POBLACIóN DE CéLULAS MADRE ADULTAS DERIVADAS DE TEJIDO ADIPOSO CARDIACO Y SU USO EN REGENERACIóN CARDIACA

CAMPO DE LA INVENCIóN La presente invención se refiere al aislamiento y caracterización de una nueva población de células madre adultas derivadas de tejido graso cardiaco y a sus potenciales aplicaciones en terapia. En concreto, la invención se refiere al uso de dicha población de células madre adultas derivadas de tejido graso cardiaco en protocolos de terapia celular con el objetivo de regenerar el tejido miocárdico dañado.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIóN

El gran impacto social y económico que tienen actualmente las enfermedades degenerativas en los países desarrollados, incluidas las patologías cardiovasculares, está impulsando la búsqueda de precursores celulares que puedan mejorar las terapias convencionales.

La principal consecuencia de un infarto de miocardio es la pérdida irreversible de una porción del músculo cardiaco que se sustituye por tejido cicatrizal. Esta pérdida produce una disminución de la capacidad contráctil del miocardio así como de la función de bombeo para proporcionar el gasto cardiaco necesario, sobrecargando al miocardio superviviente y conduciendo en última instancia a una insuficiencia cardiaca. En 1998, solamente en Estados Unidos, había más de 7,5 millones de personas supervivientes de un infarto de miocardio. Entre ellos, más de un 30% mueren durante el primer año después del infarto. La supervivencia tras el infarto depende en gran medida del tamaño de la zona de miocardio muerta por falta de vascularización. En los humanos un infarto de más del 45% de la masa del ventrículo izquierdo produce choque cardiogénico irreversible.

Esta pérdida local de miocardio produce la re-organización del resto del músculo cardiaco, con incremento de muerte celular por apoptosis, hipertrofia de las células musculares y aumento de la fibrosis en el miocardio que sobrevive. Esta reorganización del músculo cardiaco, comúnmente conocida con el nombre de "remodelamiento", muy frecuentemente resulta en la aparición de insuficiencia cardiaca. En esta situación, el

corazón es incapaz de mantener un gasto cardiaco adecuado resultando en una limitación seria y progresiva de la capacidad del individuo.

Tras un infarto agudo de miocardio, así como en aquellos pacientes que han desarrollado insuficiencia cardiaca congestiva, la terapia actual no consigue la recuperación plena del miocardio de tales pacientes con disfiinción ventricular severa refractaria. Todas las terapias actualmente en uso para tratar la pérdida de músculo cardiaco están dirigidas a preservar la función del miocardio restante.

Dichas terapias tienen como objetivo preservar y mejorar la función de los cardiomiocitos (las células contráctiles del corazón) que han sobrevivido y evitar su muerte ya sea por apoptosis o por necrosis. La mayoría de tratamientos para el infarto de miocardio intentan restaurar el flujo sanguíneo al área isquémica para prevenir la pérdida de más células contráctiles. Estas terapias de reperfusión incluyen el uso de agentes trombolíticos (que disuelven el trombo formado en la arteria coronaria), la angioplastia de balón (para abrir la arteria cerrada por métodos físicos) o el bypass coronario en el que la zona cerrada es sobrepasada mediante un puente que une la parte proximal con la parte distal de la arteria obstruida por medio de un injerto venoso. Solo en 1998, en Estados Unidos, se realizaron más de medio millón de angioplastias de balón y un número parecido de bypasses quirúrgicos. Estos tratamientos frecuentemente logran re-establecer el flujo coronario al área dañada y evitan por un tiempo la pérdida adicional de músculo cardiaco. Sin embargo, ninguno de ellos logra recuperar el tejido ya muerto en el momento de la intervención. Si esta pérdida es sustancial, la consecuencia a largo plazo es el desarrollo de insuficiencia cardiaca crónica que evoluciona en insuficiencia cardiaca terminal.

Hasta ahora, la única opción para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca terminal que permite recuperar completamente la función cardiaca es el trasplante de corazón. Sin embargo, la realización de trasplantes de órganos presenta numerosas complicaciones tales como la escasez de donantes, la alta probabilidad de rechazo del órgano transplantado, etc.

En el caso particular de la insuficiencia cardiaca, debido a la escasez de donantes, el transplante es una opción disponible como máximo en un 5% de los pacientes que lo requieren. Suponiendo que el alto coste de la intervención no fuera un obstáculo suficientemente limitante, el alto coste de la terapia inmunosupresora de por

vida y el elevado número de neoplasias que estos enfermos sufren como consecuencia, son otras limitaciones de esta modalidad terapéutica.

Tradicionalmente se consideraba que los miocardiocitos sólo se dividían durante el desarrollo embrionario-fetal, perdiéndose de forma irreversible después de un infarto de miocardio. De tal manera que, hasta hace relativamente poco, los expertos en biología cardiaca consideraban que el corazón no tenía potencial autoregenerativo. Este concepto, a la luz de recientes estudios, ha cambiado radicalmente.

La terapia celular o cardiomioplastia, basada en el principio de la capacidad regenerativa del corazón a partir de la aplicación de células madre, se vislumbra como una vía terapéutica prometedora en el tratamiento de las enfermedades cardiacas. Durante los últimos cinco años se han realizado una serie de estudios que han puesto de manifiesto los procesos de regeneración miocárdica, demostrando la presencia de células madre residentes y/o de origen extracardiaco con potencial regenerativo en corazones adultos. En este contexto, la observación de quimerismo cardiaco post- trasplante constituyó una prueba fehaciente de la existencia de células capaces de colonizar el tejido miocárdico y adoptar un destino cardiaco [Bayés-Genís A. et al., 2002, Host-cell derived cardiomyocytes in Sex-mismatch cardiac allografts. Cardiovasc Res 2002; 404-410].

Uno de los objetivos principales que persigue la investigación en este campo es identificar el tipo óptimo de célula madre que pueda ser aplicado con seguridad y eficacia en las terapias de regeneración cardiaca. El tipo de célula madre idóneo para la regeneración del corazón debería ser capaz de expandirse suficientemente, presentar capacidad de diferenciación a un miocardiocito plenamente funcional, integrarse en el tejido miocárdico estableciendo contacto electroquímico con las células adyacentes y por último, no estar limitada su aplicación por cuestiones de rechazo inmunológico ni por consideraciones éticas.

Las células madre se caracterizan por su capacidad de automantenerse y por su plasticidad, este último término relacionado con su capacidad de diferenciarse hacia uno o más linajes celulares bajo los estímulos adecuados. La clasificación de las células madre se realiza básicamente atendiendo a criterios de linaje o estirpe celular; órgano o tejido de origen; expresión de marcadores de superficie específicos, expresión de

factores de transcripción y/o proteínas; y capacidad de diferenciación, es decir, número y tipo de células especializadas a los que pueden dar origen.

Dentro de las células madre existe una clara distinción entre aquellas células madre que pueden obtenerse durante una de las primeras etapas del desarrollo de un embrión (blastocito), conocidas como células madre embrionarias, y aquéllas que proceden de tejidos somáticos del adulto, las denominadas células madre adultas. Una célula madre adulta es una célula indiferenciada que se halla en un tejido diferenciado y presenta capacidad de proliferación y de diferenciación a uno o más tipos celulares. Las células madre adultas están presentes en diversos tejidos adultos, encontrándose ampliamente descrita su presencia en médula ósea, tejido adiposo, sangre, córnea, retina, cerebro, músculo esquelético, pulpa dental, epitelio gastrointestinal, hígado y piel. Por su naturaleza, las células madre adultas autólogas son inmunocompatibles y su uso no presenta impedimentos de tipo ético.

A pesar de que se han identificado células madre cardiacas residentes [Beltrami, A.P. et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. CeIl 114, 763-76 (2003); Oh, H. et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusión after infarction. Proc Nati Acad Sci U S A 100, 12313-8 (2003)], la reparación tisular tras el daño es deficiente y se han investigado poblaciones de células madre adultas no cardiacas alternativas [Goldstein, G. et al. Human umbilical cord blood biology, transplantation and plasticity. Curr Med Chem 13, 1249-59 (2006); Orlic, D. et al. Transplanted adult bone marrow cells repair myocardial infarcts in mice. Ann N Y Acad Sci 938, 221-9; discussion 229-30 (2001); Pittenger, M.F. & Martin, BJ. Mesenchymal stem cells and their potential as cardiac therapeutics. Circ Res 95, 9-20 (2004); Rangappa, S., Fen, C, Lee, E.H., Bongso, A. & Sim, E.K. Tr ansformation of adult mesenchymal stem cells isolated from the fatty tissue into cardiomyocytes. Ann Thorac Surg 75, 775-9 (2003); Zvaifler, NJ. et al. Mesenchymal precursor cells in the blood of normal individuáis. Arthritis Res 2, 477-88 (2000)].

Se han sometido a prueba células madre adultas en una variedad de corazones de mamífero tras la lesión, desde ratones hasta seres humanos. En los ratones, surgió una gran expectativa con las células madre derivadas de médula ósea, aunque tal expectación se ha atenuado por informes que muestran que su potencial de regeneración

cardiaca es limitado y controvertido [Balsam, L.B. et al. Haematopoietic stem cells adopt mature haematopoietic fates in ischaemic myocardium. Nature 428, 668-73 (2004); Murry, CE. et al. Haematopoietic stem cells do not transdifferentiate into cardiac myocytes in myocardial infarcts. Nature 428, 664-8 (2004)]. En seres humanos, aunque se mostró cierta mejora en la función cardiaca en estudios clínicos preliminares [Assmus, B. et al. Transplantation of Progenitor Cells and Regeneration Enhancement in Acute Myocardial Infarction (TOPCARE-AMI). Circulation 106, 3009-17 (2002); Strauer, B.E. et al. Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans. Circulation 106, 1913-8 (2002)], los ensayos clínicos más recientes sólo muestran un moderado aumento de la función cardiaca tras el suministro de células [Dohmann, H.F. et al. Multicenter Double Blind Trial of Autologous Bone Marrow Mononuclear Cell Transplantation through Intracoronary Injection post Acute Myocardium Infarction a MiHeart/AMI Study. Triáis 9, 41 (2008)]. Entre las principales aproximaciones seguidas para el tratamiento de la cardiopatía isquémica se encuentran las basadas en el empleo de mioblastos [Herreros J et al., 2003. Autologous intramyocardial injection of cultured skeletal muscle-derived stem cells in patients with non-acute myocardial infarction. Eur Heart J. 2003 Nov; 24(22):2012-20; Mathur A. et al. 2004. Stem cells and repair of the heart. Lancet 2004 JuI 10-16; 364(9429): 183-92] o de células madre derivadas de médula ósea [Tomita S et al., 2002. Bone marrow stromal cells contract synchronously with cardiomyocytes in a coculture system. Jpn J Thorac Cardiovasc Surg. 2002 Aug; 50(8):321-4; Fernández- Aviles F et al., 2004. Experimental and clinical regenerative capability of human bone marrow cells after myocardial infarction. Circ Res. 2004 Oct 1; 95(7):742-8. Epub 2004 Sep 9]. No obstante, persisten una serie de impedimentos críticos que dificultan su aplicación clínica.

En consecuencia, la búsqueda de nuevos tipos de células madre adultas que restauren la función cardiaca sigue siendo un reto importante.

El tejido adiposo blanco es uno de los tejidos más abundantes del cuerpo humano y se localiza en diversas zonas corporales. Dicho tejido adiposo blanco está compuesto por dos poblaciones celulares que pueden ser fácilmente separadas, por una parte los adipocitos maduros y por la otra la fracción estromal-vascular (SVF). Esta

última es heterogénea y puede ser dividida en dos fracciones, al igual que en el caso de la médula ósea, la fracción estromal y la fracción compuesta por células hematopoyéticas. La fracción estromal está compuesta por células de aspecto fibroblástico que se adhieren en cultivo. Dicha población celular, relativamente homogénea, presenta propiedades similares, aunque no idénticas, a las de las células madre mesenquimales derivadas de médula ósea [Zuk et al., 2001. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 2001 Apr; 7(2): 211-28]. Dichas células, denominadas genéricamente células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC), son células que pueden aislarse con facilidad y cultivarse durante meses con un tiempo de duplicación y niveles de senescencia relativamente bajos. En el caso de las células madre derivadas de tejido adiposo subcutáneo, éstas pueden diferenciarse a varios tipos celulares incluyendo adipocitos, osteoblastos, condrocitos e incluso a cardiomiocitos, en respuesta a factores de inducción específicos de cada linaje celular. Asimismo, ha sido publicado que las ADSC pueden ser una fuente potencial de células autólogas para la reparación miocárdica (WO2006/127007).

Hasta la fecha, el uso clínico de las células madre adultas ha dado lugar a resultados bastante modestos en cuanto a la recuperación de la función cardiaca. Sin embargo, los ensayos clínicos han demostrado que la terapia celular es segura y constituye la "prueba de concepto" de que el corazón tiene capacidad de regenerarse tras la aplicación terapéutica de células madre.

Así pues, aunque en los últimos años se ha avanzado mucho en el conocimiento sobre la regeneración del miocardio, no se ha encontrado una población de células madre adultas que pueda ser usada con seguridad y eficacia en terapias de regeneración del corazón, proporcionando de este modo un método simple y eficaz de reparar los daños en el tejido miocárdico. Actualmente, la proporción de pacientes que pueden beneficiarse de una terapia post-infarto efectiva es baja, por lo que es necesario mejorar la eficacia de las terapias existentes, así como la búsqueda de alternativas que puedan restaurar el daño cardiaco, en especial, para aquellos pacientes que han sufrido múltiples infartos.

COMPENDIO DE LA INVENCIóN

La presente invención hace referencia a una nueva población de células madre adultas derivadas de tejido adiposo cardiaco, preferentemente de la zona epicárdica del miocardio, que, sorprendentemente, presentan cierta predisposición cardiomiogénica. En concreto, la invención se refiere al uso de dicha población de células madre adultas derivadas de tejido graso cardiaco en protocolos de terapia celular con el objetivo de contribuir a la reparación del corazón en situaciones fisiopatológicas.

La invención se basa en el hallazgo de que esta nueva población de células madre adultas que se encuentran en la grasa que envuelve al corazón (tejido adiposo epicárdico y/o pericárdico) expresa, in vitro, de manera constitutiva, una serie de marcadores cardioespecíficos, tanto a nivel de RNA mensajero (mRNA), como a nivel proteico, presentando cierta predisposición hacia un linaje cardiomiocítico. Aunque no se desea estar vinculado a ninguna hipótesis, se cree que dicha predisposición sea probablemente debida a su ubicación, en íntimo contacto con el tejido miocárdico y al ambiente que las rodea. Los inventores han observado que esta nueva población celular podría presentar un mejor potencial cardiomiogénico en comparación con el de otras poblaciones de células madre ya descritas, por lo que esta nueva población de células madre adultas aisladas de tejido graso cardiaco constituye un reactivo celular potencialmente útil en la regeneración del tejido cardiaco y en el tratamiento de situaciones en las que existe una pérdida de tejido miocárdico funcional, por ejemplo, en pacientes que han sufrido uno o más infartos de miocardio o en pacientes que han desarrollado insuficiencia cardiaca congestiva.

En particular, los inventores han caracterizado una nueva población de células madre adultas, humanas, derivadas de tejido adiposo cardiaco, de la zona epicárdica, por su perfil de marcadores de superficie y han analizado la expresión génica (mRNA) y proteica de distintos componentes básicos de la célula muscular cardiaca, entre los que se encuentran los factores de transcripción cardiacos GATA-4 y Nkx2.5, los componentes del sarcómero denominados cadena pesada de la beta miosina (β-MHC), la troponina I cardiaca (cTnl), y la α-actinina, y los reguladores de la conexión electroquímica y de la distribución intracelular de calcio conexina-43 (Cx43) y SERCA- 2, respectivamente. El análisis de la expresión de todos estos marcadores se ha realizado

de forma constitutiva, es decir, sin la adición al medio de cultivo de ningún tipo de factor de inducción de la diferenciación hacia un linaje específico.

Se ha efectuado un estudio comparativo del perfil inmunofenotípico, así como de la expresión génica y proteica de marcadores cardioespecíficos en poblaciones de células madre adultas, sustancialmente homogéneas, procedentes de muestras humanas de tejido adiposo de origen epicárdico (epi-ADSC) y de tejido adiposo subcutáneo (sub- ADSC). El aislamiento y expansión de dichas poblaciones celulares se realizó siguiendo protocolos previamente establecidos para células madre derivadas de grasa subcutánea. No se observaron diferencias significativas en cuanto a la expresión de antígenos de superficie entre ambas poblaciones celulares; sin embargo, en el ensayo comparativo de caracterización de la expresión génica en condiciones básales (Ejemplo 3) se puso de manifiesto que dicha población de células epi-ADSC, sorprendentemente, presentaba un incremento estadísticamente significativo de los niveles de expresión génica (mRNA) para el factor de transcripción cardiaco GATA-4 y la proteina Cx43, responsable del acoplamiento electroquímico entre cardiomiocitos adyacentes, respecto a la expresión de los mismos en células madre derivadas de tejido adiposo subcutáneo (sub- ADSC).

Los resultados obtenidos en el análisis de expresión génica fueron completados con el estudio de la expresión de dichos marcadores cardioespecíficos a nivel proteico, mediante Western Blot e inmunofluorescencia (Ejemplo 4). Los resultados del ensayo de inmunofluorescencia muestran la expresión de GAT A-4 nuclear, β-MHC, SERCA-2, Cx43 y α-actinina, así como la distribución a nivel celular de las mismas en una población de células madre derivadas de tejido adiposo cardiaco (epi-ADSC). Los resultados del Western Blot muestran una comparativa del perfil de expresión de las células madre derivadas de tejido adiposo subcutáneo (sub- ADSC) respecto a las células epi-ADSC confirmando una expresión diferencial de la proteína GAT A-4 nuclear y de Cx43 y cómo ésta se mantiene o aumenta con el tiempo de cultivo. Además se observa una expresión diferencial de la cadena pesada de la beta miosina (β-MycHC) con el tiempo de cultivo.

Los resultados del estudio comparativo de la expresión de genes específicos de linaje cardiomiocítico en las poblaciones de células epi-ADSC y sub-ADSC demuestran que la población de células madre derivadas de grasa epicárdica (epi-ADSC) está más

comprometida hacia linaje cardiaco que la población de células madre derivadas de grasa subcutánea del mismo individuo.

Estudios adicionales realizados por los inventores con dicha población de células madre adultas, humanas, derivadas de tejido adiposo cardiaco (ADSC cardiacas), basados en el análisis de expresión inicial y experimentos de diferenciación in vitro, han revelado que dichas ADSC cardiacas tienen un fenotipo inherente de tipo cardiaco y no pueden diferenciarse en adipocitos, aunque se diferencian en linaje endotelial en cultivo. Dichas ADSC cardiacas secretan factores proangiogénicos y, cuando se transplantaron esas células en miocardio dañado en modelos de infarto de miocadio en rata, las células inyectadas expresaron proteínas cardiacas y endoteliales, aumentaron la vascularización, redujeron el tamaño del infarto y en consecuencia mejoraron la función cardiaca in vivo (Ejemplos 6 y 7), por lo que dichas ADSC cardiacas pueden ser consideradas como candidatos válidos para la terapia celular de miocardio.

Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con una nueva célula madre adulta, aislada, derivada de tejido graso cardiaco de mamífero, que expresa GAT A-4 y/o Cx43 de forma constitutiva. En una realización particular, dicha célula madre adulta, aislada, derivada de tejido graso cardiaco de mamífero, expresa GATA-4 y/o

Cx43 de forma constitutiva y estable durante su expansión in vitro.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una población, aislada, de dichas células madre adultas derivadas de tejido graso cardiaco de mamífero.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para obtener una composición que comprende células madre adultas derivadas de tejido graso cardiaco de mamífero, que expresan GATA-4 y/o Cx43 de forma constitutiva. La composición obtenible según dicho procedimiento constituye un aspecto adicional de esta invención.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para obtener células diferenciadas a partir de dichas células madre adultas derivadas de tejido graso cardiaco de mamífero, que comprende cultivar dichas células madre en un medio de diferenciación específico apropiado. Las células diferenciadas obtenibles según dicho método constituyen un aspecto adicional de la invención.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende dicha población aislada de células madre adultas derivadas de tejido

graso cardiaco o dicha composición que comprende dichas células madre derivadas de tejido graso cardiaco de mamífero o una composición que comprende dichas células diferenciadas obtenibles a partir de dichas células madre adultas derivadas de tejido graso cardiaco de mamífero, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto, la invención se relaciona con un biomaterial que comprende dicha población aislada de células madre adultas derivadas de tejido graso cardiaco, dicha composición que comprende dichas células madre derivadas de tejido graso cardiaco de mamífero, dicha composición que comprende dichas células diferenciadas obtenibles a partir de dichas células madre adultas derivadas de tejido graso cardiaco de mamífero, o dicha composición farmacéutica.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de dicha población aislada de células madre adultas derivadas de tejido graso cardiaco, o de dicha composición que comprende dichas células madre derivadas de tejido graso cardiaco de mamífero, o de dicha composición que comprende dichas células diferenciadas obtenibles a partir de dichas células madre adultas derivadas de tejido graso cardiaco de mamífero, en la elaboración de una composición farmacéutica para la regeneración de tejido cardiaco, o en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de una cardiopatía isquémica, o en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento post-infarto de miocardio, o para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca congestiva, o en la elaboración de una composición farmacéutica para estimular la angiogénesis.

En otro aspecto, la invención se relaciona con dicha población aislada de células madre adultas derivadas de tejido graso cardiaco, o de dicha composición que comprende dichas células madre derivadas de tejido graso cardiaco de mamífero, o de dicha composición que comprende dichas células diferenciadas obtenibles a partir de dichas células madre adultas derivadas de tejido graso cardiaco de mamífero, para la regeneración de tejido cardiaco, o para el tratamiento de una cardiopatía isquémica, o para el tratamiento post-infarto de miocardio, o para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca congestiva, o para estimular la angiogénesis.. En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la regeneración de tejido cardiaco, o para el tratamiento de una cardiopatía isquémica, o para el tratamiento post-infarto de miocardio, o para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca congestiva,

o para estimular la angiogénesis, que comprende la administración a un sujeto que lo necesita de una cantidad terapéuticamente efectiva de células madre adultas derivadas de tejido graso cardiaco, o de dicha composición que comprende dichas células madre derivadas de tejido graso cardiaco de mamífero, o de dicha composición que comprende dichas células diferenciadas obtenibles a partir de dichas células madre adultas derivadas de tejido graso cardiaco de mamífero, o de dicha composición farmacéutica.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un kit que comprende dicha población aislada de células madre adultas derivadas de tejido graso cardiaco o dicha composición que comprende dichas células madre derivadas de tejido graso cardiaco de mamífero o dicha composición que comprende dichas células diferenciadas obtenibles a partir de dichas células madre adultas derivadas de tejido graso cardiaco de mamífero.

En otro aspecto, la invención se relaciona un método para evaluar in vitro la respuesta celular a un agente biológico o farmacológico, que comprende poner en contacto dicho agente con una población aislada de células madre adultas derivadas de tejido graso cardiaco, o dicha composición que comprende dichas células madre derivadas de tejido graso cardiaco de mamífero, opcionalmente, diferenciadas a un tipo celular concreto, y evaluar los efectos de dichos agentes sobre dicha población celular en cultivo.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para obtener factores de crecimiento y/o citocinas que comprende cultivar dichas células madre adultas derivadas de tejido graso cardiaco de mamífero, o dichas células diferenciadas a partir de dichas células madre, bajo condiciones apropiadas para la expresión y producción de dichos factores de crecimiento y/o citocinas, y, si se desea, separar dichos factores de crecimiento y/o citocinas.

BREVE DESCRIPCIóN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 (A) muestra una fotografía de las fracciones extraídas de grasa epicárdica y subcutánea; la Figura 1 (B) muestra una imagen microscópica en la que se puede observar la morfología de las células madre adultas derivadas de tejido adiposo humano epicárdico (epi- ADSC); y la Figura 1 (C) muestra una imagen microscópica en la que se puede observar la morfología de las células madre adultas de derivadas de tejido adiposo subcutáneo humano (sub-ADSC).

La Figura 2 muestra la caracterización inmunofenotípica de células madre adultas derivadas de tejido adiposo humano epicárdico (epi-ADSC) mediante citometría de flujo (FACS). Se representan los histogramas correspondientes a los cuatro pacientes (P1-P4) en estudio [Figura 2 A epi-ADSC Pl, Figura 2B epi-ADSC P2, Figura 2C epi- ADSC P3 y Figura 2D epi-ADSC P4]. Los histogramas muestran en el eje de ordenadas la intensidad de fluorescencia del marcador en estudio y en el de abscisas el número de células. En cada histograma se muestran superpuestas las gráficas de expresión del marcador control (negro) y del marcador en estudio (gris). El grado de desplazamiento lateral del marcador en estudio respecto al control en el eje de abscisas indica cuan positiva es la muestra celular para el marcador en cuestión.

En la Figura 3 se muestra el análisis comparativo de la expresión génica constitutiva de marcadores cardioespecíficos entre las poblaciones de células madre adultas epi-ADSC y sub-ADSC mediante RT-PCR en tiempo real. Se observa una expresión diferencial del factor de transcripción GATA4 (a pase 2 y a pase 5) (Figuras 3 A, 3B y 3C), observándose también a pase 5 un incremento de los niveles de transcrito de Cx43 (probablemente su expresión sea inducida por GAT A4) en las células madre epi-ADSC respecto a las células madre sub-ADSC (Figuras 3B y 3C). Para el resto de genes cardiacos analizados (α-actinina, β-MHC, troponina I cardiaca, SERCA-2 y Nkx2.5) no se observaron diferencias significativas en cuánto a su expresión a lo largo del cultivo de las células.

La Figura 4 muestra el análisis comparativo de la expresión de marcadores cardioespecíficos entre las poblaciones de células madre adultas epi-ADSC (E) y sub- ADSC (S) mediante Western Blot. La Figura 4A muestra el análisis comparativo en extractos totales. La Figura 4B muestra el análisis comparativo efectuado en las fracciones citoplasmáticas (C) y nucleares (N). Se puede observar un aumento de los niveles de expresión proteica de Cx43 y GAT A-4 por parte de las células madre epi- ADSC respecto a las células madre sub-ADSC, tanto a pase 2 (p2) como a pase 5 (p5). Asimismo, se observa una expresión diferencial de β-MHC a pase 5 en las células madre epi-ADSC. La Figura 5 ilustra la expresión de marcadores cardioespecíficos en la población de células madre adultas epi-ADSC mediante inmunofluorescencia. En las microfotografías se muestra la detección mediante anticuerpos específicos de la

expresión de las proteínas cardiacas: GATA-4, β-MHC (βMHC), α-actinina, SERCA-2 y conexina-43 (Cx43). Se puede observar que GATA-4 se encuentra mayoritariamente en el núcleo de las células, que β-MHC está estructuralmente bien organizada formando miofibrillas, y que α-actinina, SERCA-2 y Cx43 se distribuyen difusamente por las células.

La Figura 6 muestra el aislamiento y caracterización de ADSC cardiacas. La Figura 6a muestra una vista de un corazón humano en una cirugía a corazón abierto; se observan unas pinzas sujetando la biopsia de tejido adiposo cardiaco tomada junto a la arteria coronaria derecha proximal. (AO, Aorta; LV, ventrículo izquierdo). La Figura 6b muestra un cultivo primario de ADSC cardiacas antes de confluencia (aumento de 2Ox). La Figura 6c es una diagrama de barras que muestra os resultados de un análisis con citometría de flujo de inmunofenotipado de ADSC cardiacas.

La Figura 7 muestra el resultado de un análisis de diferenciación adipogénico mediante tinción con rojo de alizarina S de ADSC cardiacas (Figura 7a) y ADSC subcutáneas (Figura 7b) tras el cultivo en medio de diferenciación adipogénico. La Figura 7c es una diagrama de barras en el que se muestra el porcentaje de células positivas de tipo adipocito tras 3 y 4 semanas de tratamiento para las distintas poblaciones celulares ensayadas (ADSC cardiacas y ADSC subcutáneas).

La Figura 8 es un diagrama de barras que muestra los resultados de la RT-PCR en tiempo real de genes cardiomiogénicos en ADSC cardiacas frente a ADSC subcutáneas. Los valores indican el número de veces que se expresa un tipo de células con respecto al otro tipo de células del mismo paciente (en este caso, ADSC cardiacas frente a ADSC subcutáneas). Se observa un incremento estadísticamente significativo de transcrito de GATA4 y de Cx43 en las ADSC cardiacas en comparación con las ADSC subcutáneas (GAT A4, p<0,001 ; Cx43, p=0,031).

La Figura 9 muestra la expresión basal de marcadores cardiacos en ADSC cardiacas sometidas a un ensayo mediante inmunotransferencia de tipo Western e inmunocitofluorescencia. En la Figura 9a se muestra el resultado del análisis de tipo Western de Usados de ADSC cardiacas y ADSC subcutáneas (Sub); como controles se utilizaron extracciones de proteínas de corazón humano adulto. Las Figuras 9b-9d muestran la expresión de β-MHC, SERCA2 y α-actinina sarcomérica respectivamente en ADSC cardiacas (rojo). La Figura 9e muestra la expresión de GATA4 (verde) y

Cx43 (rojo) en ADSC cardiacas. Los núcleos se tiñeron con Hoescht 33342 (azul) en los paneles de las Figuras 9c y 9d. Barra de escala de 50 μm.

La Figura 10 muestra el cocultivo de ADSC cardiacas con cardiomiocitos neonatales. ADSC cardiacas-eGFP+ (verde: a, e, i, 1 y p); cTnl (rojo: b, f y j); β-MHC (azul: c); contratinción nuclear con DAPI (cian: d) (azul: g, h' y s). (h% k' y o') vistas en modo xz de líneas de puntos en h, k y o, respectivamente. Las imágenes se tomaron con un microscopio confocal, mostrando la ubicación conjunta de los marcadores cardiacos en las ADSC cardiacas. Cx43 (rojo: m), α-actinina sarcomérica (cian: n), SERCA2 (rojo: q) y GATA4 (cian: r). (d, h, h\ k, k', o, o' y s) son imágenes fusionadas. Barra de escala de 50 μm (a-d y p-s), 25 μm (e-h y l-o) y 10 μm (i-k).

La Figura 11 muestra que las ADSC cardiacas se diferencian en células endoteliales en cultivo. La Figura 1 la es un diagrama de barras en el que se muestra el número de veces que se expresan los marcadores proangiogénicos de células tratadas con EGM-2 frente a células control no tratadas, determinado mediante RT-PCR en tiempo real. La Figura l lb muestra la incorporación de DiI-Ac-LDL por las ADSC cardiacas tras el tratamiento de diferenciación. Las Figuras 1 Ic-I le muestran la formación de túbulos a las 2, 4 y 7 h desde el cultivo con recubrimiento de Matrigel de ADSC cardiacas (aumento de 1Ox). Las Figuras Hf y Hg muestran la tinción con isolectina GSLI B4 de los túbulos formados en el recubrimiento con Matrigel. Barra de escala de 50 μm.

La Figura 12 muestra los valores de distintos parámetros funcionales ecocardiográficos: acortamiento fraccional (FS) [Figura 12a]; fracción de eyección (EF) [Figura 12b]; y espesor de la pared anterior (AWT) [Figura 12c].

La Figura 13 muestra el resultado del análisis morfométrico de corazón de rata. Las Figuras 13a y 13b muestran los resultados de la tinción con tricromo de Masson de secciones transversales de corazones de rata a través de miocardio infartado 30 días después de la cirugía (e, control; f, tratado). Las Figuras 13c y 13d muestran el porcentaje del tamaño del infarto del LV de rata y el espesor de la pared del LV en grupos control y tratado con células. La Figura 14 muestra los resultados del injerto de ADSC cardiacas humanas en corazón de rata con infarto, donde puede observarse una diferenciación cardiaca y endotelial in vivo. En la Figura 14a las ADSC-eGFP+ cardiacas inyectadas en el

miocardio aparecen en verde y se muestra el resultado de la inmunotinción frente a antígeno nuclear humano (HNA, rojo) para confirmar el origen humano de las eGFP+- ADSC cardiacas inyectadas. Las Figuras 14b-14d muestran el resultado de la inmunotinción en secciones de corazón a las que se inyectaron ADSC cardiacas frente a cTnl (b), α-actinina sarcomérica (c) y CD31 (d) (todas en rojo). Obsérvese la distribución de las células a lo largo del tejido isquémico a pesar de la inyección en la zona límite. Barras de escala de 50 μm.

La Figura 15 muestra el resultado de la medición del espectro de emisión de células eGFP+ (ROIl) y fondo (ROI2). La Figura 16 muestra los resultados del análisis de densidad capilar en miocardio infartado, en concreto, capilares en la zona límite en miocardios control (Figura 16a) y en miocardios tratados con ADSC cardiacas (Figura 16b) teñidos con isolectina GSLI B4. La Figura 16c es un diagrama de barras que muestra el número de capilares por mm ² en el grupo control y en el grupo tratado con ADSC cardiacas en las áreas límite y distal del infarto. No se observaron diferencias significativas en el área distal. Barra de escala de 50 μm.

DESCRIPCIóN DETALLADA DE LA INVENCIóN

La presente invención se refiere, en general, a una población sustancialmente homogénea de células madre adultas derivadas del tejido adiposo cardiaco, presente en la zona epicárdica y/o pericárdica. Los inventores han observado que dicha población celular presenta cierta predisposición hacia linaje cardiaco, presentando un mayor potencial miocardiogénico en comparación con otras células madre de origen diferente.

Así pues, dicha población celular es potencialmente útil en la regeneración de tejido cardiaco. En concreto, la invención se refiere al uso de dicha población de células madres adultas derivadas de tejido graso cardiaco, en protocolos de terapia celular que contribuyan a la reparación del corazón en situaciones fisiopatológicas. Dicha población celular puede usarse en la elaboración de una composición farmacéutica o en un biomaterial para la regeneración del miocardio en aquellas situaciones en las que existe una pérdida de la capacidad contráctil del miocardio, por ejemplo, en el tratamiento de pacientes que han sufrido un infarto de miocardio y/o han desarrollado insuficiencia cardiaca congestiva.

Definiciones

Con el fin de facilitar la comprensión de la presente descripción, se explicará a continuación el significado de algunos términos y expresiones tal como se utilizan en el contexto de la invención. Se incluirán definiciones adicionales junto con la descripción cuando sea necesario.

El término "sujeto" se refiere a un animal, preferentemente un mamífero, incluyendo no-primates (e.g., vaca, cerdo, caballo, gato, perro, rata o ratón) y primates (e.g., mono, ser humano). En una realización preferente, el sujeto es un ser humano. El término "células madres adultas" hace referencia a células presentes en un tejido diferenciado que presentan características de células madre. Una célula madre adulta es una célula indiferenciada que se halla en un tejido diferenciado y presenta capacidad de proliferación y de diferenciación a uno o más tipos celulares. Las células madre adultas están presentes en diversos tejidos adultos, encontrándose ampliamente descrita su presencia en médula ósea, tejido adiposo, sangre, córnea, retina, cerebro, músculo esquelético, pulpa dental, epitelio gastrointestinal, hígado y piel.

El término "tejido adiposo" o "tejido graso", utilizados indistintamente en esta descripción, hace referencia al tejido de origen mesenquimal conformado por la asociación de células que acumulan lípido en su citoplasma: los adipocitos. El tejido adiposo, por un lado cumple funciones mecánicas, entre ellas servir como amortiguador, protegiendo y manteniendo en su lugar los órganos internos así como a otras estructuras más externas del cuerpo, y, por otro lado, también cumple funciones metabólicas. En mamíferos se pueden distinguir dos tipos de tejido adiposo: el tejido adiposo marrón o grasa parda y el tejido adiposo blanco. Estos tejidos son reconocidos como tejidos distintos en términos metabólicos y de composición celular. En los recién nacidos y lactantes menores de 6 meses, la grasa parda está implicada en la termogénesis como mecanismo compensatorio durante la exposición a un ambiente frío mientras que en los adultos dicha termogénesis está mediada por la actividad tiroidea. Recientemente, se ha publicado un artículo en el que se identifica la grasa parda de neonatos como fuente de células progenitoras (madre) de cardiomiocitos y su potencial uso en terapia cardiaca regenerativa (Y amada et al, 2006. Cardiac progenitor cells in brown adipose tissue repaired damaged myocardium. Biochem Biophys Res Commun. 2006 Apr 7;

342(2):662-70. Epub 2006 Feb 10). El conjunto de estudios efectuados sobre el tejido adiposo blanco muestra que éste interviene de manera directa o indirecta en todas las principales funciones del organismo. Se trata de un tejido muy heterogéneo constituido por numerosas poblaciones celulares que interaccionan entre ellas. En este contexto hay que considerar la diferencia en la biología y la plasticidad de las células en función de su localización. La comparación de obesidades masculinas y femeninas muestra que el desarrollo de tejido adiposo, en función de su localización tiene consecuencias distintas sobre el organismo. Asimismo, el potencial de diferenciación de las células depende de la localización de las mismas. En un estudio comparativo entre el potencial de diferenciación de la población celular estromal del tejido adiposo en función del origen del depósito se demuestra que, en el caso de ratones, el tejido adiposo que presenta una mayor capacidad de diferenciación es el tejido adiposo subcutáneo (Prunet-Marcassus et al., 2006. From heterogeneity to plasticity in adipose tissues: site-specific differences.Exp CeIl Res. 2006 Apr 1; 312(6):727-36. Epub 2005 Dec 28). El término "tejido graso cardiaco" hace referencia al tejido adiposo cardiaco, el cuál por su ubicación anatómica puede distinguirse en tejido adiposo epicárdico (recubriendo el miocardio) o tejido adiposo pericárdico (en el área pericárdica, es decir, en las proximidades del corazón). Es conocido que el tejido adiposo es un órgano endocrino altamente complejo que genera moléculas con efectos tanto locales como sistémicos. A pesar de la similitud en sus propiedades cualitativas, en la actualidad se reconoce que distintos tipos de tejido adiposo, en particular depósitos de tejido adiposo subcutáneo y visceral presentan un perfil de expresión diferencial de ciertas proteínas sugiriendo características diferenciales en la producción de moléculas biológicas activas (Dusserre E. et al. ; 2000. Differences in mRNA expression of the proteins secreted by the adipocytes in human subcutaneous and visceral adipose tissues. Biochim Biophys Acta. 2000 Jan 3; 1500(1 ):88-96).

El término "expresión constitutiva" o "expresión basal" se refiere a la expresión de un gen en ausencia de factores inductores de la expresión del mismo. Se entiende por genes de expresión constitutiva aquellos que son transcritos continuamente. El término "aislada" cuando hace referencia a una población celular se refiere a una población celular aislada a partir de un tejido u órgano animal, incluyendo seres humanos, la cuál se encuentra sustancialmente libre de otras poblaciones celulares

generalmente asociadas con dicha población celular in vitro o in vivo. En general, se obtiene una población celular "sustancialmente libre" de otras cuando se separa de, al menos, el 50%, preferentemente de, al menos, el 60%, más preferentemente de, al menos, el 70%, aún más preferentemente de, al menos, el 80%, todavía más preferentemente de, al menos, el 90%, y, todavía aún más preferentemente de, al menos, el 95%, 96%, 97%, 98% ó incluso 99%, de otras poblaciones celulares generalmente asociadas con dicha población celular in vitro o in vivo.

El término "cardiopatía isquémica" se refiere a la enfermedad resultante de la incapacidad de las arterias coronarias para llevar el oxígeno necesario a un determinado territorio del músculo cardiaco, lo que dificulta el funcionamiento de éste. Las causas más frecuentes de la alteración de las coronarias es la arterioesclerosis o la aterosclerosis. Estas dos situaciones dificultan la llegada de la sangre a las células del corazón, que son muy sensibles a la disminución del aporte de sangre. Cuando la cantidad de oxígeno que llega al corazón es insuficiente, se manifiesta la enfermedad coronaria o cardiopatía isquémica. Sus principales consecuencias son el infarto de miocardio, la angina de pecho, la insuficiencia coronaria, la miocardiopatía de origen isquémico y la muerte súbita.

El término "insuficiencia cardiaca", "insuficiencia cardiaca congestiva" o "ICC" se refiere a una afección crónica en la que el corazón no puede bombear suficiente sangre oxigenada como para satisfacer las necesidades de los demás órganos del cuerpo. Como resultado, los órganos vitales del organismo no reciben suficiente oxígeno y nutrientes, y los residuos del organismo van eliminándose más lentamente. A la larga, los sistemas vitales dejan de funcionar. Generalmente, la insuficiencia cardiaca es síntoma de un problema cardiaco subyacente. El término "infarto de miocardio" o "infarto agudo de miocardio" o "IAM" hace referencia a una necrosis isquémica de una parte del miocardio debida a la obstrucción de una o varias arterias coronarias o sus ramas. El infarto de miocardio se caracteriza por la pérdida de cardiomiocitos funcionales, dañándose el tejido miocárdico de manera irreversible. El miocardio, o músculo del corazón, sufre un infarto cuando existe una enfermedad coronaria avanzada, en un caso particular, esto se produce cuando una placa de ateroma que se encuentra en el interior de una arteria coronaria se ulcera o se rompe, causando una obstrucción aguda de ese vaso.

El término "regeneración cardiaca", "regeneración de tejido cardiaco" o

"regeneración del miocardio" hace referencia a la reparación de la pérdida de la masa celular del tejido cardiaco, mediante la implantación de células madre capaces de proliferar y diferenciarse a miocardiocitos, regenerando el tejido miocárdico dañado y la función cardiaca.

Tal como se usa en este documento, los términos "tratar, "tratamiento" y

"tratando" se refieren a la mejora, cura o remedio de la situación fisiopatológica, que resulta de la administración de la composición farmacéutica proporcionada por la presente invención, que comprende dicha población de células madres adultas derivadas de tejido graso cardiaco, a un sujeto necesitado de dicho tratamiento.

Células madre de la invención

La presente invención se basa en la identificación de una nueva población de células madre adultas derivadas de tejido adiposo cardiaco que presentan cierta predisposición cardiomiogénica, por lo que pueden ser utilizadas en protocolos de terapia celular, en particular, en protocolos de terapia celular con el objetivo de contribuir a la reparación y/o regeneración de tejido miocárdico en situaciones fisiopatológicas en las que ha habido una pérdida de tejido cardiaco funcional.

Por tanto, en un aspecto, la invención se refiere a una célula madre adulta, aislada, derivada de tejido graso cardiaco de mamífero, en adelante célula madre de la invención, que expresa de forma constitutiva GAT A-4 y/o conexina 43 (Cx43).

Las células madre de la invención, en ocasiones también identificadas en esta descripción como "ADSC cardiacas", proceden de una fuente de tejido adiposo cardiaco, e.g., tejido adiposo epicárdico o pericárdico, tal como la fracción estromal de dicho tejido adiposo cardiaco, de un mamífero, tal como un roedor, un primate, etc., preferentemente, de un ser humano. En una realización particular, las células madre de la invención se obtienen a partir de tejido adiposo epicárdico humano.

Las células madre de la invención pueden ser células de origen autólogo, alogénico o xenogénico. En una realización particular y preferida, dichas células son de origen autólogo y se aislan del tejido adiposo cardiaco del sujeto al que se le van a administrar.

Además de por su origen, las células madre de la invención se caracterizan por expresar GATA-4 y/o Cx43 de forma constitutiva. En una realización particular, las células madre de la invención expresan de forma constitutiva GATA-4 y Cx43.

GAT A-4 es un factor de transcripción miembro de la familia GATA de factores de transcripción de dedos de zinc. Los miembros de esta familia reconocen el motivo GATA, el cual se encuentra presente en los promotores de varios genes. Dicha proteína se cree que participa en la regulación de genes implicados en la embriogénesis, así como en la diferenciación y función cardiaca. Mutaciones en el gen que codifica dicha proteína GAT A-4 han sido asociadas con defectos en el septo cardiaco. La conexina 43 (Cx43), también denominada GJAl (gap junction protein), es un miembro de la familia de las conexinas. Dicha proteína es un componente de las uniones gap intercelulares, las cuales están compuestas por un conjunto de canales intercelulares que proporcionan una ruta para la difusión de material de bajo peso molecular de una célula a otra. La proteína Cx43 es una de las principales proteínas en las uniones gap del corazón las cuales, se cree, juegan un papel crucial en la sincronización de la contracción del corazón, así como en el desarrollo embrionario.

Tal como se ha comentado anteriormente, el músculo esquelético es considerado como una potencial fuente para la obtención de células para la regeneración del miocardio; sin embargo, el músculo esquelético no expresa la proteína Cx43 y las uniones gap existentes entre miocardiocitos no se forman. Así pues, la contracción entre los miotubos resultantes y el miocardio adyacente es asincrónico. Esta falta de acoplamiento eléctrico es la que posiblemente explique la aparición de arritmias malignas en algunas series clínicas (Herreros J et al., 2003. Autologous intramyocardial injection of cultured skeletal muscle-derived stem cells in patients with non-acute myocardial infarction. Eur Heart J. 2003 Nov; 24(22):2012-20).

En una realización particular y preferida, la expresión de GAT A-4 y/o Cx43 de forma constitutiva en dicha célula madre de la invención se mantiene estable durante su expansión in vitro.

Tal como aquí se utiliza, la expresión "estable" de un gen o una proteína por una célula "durante su expansión in vitro" se refiere a que la expresión de un gen o de su producto de expresión (proteína) por parte de una célula se mantiene sustancialmente al mismo nivel durante, al menos, dos pases de cultivo celular in vitro; es decir, la célula

se cultiva in vitro bajo condiciones apropiadas (medio de cultivo, temperatura, atmósfera, dilución, cambio de medio de cultivo, etc.) para su expansión in vitro, tales como cultivo en medio de cultivo α-MEM suplementado con 10% de FBS, L- glutamina 1 mM y 1% de penicilina-estreptomicina a 37°C en atmósfera de aire con 5% de CO ₂ , hasta pre-confluencia, reemplazando el medio de cultivo cada 3 ó 4 días, tal como se menciona en el Ejemplo 1.

Las células madre de la invención pueden ser células de origen autólogo, alogénico o xenogénico. En una realización particular y preferida, dichas células son de origen autólogo y se aislan del tejido adiposo cardiaco del sujeto al que se le van a administrar.

En una realización particular, dicha célula madre de la invención expresa, de forma constitutiva, la cadena pesada de la beta miosina (β-MHC), ausente de forma constitutiva en otras poblaciones de células madre ya descritas así como en las células madre derivadas de tejido adiposo subcutáneo (sub-ADSC) obtenidas del mismo sujeto que las células madre adultas derivadas de tejido graso cardiaco (células madre de la invención). Es conocido que esta proteína juega un papel fundamental en la contracción del músculo del corazón debido a que forma parte del sarcómero (aparato contráctil de los cardiomiocitos).

En otra realización particular, la célula madre de la invención expresa, de forma constitutiva, la proteína SERCA-2 a lo largo de su cultivo in vitro. Esta proteína sarcoplásmica (SERCA-2) es una bomba Ca ²⁺ - ATPasa y es responsable de la regulación de la distribución intracelular de calcio dentro de la célula muscular cardiaca. Esta función también es básica para la contracción correcta del músculo cardiaco.

Además, la célula madre de la invención también puede ser caracterizada por la expresión, o no expresión, de una serie de marcadores de superficie, tales como CD 14, CD29, CD34, CD44, CD59, CD90, CD105, CD106 y CDl 17, y, opcionalmente, de los marcadores CD45, CD133, CD166 y VEGFR2.

En una realización particular, la célula madre de la invención se caracteriza porque expresa, además, uno o más marcadores de superficie seleccionados entre CD29, CD44, CD59, CD90 y CD105; es decir, la célula madre de la invención es positiva para al menos uno, dos, tres, cuatro, o, preferiblemente, todos los marcadores de superficie CD29, CD44, CD59, CD90 y CDl 05. En otra realización particular, la célula madre de

la invención se caracteriza porque expresa, además, el marcador de superficie CD 166. Por tanto, en otra realización particular, la célula madre de la invención se caracteriza porque expresa, además, uno o más marcadores de superficie seleccionados entre CD29, CD44, CD59, CD90, CD105 y CD166; es decir, la célula madre de la invención es positiva para al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, o, preferiblemente, todos los marcadores de superficie CD29, CD44, CD59, CD90, CD 105 y CD 166.

En otra realización particular, la célula madre de la invención se caracteriza porque no expresa un marcador de superficie seleccionado entre CD 14, CD34, CD 106, CDl 17 y combinaciones de los mismos; es decir, la célula madre de la invención es negativa para al menos uno, dos, tres, o, preferiblemente, todos los marcadores de superficie CD14, CD34, CD106 y CDl 17. En otra realización particular, la célula madre de la invención se caracteriza porque no expresa (o lo hace muy débilmente) el marcador de superficie VEGFR2. Por tanto, en otra realización particular, la célula madre de la invención se caracteriza porque es negativa para al menos uno, dos, tres, cuatro, o, preferiblemente, todos los marcadores de superficie CD 14, CD34, CD 106, CD117 y VEGFR2.

En otra realización particular, la célula madre de la invención se caracteriza, además de por su origen y de por la expresión constitutiva de GATA-4 y/o Cx43, porque (i) expresa la totalidad de los marcadores de superficie CD29, CD44, CD59, CD90 y CD 105, y (ii) no expresa ninguno de los marcadores de superficie CD 14, CD34, CD106 y CD117.

En otra realización particular, la célula madre de la invención se caracteriza, además de por su origen y de por la expresión constitutiva de GATA-4 y/o Cx43, porque (i) expresa la totalidad de los marcadores de superficie CD29, CD44, CD90, CD 105 y CD 166 y (ii) no expresa ninguno de los marcadores de superficie CD 14, CD34, CD 106, CDl 17 ni VEGFR2.

En otra realización particular, la célula madre de la invención se caracteriza, además de por su origen y de por la expresión constitutiva de GAT A-4 y/o Cx43, porque (i) expresa la totalidad de los marcadores de superficie CD29, CD44, CD59, CD90, CD 105 y CD 166, y (ii) no expresa ninguno de los marcadores de superficie CD 14, CD34, CD 106, CDl 17 ni VEGFR2.

En una realización concreta, la célula madre adulta de la invención es una célula madre adulta, derivada de tejido graso (adiposo) cardiaco de mamífero, preferentemente de un ser humano, aislada, que: a) expresa de forma constitutiva GAT A-4 y/o Cx43; b) expresa de forma constitutiva β-MHC; c) expresa la totalidad de los marcadores de superficie CD29, CD44, CD59, CD90 y CD105; y d) no expresa ninguno de los marcadores de superficie CD 14, CD34, CD 106 y CDl 17. En otra realización concreta, la célula madre adulta de la invención es una célula madre adulta, derivada de tejido graso (adiposo) cardiaco de mamífero, preferentemente de un ser humano, aislada, que: a) expresa de forma constitutiva GAT A-4 y/o Cx43; b) expresa de forma constitutiva β-MHC; c) expresa la totalidad de los marcadores de superficie CD29, CD44, CD90,

CD105 y CD166; y d) no expresa ninguno de los marcadores de superficie CD14, CD34, CD106,

CD117 ni VEGFR2.

En otra realización concreta, la célula madre adulta de la invención es una célula madre adulta, derivada de tejido graso (adiposo) cardiaco de mamífero, preferentemente de un ser humano, aislada, que: a) expresa de forma constitutiva GAT A-4 y/o Cx43; b) expresa de forma constitutiva β-MHC; c) expresa la totalidad de los marcadores de superficie CD29, CD44, CD59, CD90, CD 105 y CD 166; y d) no expresa ninguno de los marcadores de superficie CD 14, CD34, CD 106, CD117 ni VEGFR2.

En una realización particular y preferida, la expresión de GAT A-4 y/o Cx43 de forma constitutiva en dicha célula madre de la invención se mantiene estable durante su expansión in vitro.

La expresión de los genes y proteínas de interés (e.g., GAT A-4, Cx43, β-MHC, α-actinina, etc.) puede ser determinada por métodos convencionales conocidos por los

técnicos en la materia bien a nivel de ácido nucleico (e.g., a nivel de mRNA) o a nivel de proteína.

En una realización particular, la expresión de un gen dado puede ser determinada mediante análisis de su expresión génica sin adición al medio de cultivo de ningún componente capaz de inducir la diferenciación hacia un linaje específico, es decir, en condiciones de expresión constitutiva. A modo ilustrativo, no limitativo, la expresión de dichos genes en una célula puede ser analizada mediante técnicas convencionales tales como RT-PCR en tiempo real, Northern blot o microarrays de DNA. La RT-PCR en tiempo real es una variante de la transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa que permite una detección cuantitativa del gen a medida que se amplifica. La RT-PCR en tiempo real se ha utilizado en los Ejemplo 3 y 6 para determinar los niveles de expresión génica (mRNA) de las proteínas cardioespecíficas de interés. La técnica de Northern blot permite la identificación, localización y cuantificación de secuencias de mRNA mediante la transferencia de todo el mRNA desde un gel a una membrana de nylon o nitrocelulosa. La presencia de un mRNA particular se detecta por hibridación con una sonda apropiada. La técnica de microarrays de DNA se basa en la utilización de una superficie sólida a la cual se unen una serie de fragmentos de DNA. Las superficies empleadas para fijar el DNA son muy variadas (e.g., vidrio, plástico e incluso chips de silicio); esta técnica permite averiguar la expresión de numerosos genes, pudiendo monitorizarse los niveles de expresión de un gran número de genes de forma simultánea.

Alternativamente, la expresión de una proteína puede ser analizada mediante técnicas inmunológicas, e.g., ELISA, Western Blot o inmunofluorescencia. La técnica de Western Blot se basa en la detección de proteínas previamente separadas por electroforesis e inmovilizadas en una membrana, generalmente de nitrocelulosa, mediante la incubación con un anticuerpo específico y un sistema de revelado, e.g., quimioluminiscente. El análisis mediante inmunofluorescencia se refiere al uso de un anticuerpo específico contra una proteína de interés para el análisis de su expresión y localización subcelular mediante microscopía. Generalmente, las células en estudio son previamente fijadas con paraformaldehído y permeabilizadas con un detergente no iónico. Las técnicas de Western Blot e inmunofluorescencia han sido utilizadas en los Ejemplos 4 y 6. La técnica de ELISA, está basada en el uso de antígenos o anticuerpos

marcados con enzimas de forma que los conjugados resultantes poseen actividad tanto inmunológica como enzimática. Al estar uno de los componentes marcado e insolubilizado sobre un soporte, la reacción antígeno-anticuerpo queda inmovilizada y, por tanto, puede ser revelada con facilidad mediante la adición de un sustrato específico que produce una reacción cuantificable mediante, por ejemplo, espectro fotometría. Esta técnica no permite la localización subcelular exacta ni la determinación del peso molecular de las proteínas estudiadas pero permite una detección muy específica y altamente sensible de proteínas de interés por ejemplo en fluidos biológicos de interés clínico (suero, sobrenadantes de cultivos celulares, fluido ascítico, etc.). Asimismo, los marcadores fenotípicos de las células madre de la invención pueden identificarse por cualquier técnica apropiada basada, normalmente, en una selección positivo/negativo. En una realización particular, pueden utilizarse anticuerpos, preferentemente, anticuerpos monoclonales, frente a dichos marcadores fenotípicos cuya presencia o ausencia en las células madre de la invención debe ser confirmada para caracterizar adicionalmente las células madre de la invención mediante su perfil inmunocitoquímico, aunque también pueden utilizarse otras técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia. Por tanto, en una realización particular, se utilizan anticuerpos monoclonales frente a, al menos, los marcadores de superficie celular CD29, CD44, CD59, CD90 y CD 105, con el fin de confirmar la presencia de dichos marcadores en las células seleccionadas o los niveles de expresión detectable de al menos uno de dichos marcadores, y preferentemente de todos, y se usan anticuerpos monoclonales frente a, al menos, CD14, CD34, CD106 y CDl 17, para confirmar la ausencia de los mismos. En otra realización particular, se utilizan anticuerpos monoclonales frente a, al menos, los marcadores de superficie celular CD29, CD44, CD90, CD 105 y CD 166, con el fin de confirmar la presencia de dichos marcadores en las células seleccionadas o los niveles de expresión detectable de al menos uno de dichos marcadores, y preferentemente de todos, y se usan anticuerpos monoclonales frente a, al menos, CD 14, CD34, CD 106, CDl 17 y VEGFR2, para confirmar la ausencia de los mismos. Asimismo, en otra realización particular, se utilizan anticuerpos monoclonales frente a, al menos, CD 14, CD29, CD34, CD44, CD59, CD90, CD 105, CD 106, CDl 17, CD 166 y VEFGR2, con el confirmar la presencia o ausencia

de dichos marcadores en las células seleccionadas o los niveles de expresión detectable de al menos uno de dichos marcadores, y preferentemente de todos.

Dichos anticuerpos monoclonales son conocidos o pueden ser obtenidos por cualquier persona experta en la materia mediante procedimientos convencionales. En los Ejemplos 2 y 6 se describe, a modo ilustrativo y no limitativo, una manera de llevar a cabo la caracterización inmunofenotípica de una población de células madre proporcionada por esta invención.

Si se desea, la célula madre de la invención puede ser modificada genéticamente por cualquier método convencional incluyendo, a modo ilustrativo, no limitativo, procesos de transgénesis, deleciones o inserciones en su genoma que modifiquen la expresión de genes que sean importantes para sus propiedades básicas (proliferación, migración, transdiferenciación, etc.). Así por ejemplo, es conocido que las células madre adultas expandidas ex vivo o trasplantadas dentro de los tejidos dañados envejecen con rapidez debido al acortamiento de sus telómeros. Para evitar este y otros fenómenos, puede ser deseable transducir las células utilizando por ejemplo, partículas víricas retrovirales que contengan construcciones génicas cuya expresión contrarreste el efecto de esta y otras alteraciones no deseadas.

Las células madre de la invención poseen capacidad de proliferación y auto- renovación por lo que pueden ser expandidas in vitro (ex vivo), una vez aisladas y caracterizadas. Por tanto, las células madre de la invención, una vez aisladas, pueden mantenerse y proliferar in vitro en un medio de cultivo apropiado. A modo ilustrativo, no limitativo, dicho medio comprende medio α-MEM (Mínimum Essential Médium eagle-alpha modification (Sigma Ref. M4526). Eagle, H. Media for animal cell culture. Tissue Culture Association Manual. 3,517-520.1976), antibióticos y glutamina, y se complementa con suero de bovino fetal (FBS). Depende de la experiencia de cada técnico en la materia el modificar o modular las concentraciones de los medios y/o los complementos de medios según se requiera para las células usadas. Los sueros a menudo contienen factores y componentes celulares que son necesarios para la viabilidad y la expansión celular. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de tales sueros, incluyen FBS, suero de bovino (BS), suero de ternero (CS), suero de carnero fetal (FCS), suero de carnero neonato (NCS), suero de cabra (GS), suero de caballo (HS), suero porcino, suero de ovejas, suero de conejo, suero de rata (RS), etc. También se

contempla, si las células madre de la invención son de origen humano, complementar el medio de cultivo celular con un suero humano, preferentemente de origen autólogo. Se entiende que los sueros pueden inactivarse por calor si se considera necesario para inactivar los componentes de la cascada del complemento. Puede usarse también la modulación de las concentraciones de suero, la retirada de suero del medio de cultivo para promover la supervivencia de uno o más tipos celulares deseados. En otra realización, las células madre de la invención pueden expandirse en un medio de cultivo de composición definida, en el que se reemplaza el suero por una combinación de albúmina de suero, transferrina, selenio y proteínas recombinantes incluyendo, aunque sin limitarse a ello, insulina, factor de crecimiento derivado de plaquetas y un factor de crecimiento, e.g., factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF).

Muchos medios de cultivo celular ya contienen aminoácidos; no obstante, algunos requieren ser complementados antes de cultivar las células. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos aminoácidos incluyen L-alanina, L-arginina, ácido L-aspártico, L-cisteína, L-cistina, ácido L-glutámico, L-glutamina, L-glicina, etc. También se usan normalmente agentes antimicrobianos en el cultivo de células para mitigar una eventual contaminación bacteriana, micoplasmática y/o fúngica. Normalmente, los compuestos antibióticos o antimicóticos usados son mezclas de penicilina y estreptomicina, aunque pueden incluir también, otros compuestos antibióticos o antimicóticos, tales como, por ejemplo, anfotericina, ampicilina, gentamicina, bleomicina, higromacina, kanamicina, mitomicina, etc. Tambiénpueden añadirse hormonas al cultivo celular, incluyendo, aunque sin limitarse, D-aldosterona, dietilestilbestrol (DES), dexametasona, b-estradiol, hidrocortisona, insulina, prolactina, progesterona, somatostatina/hormona del crecimiento humano (HGH), etc. El mantenimiento de las células madre de la invención puede requerir la incorporación de factores celulares que permiten que las células permanezcan en una forma no diferenciada. Resultará evidente para el técnico en la materia que, antes de proceder a diferenciar las células madre de la invención hacia células diferenciadas deben eliminarse del medio de cultivo dichos factores que inhiben la diferenciación celular. Es evidente también que no todas las células requerirán estos factores. De hecho, estos factores pueden provocar efectos no deseados, dependiendo del tipo de célula.

Si se desea, las células madre de la invención pueden expandirse clonalmente usando un procedimiento adecuado para clonar poblaciones celulares. A modo ilustrativo, una población proliferada de células madre de la invención puede recogerse físicamente y sembrarse en una placa separada (o en los pocilios de una placa "multi- pocilio"). Alternativamente, células madre de la invención pueden subclonarse en una placa "multi-pocillo" en una relación estadística para facilitar la operación de colocar una única célula en cada pocilio (e.g., desde aproximadamente 0,1 a cerca de una célula/pocilio o incluso de unas 0,25 a 0,5 células/pocilio, por ejemplo 0,5 células/pocilio). Por supuesto, las células pueden clonarse a baja densidad (por ejemplo, en un disco de Petri u otro sustrato adecuado) y aislarlas de otras células usando dispositivos tales como anillos de clonación. La producción de una población clonal puede expandirse en cualquier medio de cultivo adecuado. En cualquier caso, las células aisladas pueden cultivarse hasta un punto adecuado cuando su fenotipo de desarrollo pueda evaluarse. Cualquiera de los pasos y procedimientos para aislar las células madre de la invención puede realizarse manualmente, si se desea; alternativamente, pueden utilizarse los dispositivos adecuados, conocidos por los técnicos en la materia, para facilitar el aislamiento de las células.

El análisis de la capacidad de las células madre de la invención de diferenciarse en uno o más tipos o linajes celulares puede evaluarse mediante procedimientos convencionales de inducción de la diferenciación, conocidos por los técnicos en la materia. Para ello, las células madre, en general, se someten a los protocolos de diferenciación específicos apropiados para cada tipo o linaje celular, los cuales incluyen el cultivo de las células madre en los medios de diferenciación específicos apropiados.

Los inventores, tras el análisis de los resultados obtenidos en estudios preliminares de diferenciación siguiendo los protocolos habituales para inducir la diferenciación específica a adipocito, osteocito y condrocito, consideran que las células madre de la invención presentan una capacidad de diferenciación reducida (menor) respecto a la de otras poblaciones de células madre adultas mesenquimales también positivas para los marcadores CD29, CD44, CD59, CD90 y CD 105, e.g. células madre derivadas de tejido adiposo subcutáneo (sub-ADSC). En concreto (Ejemplo 5), las células madre de la invención fueron sometidas a protocolos de diferenciación adipogénica, osteogénica y condrogénica previamente establecidos para células madre

derivadas de tejido adiposo subcutáneo [Zuk et al, 2002. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol CeIl. 2002 Dec; 13(12):4279-95] y se observó que las células madre de la invención presentaban una menor capacidad de diferenciación a dichos linajes respecto a células madre derivadas de tejido adiposo subcutáneo. No obstante, no se puede descartar que sea posible obtener una mayor capacidad de diferenciación mediante modificaciones en los protocolos de diferenciación específicos de linajes adipogénico, condrogénico y osteogénico utilizados. Así pues, aunque no se desea estar vinculado por ninguna conclusión, parecen existir indicios que hacen pensar que las células madre de la invención presentan un perfil de diferenciación a linajes mesenquimales distinto al de otras poblaciones de células madre adultas mesenquimales también positivas para los marcadores CD29, CD44, CD59, CD90 y CD 105. De hecho, ensayos adicionales realizados por los inventores parecen confirmar que las células madre de la invención no diferencian a adipocitos (Ejemplo 6), lo que indica una menor plasticidad y un mayor grado de compromiso, a diferencia de las células madre derivadas de tejido adiposo subcutáneo (sub- ADSC).

Población celular de la invención

En otro aspecto, la invención se relaciona con una población, aislada, sustancialmente homogénea, de células madre, en adelante "población celular de la invención", que comprende un conjunto de células madre adultas derivadas de tejido graso cardiaco de mamífero que expresan de forma constitutiva GATA-4 y/o Cx43

(células madre de la invención).

En una realización particular, la población celular de la invención comprende células madre adultas derivadas de tejido graso cardiaco de mamífero que expresan de forma constitutiva GAT A-4 y Cx43.

En otra realización particular y preferida, la población celular de la invención comprende células madre de la invención en las que la expresión de forma constitutiva de GATA-4 y/o Cx43 se mantiene estable durante su expansión in vitro. En otra realización particular, la población celular de la invención comprende células madre de la invención que, además, expresan, de forma constitutiva, β-MHC y/o

SERCA-2.

En otra realización particular, la población celular de la invención comprende células madre de la invención que, además, expresan uno o más marcadores de superficie seleccionados entre CD29, CD44, CD59, CD90 y CD 105. En una realización concreta, la población celular de la invención presenta una expresión significativa de, al menos, uno, dos, tres, cuatro, o, preferiblemente, todos los marcadores de superficie CD29, CD44, CD59, CD90 y CD 105. En otra realización particular, la célula madre de la invención se caracteriza porque expresa, además, el marcador de superficie CD 166. Por tanto, en otra realización concreta, la célula madre de la invención presenta una expresión significativa de, al menos, uno, dos, tres, cuatro, cinco, o, preferiblemente, todos los marcadores de superficie CD29, CD44, CD59, CD90, CD 105 y CD 166. Tal como aquí se utiliza, "expresión significativa" significa que, en dicha población celular, al menos el 30% de las células muestran una señal para un marcador de superficie celular específico determinado por citometría de flujo, por encima de la señal de fondo, preferiblemente un 40%, 50%, 60%, 70% y más preferiblemente un 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100%.

En otra realización particular, la población celular de la invención comprende células madre de la invención que no expresan uno, dos, tres o ninguno de los marcadores de superficie seleccionados entre CD 14, CD34, CD 106 y CDl 17. En una realización concreta, la población celular de la invención carece de expresión significativa de, al menos, uno, dos, tres, o, preferiblemente, todos los marcadores de superficie CD 14, CD34, CD 106 y CDl 17. En otra realización particular, la célula madre de la invención se caracteriza porque no expresa (o lo hace muy débilmente) el marcador de superficie VεGFR2. Por tanto, en otra realización concreta, la célula madre de la invención carece de expresión significativa de, al menos, uno, dos, tres, cuatro, o, preferiblemente, todos los marcadores de superficie CD 14, CD34, CD 106, CDl 17 y VEGFR2. Tal como aquí se utiliza, "carece de expresión significativa" significa que, en dicha población celular, menos del 30% de las células muestran una señal para un marcador de superficie celular específico en citometría de flujo por encima de la señal de fondo, preferiblemente menos de un 20%, 15% ó 10%, más preferiblemente menos de 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ó 1%.

En otra realización particular, la población celular de la invención comprende células madre de la invención que se caracterizan, además de por su origen y por la

expresión constitutiva de GATA-4 y/o Cx43, porque (i) expresan la totalidad de los marcadores de superficie CD29, CD44, CD59, CD90 y CD 105, y (ii) no expresan ninguno de los marcadores de superficie CD 14, CD34, CD 106 y CDl 17.

En otra realización particular, la población celular de la invención comprende células madre de la invención que se caracterizan, además de por su origen y de por la expresión constitutiva de GAT A-4 y/o Cx43, porque (i) expresan la totalidad de los marcadores de superficie CD29, CD44, CD90, CD 105 y CD 166 y (ii) no expresan ninguno de los marcadores de superficie CD14, CD34, CD106, CDl 17 ni VEGFR2.

En otra realización particular, la población celular de la invención comprende células madre de la invención que se caracterizan, además de por su origen y de por la expresión constitutiva de GATA-4 y/o Cx43, porque (i) expresan la totalidad de los marcadores de superficie CD29, CD44, CD59, CD90, CD 105 y CD 166, y (ii) no expresan ninguno de los marcadores de superficie CD 14, CD34, CD 106, CDl 17 ni VEGFR2. En otra realización particular, la población celular de la invención comprende células madre adultas, derivadas de tejido graso (adiposo) cardiaco de mamífero, preferentemente de un ser humano, aisladas, que a) expresan de forma constitutiva, GATA-4 y/o Cx43; b) expresan de forma constitutiva β-MHC; c) expresan la totalidad de los marcadores de superficie CD29, CD44, CD59, CD90 y CD105; y d) no expresan ninguno de los marcadores de superficie CD14, CD34, CD106 ni CDl 17.

En otra realización particular, la población celular de la invención comprende células madre adultas, derivadas de tejido graso (adiposo) cardiaco de mamífero, preferentemente de un ser humano, aisladas, que a) expresan de forma constitutiva, GAT A-4 y/o Cx43; b) expresan de forma constitutiva β-MHC; c) expresan la totalidad de los marcadores de superficie CD29, CD44, CD90, CD 105 y CD 166; y d) no expresan ninguno de los marcadores de superficie CD 14, CD34, CD 106, CDl 17 ni VEGFR2.

En otra realización particular, la población celular de la invención comprende células madre adultas, derivadas de tejido graso (adiposo) cardiaco de mamífero, preferentemente de un ser humano, aisladas, que a) expresan de forma constitutiva, GAT A-4 y/o Cx43; b) expresan de forma constitutiva β-MHC; c) expresan la totalidad de los marcadores de superficie CD29, CD44, CD59, CD90, CD 105 y CD 166; y d) no

expresan ninguno de los marcadores de superficie CD 14, CD34, CD 106, CDl 17 ni VEGFR2.

En otra realización particular, la población celular de la invención comprende células madre de la invención obtenidas a partir de tejido adiposo cardiaco, e.g., epicárdico o pericárdico, de un mamífero, tal como un roedor, un primate, etc., preferentemente, de un ser humano. En una realización particular, la población celular de la invención comprende células madre de la invención obtenidas a partir de tejido adiposo epicárdico de un ser humano.

En otra realización particular, la población celular de la invención comprende células madre de la invención obtenidas a partir de la fracción estromal de tejido adiposo cardiaco.

En otra realización particular, la población celular de la invención comprende células madre de la invención de origen autólogo, alogénico o xenogénico. En una realización particular y preferida, dichas células son de origen autólogo y se aislan del tejido adiposo cardiaco del sujeto al que se le van a administrar.

Dicha población celular de la invención, si se desea, puede encontrarse en un banco de células para transplante. En una realización particular, dicho banco de células comprende una pluralidad de células madre de la invención homocigotas para, al menos, uno o más genes de antígenos críticos, es decir, genes que codifican antígenos de histocompatibilidad (e.g., un alelo del complejo principal de histocompatibilidad (CMH) presente en la población humana). A partir de dicho banco pueden seleccionarse las células de la invención homocigotas para uno o más alelos de antígenos de histocompatibilidad compatibles con el alelo del CMH del sujeto necesitado de transplante o implante celular. Si se desea, la población celular de la invención puede ser mantenida congelada bajo condiciones que no afecten ni comprometan su viabilidad después de su reconstitución.

Procedimiento de obtención de una composición que comprende células madre de la invención

En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para obtener una composición que comprende células madre adultas derivadas de tejido graso

cardiaco de mamífero que expresan GATA-4 y/o Cx43 de forma constitutiva, en adelante procedimiento de la invención, que comprende: a) obtener una suspensión celular de una muestra de tejido graso cardiaco de un mamífero; b) separar las células de dicha suspensión celular; c) cultivar dichas células en un medio de cultivo sobre un soporte sólido bajo condiciones que permiten a dichas células adherirse a dicho soporte sólido; y d) recuperar las células madre adultas derivadas de tejido graso cardiaco de mamífero que expresan GAT A-4 y/o Cx43 de forma constitutiva. La muestra de tejido graso cardiaco puede obtenerse a partir de tejido graso epicárdico o de tejido graso pericárdico, preferentemente, de tejido adiposo epicárdico. Dicha muestra de tejido graso cardiaco procede de un mamífero, tal como un roedor, un primate, etc., preferentemente, un ser humano. Dicha muestra de tejido graso cardiaco de mamífero puede obtenerse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia. En una realización particular, dicha muestra de tejido graso cardiaco se extrae de la fracción estromal del tejido graso. Una fuente apropiada de tejido graso cardiaco procede de la zona próxima a la arteria coronaria derecha proximal o de la base del corazón alrededor de la arteria aorta, de donde el tejido graso cardiaco puede ser obtenido en el contexto de cirugía cardiaca rutinaria. En el Ejemplo 1 se describe de manera detallada una forma de obtención de una muestra de tejido graso cardiaco (en particular, epicárdico) humano.

La muestra de tejido graso cardiaco extraída se lava y se corta en fragmentos pequeños que son digeridos enzimáticamente (o por otros medios convencionales) con el fin de obtener una suspensión celular que se somete a centrifugación obteniéndose un pellet celular que se resuspende en un medio apropiado (e.g., un medio de cultivo que comprende medio α-MEM suplementado con suero, glutamina y antibióticos) y se siembra sobre un soporte sólido (e.g., plástico, placa de cultivo, frasco de cultivo, etc.) bajo condiciones que permiten que las células se adhieran a dicho soporte sólido (e.g., a 37°C y atmósfera de aire con 5% de CO ₂ ); una vez que se observa que las células se han adherido (e.g., al cabo de 24 horas aproximadamente dependiendo de las condiciones del cultivo), se retira el medio de cultivo y se lavan las células adheridas antes de proceder a su expansión in vitro. Para ello, las células adheridas (células madre de la

invención) se cultivan en presencia de un medio de cultivo apropiado (e.g., medio α- MEM suplementado con suero, glutamina y antibióticos) y bajo condiciones apropiadas (e.g., 37°C, atmósfera de aire con 5% de CO ₂ ) y se mantienen en cultivo en tales condiciones hasta pre-confluencia (e.g., hasta que se alcanza un grado de confluencia del 80% aproximadamente) reemplazando la totalidad o parte del medio de cultivo periódicamente (e.g., cada 3 ó 4 días). Las células pueden ser sub-cultivadas repetidamente (pases) hasta alcanzar una cantidad de material celular (es decir, un número mínimo de células) que permita su análisis. En una realización particular, dichas células se sub-cultivan, al menos, dos veces (es decir, se someten a 2 pases), típicamente, 3, 4, 5 o más veces. En una realización concreta, dichas células se sub- cultivaron 2 veces (pase 2), mientras que, en otra realización concreta se sub-cultivaron 5 veces, es decir, hasta pase 5 (3-4 meses), a las diluciones apropiadas. Operando de esta manera se puede obtener una densidad celular de 5-6x10 ³ células madre de la invención/cm ² , tras ser despegadas del soporte sólido (e.g., placa de cultivo, etc.). En ambos casos (pases 2 y 5), se analizó la expresión de GAT A-4 y Cx43 observándose que la expresión constitutiva de dichos marcadores cardioespecíficos se mantiene sustancialmente estable a lo largo de la expansión in vitro de dichas células (células madre de la invención). En los Ejemplos 1 y 6 se describe de manera detallada la obtención, identificación, caracterización y aislamiento de células madre de la invención a partir de tejido graso epicárdico humano.

La composición resultante, que comprende células madre de la invención, obtenible según el procedimiento de la invención, previamente descrito, constituye un aspecto adicional de esta invención.

Células diferenciadas En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para obtener células diferenciadas que comprende cultivar células madre de la invención en un medio de diferenciación específico apropiado. En una realización particular, dicho medio de diferenciación específico es un medio específico para la diferenciación en linaje cardiomiogénico. En otra realización particular, dicho medio de diferenciación específico es un medio específico para la diferenciación en linaje endotelial. En otra realización particular, dicho medio de diferenciación específico es un medio específico

para la diferenciación en adipogénico, osteogénico o condrogénico. Dichos medios de diferenciación específico son conocidos por los técnicos en la materia.

Las células diferenciadas obtenibles a partir de dicho método de diferenciación celular, en adelante células diferenciadas de la invención, constituyen un aspecto adicional de la invención. En una realización particular, dichas células diferenciadas de la invención son cardiomicitos, osteocitos o condrocitos.

Asimismo, en otro aspecto, la invención se relaciona con una composición que comprende dichas células diferenciadas de la invención y un medio adecuado.

Composición farmacéutica

En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica, en adelante composición farmacéutica de la invención, que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de dicha población celular de la invención, o de dicha composición que comprende células madre de la invención obtenible según el procedimiento de la invención, o de dicha composición que comprende células diferenciadas de la invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Tal como aquí se utiliza, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de células madre de la invención presentes en dicha población celular de la invención, o en dicha composición que comprende células madre de la invención obtenible según el procedimiento de la invención, o de dicha composición que comprende células diferenciadas de la invención, que debe contener la composición farmacéutica de la invención, para ser capaz de producir el efecto terapéutico deseado; en general, dicha cantidad terapéuticamente efectiva vendrá determinada, entre otros factores, por las propias características de las células y el efecto terapéutico deseado que se persigue. En general, la cantidad terapéuticamente efectiva de células de la invención que debe administrarse dependerá, entre otros factores, del grado de la enfermedad a tratar, de las propias características del sujeto, de la zona afectada, etc. Por este motivo, las dosis mencionadas en esta descripción deben tenerse en cuenta sólo como guía para el experto en la materia, que debe ajustar dicha dosis dependiendo de los factores anteriormente descritos. Como ejemplo ilustrativo y no limitativo, la composición farmacéutica de la invención puede administrarse como una dosis única, que contenga aproximadamente entre IxIO ⁵ y 1x10 ⁹ , preferentemente entre 1x10 ⁶ y 1x10 ⁸ , más

preferentemente entre IxIO ⁷ y 5x10 células madre de la invención, las cuáles pueden estar parcial o totalmente diferenciadas, o combinaciones de las mismas. La dosis puede repetirse, dependiendo del estado y evolución del paciente, en intervalos temporales de días, semanas o meses que debe establecer el especialista en cada caso. Las células madre de la invención contenidas en la población celular de la invención o en dicha composición que comprende células madre de la invención obtenible según el procedimiento de la invención, así como las células diferenciadas de la invención contenidas en dicha composición, pueden ser células de origen autólogo, alogénico o xenogénico. En una realización particular y preferida, dichas células son de origen autólogo y se aislan del tejido adiposo cardiaco del sujeto al que se le van a administrar, reduciendo así las complicaciones potenciales asociadas con las respuestas antigénicas y/o inmunogénicas a dichas células.

Si se desea, las células madre de la invención contenidas en la población celular de la invención o en dicha composición que comprende células madre de la invención obtenible según el procedimiento de la invención, pueden purificarse, tal como se ha mencionado anteriormente, usando una selección de células positivas y/o negativas por medio de anticuerpos a fin de enriquecer la población celular para aumentar la eficacia, reducir la morbilidad o facilitar el procedimiento.

De acuerdo con la invención, las células madre de la invención contenidas en la población celular de la invención o en dicha composición que comprende células madre de la invención obtenible según el procedimiento de la invención, así como las células diferenciadas de la invención, pueden administrarse al paciente sin un procesamiento adicional o siguiendo procedimientos adicionales para purificar, modificar, estimular o cambiar de otro modo adicionalmente las células. Por ejemplo, las células madre de la invención obtenidas a partir de un sujeto pueden administrarse a otro sujeto que las necesite tras ser cultivadas antes de su administración. Asimismo, la población celular de la invención o dicha composición que comprende células madre de la invención obtenible según el procedimiento de la invención, o dichas células diferenciadas de la invención, pueden ser administradas aisladas o junto con otras poblaciones celulares, por ejemplo, junto con el resto de componentes de la fracción estromal del tejido adiposo cardiaco. En una realización particular, la recogida de tejido adiposo cardiaco se llevará a cabo junto a la cama del paciente. Puede usarse control hemodinámico para

monitorizar el estado clínico del paciente. De acuerdo con la invención aquí descrita, la composición farmacéutica de la invención puede administrarse al paciente poco tiempo después de efectuarse la extracción del tejido adiposo cardiaco. Por ejemplo, la composición farmacéutica de la invención puede administrarse inmediatamente después de procesar el tejido adiposo cardiaco para aislar la población celular de la invención o la composición que comprende células madre de la invención obtenible según el procedimiento de la invención, y haberla dispuesto en un vehículo farmacéuticamente adecuado. En otra realización, el plazo de entrega dependerá de la disponibilidad del paciente y el tiempo requerido para procesar el tejido adiposo cardiaco y aislar la población celular de la invención.

El término "vehículo aceptable farmacéuticamente" se refiere a un vehículo que debe estar aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o un gobierno estatal o enumerado en la Farmacopea Estadounidense o la Farmacopea Europea, u otra farmacopea reconocida generalmente para su uso en animales, y más concretamente en humanos.

El término "vehículo" se refiere a un diluyente, coadyuvante, excipiente o portador con el que se debe administrar las células de la población celular de la invención o de dicha composición que comprende células madre de la invención obtenible según el procedimiento de la invención; obviamente, dicho vehículo debe ser compatible con dichas células. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dicho vehículo incluyen cualquier vehículo fisiológicamente compatible, por ejemplo, soluciones isotónicas (e.g., solución salina estéril (0,9% NaCl), solución salina tamponada con fosfatos (PBS), solución Ringer-lactato, etc.), opcionalmente suplementadas con suero, preferiblemente con suero autólogo; medios de cultivo celular (e.g., DMEM, etc.); o, alternativamente, un medio soporte sólido, semisólido, gelatinoso o viscoso, tal como colágeno, colagen-glicosamino-glicano, fibrina, cloruro de polivinilo, poliaminoácidos, tales como polilisina, o poliornitina, hidrogeles, agarosa, sulfato de dextrano silicona. Asimismo, si se desea, el medio de soporte puede, en realizaciones específicas, contener factores de crecimiento u otros agentes. Si el soporte es sólido, semisólido, o gelatinoso, las células pueden ser introducidas en una fase líquida del vehículo que es tratada posteriormente de forma tal que se convierte en una fase más sólida. En algunas

realizaciones de la invención en las que el vehículo tenga una estructura sólida, dicho vehículo podrá ser conformado de acuerdo con la forma de la lesión.

La composición farmacéutica de la invención, si se desea, puede contener también, cuando sea necesario, aditivos para aumentar, controlar o dirigir de otro modo el efecto terapéutico deseado de las células, los cuales comprenden dicha composición farmacéutica, y/o sustancias auxiliares o sustancias farmacéuticamente aceptables, tales como agentes tamponantes, tensioactivos, codisolventes, conservantes, etc. También, para estabilizar la suspensión celular, es posible añadir quelantes de metales. La estabilidad de las células en el medio líquido de la composición farmacéutica de la invención puede mejorarse mediante la adición de sustancias adicionales, tales como, por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico, etcétera. Dichas sustancias farmacéuticamente aceptables que pueden usarse en la composición farmacéutica de la invención son conocidas, en general, los técnicos en la materia y se usan normalmente en la elaboración de composiciones celulares. Ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen, por ejemplo, en "Remington's Pharmaceutical Sciences", de E. W. Martin. Puede encontrarse información adicional sobre dichos vehículos en cualquier manual de tecnología farmacéutica (Farmacia Galénica).

La composición farmacéutica de la invención contendrá una cantidad terapéuticamente efectiva de la población celular de la invención o de dicha composición que comprende células madre de la invención obtenible según el procedimiento de la invención, o de dicha composición que comprende células diferenciadas de la invención, preferentemente una población celular sustancialmente homogénea de la invención, tras ser aislada y expandida, conjuntamente con el vehículo adecuado en la cantidad apropiada para proporcionar la forma de administración correcta al sujeto.

La composición farmacéutica de la invención se formulará de acuerdo con la forma de administración elegida. La formulación se adecuará al modo de administración. En una realización particular, la composición farmacéutica de la invención se prepara en un modo de dosificación líquido o gel, por ejemplo, en forma de suspensión, para ser inyectada o perfundida al sujeto necesitado de tratamiento. Ejemplos ilustrativos, y no limitativos, incluyen la formulación de la composición farmacéutica de la invención en una suspensión estéril con un excipiente

farmacéuticamente aceptable, tal como una solución isotónica, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfatos (PBS), o cualquier otro vehículo farmacéuticamente aceptable apropiado, para la administración a un sujeto vía parenteral, e.g., un ser humano, preferentemente vía intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, etc., aunque también son posibles otras rutas alternativas de administración.

La administración de la composición farmacéutica de la invención al sujeto que la necesita se llevará a cabo por los medios convencionales. En una aplicación específica, dicha composición farmacéutica se puede administrar a dicho sujeto por vía intravenosa utilizando los dispositivos adecuados, tales como jeringas, catéteres, trocares, cánulas, etc. En todos los casos, la composición farmacéutica de la invención se administrará utilizando los equipos, aparatos y dispositivos adecuados a la administración de composiciones celulares y conocidos por el experto en la técnica.

En una forma de realización específica, la administración de la composición farmacéutica de la invención se realiza por vía intravenosa e incluye una administración intravenosa a través de dispositivos estándar, por ejemplo, un catéter intravenoso periférico estándar, un catéter venoso central o un catéter arterial pulmonar, etc. El flujo de las células se puede controlar por inflado y desinflado en serie de globos distales y proximales ubicados dentro de la vasculatura del paciente.

En otra realización particular, la administración directa de la composición farmacéutica de la invención al sitio que se pretende beneficiar puede ser ventajosa. De este modo, si se desea, la composición farmacéutica de la invención se puede administrar (implantar, transplantar, etc.) directamente al órgano o tejido deseado aplicándola directamente (e.g., por inyección, etc.) en la superficie externa del órgano o tejido afectado mediante la inserción de un dispositivo adecuado, e.g., una cánula apropiada, catéter, etc., por perfusión arterial o venosa (incluyendo mecanismos de flujo retrógrado) o por otros medios mencionados en esta descripción o conocidos en la técnica. En una realización preferida, se efectuará una administración directa de la composición farmacéutica de la invención en la zona dañada del miocardio mediante, por ejemplo, inyección intracoronaria o por inyección transmiocárdica mediante un catéter. Se han descrito catéteres diseñados para la liberación de principios activos de forma específica en un área dañada del corazón, en particular, en el área infartada (véanse, por ejemplo, las patentes norteamericanas US 6.102.926, US 6.120.520, US

6.251.104, US 6.309.370, US 6.432.119 y US 6.485.481). El sistema de administración utilizado, puede incluir, por ejemplo, un aparato para la administración intracardiaca de medicamentos alternativos, que incluye un sensor para el posicionamiento intracardiaco y un sistema de liberación para administrar el principio activo deseado en la cantidad deseada en la posición del sensor.

La composición farmacéutica de la invención, si se desea, se puede almacenar hasta el momento de su aplicación mediante los procedimientos convencionales conocidos por los técnicos en la materia. Esta composición farmacéutica también se puede almacenar junto a medicamentos adicionales, útiles en el tratamiento post-infarto de miocardio y/o de la insuficiencia cardiaca congestiva, en una forma activa que comprende una terapia combinada. Para el almacenamiento a corto plazo (menos de 6 horas), la composición farmacéutica de la invención puede almacenarse a temperatura ambiente o por debajo de ésta en un recipiente sellado complementándola o no con una solución nutriente. El almacenamiento a medio plazo (menos de 48 horas) se realiza preferentemente a 2-8°C, y la composición farmacéutica de la invención incluirá una solución iso-osmótica y tamponada en un contenedor compuesta de, o revestida de, material que previene la adhesión celular. El almacenamiento a más largo plazo se lleva a cabo preferentemente por medio de crioconservación adecuada y almacenamiento en condiciones que promueven la retención de la función celular. En una forma de realización concreta, la composición farmacéutica de la invención se utiliza en una terapia combinada. En una realización particular, dicha composición farmacéutica se administra en combinación con una composición farmacéutica adicional para el tratamiento post-infarto de miocardio y/o de la insuficiencia cardiaca congestiva. Por tanto, las células madre de la invención contenidas en la población celular de la invención pueden utilizarse como un tratamiento único o combinadas con otros tratamientos convencionales para el tratamiento de la enfermedad cardiovascular, y, en particular, de la cardiopatía isquémica, tal como, por ejemplo, la realización de un bypass coronario, una angioplastia (con o sin stents), la administración de promotores de la angiogénesis, la implantación de un dispositivo de asistencia ventricular la administración de agentes trombolíticos, antiagregantes plaquetarios (ácido acetilsalicílico y/o clopidogrel), antihipertensivos (inhibidores de la enzima conversora de la angiotensina (IECA),

antagonistas del receptor de la angiotensina I (ARA-II), bloqueantes de los receptores β, diuréticos, antilipemiantes, digoxina, nitratos y/o antagonistas del calcio.

En una realización particular, la terapia combinada se administra a un sujeto con una cardiopatía isquémica, en particular, a un paciente que ha sufrido un infarto de miocardio y/o padece de insuficiencia cardiaca congestiva que no responde a los tratamientos convencionales.

La composición farmacéutica de la invención puede utilizarse en una terapia combinada con medicación adicional útil en el tratamiento post-infarto de miocardio y/o de la insuficiencia cardiaca congestiva, tal y como se ha descrito previamente. Dichos medicamentos adicionales pueden formar parte de la misma composición farmacéutica o se pueden suministrar, de forma alternativa, en forma de una composición aparte para la administración simultánea o sucesiva (secuencial en el tiempo) con respecto a la administración de la composición farmacéutica de la invención. En una forma de realización concreta, dicha composición farmacéutica adicional se administra de forma simultánea o secuencial a la composición farmacéutica que comprende la población celular de la invención, espaciada en el tiempo, en cualquier orden, es decir primero puede administrarse la composición farmacéutica de la invención, luego los otros medicamentos adicionales u otra composición farmacéutica para el tratamiento de una cardiopatía isquémica o primero puede administrarse los otros medicamentos adicionales u otra composición farmacéutica para el tratamiento de una cardiopatía isquémica y luego la composición farmacéutica de la invención. Alternativamente, puede mezclarse cualquiera de estos dos componentes en la misma composición y administrarlos conjuntamente. En otra forma de realización alternativa, dicha composición farmacéutica de la invención y otros medicamentos adicionales u otra composición farmacéutica para el tratamiento de una cardiopatía isquémica se administran simultáneamente.

Los pacientes pueden ser monitorizados antes de y durante la administración de la composición farmacéutica de la invención. Tras la administración de la composición farmacéutica, los pacientes pueden requerir un periodo aproximado de 24 horas de monitorización por si se produjeran efectos adversos. Se recomienda realizar estudios de seguimiento para evaluar las mejoras funcionales.

Biomaterial que comprende la población celular de la invención

En otro aspecto, la invención se relaciona con un biomaterial, en adelante biomaterial de la invención, que comprende dicha población celular de la invención, dicha composición que comprende células madre de la invención obtenible según el procedimiento de la invención, o dicha composición que comprende células diferenciadas de la invención, o dicha composición farmacéutica de la invención.

La ingeniería de tejidos consiste en el transplante en los tejidos dañados de biomateriales que están compuestos por estructuras biocompatibles adecuadas para su implantación en el organismo que han sido recubiertas de células con capacidad de adherirse y proliferar. Dichas estructuras pueden ser, entre otras: suturas, matrices, membranas, espumas, geles y cerámicas. Se conocen diversos materiales que han sido utilizados en la construcción de matrices y otras estructuras biocompatibles, entre los cuáles se incluyen: materiales inorgánicos, por ejemplo, metales; polímeros naturales tales como fibrina o alginatos; polímeros sintéticos tales como polihidroxiácidos, por ejemplo, ácido poliglicólico (PGA) y copolímeros de los mismos (e.g., ácido poliglicólico-ácido láctico (PLGA), etc.). En una realización preferida, dichos polímeros son biodegradables, de tal manera que se degradan con el tiempo y la estructura polimérica es completamente reemplazada por células. En una realización particular, dicho biomaterial de la invención comprende, o está compuesto por, una estructura biocompatible que comprende uno o más polímeros biodegradables y la población celular de la invención, o una composición que comprende células diferenciadas de la invención, o una composición farmacéutica de la invención.

En otra realización particular, dicha estructura polimérica puede estar recubierta con moléculas bioactivas, es decir, con moléculas capaces de interaccionar de manera específica con las células, o bien con otro polímero con mejores propiedades de adherencia con el fin de aumentar el grado de adherencia y proliferación de las células.

Uso de la población celular de la invención o de dicha composición que comprende células madre de la invención obtenible según el procedimiento de la invención, o de dicha composición que comprende células diferenciadas de la invención, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de patologías

Los inventores han observado que la población celular de la invención así como dicha composición que comprende células madre de la invención obtenible según el procedimiento de la invención, presentan un buen potencial cardiomiogénico, mejor que el de otras poblaciones de células madre de origen distinto ya descritas, por lo que la población celular de la invención así como dicha composición que comprende células madre de la invención obtenible según el procedimiento de la invención, constituyen unos reactivos celulares potencialmente útiles en la regeneración del tejido cardiaco y/o en el tratamiento de situaciones en las que existe una pérdida de tejido miocárdico funcional (cardiopatía isquémica), por ejemplo, en pacientes que han sufrido uno o más infartos de miocardio o en pacientes que han desarrollado insuficiencia cardiaca congestiva así como en la estimulación de la angiogénesis en situaciones en las que es conveniente estimularla.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de una población celular de la invención, o de dicha composición que comprende células madre de la invención obtenible según el procedimiento de la invención, o de dicha composición que comprende células diferenciadas de la invención, en la elaboración de una composición farmacéutica para la regeneración de tejido cardiaco, o en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de una cardiopatía isquémica, o en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento post-infarto de miocardio, o para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca congestiva, o en la elaboración de una composición farmacéutica para estimular la angiogénesis.

En otro aspecto, la invención se relaciona con la población celular de la invención, o de dicha composición que comprende dichas células madre de la invención, o de dicha composición que comprende células diferenciadas de la invención, para la regeneración de tejido cardiaco, o para el tratamiento de una cardiopatía isquémica, o para el tratamiento post-infarto de miocardio, o para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca congestiva y/o para estimular la angiogénesis.

Para regenerar el tejido cardiaco, o para el tratamiento de una cardiopatía isquémica, post-infarto de miocardio, o insuficiencia cardiaca congestiva, o para estimular la angiogénesis, la composición farmacéutica de la invención que comprende una población celular de la invención o una composición que comprende células madre de la invención obtenible según el procedimiento de la invención, o de dicha

composición que comprende células diferenciadas de la invención, se administra al sujeto en necesidad de tratamiento una cantidad terapéuticamente efectiva de dicha composición farmacéutica. Como ya se ha mencionado, las células madre de la invención (presentes en dicha población celular de la invención), derivan de tejido adiposo cardiaco y expresan GATA-4 y/o Cx43, preferentemente, ambas, de manera constitutiva. La proteína Cx43 es una de las principales proteínas en las uniones gap que conectan eléctricamente a los cardiomiocitos, por lo que el hecho de que dichas células madre de la invención expresen Cx43 de manera constitutiva sugiere un buen acoplamiento eléctrico con el tejido cardiaco preexistente tras el trasplante de dicha población celular que comprende células madre de la invención.

Las células madre de la invención, la población celular de la invención, o dicha composición que comprende células madre de la invención obtenible según el procedimiento de la invención, o dicha composición que comprende células diferenciadas de la invención, pueden ser utilizadas para obtener un número apropiado de células capaces de regenerar el tejido isquémico cardiaco o bien mejorar la funcionalidad del corazón tras uno o más infartos de miocardio. En una realización particular, dicha mejora es debida a la diferenciación de las células madre de la invención presentes en dicha población celular de la invención a miocardiocitos, músculo liso y/o tejido endotelial vascular. Tal como se ha descrito previamente, la administración de la composición farmacéutica de la invención al sujeto que la necesita puede llevarse a cabo por medios convencionales. En una forma de realización concreta, dicha composición farmacéutica se puede administrar al sujeto que la necesita directamente en la zona dañada del miocardio, como por ejemplo mediante inyección intracoronaria o por inyección transmiocárdica mediante catéter. Las células madre de la invención, la población celular de la invención, o dicha composición que comprende células madre de la invención obtenible según el procedimiento de la invención, o dicha composición que comprende células diferenciadas de la invención, pueden ser utilizadas para obtener un número apropiado de células capaces de estimular la angiogénesis en situaciones patológicas donde puede ser necesario.

Método para la regeneración de tejido cardiaco, o para el tratamiento de una cardiopatía isquémica, o para el tratamiento post-infarto de miocardio, o para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca congestiva, o para estimular la angiogénesis basado en el empleo de células madre de la invención o de células diferenciadas de la invención La invención también se relaciona con la regeneración de tejido cardiaco, con el tratamiento de situaciones patológicas en las que existe una pérdida de tejido miocárdico funcional (e.g., cardiopatía isquémica), por ejemplo, en sujetos (pacientes) que han sufrido uno o más infartos de miocardio o en pacientes que han desarrollado insuficiencia cardiaca congestiva. Asimismo, la invención también se relaciona con la estimulación de la angiogénesis en situaciones en las que es conveniente o recomendable.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la regeneración de tejido cardiaco, o para el tratamiento de una cardiopatía isquémica, o para el tratamiento post-infarto de miocardio, o para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca congestiva, o para la estimulación de la angiogénesis, que comprende la administración a un sujeto que lo necesita de una cantidad terapéuticamente efectiva de células madre de la invención, o de una composición que comprende células madre de la invención obtenible según el procedimiento de la invención, o de dicha composición que comprende células diferenciadas de la invención, o de una composición farmacéutica de la invención.

Como se ha mencionado previamente, para regenerar el tejido cardiaco, o para el tratamiento de una cardiopatía isquémica, post-infarto de miocardio, insuficiencia cardiaca congestiva, o para estimular la angiogénesis, dichas células madre de la invención, dicha composición que comprende células madre de la invención obtenible según el procedimiento de la invención, dicha composición que comprende células diferenciadas de la invención, o dicha composición farmacéutica de la invención, se administran al sujeto en necesidad de tratamiento en una cantidad terapéuticamente efectiva, por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia (e.g., mediante administración directa a la zona dañada del miocardio por inyección intracoronaria, inyección transmiocárdica, etc.).

Kit

En otro aspecto la invención se relaciona con un kit que comprende una célula madre de la invención, una población celular de la invención, una composición que comprende células madre de la invención obtenible según el procedimiento de la invención o dicha composición que comprende células diferenciadas de la invención, Las características de dichas células madre y población celular de la invención, así como de dicha composición que comprende células madre de la invención obtenible según el procedimiento de la invención, y de dicha composición que comprende células diferenciadas de la invención ya han sido descritas anteriormente. Las células madre de la invención, presentes en la población celular de la invención o en dicha composición que comprende células madre de la invención obtenible según el procedimiento de la invención, al igual que dichas células diferenciadas de la invención presentes en dicha composición, que forman parte de dicho kit pueden ser de origen alogénico o xenogénico.

Dicho kit puede ser utilizado con fines diagnóstico y/o para investigación in vitro, por lo que, para tales fines, si se desea, las células madre de la invención pueden ser inmortalizadas de manera que sean capaces de expandirse de manera indefinida.

Por tanto, en una realización particular, las células madre de la invención se someten a un proceso de inmortalización, por ejemplo, a un proceso de inmortalización reversible, con el fin de obtener células madre inmortalizadas, preferentemente, células madre de la invención inmortalizadas de forma reversible. En este sentido, tal como aquí se utiliza, el término "inmortalización" o "inmortalizada" se refiere a una célula, o a un proceso para la creación de una célula, que proliferará indefinidamente en cultivo sin entrar en senescencia. Según la presente invención, la inmortalización se refiere a un proceso por el que un cultivo celular es transformado de modo que las células se comporten en algunos aspectos como células tumorales, en particular, en lo relativo a las características proliferativas de las células tumorales. Así, una "célula inmortalizada de forma reversible" se refiere a una célula que, en un momento dado se encuentra en un estado inmortalizado pero que puede ser devuelta a un estado no-inmortalizado en un momento posterior, utilizando un proceso de inmortalización inverso. En una realización particular, las células madre de la invención son inmortalizadas reversiblemente mediante un procedimiento que comprende: (a) transformar células madre de la invención con un vector que comprende un "polinucleótido retirable" que

contiene un oncogén (o una combinación de oncogenes), con el fin de obtener células madre de la invención inmortalizadas; (b) crecer dichas células madre de la invención inmortalizadas; y (c) seleccionar aquellas líneas celulares clónales de células madre de la invención inmortalizadas que mantienen las propiedades funcionales de las células de la invención; si se desea, se puede retirar el oncogén (o combinación de oncogenes) de las células madre de la invención inmortalizadas. A modo ilustrativo, se pueden inmortalizar poblaciones celulares mediante sobreexpresión individual o en combinación de algunos oncogenes, tales como el antígeno T largo de SV40, la subunidad catalítica de la telomerasa, Bmi-1, etc. La sobreexpresión de estos oncogenes podría ser revertida mediante el flanqueo con dianas de recombinasas (e.g., introduciendo la recombinasa Cre que reconoce las dianas loxP, etc.), y, además, añadiendo el gen suicida de la timidina kinasa que permitiría la destrucción de las células inmortalizadas.

Método para evaluar in vitro la respuesta celular a agentes biológicos o farmacológicos

En otro aspecto, la invención se relaciona un método para evaluar in vitro la respuesta celular frente a un agente biológico o farmacológico, que comprende poner en contacto dicho agente con una población celular de la invención, que comprende una pluralidad de células madre de la invención, o con una composición que comprende células madre de la invención obtenible según el procedimiento de la invención, opcionalmente, diferenciadas a un tipo celular concreto, o con dicha composición que comprende células diferenciadas de la invención, y evaluar los efectos de dichos agentes sobre dicha población celular en cultivo.

A modo ilustrativo, se puede evaluar in vitro la respuesta celular frente a un agente biológico o farmacológico mediante un procedimiento que comprende: (a) aislar una población celular de la invención o una composición que comprende células madre de la invención obtenible según el procedimiento de la invención, a partir de un individuo o de un grupo de individuos; (b) opcionalmente, diferenciar la totalidad o parte de las células madre de la invención presentes en dicha población celular, o en dicha composición que comprende células madre de la invención obtenible según el procedimiento de la invención, a un tipo o linaje celular concreto; (c) expandir in vitro las células resultantes de la etapa (a) o (b) en cultivo; (d) opcionalmente, diferenciar las

células expandidas en la etapa (c) a un tipo celular concreto; (e) poner en contacto la población celular resultante de la etapa (c) o (d) en cultivo con uno o más agentes biológicos o farmacológicos; y (f) evaluar los efectos de dichos agentes sobre la población celular en cultivo. En una realización particular, las células madre de la invención, presentes en la población celular de la invención o en la composición que comprende células madre de la invención obtenible según el procedimiento de la invención, son diferenciadas a cardiomiocitos. La etapa de diferenciación puede tener lugar bien tras el aislamiento de la población celular de la invención [etapa (b)] o bien tras su expansión in vitro [etapa (d)].

Procedimiento para la obtención de factores de crecimiento y/o citocinas

En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la obtención de factores de crecimiento y/o citocinas que comprende cultivar células madre de la invención, o células diferenciadas de la invención, bajo condiciones apropiadas para la expresión y producción de dichos factores de crecimiento y/o citocinas, y, si se desea, separar dichos factores de crecimiento y/o citocinas. Dichas condiciones son conocidas por los técnicos en la materia o pueden ser deducidas fácilmente por un experto a la vista de la información contenida en esta descripción. Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deberán ser considerados en sentido limitativo de la misma.

EJEMPLO 1

Aislamiento y cultivo celular de poblaciones de células madre adultas sub-ADSC y epi-ADSC

Se aislaron dos poblaciones de células madre sustancialmente homogéneas a partir de muestras de grasa humana de origen epicárdico y subcutáneo de un mismo individuo y se compararon tanto su fenotipo como la expresión basal de marcadores cardioespecíficos.

Materiales y Métodos Obtención de muestras de grasa epicárdica v subcutánea

Las muestras de grasa epicárdica y subcutánea se obtuvieron de 4 pacientes (Pl, P2, P3 y P4) en el contexto de cirugía cardiaca rutinaria previo consentimiento informado, extrayéndose una muestra de cada tipo de grasa de cada uno de ellos. En la cirugía cardiaca, en primer lugar, se realiza la disección del tejido cutáneo y subcutáneo hasta exponer el esternón. De la grasa del tejido subcutáneo torácico expuesta en este proceso se obtuvo un fragmento (alrededor de 2 a 5 g) utilizando pinzas quirúrgicas. A continuación, se realiza esternotomía media y disección del pericardio con la consiguiente exposición del corazón. El tejido adiposo epicárdico (alrededor de 0,5 a 2 g) se obtuvo de la base del corazón alrededor de la arteria aorta. Este tejido adiposo se seleccionó mediante pinzas quirúrgicas y se resecó utilizando tijeras quirúrgicas habituales. El estudio fue aprobado por el Comité ético del Hospital de la Santa Creu i Sant Pau.

Aislamiento de las poblaciones celulares epi-ADSC v sub-ADSC a partir de las muestras de grasa epicárdica y subcutánea

Ambos tipos de muestras de grasa (epicárdica y subcutánea) fueron lavadas repetidamente con tampón PBS (Gibco Invitrogen Corp.) y cortadas en fragmentos pequeños usando bisturí previa disección de vasos sanguíneos presentes.

A continuación, los fragmentos de tejido adiposo fueron digeridos enzimáticamente con una solución de colagenasa tipo II al 0,05 % en α-MEM (Gibco

Invitrogen Corp) durante 30 minutos a 37°C en agitación. La reacción fue detenida añadiendo medio α-MEM suplementado con 10% de suero de bovino fetal (FBS), L- glutamina 1 mM (Gibco Invitrogen Corp) y 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco

Invitrogen Corp). Seguidamente la suspensión se centrifugó a 1.200 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se descartó el sobrenadante, el pellet se resuspendió con medio completo de cultivo α-MEM suplementado con 10% de FBS, L-glutamina 1 mM y 1% penicilina-estreptomicina y se sembró en frascos de cultivo (a 37°C y atmósfera de aire con 5% de CO ₂ ). Pasadas 24 horas se retiró el medio de cultivo y se lavaron las células adheridas con PBS.

Expansión in vitro de las células previamente aisladas

Las células adheridas se cultivaron en presencia de α-MEM suplementado con 10% de FBS, L-glutamina 1 mM y 1% de penicilina-estreptomicina a 37°C en atmósfera de aire con 5% de CO ₂ . Las células se mantuvieron en cultivo bajo las mismas condiciones hasta que se alcanzó un grado de confluencia de aproximadamente el 80% (pre-confluencia) reemplazando el medio de cultivo cada 3 ó 4 días. Las células fueron repetidamente subcultivadas al llegar a pre-confluencia hasta pase 5 (3-4 meses), a una dilución 1 :3, lo cuál corresponde a una densidad de 5-6xl0 ³ células/cm ² , tras ser despegadas de la placa de cultivo mediante una solución de tripsina- EDTA.

Resultados

Se seleccionó y expandió en cultivo in vitro una población de células madre adultas derivadas de tejido adiposo epicárdico y una población de células madre adultas derivadas de tejido adiposo subcutáneo procedentes del mismo individuo. La Figura IA muestra las fracciones extraídas de grasa epicárdica y subcutánea. La morfología de las células madre adultas derivadas de tejido adiposo humano epicárdico (epi- ADSC) se muestra en la Figura IB, mientras que la morfología de las células madre adultas derivadas de tejido adiposo subcutáneo humano (sub-ADSC) se muestra en la Figura IC.

EJEMPLO 2

Caracterización inmunofenotípica de la población de células madre adultas epi-

ADSC

Mediante citometría de flujo se analizó la expresión de diversos marcadores de superficie con el fin de caracterizar la población de células madre derivadas de tejido adiposo epicárdico (epi- ADSC) y se compararon los resultados obtenidos con los de la población celular aislada de tejido adiposo subcutáneo (sub-ADSC).

Materiales y Métodos

Citometría de flujo El análisis inmunofenotípico mediante citometría de flujo se efectuó en cuatro poblaciones celulares derivadas de tejido adiposo epicárdico (células epi-ADSC) aisladas de cuatro muestras de pacientes identificadas como Pl, P2, P3 y P4, y se

compararon frente a una muestra representativa de células sub-ADSC. Las células epi- ADSC Pl y P2 fueron caracterizadas tras ser cultivadas durante 3-4 semanas (pase bajo) mientras que las células epi-ADSC P3 y P4 fueron caracterizadas tras ser cultivadas durante 9-12 semanas (pase alto). Se lavaron las células con PBS a 4 ⁰ C y se despegaron de la placa con tripsina/EDTA 0,05% (Gibco) durante 5 minutos en condiciones de cultivo. Una vez bloqueada la acción de la tripsina, las células se centrifugaron a 1.400 rpm durante 5 minutos en refrigeración. Las células se mantuvieron en buffer de tinción refrigerado (PBS IX con 1% de FCS) durante todo el proceso de tinción. La tinción se llevó a cabo mediante anticuerpos específicos frente a distintos antígenos de superficie: CD3, CD9, CDlO, CDI lB CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD28, CD29, CD31, CD34, CD36, CD38, CD44, CD45, CD49a, CD49d, CD49e, CD49f, CD50, CD51, CD54, CD55, CD56, CD58, CD59, CD61, CD62e, CD621, CD62p, CD71, CD90, CD95, CD102, CD104, CD105, CD106, CDl 17, CD133/2, CD59, CD235a, HLAI, HLAII, NGFR y β2-microglobulina (todos ellos, procedentes de Serotec).

Para revelar la presencia de dichos antígenos en la membrana celular se usaron dos fluoróforos, isotiocianato de fluoresceína (FITC) y ficoeritrina (PE), diluidos 1/50 en buffer de tinción durante 20 minutos protegidos de la luz y a 4°C. Las muestras fueron analizadas en citómetro Coulter EPICS XL y mediante un software específico (FCS Express 3 software).

Resultados

En la Figura 2 se muestran los resultados positivos obtenidos del perfil inmunofenotípico de las muestras epi-ADSC. El parámetro estadístico usado para el análisis fue el "% positivo". Este parámetro mide el porcentaje de las células aceptadas en la fórmula de adquisición que considera positivas con respecto al control. Estadísticamente el programa FCS Express hace una sustracción numérica y considera como resultado positivo un valor mayor del 30% del parámetro "porcentaje de células positivas". En base a esto los resultados del análisis del perfil inmunofenotípico mediante citometría de flujo muestran que más de un 90% de los marcadores estudiados presentan una expresión similar en ambas poblaciones celulares (epi-ADSC y sub-ADSC). En

concreto, la población de células epi-ADSC es muy positiva para CD9, CD29, CD44, CD51, CD54, CD55, CD59, CD90, CD 105, HLA-I y β2-microglobulina, al igual que en el caso de la población de células sub-ADSC (Tabla 1). El resto de los marcadores específicos de sub-ADSC negativos lo son también para las células epi-ADSC. No obstante, se ha detectado una diferencia en relación con la expresión del marcador de superficie celular CD54 que es positivo en el caso de las células epi-ADSC y negativo en las células sub-ADSC.

Tabla 1

Resultados de expresión de los marcadores de superficie analizados por citometría de flujo en las diferentes muestras de células epi-ADSC frente a una muestra representativa de células sub-ADSC

[NOTA: únicamente se han mostrado aquellos marcadores que presentan un resultado positivo (expresión mayor al 30%)]

EJEMPLO 3

Estudio comparativo de la expresión génica de marcadores cardioespecíficos en poblaciones de células madre sub-ADSC y epi-ADSC

Se analizó la expresión basal de los marcadores cardioespecífícos: β-MHC, GATA-4, Nkx2.5, troponina I cardiaca (cTnl), SERCA-2, α-actinina sarcomérica y conexina-43 mediante la técnica de RT-PCR en tiempo real.

Materiales y Métodos

RT-PCR en tiempo real

Se extrajo el RNA total de las células aisladas con el kit QuickPrep Total RNA Extraction (Amersham) según las instrucciones del fabricante. A partir de 2 μg de RNA total se efectuó la síntesis del cDNA mediante una reacción de transcripción inversa utilizando el kit Script One-Step RT-PCR con hexámeros aleatorios (Bio-Rad Laboratories) a 50 ⁰ C durante 10 minutos. Una vez obtenido el cDNA se prepararon todas las reacciones de PCR con cebadores marcados con FAM®, específicos para todos los genes estudiados, en el kit TaqMan Universal PCR master mix (Applied Biosystems). Los cebadores utilizados fueron: GATA-4 (HsOOl 71403_ml), Nkx2.5 (Hs00231763_ml), α-actinina sarcomérica (Hs00241650_ml), β-MHC (HsOOl 65276_ml), conexina-43 (Hs00748445_sl), SERCA-2 (Hs00544877_ml), cTnl (Hs00165957_ml) y GAPDH (Hs99999905_ml) (Applied Biosystems) y las condiciones de reacción: 2 minutos a 50 ⁰ C, 10 minutos a 95°C y 40 ciclos de 15 segundos a 95°C y 1 minuto a 60 ⁰ C para todos los cebadores. Finalmente, se analizó la amplificación mediante el sistema ABI Prism 7000 Sequence Detection (Applied Byosistems). Para la cuantificación de la expresión génica los datos obtenidos se analizaron con el programa ABI Prism 7000 SDS software. Todas las muestras se analizaron por duplicado. Se utilizó el método de comparación de Ct (δ Ct) ; Ct es el ciclo de PCR en el que se detecta el primer incremento de fluorescencia por encima del nivel basal) para calcular la expresión relativa de cada gen analizado utilizando el gen de expresión constitutiva GAPDH como control de referencia endógeno.

Resultados

Como se muestra en la Tabla 2 y en la Figura 3 A, a pase 2 se detectó un incremento estadísticamente significativo de los niveles génicos para el factor de transcripción cardiaco GAT A-4 en la población de células epi-ADSC en comparación con las células sub-ADSC extraídas del mismo individuo (p<0,001). Por el contrario, no

se detectaron diferencias significativas en cuanto a la expresión génica del resto de marcadores cardioespecíficos (α-actinina, β-MHC, cTnl, Cx43, SERCA-2 y Nkx2.5) entre los dos tipos de poblaciones celulares estudiadas (Figura 3A). Merece la pena destacar que a pase 5 la diferencia de expresión de GAT A-4 se incrementa (p<0,001) y se detecta también una diferencia significativa respecto a los niveles de transcrito para Cx43 (p=0,031) (Figuras 3B y 3C). Estos resultados indican que la población de células madre de grasa epicárdica (epi-ADSC) está más comprometida hacia linaje cardiaco en comparación con la población de células procedentes de grasa subcutánea (sub-ADSC) del mismo individuo.

Tabla 2 Cuantificación de los niveles de expresión génica

Gen amplificado Pase 2 Pase 5 epi-ADSC sub-ADSC epi-ADSC sub-ADSC

Cx43 0,92 ± 0,1 0,77 ± 0,1 1,17 ± 0,2 0,78 ± 0,2 α-actínina 0,92 ± 0,2 0,77 ± 0,2 1,03 ± 0,1 0,74 ± 0,2 cTnl 0 0 0,99 ± 1,2 0,35 ± 0,2 β-MHC 0 0 0,90 ± 0,3 0,62 ± 0,4

GATA-4 0,88 ± 0,1 0,08 ± 0,2 1,07 ± 0,2 0

Nkx2.5 0 0 0 0

SERCA-2 0,90 ± 0,1 0,88 ± 0,26 0,92 ± 0,6 0,66 ± 0,2

EJEMPLO 4

Estudio comparativo a nivel proteico de la expresión de marcadores cardioespecíficos en las células epi-ADSC y en las células sub-ADSC

Se analizó la expresión basal de los marcadores cardioespecíficos β-MHC, GATA-4, Nkx2.5, troponina I cardiaca, SERCA-2, α-actinina sarcomérica y conexina- 43, a nivel de proteína mediante las técnicas de inmunofiuorescencia y Western blot.

Materiales y Métodos

Western Blot

Las células se lavaron repetidamente con tampón PBS frío y se homogeneizaron en tampón de lisis [Tris 25 mM pH 7,6, NaCl 150 mM, EDTA (ácido

etilendiaminotetraacético) 1 mM, EGTA (ácido etilenglicoltetraacético) 1 mM, 1% de SDS (laurilsulfato de sodio), PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonil) 1 mM, lμg/ml de aprotinina y lμg/ml de leupeptina] durante 30 minutos a 4°C. La fracción SDS- insoluble se obtuvo mediante centrifugación a 13.000 rpm durante 10 minutos a 4°C. La concentración de proteína de los extractos totales fue determinada mediante el kit Bio- Rad DC protein (BioRad) utilizando BSA como estándar. 50 μg de proteína se transfirieron a membranas de nitrocelulosa de 0,45 mm de poro y se revelaron con anticuerpos específicos para los distintos marcadores cardioespecíficos analizados: Cx43 (1/100) (BD Transduction Laboratories), GATA-4 (1/100), SERCA-2 (1/100), anti-troponina I cardiaca (cTnl) (1/100) (los 3 anteriores de Santa Cruz Biotechnology), β-MHC (1/10) (Chemicon) y α-actinina sarcomérica (1/100) (Sigma)). Se utilizó un sistema de detección quimioluminiscente para la visualización de las bandas específicas correspondientes (Pierce) según instrucciones del fabricante.

Inmunofluorescencia

Las células, cultivadas en placas de 35 mm con fondo de cristal de 0,17 mm, especiales para su estudio mediante microscopía confocal (FluoroDish, WPI Inc.), fueron lavadas repetidamente con tampón PBS y fijadas con 4% de PFA (paraformaldehido) preparado en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, las células fueron permeabilizadas con 1% de BSA (albúmina de suero bovino)/0,l% de saponina en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Finalmente las células fueron incubadas con anticuerpos específicos para los distintos marcadores cardioespecíficos analizados: Cx43 (1/100) (BD Transduction Laboratories), GATA-4 (1/100), SERCA-2 (1/100), troponina I cardiaca (cTnl) (1/100) (Santa Cruz Biotechnology), β-MHC (no diluido) (Chemicon) y α-actinina sarcomérica (1/100) (Sigma)) y finalmente fueron analizadas bajo un microscopio confocal de fluorescencia (Leica).

Resultados Los resultados del estudio de la expresión de dichos marcadores a nivel proteico complementan los resultados obtenidos en el análisis de la expresión génica de los mismos.

De esta forma, se observó que, en ausencia de factores o estímulos cardiogénicos adicionales en el medio de cultivo, únicamente las células epi-ADSC expresaban Cx43 y GAT A-4 tanto a pase 2 como a pase 5 (Figuras 4A y 4B). Se observó también un aumento de los niveles de expresión de Cx43 y GATA-4 en las células epi-ADSC a lo largo de su expansión in vitro (de pase 2 a pase 5).

Cabe destacar la ausencia de expresión, a nivel de proteína, de la bomba de calcio SERCA-2 y de β-MHC en ambas poblaciones celulares a pase 2. Sin embargo, a pase 5 se detectó un incremento en la expresión de β-MHC y SERCA-2 en ambas poblaciones celulares (Figuras 4 y 5), las células epi-ADSC presentan un incremento en la expresión de β-MHC superior al observado en las células sub-ADSC procedentes de un mismo individuo (Figura 4).

La existencia de esta expresión diferencial a nivel proteico puede deberse a diferencias en los mecanismos de regulación del proceso de traducción de transcrito o mRNA a proteína madura entre las dos poblaciones celulares estudiadas. En relación con los restantes genes/proteínas analizadas hay un alto grado de coincidencia entre los resultados obtenidos mediante la RT-PCR a tiempo real y los experimentos de Western blot e inmunofluorescencia.

EJEMPLO 5 Análisis de la capacidad de diferenciación de células madre derivadas de tejido graso epicárdico (epi-ADSC)

Se analizó la capacidad de diferenciación de las células madre derivadas de grasa de epicardio (epi- ADSCs) a linaje adipogénico, osteogénico y condrogénico.

Materiales y Métodos

Diferenciación de células epi-ADSCs a linaje osteogénico. adipogénico y condrogénico Se utilizaron protocolos de diferenciación específicos para cada uno de los linajes celulares: diferenciación osteogénica, diferenciación adipogénica y diferenciación condrogénica.

o Diferenciación Osteogénica

La inducción de la diferenciación a osteocitos se efectuó siguiendo un protocolo ya establecido para células madre derivadas de tejido adiposo subcutáneo y para otros tipos celulares (Zuk et al., 2002. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol CeIl. 2002 Dec; 13(12):4279-95). Tras mantener las células 1 semana en cultivo (medio DMEM, L-glutamina 2 mM (Gibco), 100 U/mL de penicilina/estreptomicina (Gibco), se indujo la diferenciación a osteocitos mediante el cultivo durante dos semanas en un medio de diferenciación específico compuesto por: DMEM (BEl 2-614F Cambrex, Biowhitaker), 10% de FBS (5253 Linus Cuítele), L-glutamina 2 mM (Gibco), 100 U/mL de penicilina/estreptomicina (Gibco), dexametasona 100 nM (Sigma), ácido 2-fosfato ascórbico 50 μM (Sigma) y beta-glicerofosfato 10 mM (Sigma).

o Diferenciación Adipogénica

La inducción de la diferenciación a adipocitos se efectuó siguiendo un protocolo ya establecido para células madre derivadas de tejido adiposo subcutáneo y para otros tipos celulares (Zuk et ai, 2002, citado supra; Awad et al, 2003. Effects of transforming growth factor betal and dexamethasone on the growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells.Tissue Eng. 2003 Dec; 9(6): 1301 -12).

Tras mantener las células 1 semana en cultivo en medio DMEM, L-glutamina 2 mM (Gibco), 100 U/mL de penicilina/estreptomicina (Gibco), se indujo la diferenciación a adipocitos mediante la alternancia de dos medios de cultivo (Medio A y Medio B), cuya composición se especifica a continuación:

Medio A: DMEM (BE12-614F Cambrex, Biowhitaker), 10% de FBS (5253 Linus Cultek), L-glutamina 2 mM (Gibco), 100 U/mL de penicilina/estreptomicina (Gibco), dexametasona 1 μM (Sigma), indometacina

0,2 mM (Sigma), 10 μg/ml de insulina (Sigma) y 3-isobutil-l-metilxantina 0,5 mM (Sigma).

Medio B: DMEM (BE12-614F Cambrex, Biowhitaker), 10% de FBS (5253 Linus Cultek), L-glutamina 2 mM (Gibco), 100 U/mL de penicilina/estreptomicina (Gibco) y 10 μg/ml de insulina (Sigma).

o Diferenciación Condrogénica

La inducción de la diferenciación a condrocitos se efectuó siguiendo un protocolo ya establecido para células madre derivadas de tejido adiposo subcutáneo y para otros tipos celulares (Zuk et al, 2002, citado suprά). Se indujo la diferenciación mediante la combinación de un cambio de medio y el sometimiento de las células a una baja concentración de oxígeno.

Preinducción: Se centrifugaron los clones en placas de 96 pocilios de fondo cónico, y se dejaron crecer los aglomerados de células durante 24 horas en DMEM con 1% de FBS.

Inducción: Los clones se mantuvieron durante 20 días en un medio específico, cambiando el medio cada 3 días, con medio compuesto de DMEM (BEl 2-614F

Cambrex, Biowhitaker), 1% de FBS (5253 Linus Cultek), L-glutamina 2 mM (Gibco), 100 U/mL de penicilina/estreptomicina (Gibco), 6,25 de μg/ml de insulina (Sigma), 10 ng/mL de TGFB-I (R&D) y ácido ascórbico-2-fosfato 50 nM (Sigma).

Tinción de células epi-ADSC diferenciadas a osteocitos. adipocitos y condrocitos

Se usaron diferentes protocolos de tinción adecuados para cada una de las diferenciaciones :

o Tinción de la diferenciación osteogénica:

Se fijaron las células con etanol al 50% durante 15 minutos a 4°C. La tinción se realizó con Rojo Alizarina al 1% en agua destilada (pH = 4,1) a temperatura ambiente en agitación durante 45 minutos. Las colonias que han diferenciado y, por tanto, han generado calcio a su alrededor, quedan teñidas de rojo intenso.

o Tinción de la diferenciación adipogénica:

Se fijaron las células con una dilución 1:10 de formaldehído al 37% en PBS (pH

7,4) durante 20 minutos a temperatura ambiente. La tinción se realizó con "OiI Red"

(0,3 g de "OiI Red" en 100 mi de isopropanol, dilución 1:2 en agua destilada) e incubación a temperatura ambiente durante 20 minutos. Los lípidos acumulados en las vacuolas de las células que han diferenciado quedan teñidos de rojo.

o Tinción de la diferenciación condrogénica:

Se fijaron las células con una dilución de formaldehído al 4% durante 1 hora a temperatura ambiente. La tinción se realizó con una dilución de 0,1% de azul de Alcian en "alcohol ácido" (70% de etanol, 1% de HCl en agua destilada) incubando a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras lavar se vuelve a fijar la tinción con PFA al 4%. Las células diferenciadas quedan teñidas de azul.

Resultados El análisis de los resultados de tinción específica para los linajes adipogénico, osteogénico y condrogénico muestra que las células madre derivadas de grasa de tejido graso de corazón, en particular de la zona del epicardio (epi-ADSC) se tiñen significativamente peor que las células madre derivadas de tejido adiposo subcutáneo (sub-ADSC). La aparición de una coloración intensa es indicativa de un mayor grado de diferenciación, por lo que se puede concluir que las células madre derivadas de tejido adiposo cardiaco (epi-ADSC) presentan una menor capacidad de diferenciación hacia adipocito, osteocito y condrocito respecto a las células madre derivadas de tejido adiposo subcutáneo (sub-ADSC).

EJEMPLO 6

Aislamiento y caracterización de células madre derivadas de tejido adiposo

(ADSC) cardiaco humano

1. Materiales y métodos 1.1 Recogida de tejido adiposo cardiaco y cultivo celular

Se obtuvieron muestras de biopsia de tejido adiposo cardiaco de pacientes que se sometieron a cirugía cardiaca antes del inicio de una derivación (bypass) cardiopulmonar. Se tomaron muestras de biopsia de tejido adiposo epicárdico (de alrededor de 0,5 a 1,0 g de promedio) cerca de la base del corazón y alrededor de la arteria aorta. Para la realización de este estudio se utilizaron biopsias de tejido adiposo cardiaco de 117 pacientes (edad: 67,5 ± 9,2 años) que proporcionaron su consentimiento

informado. El estudio fue aprobado por el Comité ético del Hospital de la Santa Creu i Sant Pau.

Las muestras fueron procesadas y aisladas tal como describen Martinez-Estrada, O.M., et al., Human adipose tissue as a source of FIk-I+ cells: new method of differentiation and expansión. Cardiovasc Res 65, 328-33 (2005). Las células adheridas se hicieron crecer hasta subconfluencia en medio α-MEM suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco Invitrogen Corp., Grand Island, NY, EE.UU.) y se cultivaron en condiciones habituales.

1.2 Ensayo clonogénico

Se realizó un ensayo clonogénico siguiendo el protocolo descrito por McFarland [McFarland, D.C. Preparation of puré cell cultures by cloning. Methods CeIl Sci 22, 63- 6 (2000)]. Brevemente, se sembraron células en placas a una densidad de 400 células/ 100 cm ² y se dejó que se desarrollaran los clones individuales hasta que alcanzaron varios milímetros (mm) de diámetro. A continuación, se retiró el medio y se colocaron unos anillos de clonación para rodear la colonia. Se añadió medio completo α-MEM suplementado con 20% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina en los anillos de clonación y se cultivaron las placas en condiciones habituales.

1.3 Evaluación del teratoma

Para evaluar el potencial teratogénico de las ADSC cardiacas humanas, se realizaron inyecciones subcutáneas e intramusculares (1,5 x 10 ⁶ células) a 4 ratones SCID (CB17xC57Bl/6) (30 g, Charles River Laboratories Inc. Willmington, MA, EE.UU.) de 12 semanas de edad. Se examinaron los animales semanalmente para evaluar la formación de tumores. Cuatro meses después de la inyección de células, se recogió piel, músculo esquelético, hígado y bazo y se procesaron para su análisis histológico.

1.4 Ensayos de diferenciación adipogénica y osteogénica Se sometieron a ensayo cultivos celulares primarios expandidos para determinar el potencial adipogénico y osteogénico. Se realizaron ensayos de diferenciación y tinción con rojo de alizarina S tal como ya ha sido descrito previamente [Phillis, B. D., et

al. Modification of d-amphetamine-induced responses by baclofen in rats. Psychopharmacology (Berl) 153, 277-84 (2001); Roura, S. et al. Effect of aging on the pluripotential capacity of human CD 105+ mesenchymal stem cells. Eur J Heart Fail 8, 555-63 (2006)].

1.5 Citometría de flujo

Se recogieron las células en el pase dos y se sometieron a inmunotinción con anticuerpos monoclonales específicos frente a CD 105 (Serotec), CD44, CD 166, CD29, CD90, CDl 17, CD106, CD34, CD45, CD14, CD133 y VEGFR2 (BD Pharmingen). Se definieron los niveles de citometría de flujo de cada antígeno mediante la relación entre el anticuerpo específico y el control de isotipo IgG (Caltag Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.) (1 = sin diferencia). Se utilizó un citómetro de flujo Coulter EPICS XL (Beckman Coulter, Miami, FL, EE.UU.) para adquirir todos los datos y los análisis se realizaron usando el programa Expo32 (Beckman Coulter).

1.6 Ensayo de inmunosupresión

Para analizar el efecto de las ADSC cardiacas sobre la proliferación de linfocitos de sangre periférica (PBL), se sembraron en placas 5 x 10 ³ ADSC cardiacas con 2 x 10 ⁵ PBL y en presencia o ausencia del estímulo apropiado (PHA 5 μg/ml). Se sembraron en placa ADSC subcutáneas del donante Ll 00605 (CMDL) como control para la inmunosupresión. Tras 4 días de estimulación, se añadió BrdU a los medios durante 24 h y se determinó la proliferación mediante ELISA siguiendo las instrucciones del fabricante (CeIl proliferation ELISA BrdU, Roche). El experimento se realizó por triplicado. Los datos se muestran con respecto a la proliferación de PBL sin células progenitoras.

1.7 Análisis de expresión GeneChip

Se aisló el ARN total de ADSC cardiacas en el pase 2 de 4 pacientes diferentes usando el kit de extracción de ARN total QuickPrep (Amersham, Friburgo, Alemania) según las instrucciones del fabricante. Se preparó ARNc a partir de ARN total, se hibridó con los chips Affymetrix HG-U 133 Plus 2.0 y se analizó para determinar los genes expresados de manera diferencial. El procesamiento del microarray GeneChip fue

realizado por el Grupo de Genómica Funcional en el Instituto de Investigación en Biomedicina (Barcelona, España) según los protocolos del fabricante (Affymetrix, Santa Clara, CA) tal como ha sido descrito anteriormente [Virtaneva, K. et al. Expression profiling reveáis fundamental biological differences in acute myeloid leukemia with isolated trisomy 8 and normal cytogenetics. Proc Nati Acad Sci USA 98, 1124-9 (2001)]. Se escanearon las señales de expresión en un GeneArray Scanner de Hewlett-Packard.

El análisis estadístico de los datos se realizó usando R. En primer lugar, se normalizaron los datos sin procesar usando el algoritmo gcRMA puesto en práctica en R, después se filtraron las sondas usando FLUSH [Calza, S. et al. Filtering genes to improve sensitivity in oligonucleotide microarray data analysis. Nucleic Acids Res 35, el 02 (2007)] y se extrajeron los cambios relevantes usando GenePattern [Reich, M. et al. GenePattern 2.0. Nat Genet 38, 500-1 (2006)]. Se compararon los resultados obtenidos con los de un array publicados sobre células derivadas de tejido adiposo subcutáneo no diferenciadas [Tchkonia, T. et al. Identification of depot-specific human fat cell progenitors through distinct expression profiles and developmental gene patterns. Am J Physiol Endocrinol Metab 292, E298-307 (2007)] obtenidos de la base de datos GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/; ID de registro: GDS2366). Para ello, se clasificó cada conjunto de sondas en el array (ambos estudios se realizaron en la misma plataforma) con una estrategia de rango de porcentaje, y después se comparó ese rango de porcentaje entre esos 2 estudios. El uso de un rango de porcentaje en lugar de valores de intensidad permitió librarse de cualquier sesgo sistemático, que habría estado presente en cualquier hibridación.

1.8 RT-PCR cuantitativa en tiempo real

Se aisló el ARN total de ADSC cardiacas y subcutáneas tal como se ha explicado previamente. Se sintetizó ADNc a partir de 2 mg de ARN total usando hexámeros al azar (Qiagen) y el kit ScriptTM One-Step RT-PCR (BioRad Laboratories) según el protocolo del fabricante. Los detalles del protocolo de la RT-PCR cuantitativa en tiempo real se describen a continuación.

Brevemente, se llevaron a cabo amplificaciones mediante PCR en tiempo real con 2 mi de ADNc en un volumen final de 50 μl que contenía 25 mi de mezcla TaqMan

2X Universal PCR Master Mix y 2 mi de cada sonda/cebador marcado con FAM adquiridos a Applied Biosystems (Foster City, CA, EE.UU.): GATA4 (Hs00171403_ml), conexina 43 (Cx43) (Hs00748445_sl), SERCA2 (Hs00544877_ml), troponina I cardiaca (cTn-I) (HsOO165957_ml), α-actinina sarcomérica (Hs00241650_ml), cadena pesada de miosina β (β-MHC) (HsOOl 65276_ml), VCAM-I (Hs00365486_ml), factor de von Willebrand (vWF) (Hs00169795_ml), VE-cadherina (HsOOl 74344_ml), CD34 (Hs00990732_ml), EGR- 3 (Hs00231780_ml), CD102 (Hs00168384_ml), CD36 (HsOO 169627_ml), VEGF-A (HsOOl 73626_ml), EGR-I (HsOOl 52928_ml), CD31 (HsOO 169777_ml), SDF-I (Hs00930455_ml), CXCR-4 (Hs00237052_ml) y gliceraldehído-3 -fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (Hs99999905_ml). Se recogieron los datos y se analizaron en el sistema de detección de secuencias ABI Prism 7000 (ABI). Se analizó cada muestra por duplicado. Se usó el método de ciclo de umbral δ (Ct) (Ct es el ciclo de PCR en el que se detecta por primera vez un aumento en la fluorescencia de indicador por encima del nivel inicial) para calcular la cuantificación relativa de la expresión de cada gen, usando GAPDH como referencia endógena tal como ya ha sido descrito [Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT- PCR. NucleicAcids Res 29, e45 (2001)].

1.9 Extracción de proteínas e inmunotransferencia de tipo Western

Se obtuvieron extracciones de proteínas siguiendo un método ya descrito [Roura, S. et al. Idiopathic dilated cardiomyopathy exhibits defective vascularization and vessel formation. Eur J Heart Fail 9, 995-1002 (2007)]. Los niveles de proteínas fueron normalizados mediante el ensayo de proteínas DC de Bio-Rad (Bio-Rad) con seroalbúmina bovina (BSA), y se separaron las muestras en geles de SDS-PAGE al 5- 10%. Se transfirieron las proteínas sobre membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad), que se examinaron con anticuerpos monoclonales (AcM) específicos frente a GATA4 (1:500), SERCA2 (1:100), α-actina (1:300), cTnl (1:300) (Santa Cruz Biotech.), Cx43 (1:500) (BD Transduction, Lexington, KY, EE.UU.), β-MHC (1 :10) (Chemicon, Temecula, CA, EE.UU.) y α-actina sarcomérica (1:500) (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) respectivamente. Se usó un sistema de detección de quimioluminiscencia potenciada (Amersham Biosciences) para visualizar las bandas de proteínas.

1.10 Tinción con inmunocitofluorescencia

Las células se permeabilizaron, se bloquearon en suero de cabra normal al 5% durante 30 minutos y se marcaron con anticuerpos anti-GATA4, anti-SERCA2, anti- cTnl (2 μg/ml) (Santa Cruz Biotechnology), anti-α-actina sarcomérica (dilución 1 :500) (Sigma), anti-β-MHC (sin diluir) (Chemicon) y anti-Cx43 (2,5 μg/ml) (BD Transduction) durante 1 h a temperatura ambiente. Se aplicaron anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor 488 y Alexa Fluor 568 (5 μg/ml) (Molecular Probes) y se visualizaron las señales con microscopía de barrido láser confocal (Leica TCS SP5).

1.11 Cocultivo de ADSC cardiacas

Se marcaron ADSC cardiacas con eGFP mediante transducción viral tal como se ha descrito anteriormente [Gandía, C. et al. Human dental pulp stem cells improve left ventricular function, induce angiogenesis, and reduce infarct size in rats with acute myocardial infarction. Stem Cells 26, 638-45 (2008)]. Se aislaron cardiomiocitos de rata neonatales mediante dispersión enzimática a partir de ratas recién nacidas (1-3 días de edad) tal como ha sido descrito anteriormente [Fukuhara, S. et al. Direct cell-cell interaction of cardiomyocytes is key for bone marrow stromal cells to go into cardiac lineage in vitro. J Thorac Cardiovasc Surg 125, 1470-80 (2003)]. Se mantuvieron los cardiomiocitos sobre placas recubiertas con gelatina al 2% a una densidad de 5 x 10 células/cm ² en DMEM:M-199 4:1 (Sigma) suplementado con FBS al 5%, suero de caballo al 10% (Invitrogen), penicilina-estreptomicina al 1% y citosina β-D- arabinofuranósido 100 μM (Sigma) para experimentos. Después se mezclaron las ADSC eGFP+ y los cardiomiocitos neonatales en una relación 1 :25 y se sembraron a una densidad celular de 5 x 10 ⁴ células/cm ² . Se cultivaron conjuntamente (coculti varón) ininterrumpidamente las células a 37°C en CO ₂ al 5% en aire durante 30 días.

1.12 Ensayo de diferenciación endotelial

Se expandieron ADSC cardiacas y se analizó la diferenciación endotelial tal como se ha descrito anteriormente [Heydarkhan-Hagvall, S. et al. Human adipose stem cells: a potential cell source for cardiovascular tissue engineering. Cells Tissues Organs

187, 263-74 (2008); Liu, J.W. et al. Characterization of endothelial-like cells derived

from human mesenchymal stem cells. J Thromb Haemost 5, 826-34 (2007)]. Se usó la incorporación de DiI-Ac-LDL (10 μg/ml, Biomedical Technologies) para evaluar la diferenciación endotelial.

1.13 Formación in vitro de estructuras vasculares

Para inducir la rubulogénesis, se sembraron ADSC cardiacas a una densidad de 26.000 células por cm ² sobre placas recubiertas con ECMatrix™ al 1% (Chemicon International) y se comprobó la formación de túbulos a las 2, 4 y 7 horas con isolectina GSLI B4 biotinilada (lectina I B4 de Griffonia Simplicifolia) (Vector Labs). Se usó estreptavidina conjugada con Alexa Fluor 568 (5 μg/ml) (Molecular Probes) para detectar las células marcadas.

1.14 Potencial de vasculogénesis de las ADSC cardiacas

Se obtuvo medio acondicionado a partir de 10.000 células/cm en el pase 2 cultivado con normoxia (O ₂ al 21%), hipoxia moderada (O ₂ al 5%) e hipoxia grave (O ₂ al 1%) durante 24 h. Se analizó la concentración de citocinas angiogénicas usando un inmunoensayo múltiplex (Procarta Cytokine Assay Kit, Panomics). Las citocinas en medio acondicionado analizadas fueron IL- lβ, IL-6, TNF-α, VEGF, PDGF _BB y bFGF.

Se expresaron los resultados como media ± d.e. (pg) de factor secretado por 10 ⁶ células en el momento de la recogida del medio.

2. Resultados

2.1 Aislamiento y caracterización de ADSC cardiacas

Se aislaron satisfactoriamente poblaciones de células madre (progenitoras) en todas las muestras de tejido adiposo cardiaco de los pacientes que se sometieron a cirugía cardiaca, se expandieron en cultivos en monocapa y se caracterizaron (Figura 6).

Aparecieron unas pocas células alargadas similares a fibroblastos unidas tras 3 días en cultivo en las condiciones descritas (Figura 6b).

Estas células son clonogénicas, tienen un tiempo de duplicación (T _d ) de aproximadamente 5 días y no inducen la formación de teratoma en ratones SCID (datos no mostrados). Resulta interesante observar que el cultivo de células madre derivadas de tejido adiposo epicárdico (epi-ADSC) con medios adipogénicos y osteogénicos no dio

como resultado ni la acumulación intracelular de gotitas de lípidos ni la deposición de calcio extracelular (Figura 7a); mientras que, por el contrario, las células madre derivadas de tejido adiposo subcutáneo (sub-ADSC) adquirieron fácilmente un linaje adipogénico (Figura 7b). Se examinó el perfil de marcadores de superficie para caracterizar inmunofenotípicamente las ADSC cardiacas aisladas. Más del 90% de las células expresaron un patrón de tipo mesenquimatoso (MSC). Dichas células resultaron ser fuertemente positivas para CD 105, CD44, CD 166, CD29 y CD90, y débilmente positivas o negativas para CD106, CDl 17, CD34, CD45, CD14 y CD133 y VEGFR2 (Figura 6c).

Adicionalmente, las ADSC cardiacas pudieron inhibir parcialmente la proliferación de linfocitos de sangre periférica (una reducción de la proliferación del 42%), lo que indica una capacidad inmunosupresora moderada de las ADSC cardiacas.

2.2 Diferenciación de linaje cardiomiogénico de las ADSC cardiacas

Se realizó un análisis de microarray GeneChip para analizar el perfil de expresión génica de las ADSC cardiacas. Se compararon los resultados con la expresión génica de células derivadas de tejido adiposo subcutáneo no diferenciadas diferenciar obtenida de la base de datos GEO. Entre los aproximadamente 22.000 genes examinados, se encontró una expresión diferente de algunos marcadores cardiacos dentro de las ADSC cardiacas en comparación con las células madre derivadas de tejido adiposo de origen subcutáneo (Tabla 3).

Usando la RT-PCR cuantitativa en tiempo real (Figura 8), se detectó una expresión muy elevada del factor de transcripción GATA4 y de la conexina 43 (Cx43), una proteína responsable del acoplamiento electroquímico entre cardiomiocitos adyacentes, en las ADSC cardiacas en comparación con las células madre aisladas de tejido adiposo subcutáneo. Los niveles de transcritos para SERCA2, cTnl, α-actinina sarcomérica y β-MHC fueron similares en ambas poblaciones celulares.

A nivel de proteína, en medios de cultivo iniciales, las ADSC cardiacas expresaron β-MHC, SERCA2, α-actina sarcomérica, Cx43 y GATA4 (Figura 9a) y trazas de Tbx5 (datos no mostrados). Los resultados se confirmaron mediante inmunotransferencia de tipo Western (Figura 9a) e inmunofiuorescencia (Figura 9b-9e).

Como puede apreciarse, las fibras de β-MHC ya expresan una distribución citoplásmica definida (Figura 9b). Por el contrario, las ADSC subcutáneas revelaron ausencia de β- MHC, Cx43, cTnl y GAT A4, y una expresión menor de α-actina sarcomérica (Figura 9a). Los cocultivos de ADSC cardiacas humanas y cardiomiocitos de rata neonatales revelaron el potencial cardiogénico de las células humanas analizadas. La intensidad y disposición de β-MHC (Figura 10c), α-actina sarcomérica (Figura 1On), Cx43 (Figura 1Om), SERC A2 (Figura 1Oq) y GAT A4 (Figura 1Or) se potenciaron en cocultivo y fueron comparables a las observadas en los cardiomiocitos neonatales. Lo que es más importante, el cocultivo estimuló la expresión de troponina I, una importante proteína sarcomérica no observada en el cultivo no estimulado (Figuras 10b, 1Of y 1Oj). La disposición en el citoplasma de la troponina I también recordó a la organización sarcomérica subcelular observada en cardiomiocitos en cultivo.

2.3 Diferenciación de las ADSC cardiacas en linaje endotelial en cultivo

Como se ha mencionado previamente, el análisis de microarray GeneChip realizado en ADSC cardiacas y su comparación con células derivadas de tejido adiposo subcutáneo sin diferenciar, reveló una expresión con mayor rango percenrual de genes proangiogénicos en las ADSC cardiacas. Adicionalmente, la expresión de inhibidores de la angiogénesis fue predominantemente baja (Tabla 4).

Para determinar el potencial de linaje endotelial de las ADSC cardiacas humanas, se cultivaron células con medio de diferenciación EGM-2. La comparación de los niveles de transcritos endoteliales en células tratadas y no tratadas (control) reveló un aumento de la expresión de los marcadores endoteliales CD34, VEGF-α, VCAM-I, VE-cadherina, ERG-I , ERG-3, CD31 y SDF- 1 (Figura 11 ). Resulta interesante observar que el factor SDF-I, que favorece la migración de células progenitoras endoteliales y potencia la vasculogénesis, experimentó un aumento de la expresión de 120 veces [Yamaguchi, J. et al. Stromal cell-derived factor- 1 effects on ex vivo expanded endothelial progenitor cell recruitment for ischemic neovascularization. Circulation 107, 1322-8 (2003); Zhang, M. et al. SDF-I expression by mesenchymal stem cells results in trophic support of cardiac myocytes after myocardial infarction. Faseb J 21, 3197-207 (2007)], mientras que CD31, ERGl y ERG3 aumentaron más de 15, 10 y 16

veces, respectivamente. Además, también se demostró la diferenciación endotelial de estas células mediante la rápida incorporación y metabolización de DiI-Ac-LDL [Voyta, J. C. et al. Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein. J CeIl Biol 99, 2034-40 (1984)] (Figura Hb).

Adicionalmente, se realizó un ensayo angiogénico funcional para verificar la capacidad de las ADSC cardiacas para diferenciarse en linaje endotelial. Tras cultivar las células en un recubrimiento de Matrigel y condiciones habituales, se formaron estructuras tubulares. Estas estructuras se desarrollaron rápidamente para formar una red tubular, creciendo en su organización y en su diámetro (Figuras 1 Ic-I le). También se tiñeron para detectar el marcador específico endotelial isolectina GSLI B4 (Figuras 1 If y Hg)-

2.4 Las ADSC cardiacas secretan factores proangjogénicos Se analizó la secreción in vitro de factores proangiogénicos en condiciones de hipoxia para someter a prueba si las ADSC cardiacas podrían secretar estos factores en el tejido huésped cuando se inyectasen en el miocardio isquémico y así potenciar la formación de vasos. En normoxia, las células secretaron cantidades significativas de IL- 6 (53.677 ± 24.613 pg/ml/10 ⁶ células) y VEGF (3.201 ± 1.011 pg/ml/10 ⁶ células), y ligeras cantidades de bFGF (161,0 ± 31,2 pg/ml/10 ⁶ células) y TNF-α (59,1 ± 16,0 pg/ml/10 ⁶ células). No se detectó expresión de IL- lβ ni de PDGF _BB - En hipoxia moderada (O ₂ al 5%) y grave (O ₂ al 1 %), hubo un aumento notable de la secreción de VEGF (92%; p=0,04), y las concentraciones de IL-6, bFGF y TNF-α aumentaron en aproximadamente un 20%. Los niveles de IL- lβ y PDGF _BB permanecieron indetectables.

EJEMPLO 7 El trasplante de ADSC cardiacas mejora la función cardiaca tras el infarto de miocardio 1. Materiales y métodos

1.1 Modelo de infarto de miocardio y trasplante de células

1.1.1 Rata

Se usaron un total de 16 ratas desnudas macho (200-250 g; mK-Foxnl ^rnu ', Charles River Laboratories inc. Willmington, MA, EE.UU.) para el estudio. Se realizó la ligación de la arteria coronaria izquierda tal como se ha descrito anteriormente [Gandía, C. et al. Human dental pulp stem cells improve left ventricular fixnction, induce angiogenesis, and reduce infarct size in rats with acute myocardial infarction. Stem Cells 26, 638-45 (2008)]. Las ratas fueron entubadas y anestesiadas con una mezcla de (VSevorane y ventiladas mecánicamente (ventilador para animales pequeños Harvard Apparatus modelo 683), y, tras la toracotomía, se indujo un infarto de miocardio agudo mediante ligación permanente de la arteria coronaria LAD con proleno 6-0. Se cerró la incisión con una sutura con seda 3-0. Al cabo de una semana, las ratas fueron anestesiadas y se volvieron a abrir mediante esternotomía media para efectuar el trasplante intramiocárdico (10 ⁶ células ADSC cardicas-GFP suspendidas en solución salina o un volumen igual de solución salina) en 5 inyecciones de 5 μl de volumen en 5 puntos de la zona límite del infarto con una jeringuilla Hamilton. Al cabo de 30 días, aproximadamente, desde la inyección de células, se pararon los corazones en diástole con una solución de parada (NaCl 68,4 mM, KCl 59 mM, glucosa 11,1 mM, NaHCO ₃ 1,9 mM, BDM 29,7 mM (2,3-butanediona-monoxima), heparina 1.000 U), se escindieron, se fijaron, se crioconservaron en sacarosa al 30% en PBS, se embebieron en OCT (Sakura, Torrance, California, EE.UU.) y se congelaron instantáneamente en isopentano enfriado con nitrógeno líquido. Se almacenaron bloques de tejido a -80 ⁰ C hasta que fueron seccionados.

En todo el proceso se siguieron las normas de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio ("Guide for the Care and Use of Laboratory Animáis") del Instituto de Investigación con Animales de Laboratorio ("Institute of Laboratory Animal Research") (NIH Pub. N° 86-23, revisado en 1996).

1.1.2 Ecocardiografía

Para evaluar la función cardiaca, se realizó una ecocardiografía transtorácica en ratas tal como ya ha sido descrito anteriormente [Friedrich, J. et al. 3 IP nuclear magnetic resonance spectroscopic imaging of regions of remodeled myocardium in the infarcted rat heart. Circulation 92, 3527-38 (1995)]. Se usó un sistema ecocardiográfico

(General Electrics) equipado con un transductor de red lineal de 10 MHz, y se tomaron

mediciones en el nivel inicial (1 día antes del infarto) y 15 y 30 días tras el trasplante de células. Se realizaron ecocardiografías en modo M y en dos dimensiones (2-D) papilar central en la vista del eje corto paraesternal. Se calcularon los parámetros funcionales sobre cinco ciclos cardiacos consecutivos usando métodos convencionales [Litwin, S. E., Katz, S.E., Morgan, J.P. & Douglas, P.S. Serial echocardiographic assessment of left ventricular geometry and function after large myocardial infarction in the rat. Circulation 89, 345-54 (1994)].

Se cuantificaron las dimensiones de la pared anterior y posterior (AW y PW) en diástole y sístole, las dimensiones del LV en la diástole final (LVDd) y sístole final (LVDd), área diastólica final (EDA) y área sistólica final (ESA). Se calcularon los cambios en AW y PW como (AWs/AWd-l)xl00 y (PWs/PWd-l)xl00, respectivamente. Se calculó el acortamiento fraccional (FS) como [(LVDd- LVDs)/LVDd]xl00 y Ia fracción de eyección (EF) como [(LVEDV- LVESV)/LVEDV]xl00.

1.2 Morfometría

1.2.1 Rata

Se cortaron transversalmente corazones de rata en tres segmentos: ápice, medio (que contiene la ligación) y base. Para las mediciones, se riñeron criosecciones en serie de 10 μm de espesor (6 secciones, separadas 200 μm) del segmento medio con tricromo de Masson y se determinaron los parámetros morfométricos usando un software de análisis de imágenes (ImageJ, NIH). Se midió el tamaño de infarto como porcentaje del área cicatrizal media en la superficie de pared del LV total. Se calculó el espesor del infarto mediante la suma de las áreas de infarto endocardiacas parciales [Takagawa, J. et al. Myocardial infarct size measurement in the mouse chronic infarction model: comparison of área- and length-based approaches. J Appl Physiol 102, 2104-11 (2007)]. Se examinaron todas las secciones de manera ciega y se fotografiaron usando un estereoscopio Leica (Leica TL RCI).

1.2.2 Histología inmunofluorescente

Se realizaron inmunotinciones dobles en criosecciones de corazón de rata. Se incubaron los tejidos con los anticuerpos primarios frente a CD31 (1:25) (Abcam) y α-

actina sarcomérica (dilución 1:500) (Sigma) o cTnl (2 μg/ml) (Santa Cruz Biotechnology). Para la detección inmunohistológica de células humanas en corazón de rata, se incubaron las secciones de tejido con anticuerpo anti-antígeno nuclear humano (HNA, Chemicon). Se usaron anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 y Alexa Fluor 647 (5 μg/ml) (Molecular Probes). Se contratiñeron las secciones con 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Sigma) y se analizaron con Leica TCS SP5.

1.2.3 Densidad capilar Para determinar la densidad capilar en zonas límite del infarto y en miocardio distal del infarto, se tifteron secciones de corazón usando isolectina GSLI B4 biotinilada (Vector Labs). Se usó estreptavidina conjugada con Alexa Fluor 568 como sistema de detección. Se contaron los capilares en, al menos, 12 campos seleccionados aleatoriamente (6 zonas límite + 6 zonas distales) en 4 animales control y 5 tratados. Los resultados se expresaron como número capilar medio por superficie de tejido en mm ² . Dos observadores independientes de manera ciega al tratamiento analizaron el grupo control y tratado con un coeficiente de correlación entre clases (ICC) de 0,821 en la zona límite (p < 0,001) y 0,743 en la zona distal (p < 0,001). Teniendo en cuenta que los valores obtenidos por los investigadores fueron similares, el resultado final de cada punto fue la media ± e.e.m.

1.2.4 Análisis estadístico

Todas las secciones se examinaron de manera ciega, se contaron y se revisaron por dos de los investigadores. Se estimó la significación estadística de los datos de FS, EF y AWT mediante análisis de la varianza (ANOVA bilateral) para comparación múltiple entre grupos y se aplicó la corrección de Greenhouse. Se realizó la comparación de parámetros ecocardiográficos en el IM y a los 30 días (Tabla 5) y los valores morfométricos entre el grupo control y con células usando la prueba de la t. Los resultados se presentaron como media ± d.e. También se compararon las diferencias en la densidad capilar entre los grupos control y con células en las zonas límite y distal usando la prueba de la t. Se consideró que los valores de p <0,05 eran significativos entre grupos. Se realizó la estadística descriptiva con SPSS.

uu uü 4ϋ

2. Resultados 2.1 El trasplante de ADSC cardiacas mejora la función cardiaca tras el infarto de miocardio Se obtuvieron parámetros ecocardiográficos de grupos control y de ADSC cardiacas en el nivel inicial, tras un infarto de miocardio (IM), y hasta 30 días tras la inyección de células en ratas desnudas (Tabla 5). En el nivel inicial y tras el IM, los valores de los parámetros ecocardiográficos analizados fueron similares en animales tratados y sin tratar, lo que indica niveles comparables de lesión tisular. Tras el IM, se detectó una mejora funcional significativa en el grupo tratado entre el IM y los 30 días (Tabla 5). La evolución del grupo control mostró un deterioro progresivo de los parámetros de la función cardiaca debido a la remodelación del ventrículo izquierdo (LV), determinado mediante los diámetros y las áreas diastólicas finales y sistólicas finales del LV (Tabla 5). Usando el sistema ANOVA bilateral se encontraron diferencias significativas entre los grupos control y tratado con células en el acortamiento fraccional (p=0,024) y la fracción de eyección (p=0,003) (Figura 12a y 12b). Además, la pared anterior era significativamente más espesa al cabo de 30 días del tratamiento con ADSC cardiacas (p=0,014) (Figura 12c). La grabación en vídeo de la movilidad cardiaca mostró una mejora en la contractilidad en el grupo de ADSC cardiacas pero no en el grupo control.

2.2 El trasplante de ADSC cardiacas reduce el tamaño del infarto

Se usaron secciones transversales teñidas con tricromo de Masson para medir los parámetros morfométricos en los modelos de rata de EVI. Se desarrolló una cicatriz moderada tras la ligación de la LAD (aproximadamente 20% del área del LV), y el efecto beneficioso de las ADSC cardiacas fue muy notable. El porcentaje del área de tejido cicatrizal fibroso fue un 75% inferior en animales tratados en comparación con los controles y la pared del LV fue un 45% más espesa en animales tratados. Por tanto, las ADSC cardiacas reducen eficazmente el tamaño del infarto medido mediante histopatología al cabo de 30 días desde la inyección de ADSC cardiacas.

2.3 Injerto de ADSC cardiacas humanas y diferenciación in vivo

Se analizó el injerto de ADSC cardiacas humanas rastreando la epifluorescencia de eGPF y se demostró el origen humano mediante detección de HNA (antígeno de núcleos humanos) (señal roja) (Figura 14a). Adicionalmente, se confirmó la señal específica de eGFP mediante análisis espectral de separación de tinte (exploración lambda) (Figura 15). Resulta interesante observar que las células se localizaron uniformemente dentro del área cicatrizal del tejido independientemente de que la inyección se dirigiese a la zona límite del infarto, lo que indica la capacidad de las células para migrar hacia donde pueden ser especialmente necesarias (Figura 14b). Con el fin de analizar el nivel de diferenciación cardiaca y endotelial de las células inyectadas y su injerto en el tejido huésped, se realizó una doble inmunotinción frente a marcadores cardiacos (α-actinina sarcomérica y troponina I) y endotelial (CD31). Las ADSC cardiacas-eGFP+ volvieron a mostrar expresión de troponina I (Figura 14b) y fueron positivas para la α-actinina sarcomérica (Figura 14c). También se observó expresión de CD31 en las ADSC cardiacas-eGPF+-, que se dispusieron a lo largo del tejido formando estructuras tubulares, lo que sugiere que estas células contribuyen a la formación de nuevos vasos (Figura 14d).

2.4 Aumento de la densidad capilar por las ADSC cardiacas Finalmente, se usó isolectina GSLI B4 para evaluar la densidad capilar en las zonas límite del tejido fibrótico y a distancia tras el trasplante de ADSC cardiacas. Tal como se ilustra en la Figura 16c, la densidad capilar en la zona límite fue 1,6 veces mayor en los animales que recibieron ADSC cardiacas que en los controles (p=0,003) (Figuras 16a y 16b) y también se encontró una tendencia hacia el aumento de la densidad capilar en las zonas distales (p=0,057). La presencia de células sanguíneas en su lumen indica que estos vasos eran funcionales.

3. Discusión

Los resultados mostrados en los Ejemplos 1-7 que acompañan a esta descripción ponen de manifiesto que se ha identificado y caracterizado una nueva población de células madre adultas derivadas de tejido adiposo cardiaco (ADSC cardiacas). Dichas

ADSC cardiacas expresan marcadores de superficie similares a células madre mesenquimatosas (MSC) y conservan la capacidad clonogénica y, aunque proceden del

tejido adiposo, no se diferencian en adipocitos como lo hacen las MSC, lo que indica una menor plasticidad y un mayor estado asignado. Además, las ADSC cardiacas expresan varios marcadores cardiomiogénicos esenciales, tales como GAT A4, Cx43, β- MHC, α-actinina sarcomérica, o SERCA2. La comparación de la expresión génica y de proteínas cardiomiogénicas en ADSC cardiacas y subcutáneas reveló que la expresión de estas proteínas era notablemente superior en las ADSC cardiacas. Estos resultados sugieren que las nuevas ADSC cardiacas, a pesar de residir en un entorno adipocítico, pueden tener una función en la homeostasis cardiaca. La grasa que rodea al corazón también puede funcionar como reserva de células para la renovación del tejido de miocardio; no obstante, la gran cantidad de miocardio puesto en peligro que se produce tras un infarto supera la capacidad homeostática de reparación tisular.

Cuando las ADSC cardiacas se encontraban bajo la influencia de cardiomiocitos de rata neonatales, la expresión de los marcadores cardiomiogénicos fue significativamente regulada al alza (α-actinina sarcomérica, β-MHC, SERCA2) o activada de novo (troponina I). Estudios anteriores demostraron que el mecanismo mediante el cual los cardiomiocitos neonatales estimulaban la diferenciación cardiaca podía ser la secreción de factores de diferenciación, interacciones entre células y estimulaciones eléctricas y mecánicas. Además, el cultivo de ADSC cardiacas en Matrigel o en un medio de diferenciación endotelial condujo a la formación de estructuras tubulares, a la incorporación de DiI-Ac-LDL y a la potenciación de la expresión de marcadores endoteliales. Experimentos in vivo también demostraron la capacidad de las ADSC cardiacas para diferenciarse en linajes de células cardiacas. Cuando se trasplantaron a miocardio infartado, se observó que dichas ADSC cardiacas expresaban α-actinina sarcomérica, cTnl y CD31 y se injertaron eficazmente dentro del miocardio. Las interacciones celulares junto con la influencia eléctrica y mecánica del tejido estimularon su diferenciación. El trasplante de células dio como resultado una función cardiaca mejorada, aumentándose significativamente la fracción de eyección, el acortamiento fraccional y el espesor de pared del LV en animales tratados con células. Los efectos beneficiosos de las ADSC cardiacas fueron superiores o iguales a los observados por células de médula ósea [Agbulut, O. et al. Comparison of human skeletal myoblasts and bone marrow-derived CDl 33+ progenitors for the repair of infarcted myocardium. J Am CoIl Cardiol 44, 458-63 (2004)] y células madre cardiacas

adultas [Beltrami, A.P. et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. CeIl 114, 763-76 (2003)] con una mejora de la fracción de eyección del 7 y el 9,7% respectivamente, o células mononucleares de sangre de cordón umbilical [Henning, RJ. et al. Human umbilical cord blood mononuclear cells for the treatment of acute myocardial infarction. CeIl Transplant 13, 729-39 (2004)] que mostraron una reducción de la fracción de eyección del 27% cuando se trasplantaron en miocardio infartado.

Con el fin de determinar si las ADSC cardiacas podrían sobrevivir en un tejido isquémico y favorecer la angiogénesis, se cultivaron células en condiciones hipóxicas moderadas y graves, y se analizó la secreción de factores proangiogénicos al medio. Los resultados revelaron un aumento en los niveles de VEGF, TNF-β, bFGF e IL-6 en comparación con la normoxia. Se ha notificado que, cuando se suministró un único factor angiogénico a pacientes con enfermedad arteriosclerótica, la respuesta de neovascularización sólo fue moderada. Una posible explicación de ese resultado podría ser que la formación de la red de vasos y su expansión es un proceso que requiere la acción de múltiples factores que actúan de una manera sinérgica. Por tanto, la secreción de una combinación de factores proangiogénicos por las ADSC cardiacas en condiciones básales y su aumento en situaciones hipóxicas hace que estas células sean potencialmente útiles para su inyección en miocardio isquémico. De hecho, se observó un claro aumento en la densidad capilar tras el trasplante de ADSC cardiacas en el corazón infartado. Todo esto, conjuntamente, sugiere que estas células (ADSC cardiacas) pueden ejercer un efecto paracrino en el miocardio isquémico favoreciendo la formación de nuevos vasos. Un gran número de capilares mejora las limitaciones de oxígeno en el miocardio, favoreciendo así tal reducción significativa en los tamaños de infarto, del 43% en ratas. Además, hay informes que muestran que un aumento de SDF- 1 puede mejorar la supervivencia de cardiomiocitos e inducir la neovascularización tras un infarto [Penn, M. S. & Mangi, A. A. Genetic enhancement of stem cell engraftment, survival, and efficacy. Circ Res 102, 1471-82 (2008)]. Por tanto, la demostración del linaje endotelial in vivo de ADSC cardiacas y la considerable sobreexpresión de SDF-I observada tras la diferenciación endotelial in vitro sugieren que SDF-I podría tener un efecto cardioprotector sobre los cardiomiocitos así como un efecto angiogénico.

Resulta notable observar que, aunque las ADSC cardiacas se inyectaron en la zona límite del infarto, las células se localizaron dentro de la cicatriz fibrótica. Este hecho indica su capacidad para migrar desde el sitio de la inyección hacia áreas isquémicas, en donde pueden ser especialmente necesitadas. Experimentos anteriores usando otros linajes de células madre demostraron resultados similares, que se explicaron por una respuesta de migración celular debida al efecto quimiotáctico del VEGF en condiciones hipóxicas [Gandía, C. et al. Human dental pulp stem cells improve left ventricular function, induce angiogenesis, and reduce infarct size in rats with acute myocardial infarction. Stem Cells 26, 638-45 (2008); Matsushita, K. et al. The role of vascular endothelial growth factor in human dental pulp cells: induction of chemotaxis, proliferation, and differentiation and activation of the AP-1-dependent signaling pathway. J Dent Res 79, 1596-603 (2000)]. En el mismo orden de evidencias, un estudio realizado en embriones de pollo mostró que la lesión cardiaca es un potente estímulo para la atracción de células madre derivadas de sangre de cordón umbilical humanas [Torre-Pérez, N. et al. Migration and differentiation of human umbilical cord stem cells after heart injury in chicken embryos. Stem Cells Dev (2008)].

El tejido adiposo cardiaco está íntimamente dispuesto alrededor del corazón y la accesibilidad a las ADSC cardiacas constituye un inconveniente. Aunque podría realizarse fácilmente una toracotomía lateral izquierda para obtener biopsias de grasa cardiaca para el aislamiento de estas ADSC cardiacas, este enfoque no parece clínicamente aplicable en el entorno de urgencia de un infarto de miocardio, aunque podría usarse antes de la cirugía de derivación (bypass) de las arterias coronarias en pacientes isquémicos estables. Sin embargo, el hecho de que las ADSC cardiacas presenten una capacidad inmunosupresora similar a la descrita para otros tipos de células madre mesenquimatosas genera la posibilidad de un futuro uso terapéutico alogénico de estas células.

En resumen, se describe un nuevo tipo de células madre (progenitoras) con potencial endotelial y cardiaco inherente, que puede diferenciarse en linajes de células cardiacas in vitro e in vivo, ejerciendo un efecto funcional e histopatológico beneficioso cuando se inyectan en miocardio dañado tras un IM. Aunque no se desea estar vinculado por ninguna teoría, se cree que podría existir un doble mecanismo de atenuación de la remodelación, en el que las células tienen el potencial de sustituir a los

cardiomiocitos y a las células endoteliales perdidas y también ejercen un efecto paracrino en la potenciación de la angiogénesis. Estas propiedades, junto con la capacidad de inmunosupresión y la ausencia de teratogenicidad, hacen que las ADSC cardiacas sean candidatos prometedores y seguros para su futuro uso en la terapia celular para regenerar el miocardio dañado.

Tabla 3 Perfiles de expresión de genes cardiacos en ADSC cardiacas y subcutáneas

„. , Nombre _ . .. Rango percentil

ID de gen , . Descripción

⁶ del gen ^r Cardiaco Sub

201058 A_ ^at MRLC-2 Cadena ligera 2 reguladora de miosina, isoforma de músculo liso (RLC de miosina). 100 97

20 I667_ _at Cx43 Conexina 43 99 97

209186 _. _a ^ι SERCA2 ATPasa 2 de calcio sarcoplásmica/de retículo endoplasmático (EC 3.6.3.8). 99 96

202555 _s_at MLCK Cinasa de cadena ligera de miosina, músculo liso (EC 2.7.11.18). 92 87

203216 _s_at Miosina VI Miosina VI (miosina VI no convencional). 91 72 OO

213201 _. _s_at cTnT Troponina T, (troponina T de músculo cardiaco). 85 53

Proteína 1 que contiene el dominio de repetición de anquirina (proteína de repetición de anquirina

206029 _. _at cAnquirina 84 26 cardiaca) (proteína nuclear inducible por citocina) (C- 193).

203017 _s_at ADIP Proteína de unión a afadina y alfa-actinina (ADIP) (proteína de interacción con SSX2). 79 22

209904 _at TN-C Troponina C, músculos cardiaco y esquelético lento. 75 21

CAE3/BAE Proteína 3 de intercambio aniónico (proteína similar a la banda 3 neuronal) (miembro 3 de la familia 4 de

205918 _at 3 72 21 portadores de solutos) (proteína similar a la banda 3 cardiaca / cerebral).

207961 _x_at MCH-I l Miosina 11 (cadena 11 pesada de miosina) (cadena pesada de miosina, isoforma de músculo liso). 62 35

Proteína de unión a ácidos grasos, cardiaca (H-FABP) (proteína de unión a ácidos grasos de

205738_s_at H-FABP 62 34 tipo cardiaco).

217660_at MHC- 14 Miosina 14 (cadena 14 pesada de miosina) (cadena Hc pesada de miosina no muscular) (NMHC H-C). 58 14

1553131_a_at GATA4 Factor de transcripción GAT A-4 (factor 4 de unión a GATA). 56 43*

21533 l_at MHC- 15 Miosina 15 (cadena 15 pesada de miosina). 56 6

205940_at MHC-3 Miosina 3 (cadena 3 pesada de miosina) (cadena pesada de miosina embrionaria muscular) (SMHCE). 55 36

203861_s_at α-Actinina-2 Alfa-actinina-2 (isoforma 2 de músculo esquelético de alfa-actinina). 52 12

214365_at Tropomiosina-3 Cadena alfa-3 de tropomiosina (tropomiosina 3) (tropomiosina gamma) (hTM5). 50 40

ID de gen 2055l7_at. Variante de corte y empalme diferente

--4

^• o

Tabla 4 Perfiles de expresión de genes angiogénicos en ADSC cardiacas y subcutáneas

Rango

ID de gen Nombre del gen Descripción percentil Cardiaco Sub

202729_s_at TGF-bl-BP-1 Proteina 1 de unión a factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-betal -BP-I) 99 92

212171_x_at VEGF-A Precursor A del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF-A). 98 75

209946_at VEGF-C Precursor C del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF-C) 98 93

Precursor del miembro 21 de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral

218856_at TNF-a (receptor 6 de muerte relacionado con TNFR) (receptor 6 de muerte). 97 57 OO O

208944_at TGFR-2 Precursor de receptor tipo 2 de TGF-beta (receptor tipo II de TGF-beta) (TGFR-2) 97 95

212196_at IL-6R-b Precursor de la subunidad beta del receptor de interleucina 6 (IL-6R-beta) 94 87

204352_at α-Actinina-2 Factor 5 asociado con el receptor de TNF (proteína 84 de dedo RING). 94 62

Factor TNF-a ucido por Factor del factor de necrosis tumoral alfa inducido por lipopolisacáridos (factor de

200706_s_at ind TNF-alfa inducido por LPS) 94 39 LPS

209687_at SDF-I Precursor de factor 1 derivado de células del estroma (SDF-I) (CXCL 12) 90 79

220407_s_at TGF-b-2 Precursor del factor de crecimiento transformante beta 2 (TGF-beta-2) 87 19

201693_s_at EGR-I Proteína 1 de respuesta temprana al crecimiento (EGR-I) 86 18

205227_at Auxiliar de IL-IR Precursor de proteína auxiliar del receptor de interleucina 1 (proteína auxiliar del receptor de IL-I) 85 60

Precursor Precursor de proteína TSG-6 inducible por factor de necrosis tumoral (proteína del gen 6

206025_s_at 84 1 de TSG-6 estimulada por TNF)

215561_s_at IL- IR-I Precursor de receptor tipo I de interleucina 1 (IL- IR-I) 84 71

209543_s_at CD34 Precursor de antígeno CD34 de células progenitoras hematopoyéticas 82 5

220406_at TGF-b-2 Precursor del factor de crecimiento transformante beta 2 (TGF-beta-2). 78 31

39402_at IL-I b Precursor de interleucina 1 beta (IL-I beta) (Catabolina). 76 64

205992_s_at IL-15 Precursor de interleucina 15 (IL- 15) 74 19

OQ

202859_x_at IL-8 Precursor de interleucina 8 (IL-8) (CXCL8) 68 73

218658_s_at IL- 17RB Precursor del receptor B de interleucina 17 (receptor B de IL- 17) 65 5

204677_at VE-cadherina Cadherina endotelial vascular (cadherina VE) (antígeno CD 144). 64 25

Antígeno diferenciador de leucocitos (CD36) (receptor de colágeno de plaquetas) (translocasa

206488_s_at CD36 de ácidos grasos) (FAT) 59 39

208982_at CD31 Precursor de molécula de adhesión plaqueta-célula endotelial (PECAM-I) (antígeno CD31). 55 55

217028 at CXCR-4 Receptor SDF-I (CXCR-4) 53 46

2021 12_at vWF Precursor del factor de von Willebrand (vWF) 27 22

207539_s_at IL-4 Precursor de interleucina 4 (IL-4) 23 25

204912_at IL-10R-A Precursor de la cadena alfa del receptor de interleucina 10 (IL-10R-A) 20 8

207160_at IL-12A Precursor de la subunidad alfa de interleucina 12 (IL- 12A) 32 23

206999_at IL-12R-b2 Precursor de la cadena del receptor beta 2 de interleucina 12 (IL-12R-beta2). 17 25

210904_s_at IL-13R-a-l Precursor de la cadena del receptor alfa I de interleucina 13 (IL-13R-alfa-l) 64 85

206295_at IL- 18 Precursor de interleucina 18 (IL-18) 46 50

2191 l5_s_at IL-20R-a Precursor de la cadena del receptor alfa de interleucina 20 (IL-20R-alfa). 60 32 oo K)

Potenciadores de la angiogénesis: VEGF, TNFa, TGF-b, ILl, IL6, IL7, IL8, IL15, IL23, IL19. Inhibidores de la angiogénesis: IL4, ILlO, IL12, IL13, IL18, IL20, IL24.

Tabla 5 Datos ecocardiográficos

SOLUCIóN SALINA (n=6) ADSC cardiacas (n=10)

Valor de p Valor de p de IM IM ISd 3Od de IM

IM 15d 3Od frente a frente a 3Od 3Od

AW diástole (mm)

1,10 ±0,52 1,03+0,27 1,18 ±0,24 n.s. 0,98 ±0,36 1,17 ±0,43 1,30 ±0,31 0,047

AW sístole (mm)

1,50 ±0,55 1,53 ±0,43 1,57 ±0,36 n.s. 1,38 ±0,68 2,03 ± 0,84 2,19 ±0,60 0,011

PW diástole (mm)

1,43 ±0,29 1,47 ±0,31 1,52 ±0,29 n.s. 1,44 ±0,32 1,35 ±0,32 1,67 ±0,62 n.s.

PW sístole (mm)

2,02±0,40 2,25 ±0,46 1,90 ±0,35 n.s. 2,29 ± 0,44 2,08 ± 0,27 2,49 ± 0,60 n.s.

LV diástole (mm)

6,53 ± 0,43 7,12 ±0,52 7,55+0,60 0,007 7,19 ±0,58 6,97 ± 0,56 7,59 ± 0,64 n.s. oo

LV sístole (mm)

4,77 ±0,25 4,95 + 0,51 5,35 ±0,75 n.s. 5,11 ±0,45 4,57 ± 0,62 5,02 ±0,75 n.s.

EDA (mm ² )

0,36 ±0,08 0,40 ± 0,03 0,45 ±0,04 0,022 0,42 ±0,05 0,45 ± 0,06 0,42 ± 0,06 n.s.

ESA (mm ² )

0,20 ± 0,03 0,20 ±0,01 0,24 ± 0,03 0,027 0,27 ± 0,05 0,25 ± 0,09 0,22 ±0,07 n.s.

FS (%)

28,47 ±6,10 30,52 ±2,99 29,64 ± 7,28 n.s. 28,87 ±4,05 34,59 ±5,18 34,13 ±4,98 0,018

EF (%)

60,59 ±5,84 66,25 ±4,10 63,67 ± 8,35 n.s. 63,69 ±6,57 71,55 ±6,38 70,98 ±6,31 0,021

Cambio de AW (%)

40,48 ± 15,92 47,54 ± 10,84 32,08 ± 8,56 n.s. 36,74 ±22,19 71,08 ±34,87 68,32 ± 28,77 0,013

Los valores son medias ± d.e. AW indica el espesor de la pared anterior; PW, el espesor de la pared posterior; LV, la dimensión interna del ventrículo izquierdo;

EDA, el área diastólica final; ESA, el área sistólica final; FAC, el cambio en el área fraccional; FS, el acortamiento fraccional; EF, la fracción de eyección.