _CU min) dtDTNP _NPe 纳米颗粒， 对鼻咽癌细胞具有很好的杀伤效果。 如 图 30所示， 含 2 μ πιοΐ姜黄素的游离姜黄素和（Curcumi n) dtDTNP _Nrc 纳米 颗粒分别与 5-8F-mRFP细胞孵育 1 h后进行共聚焦荧光成像， 与游离姜黄 素相比， （011^111^11) (^07^^更容易被 5-8F-mRFP摄取， 而且有更好的杀 伤作用。