[0001] La présente invention concerne de nouveaux polymères biocompatibles à base de polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles pouvant être utiles, notamment pour l'administration de principe(s) actif(s) (PA) aux hommes ou aux animaux dans un but thérapeutique et/ou prophylactique.

[0002] Les dextranes et les pullulanes anioniques comportant des groupes fonctionnels carboxyles présentent du fait de leur structure et de leur biocompatibilité un intérêt particulier en pharmacie et plus particulièrement dans le domaine de la stabilisation de principes actifs protéiques par la formation de complexes.

[0003] Les alcools hydrophobes présentent un intérêt dans la formulation de principes actifs pharmaceutiques, notamment, en raison de leur caractère hydrophobe permettant de moduler l'hydrophobicité des polymères sur lesquels ils peuvent être greffés et de leur biocompatibilité.

[0004] Leur biocompatibilité est excellente dans la mesure où ils jouent un rôle dans de nombreux processus biochimiques et sont présents sous forme estérifiée dans la plupart des tissus.

[0005] Il est connu de l'homme de l'art qu'il est difficile de greffer un alcool sur un polysaccharide comportant des groupes fonctionnels carboxyles puisqu'il est difficile d'être sélectif entre les fonctions hydroxyles du polysaccharide et la fonction hydroxyle de l'alcool hydrophobe. Au moment du greffage, les alcools du polymère peuvent entrer en compétition avec l'alcool du greffon si l'on ne souhaite pas avoir recours à des techniques de protection déprotection des alcools du polymère et cette réaction secondaire conduit à la réticulation des chaînes de polymère comme cela est décrit dans Zhang, R. et al., Biomaterials 2005, 26, 4677.

[0006] La difficulté du greffage d'alcools hydrophobes sur des dextranes porteurs de fonctions carboxylates a été notamment contournée en greffant des acides hydrophobes directement sur les fonctions hydroxyles du dextrane. Cela a été réalisé avec des dérivés activés d'acides gras, tels que des anhydrides (Novak U, Tyree JT ( 1960) US Patent 2954372), des chlorures d'acides, des N-acyl urées (Nichifor, Marieta et al., Eur. Polym. J. 1999, 35, 2125-2129), etc. Ces méthodes n'ont été mises en œuvre qu'avec des polysaccharides neutres puisqu'elles ne sont pas compatibles avec la présence de fonctions carboxylates sur le polysaccharide.

[0007] D'autres chercheurs ont employé des polysaccharides non anioniques afin de pouvoir greffer des alcools hydrophobes. Akiyoshi et al., par exemple, ont converti le cholestérol, nucléophile, en un dérivé électrophile (Biomacromolecules 2007, 8, 2366-2373). Ce dérivé électrophile du cholestérol a pu être greffé sur les fonctions alcools du pullulane ou du mannane, polysaccharides neutres. Cette stratégie ne peut également pas être mise en œuvre avec des polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles.

[0008] Une revue récente des polymères fonctionnels à base de dextrane (Heinze, T. et al., Adv. Polym. Sci. 2006, 205, 199-291.) fait état de modifications par des acides hydrophobes entre autres mais ne fait pas état de dextrane fonctionnalisé par des alcools hydrophobes.

[0009] Les demandes de brevet FR 08 505506, publiée sous le numéro FR 2 936 800, et WO 2009/127940 décrivent des polysaccharides carboxylés greffés par des alcools hydrophobes par l'intermédiaire d'un bras de couplage comportant une fonction aminé susceptible de former une liaison amide avec une fonction carboxyle du polysaccharide. Cette solution si elle permet d'atteindre des composés d'intérêt comporte l'inconvénient d'introduire une fonction amide supplémentaire dans le polysaccharide qui peut influencer la formation et la stabilité de complexes polysaccharide/principe actif.

[00010] La présente invention concerne de nouveaux dérivés de polysaccharides amphiphiles comportant des groupes fonctionnels carboxyles en partie substitués par au moins unalcool hydrophobe. Ces nouveaux dérivés de polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles ont une bonne biocompatibilité et leur hydrophobicité est facilement modulable sans altérer la biocompatibilité ni leur stabilité.

[00011] Elle concerne également une méthode de synthèse permettant de résoudre les problèmes de synthèse supra cités en employant des dérivés tosylés d'alcool hydrophobes. Cette méthode a permis d'obtenir des polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles en partie substitués par des alcools hydrophobes. [00012] L'invention concerne donc des polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles, ledit polysaccharide étant choisi dans le groupe des polysaccharides synthétiques anioniques comportant des liaisons 1,6 obtenus à partir de polysaccharides neutres, sur lesquels au moins 15 groupes fonctionnels carboxyles pour 100 unités saccharidiques ont été greffées, dont un au moins desdits groupes est substitué par un alcool hydrophobe, noté Ah :

• ledit alcool hydrophobe (Ah) étant greffé ou lié au polysaccharide anionique par une fonction F ladite fonction F résultant du couplage entre la fonction carboxylate du polysaccharide anionique et la fonction hydroxyle de l'alcool hydrophobe, les fonctions carboxyles du polysaccharide anionique non substituées étant sous forme de carboxylate de cation, alcalin de préférence comme Na ⁺ ou K ⁺ .

- F étant une fonction ester,

· Ah étant un reste d'un alcool hydrophobe,

• ledit polysaccharide comportant des groupes fonctionnels carboxyles étant amphiphile à pH neutre.

[00013] Selon l'invention, le polysaccharide comportant des groupes fonctionnels carboxyles en partie substitués par des alcools hydrophobes est choisi parmi les polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles de formule générale I :

n

Formule I

- dans laquelle, n représente la fraction molaire des fonctions carboxyles du polysaccharide substituées par F-Ah et est compris entre 0,01 et 0,7,

- F et Ah répondant aux définitions données ci-dessus, et lorsque la fonction carboxyle du polysaccharide n'est pas substituée par F-Ah, alors le ou les groupes fonctionnels carboxyles du polysaccharide sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence comme Na ⁺ ou K ⁺ .

[00014] Dans un mode de réalisation, les polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles sont des polysaccharides synthétiques obtenus à partir de polysaccharides neutres, sur lesquels au moins 15 groupes fonctionnels carboxyles pour 100 unités saccharidiques ont été greffés, de formule générale II.

- les polysaccharides naturels étant choisis dans le groupe des polysaccharides dont les liaisons entre les monomères glycosidiques comprennent des liaisons (1,6),

- L étant une liaison résultant du couplage entre le bras de liaison Q et une fonction -OH du polysaccharide et étant soit une fonction ester, thionoester, carbonate, carbamate ou éther,

- i représente la fraction molaire des substituants L-Q par unité saccharidique du polysaccharide

- Q étant choisi parmi les radicaux de formule générale III :

Ri (CH ₂ )— (-Ç-)-(CH ₂ )- COOH

a b c

R ₂ I I I

dans laquelle :

1 < a + b + c≤6 et,

0 < a < 3, et R ₂ , identiques ou différents sont choisis dans le groupe constitué par -H, alkyle linéaire ou ramifié en C1 à C3, -COOH et le radical

de formule IV dans laquelle

1 < d < 3 et

R'i et R' ₂ identiques ou différents sont choisis dans le groupe constitué par -H et un groupe alkyle linéaire ou ramifié en C1 à C3.

[00015] Dans un mode de réalisation a+b+c < 5

[00016] Dans un mode de réalisation a + b+c < 4

[00017] Dans un mode de réalisation, n est compris entre 0,02 et 0,5.

[00018] Dans un mode de réalisation, n est compris entre 0,05 et 0,3.

[00019] Dans un mode de réalisation, n est compris entre 0,1 et 0,2.

[00020] Dans un mode de réalisation le polysaccharide est choisi dans le groupe constitué par les polysaccharides dont les liaisons entre les monomères glycosidiques comprennent des liaisons (1,6).

[00021] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est choisi dans le groupe constitué par le dextrane et le pullulane.

[00022] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide choisi dans le groupe constitué par les polysaccharides dont les liaisons entre les monomères glycosidiques comprennent des liaisons (1,6) est le dextrane.

[00023] Dans un mode de réalisation le polysaccharide est choisi dans le groupe constitué par les polysaccharides dont les liaisons entre les monomères glycosidiques comprennent des liaisons (1,6) et des liaisons (1,4).

[00024] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide dont les liaisons entre les monomères glycosidiques comprennent des liaisons (1,6) et des liaisons (1,4) est un pullulane. [00025] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est caractérisé en ce que le radical L-Q est choisi dans le groupe constitué par les radicaux suivants, L ayant la signification donnée ci-dessus :

[00026] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est caractérisé en ce que le radical L-Q est choisi dans le groupe constitué par les radicaux suivants, L ayant la signification donnée ci-dessus :

[00027] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est caractérisé en ce que le radical L-Q est choisi dans le groupe constitué par les radicaux suivants L a ant la si nification donnée ci-dessus :

[00028] Dans un mode de réalisation, i est compris entre 0,15 et 2.

[00029] Dans un mode de réalisation, i est compris entre 0,3 et 1,5.

[00030] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les alcools gras.

[00031] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les alcools constitués d'une chaîne alkyle insaturée ou saturée, ramifiée ou non ramifiée, comprenant de 4 à 18 carbones.

[00032] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les alcools constitués d'une chaîne alkyle insaturée ou saturée, ramifiée ou non ramifiée, comprenant de 6 à 18 carbones.

[00033] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les alcools constitués d'une chaîne alkyle insaturée ou saturée, ramifiée ou non ramifiée, comprenant de 8 à 16 carbones. [00034] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est l'octanol.

[00035] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est le 2- éthylbutanol.

[00036] Dans un mode de réalisation, l'alcool gras est choisi parmi le myristyl, le cétyl, le stéaryl, le cétéaryl, le butyl, l'oléyl, la lanoline.

[00037] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les dérivés du cholestérol.

[00038] Dans un mode de réalisation, le dérivé du cholestérol est le cholestérol.

[00039] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les dérivés du menthol.

[00040] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est le menthol sous sa forme racémique.

[00041] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est l'isomère D du menthol.

[00042] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est l'isomère L du menthol.

[00043] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les tocophérols.

[00044] Dans un mode de réalisation, le tocophérol est l'alpha tocophérol.

[00045] Dans un mode de réalisation, l'alpha tocophérol est le racémique de l'alpha tocophérol.

[00046] Dans un mode de réalisation, le tocophérol est l'isomère D de l'alpha tocophérol.

[00047] Dans un mode de réalisation, le tocophérol est l'isomère L de l'alpha tocophérol.

[00048] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les alcools porteurs de groupe aryle.

[00049] Dans un mode de réalisation, l'alcool porteur de groupe aryle est choisi parmi l'alcool benzylique, l'alcool phenéthylique.

[00050] Le polysaccharide peut avoir un degré de polymérisation m compris entre 10 et 10000.

[00051] Dans un mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m compris entre 10 et 1000.

[00052] Dans un autre mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m compris entre 10 et 500. [00053] L'invention concerne également la synthèse des polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles en partie substitués selon l'invention.

[00054] Ladite synthèse comprend une étape d'obtention d'un intermédiaire Ah-OTs et une étape de greffage de cet intermédiaire tosylé sur une fonction carboxyle d'un polysaccharide, Ah répondant aux définitions données ci-dessus.

[00055] Dans un mode de réalisation une étape de fonctionnalisation du polysaccharide par au moins 15 groupes fonctionnels carboxyles pour 100 unités saccharidiques est effectuée par greffage de composés de formule Q-L', L' étant une fonction anhydride, halogénure, tosylate, acide carboxylique, thioacide ou isocyanate sur au moins 15 fonctions alcool pour 100 unités saccharidiques du polysaccharide, Q et L répondant aux définitions données ci-dessus .

[00056] Dans un mode de réalisation, l'intermédiaire tosylé de formule Ah-OTs est obtenu par réaction de l'alcool hydrophobe Ah avec un dérivé de tosyle selon la procédure décrite par Morita et al. (Morita, J.-I. et al., Green Chem. 2005, 7, 711).

[00057] De préférence, l'étape de greffage de l'intermédiaire tosylé sur une fonction acide du polysaccharide est réalisée en milieu organique.

[00058] L'invention concerne également l'utilisation des polysaccharides fonctionnalisés selon l'invention pour la préparation de compositions pharmaceutiques telles que décrites précédemment.

[00059] L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant l'un des polysaccharides selon l'invention tel que décrit précédemment et au moins un principe actif.

[00060] L'invention concerne également une composition pharmaceutique selon l'invention telle que décrite précédemment caractérisée en ce que le principe actif est choisi dans le groupe constitué par les protéines, les glycoprotéines, les peptides et les molécules thérapeutiques non- peptidiques.

[00061] On entend par principe actif un produit sous forme d'entité chimique unique ou sous forme d'une combinaison ayant une activité physiologique. Ledit principe actif peut être exogène c'est à dire qu'il est apporté par la composition selon l'invention. Il peut également être endogène, par exemple les facteurs de croissance qui vont être sécrétés dans une plaie pendant la première phase de cicatrisation et qui pourront être retenus sur ladite plaie par la composition selon l'invention.

[00062] Selon les pathologies visées elle est destinée à un traitement local ou systémique.

[00063] Dans le cas des libérations locale et systémique, les modes d'administration envisagés sont par voie intraveineuse, sous-cutanée, intradermique, transdermique, intramusculaire, orale, nasale, vaginale, oculaire, buccale, pulmonaire etc.

[00064] Les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont soit sous forme liquide, en solution aqueuse, soit sous forme de poudre, d'implant ou de film. Elles comportent en outre les excipients pharmaceutiques classiques bien connus de l'homme de l'art.

[00065] En fonction des pathologies et des modes d'administration les compositions pharmaceutiques pourront avantageusement comporter, en outre, des excipients permettant de les formuler sous forme de gel, d'éponge, de solution injectable, de solution buvable, de lyoc, etc.

[00066] L'invention concerne également une composition pharmaceutique selon l'invention telle que décrite précédemment, caractérisée en ce qu'elle est administrable sous forme de stent, de film ou « coating » de biomatériaux implantables, d'implant.

Exemple 1 : Dextraneméthylcarboxylate de sodium partiellement esterifié par l'octanol

Polymère 1

[00067] Le 1-octyle p-toluènesulfonate est obtenu selon le procédé décrit dans la publication (Morita, J.-I. et al., Green Chem. 2005, 7, 711).

[00068] 32 g (soit 0,59 mol de fonctions hydroxyles) de dextrane de masse molaire moyenne en poids d'environ 10 kg/mol (Bachem) sont solubilisés dans de l'eau à 230 g/L. A cette solution sont ajoutés 60 mL de NaOH 10 N (0,59 mol NaOH). Le mélange est porté à 35°C puis 92 g (0,79 mol) de chloroacétate de sodium sont ajoutés. La température du milieu réactionnel est portée à 60°C à 0,5°C/min puis maintenue à 60°C pendant 100 minutes. Le milieu réactionnel est dilué avec 800 mL d'eau, neutralisé à l'acide acétique et purifié par ultrafiltration sur membrane PES de 5 kD contre 6 volumes d'eau. La solution finale est dosée par extrait sec pour déterminer la concentration en polymère ; puis dosée par dosage acide/base dans de l'eau/acétone 50 / 50 (V/V) pour déterminer le degré de substitution en méthylcarboxylates.

[00069] D'après l'extrait sec : [polymère] = 47,8 mg/g

[00070] D'après le dosage acide/base : le degré de substitution des fonctions hydroxyles par des fonctions méthylcarboxylates est de 1,09 par motif saccharidique.

[00071] La solution de dextraneméthylcarboxylate de sodium est passée sur une résine Purolite (anionique) pour obtenir une solution aqueuse de dextraneméthylcarboxylique acide dont le pH est monté à 7,1 par ajout d'une solution aqueuse (40%) d'hydroxyde de tétrabutylammonium (Sigma) puis la solution est ensuite lyophilisée pendant 18 heures.

[00072] 20 g de dextraneméthylcarboxylate de tétrabutylammonium (45 mmol fonctions méthylcarboxylates) sont solubilisés dans le DMF à 120 g/L puis chauffés à 40°C. Une solution de 2,37 g de 1-octyle p- toluènesulfonate (8.3 mmol) dans 12 ml_ de DMF est alors ajoutée à la solution de polymère. Le milieu est ensuite maintenu à 40°C pendant 5 heures. La solution est ultrafiltrée sur membrane PES 10 kD contre 15 volumes de solution NaCI 0,9% puis 5 volumes d'eau. La concentration de la solution de polymère est déterminée par extrait sec. Une fraction de solution est lyophilisée et analysée par RMN ¹ H dans D ₂ 0 pour déterminer le taux de fonctions acides converties en ester de 1-octanol.

[00073] D'après l'extrait sec : [Polymère 1] = 20,2 mg/g

[00074] D'après la RMN ¹ H : la fraction molaire des acides esterifiés par le 1-octanol par unité saccharidique est de 0,17.

Exemple 2: Dextraneméthylcarboxylate de sodium partiellement esterifié par le dodécanol

Polymère 2

[00075] Le 1-docécyle p-toluènesulfonate est obtenu selon le procédé décrit dans la publication (Morita, J.-I. et al., Green Chem. 2005, 7, 711).

[00076] Par un procédé similaire à celui décrit à l'exemple 1, en utilisant un dextrane de masse moléculaire moyenne en poids d'environ 10 kg/mol (Pharmacosmos) un dextraneméthylcarboxylate de sodium partiellement esterifié par le dodécanol est obtenu.

[00077] D'après l'extrait sec : [Polymère 2] = 18,7 mg/g [00078] D'après la RMN ^ : la fraction molaire des acides esterifiés par le dodécanol par unité saccharidique est de 0,095.

Exemple 3: Dextraneméthylcarboxylate de sodium partiellement esterifié par le 3,7-diméthyl-l-octanol

Polymère 3

[00079] Le 3,7-diméthyl-l-octyl p-toluènesulfonate est obtenu selon le procédé décrit dans la publication (Morita, J.-I. et al., Green Chem. 2005, 7, 711).

[00080] Par un procédé similaire à celui décrit à l'exemple 1, en utilisant un dextrane de masse moléculaire moyenne en poids d'environ 10 kg/mol (Pharmacosmos) un dextraneméthylcarboxylate de sodium partiellement esterifié par le 3,7-dimethyl-l-octanol est obtenu.

[00081] D'après l'extrait sec : [Polymère 3] = 14 mg/g

[00082] D'après la RMN ¹ H : la fraction molaire des acides esterifiés par le 3,7-dimethyl-l-octanol par unité saccharidique est de 0,19.

Exemple 4: Dextraneméthylcarboxylate de sodium partiellement esterifié par le 2-hexyl-l-décanol

Polymère 4

[00083] Le 2-hexyl-l-décyle p-toluènesulfonate est obtenu selon le procédé décrit dans la publication (Morita, J.-I. et al., Green Chem. 2005, 7, 711).

[00084] Par un procédé similaire à celui décrit à l'exemple 1, en utilisant un dextrane de masse moléculaire moyenne en poids d'environ 10 kg/mol

(Pharmacosmos) un dextraneméthylcarboxylate de sodium partiellement esterifié par le 2-hexyl-l-décanol est obtenu.

[00085] D'après l'extrait sec : [Polymère 4] = 20,5 mg/g

[00086] D'après la RMN ¹ H : la fraction molaire des acides esterifiés par le 2-hexyl-l-décanol par unité saccharidique est de 0,05.

Exemple S : Dextrane(2-éthyl)méthylcarboxylate de sodium partiellement esterifié par l'octanol

Polymère S

[00087] Le 1-octyle p-toluènesulfonate est obtenu selon le procédé décrit dans la publication (Morita, J.-I. et al., Green Chem. 2005, 7, 711). [00088] 15 g (soit 0,28 mol de fonctions hydroxyles) de dextrane de masse molaire moyenne en poids d'environ 40 kg/mol (Bachem) sont solubilisés dans 14 mL d'eau. 55,8 g (0,33 mol) d'acide 2-bromobutyrique et 37 mL de NaOH 10N sont ensuite ajoutés et le mélange est chauffé à 55°C. 46,3 mL de NaOH 10N sont ajoutés sur lh et le milieu chauffé à 55°C pendant 50 min. Le milieu réactionnel est dilué avec 24 mL d'eau, neutralisé à l'acide acétique et purifié par ultrafiltration sur membrane PES de 5 kD contre 15 volumes d'eau. La solution finale est dosée par extrait sec pour déterminer la concentration en polymère ; puis dosée par dosage acide/base dans de l'eau/acétone 50 / 50 (V/V) pour déterminer le degré de substitution en (2-éthyl)méthylcarboxylates.

[00089] D'après l'extrait sec : [polymère] = 46,6 mg/g

[00090] D'après le dosage acide/base : le degré de substitution des fonctions hydroxyles par des fonctions (2-éthyl)méthylcarboxylates est de 0,43 par motif saccharidique.

[00091] La solution de dextrane(2-éthyl)méthylcarboxylate de sodium est passée sur une résine Purolite (anionique) pour obtenir une solution aqueuse de dextrane(2-éthyl)méthylcarboxylique acide dont le pH est monté à 7, 1 par ajout d'une solution aqueuse (40%) d'hydroxyde de tétrabutylammonium (Sigma) puis la solution est ensuite lyophilisée pendant 18 heures.

[00092] 13 g de dextrane(2-éthyl)méthylcarboxylate de tétrabutylammonium ( 18 mmol fonctions (2-éthyl)méthylcarboxylates) sont solubilisés dans le DMF à 100 g/L puis chauffés à 40°C. Une solution de 0,6 g de 1-octyle -toluènesulfonate (2, 1 mmol) dans 3 mL de DMF est alors ajoutée à la solution de polymère. Le milieu est ensuite maintenu à 40°C pendant 5 heures. La solution est ultrafiltrée sur membrane PES 10 kD contre 15 volumes de solution NaCI 0,9% puis 5 volumes d'eau. La concentration de la solution de polymère est déterminée par extrait sec. Une fraction de solution est lyophilisée et analysée par RMN ^l dans D ₂ 0 pour déterminer le taux de fonctions acides converties en ester de 1- octanol.

[00093] D'après l'extrait sec : [Polymère 5] = 24,2 mg/g

[00094] D'après la RMN ^l : la fraction molaire des acides esterifiés par le 1-octanol par unité saccharidique est de 0, 1. Exemple 6 : Dextranesuccinate de sodium partiellement esterifié par le dodécanol

Polymère 6

[00095] Le 1-dodécyle p-toluènesulfonate est obtenu selon le procédé décrit dans la publication (Morita, J.-I. et al., Green Chem. 2005, 7, 711).

[00096] Le dextranesuccinate de sodium est obtenu à partir du dextrane 40 selon la méthode décrite dans l'article de Sanchez-Chaves et al. (Sanchez-Chaves, Manuel et al., Polymer 1998, 39 (13), 2751-2757). Le taux de fonctions acides par unité glycosidique est de 1,53 d'après la RMN *H dans D ₂ 0/NaOD.

[00097] Par un procédé similaire à celui décrit à l'exemple 1, un dextranesuccinate de sodium partiellement esterifié par le 1-dodécanol est obtenu.

[00098] D'après l'extrait sec : [Polymère 6] = 28,2 mg/g

[00099] D'après la RMN ¹ H : la fraction molaire des acides esterifiés par le 1-dodécanol par unité saccharidique est de 0,05.

Exemple 7 : N-méthylcarboxylate de sodium dextrane carbamate partiellement esterifié par l'octanol

Polymère 7

[000100] Le 1-octyle p-toluènesulfonate est obtenu selon le procédé décrit dans la publication (Morita, J.-I. et al., Green Chem. 2005, 7, 711).

[000101] 11,5 g (soit 0,21 mol de fonctions hydroxyles) de dextrane de masse molaire moyenne en poids d'environ 10 kg/mol (Bachem) sont solubilisés dans un mélange DMF/DMSO. Le mélange est porté à 130°C sous agitation et 13,75 g (0,11 mol) d'éthyle isocyanatoacétate sont progressivement introduits. Le milieu est ensuite dilué en eau et purifié par diafiltration sur membrane PES de 5 kD contre NaOH 0,1N, NaCI 0,9% et de l'eau. La solution finale est dosée par extrait sec pour déterminer la concentration en polymère ; puis dosée par dosage acide/base dans de l'eau/acétone 50 / 50 (V/V) pour déterminer le degré de substitution en charges carboxylates.

[000102] D'après l'extrait sec : [polymère] = 38,9 mg/g

[000103] D'après le dosage acide/base : le degré de substitution des fonctions hydroxyles par des fonctions N-méthylcarboxylates carbamates est de 1,08 par motif saccharidique. [000104] La solution de N-méthylcarboxylate de sodium dextrane carbamate est passée sur une résine Purolite (anionique) pour obtenir une solution aqueuse de N-méthylcarboxylique acide dextrane carbamate dont le pH est monté à 7,1 par ajout d'une solution aqueuse (40%) d'hydroxyde de tétrabutylammonium (Sigma) puis la solution est ensuite lyophilisée pendant 18 heures.

[000105] 12,1 g de N-méthylcarboxylate de tétrabutylammonium dextrane carbamate (25 mmol fonctions N-méthylcarboxylate de tétrabutylammonium carbamate) sont solubilisés dans le DMF à 140 g/L puis chauffés à 40°C. Une solution de 0,65 g de 1-octyle p-toluènesulfonate (3,2 mmol) dans 27 mL de DMF est alors ajoutée à la solution de polymère. Le milieu est ensuite maintenu à 40°C pendant 5 heures. La solution est ultrafiltrée sur membrane PES 10 kD contre 15 volumes de solution NaCI 0,9% puis 5 volumes d'eau. La concentration de la solution de polymère est déterminée par extrait sec. Une fraction de solution est lyophilisée et analysée par RMN ^l dans D ₂ 0 pour déterminer le taux de fonctions acides converties en ester de 1-octanol.

[000106] D'après l'extrait sec : [Polymère 7] = 20,2 mg/g

[000107] D'après la RMN ^ : la fraction molaire des acides esterifiés par le 1-octanol par unité saccharidique est de 0,09.

Exemple 8 : Stabilisation d'un anticorps polyclonal humain vis-à-vis du stress mécanique.

[000108] Un essai de stabilisation d'un anticorps polyclonal humain vis-à- vis du stress mécanique a été développé afin de mettre en évidence le pouvoir stabilisant des polysaccharides de l'invention. Une solution aqueuse (375 pL) de polymère (1,33 mmol/L) est diluée avec 75 pL de chlorure de sodium (1,5 M, Riedel-de-Haën). 375 pL d'une solution d'anticorps polyclonal humain (80 g/L soit 0,53 mmol/L) est alors ajoutée à la solution de polymère pour générer une solution finale à 40 mg/mL en anticorps pour un ratio molaire polymère/anticorps de 2.

[000109] Le polymère, polymère 1, selon l'invention est mis en œuvre dans ce test. A titre comparatif, un polymère décrit dans la demande de brevet FR0805506 est également mis en œuvre dans ce test, le dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par le glycinate de 1- octanol, polymère 8. [000110] Le test consiste à agiter par retournement à 30 rpm les formulations placées dans des tubes à hémolyse en verre de 6 ml_.

[000111] Après 18 h de retournement, l'aspect visuel de la solution est noté et la densité optique de l'échantillon à 450 nm mesurée.

[000112] Les résultats sont rassemblés dans le tableau suivant.

[000113] Ce test permet de mettre en évidence l'amélioration de la stabilité d'un anticorps polyclonal humain en solution par le polymère selon l'invention dans un test de stress mécanique. En revanche, le dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par le glycinate de 1-octanol stimule cette agrégation.