Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung und Abtrennung von exocellulären Proteinen aus Fermenterbrühen. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Abtrennung der Enzyme in fester Form, wobei Färb- und Geruchsstoffe entfernt werden.

Zahlreiche Enzyme, insbesondere Hydrolasen wie beispielsweise Proteasen, Amylasen oder Lipasen, werden durch Fermentation von Mikroorganismen her¬ gestellt. Geeignete Mikroorganismen und Herstellverfahren sind beispiels¬ weise in den folgenden Patenten bzw. Patentanmeldungen beschrieben: DE 1800 508, DE 22 24 777, DE 25 51 742, US 3827 938, WO 88/01293, DE 1807 185, US 3 740 318, DE 2334463, DE 2026092, EP 0232 169, EP 0220 921, EP 0247 647 und EP 0246 678.

Für zahlreiche Anwendungen, z.B. für den Einsatz der Enzymlösungen in Flüssigwaschmitteln sind stark färbende oder riechende Beimengungen nicht tolerierbar. Bei der technischen Herstellung der Enzyme versucht man daher die Verunreinigungen durch Fällungsverfahren abzutrennen. Bisher bekannt gewordene Fällungsverfahren haben jedoch den Nachteil, daß zur Erzielung einer guten Farbqualität erhebliche Ausbeuteverluste in Kauf genommen werden müssen.

Um diesen Schwierigkeiten zu begegnen, wird in der deutschen Patentanmel¬ dung P 39 11 099.0 ein Fällungsverfahren beschrieben, bei dem man eine durch Fermentation hergestellte Enzy lösung mit einem Maskierungsmittel versetzt und hernach e ne Fällung erzeugt, indem man in beliebiger Rei¬ henfolge zwei wasserlösliche, sich gegenseitig fällende, ionische Verbin¬ dungen zugibt, und gewünschtenfalls weitere Adsorptionsmittel wie z.B. Aktivkohle zufügt.

In der deutschen Patentanmeldung DE 38 21 151 wird vorgeschlagen, zur Ge¬ ruchsminderung und farblichen Verbesserung Fermenterbrühen und/oder En¬ zymlösungen mit reduzierenden Zusätzen zu bearbeiten.

Ein ähnl ches Verfahren wird in der deutschen Patentanmeldung P 39 30 284.9 beschrieben. Dort wird vorgeschlagen, daß man als selektive Adsorptionsmittel Zellen von Pilzen, Pflanzen und/oder Bakterien oder Zellwandstücke der o.g. Organismen einer Fermenterbrühe zusetzt. Auch die deutsche Patentanmeldung P 39 15277.4 beschreibt ein ähnliches Verfahren. Vorgeschlagen wird über einen pH-Wert zwischen 5 und 11 der Enzymlösung eine saure wäßrige Lösung eines Aluminiumsalzes sowie gewünschtenfalls zusätzliche Fällungsmittel zuzusetzen, wasserlösliche Bestandteile abzu¬ trennen und nach der Fällung ein Maskierungsmittel, wie eine Säure des Bors oder dergleichen zuzugeben.

Allen genannten Verfahren liegt die Idee zugrunde, die störenden Bestand¬ teile an die Oberfläche eines Adsorptionsmittels zu binden oder mit der in-situ erzeugten Fällung eines Adsorptionsmittels mitzufallen, so daß eine Enzymlösung mit verbesserter Reinheit zurückbleibt. Zwar können nach diesen Verfahren sehr saubere Enzymlösungen hergestellt werden, doch sinkt die Enzymausbeute naturgegebenermaßen mit steigendem Einsatz, so daß in jedem Falle ein Kompromiß zwischen guter Qualität und guter Quantität eingegangen werden muß.

Es ist jedoch bereits bekannt, Proteine aus Fermenterlösungen durch Aus¬ fällen nicht der störenden Beimengungen, sondern der Proteine selbst ab¬ zutrennen. Bei Einsatz der üblichen Fällungsmittel in den üblichen Kon¬ zentrationen werden dabei aber die Verunreinigungen mit gefällt, so daß die gewünschte Reinheit so nicht zu erzielen ist.

Der Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, daß eine Kon- zentrationsfällung von Proteinen, insbesondere von Hydrolasen, dann mög¬ lich ist, wenn man durch eine vorhergehende Behandlung mit einem Adsorp¬ tionsmittel gewisse offenbar in Fermenterbrühen all gegenwärtige Stoffe, die die Konzentrationsfällung verhindern, abtrennt.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Abtrennung von exocellulären Proteinen von Mikroorganismen aus einer filtrierten Fermenterbrühe, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer ersten Stufe

Stoffe, die die Proteinfällung behindern, mit Hilfe eines festen Adsorp¬ tionsmittel entfernt, die verbleibende Lösung auf einen Proteingehalt von etwa 30 bis 40 Gew.-% konzentriert und dann das Protein bei pH-Werten zwischen 6 und 10 ausfallen läßt und abtrennt, wobei gewünschtenfalls Fäl¬ lungsmittel für Proteine zur Beschleunigung des Ausfallens zugesetzt wer¬ den können.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es zahlreiche Proteine aufzureini- gen, die durch Fermentation von Mikroorganismen erzeugt und als exocellu- läre Proteine in den Fermenterbrühen vorliegen. So kann es insbesondere für die Enzymherstellung verwendet werden, so beispielsweise für die Her¬ stellung von Proteasen, Amylasen, Cellulasen, Xylanasen, Pentosanasen oder Lipasen. Eine besondere Eignung zeigt das Verfahren bei der Herstellung von Proteasen, insbesondere von alkalischen Proteasen wie Serinproteasen.

Die für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten Fermenterlösungen stam¬ men vorzugsweise aus der Kultivierung von Mikroorganismen wie Bakterien oder Pilze, insbesondere aus der Kultivierung von Bacillus-Stämmen, so beispielsweise von Stämmen von Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus oder dergleichen.

Gemäß der Erfindung werden die Fermenterbrühen zunächst mit einem Adsorp¬ tionsmittel behandelt. Dazu wird das Adsorptionsmittel in Mengen von typischerweise 0,5 bis 10 Gew.-%, bezogen auf Proteinlösung, zugegeben. Geeignete Adsoprtionsmittel sind beispielsweise silikatische Adsorptions¬ mittel wie Schichtsilikate, insbesondere Bentonite. Unter den Bentoniten eignen sich bevorzugt säureaktivierte Bentonite. So kann als besonders bevorzugte Bentonite ein säureaktivierter Bentonit mit einer Montmorillo- nit-Kennzahl von 70 und einer Feinheit von 93 % kleiner 100 μ eingesetzt werden.

Neben oder anstelle der Bentonite können als Fällungs ittel auch Alumini¬ umoxidhydrate oder allgemein gesprochen Aluminiumsalze eingesetzt werden, die bei dem um den Neutralpunkt liegenden pH-Bereich der Proteinlösungen

abtrennbare Fällungen ergeben. Als Aluminiumsalze sind Aluminiumhydroxy- chloride bevorzugt. Unter dieser technischen Bezeichnung werden erfin¬ dungsgemäß Chlorhydroxyverbindungen des Aluminiums verstanden, z.B. (Al2(0H)5Cl) mit 2 bis 3 mol ^" Kristallwasser. Bevorzugte Materialien sind hier technische Qualitäten, wie sie z.B. zur Wasserreinigung Verwendung finden. Weiter geeignet sind andere wasserlösliche Aluminiumsalze, die bei Anheben des pH-Werts in den Neutralbereich Fällungen von Aluminiumhydroxy¬ den bilden. Die erfindungsgemäß eingesetzten Aluminiumsalze werden den En¬ zymlösungen in Form von sauren wäßrigen Lösungen beigegeben. Diese sauren Lösungen weisen einen pH-Wert um 3 bis 4 und eine Konzentration zwischen 10 und 50 Gew.-% auf. Weiter haben sich Lösugen mit einem Gehalt um 20 Gew.-% als günstig erwiesen. Darüber hinaus kann Aluminiumhydroxychlorid auch in Pulverform direkt in die Enzymlösungen eingerührt werden. Dies ist jedoch weniger bevorzugt.

Beim Fällungsvorgang sollen die Enzymlösungen einen pH-Wert zwischen 5 und 11, vorzugsweise zwischen 5 und 8, aufweisen, da außerhalb dieser pH-Gren¬ zen zum einen die Enzymstabil tät beeinträchtigt werden kann, zum anderen das Fällungsmittel teilweise wieder in Lösung gehen könnte. Der Fachmann hat daher darauf zu achten, daß bei Zugabe des Fällungsmittels der pH-Wert .nicht unter 5 absinkt. Dies kann beispielsweise durch Zugabe von alkali¬ schen Lösungen, z.B. von Natron- oder Kalilauge, verhindert werden. Auch die Zugabe von Pufferlösungen ist denkbar, muß jedoch auf das Fällungsmit¬ tel abgestimmt werden.

Die einzusetzende Menge an Aluminiumsalz richtet sich nach dem zu erzie¬ lenden Reinigungsgrad. Für viele technische Anwendungen dürften Mengen von 1 bis 5 Gew.-% bevorzugt sein, jedoch werden bereits mit geringeren Ein¬ satzmengen Reinigungseffekte erzielt, z.B. ab 0,5 Gew.-%. Höhere Einsatz- meπgen z.B. bis zu 10 Gew.-% sind möglich, dürften sich aber vielfach aus wirtschaftl chen Gründen verbieten.

Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann auch mit unlös¬ lichen Calciumsalzen gefällt werden. Bevorzugt ist die Erzeugung von Calci- u phosphaten in-situ in den Proteinlösungen.

Dabei wird bevorzugt das Verhältnis des Calciumsalzes zum Verhältnis des Salzes der Phosphorsäure so gewählt, daß das Molverhältnis Calcium zu Phosphor zwischen 1,7 und 2,5 : 1 beträgt. Dabei hat sich herausgestellt, daß unter diesen Bedingungen Calciumphosphate mit überwiegend amorpher Struktur und großer Oberfläche entstehen, die für die hier zu fällenden farblichen Verunreinigungen günstige Adsorptionsmittel darstellen. Die Fällungsmittelmenge, bezogen auf Enzymlösung, beträgt üblicherweise 0,5 bis 20 Gew.-%.

Ein weiteres Adsorptionsmittel, das neben oder anstelle der genannten Ad¬ sorptionsmittel verwendet werden kann, ist Aktivkohle.

Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann den Enzymlösungen vor oder nach der Fällung ein Maskierungsmittel zugesetzt werden. Bevor¬ zugt ist der Zusatz des Maskierungsmittels vor der Fällung, da dabei ge¬ ringere Verluste an Enzymaktivität erhalten werden.

Als Maskierungsmittel können zum einen Säuren des Bors und schwefelige Säuren sowie deren Alkalimetallsalze zugesetzt werden. Die zuzusetzenden Mengen betragen 0,5 bis 5 Gew.-%, vorzugsweise 1 bis 3 Gew.-%, bezogen auf Enzymlösungen, wobei sich größere Mengen in erster Linie aus wirtschaft¬ lichen Gesichtspunkten verbieten. Geeignete Säuren des Bors sind die Bor¬ säure, die Metaborsäure und/oder die Pentaborsäure. Geeignete Alkalime¬ tallsalze sind daher insbesondere Natriumborat, Natriummetaborat, Borax oder Natriumpentaborat. Weiterhin geeignet ist das Natriumsulfit.

Als. weitere Maskierungsmittel können zusammen mit den vorgenannten oder anstelle derselben Dicarbonsäuren und/oder Hydroxycarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen eingesetzt werden. Bevorzugt sind die Hydroxydicarbonsäuren, insbesondere Zitronensäure, Weinsäure und deren Isomere. Die Zusatzmenge beträgt 1 bis 5 Gew.-%. Auch hier verbieten sich höhere Zusatzmengen, in erster Linie aus wirtschaftlichen Gesichtspunkten und nicht wegen Nach¬ lassen der technischen Effekte.

Am Ende der Behandlung mit dem Adsorptionsmittel wird die Enzymlösung auf¬ konzentriert. Dabei ist es bevorzugt, den Proteingehalt auf 40 bis 50

Gew.-% einzustellen. Der pH-Wert der Zubereitung sollte in der Nähe des Neutralpunkts liegen. Es ist bevorzugt, den pH zwischen' 7,5 und 9 einzu¬ stellen. Dies gilt für Hydrolasen und insbesondere Proteasen ganz beson¬ ders.

Für die Herstellung der konzentrierten Enzymlösungen stehen dem Fachmann eine Reihe von Verfahren zur Verfügung. So kann dabei die Mikrofiltration und/oder Ultrafiltration eingesetzt werden, und es können dann die erhal¬ tenen Enzymlösungen vorher oder anschließend durch Abdestiliieren von Was¬ ser unter vermindertem Druck, etwa in einem Dünnschichtverdampfer, auf noch höhere Konzentrationen gebracht werden. Nach einem ganz besonders bevorzugten Verfahren v-Hrd zunächst durch Mikrofiltration und Ultrafil- tratioπ vorgerefnigt, dann gefällt und schließlich durch Eindampfen kon¬ zentriert. Dabei werden die Mikrofiltations- und Ultrafiltrationsstufen insbesondere so ausgeführt, wie sie in der deutschen Patentanmeldung DE 37 30 868 beschrieben sind. Diese Patentanmeldung beschreibt ein Ver¬ fahren zur Abtrennung von biotechnologisch hergestellten Wertstoffen aus einer Fermenterbrühe durch Querstrom Mikro- und/oder Ultrafiltration, bei dem pro Stufe wenigstens zwei hintereinander geschaltete, mit porösen Mem¬ branen bestückte Module verwendet werden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß an jedem Modul permeatseitig ein unterschiedlicher Überdruck gegenüber dem Umgebungsdruck angelegt wird. Zur Durchführung dieses Verfahrens be¬ dient man sich vorzugsweise bei der Mikrofiltration einer Überströmungs¬ geschwindigkeit von mehr als 4 m/sec und setzt anorganische Materialien wie Aluminiumoxid, Siliciumcarbid oder Zirkoniumdioxid auf einem Träger als Membranwerkstoffe ein.

Die nach den bisher geschilderten Stufen des erfindungsgemäßen Verfahrens zubereiteten konzentrierten Proteinlösungen werden schließlich einem Fäl¬ lungsschritt unterzogen. Vorzugsweise läßt man dabei das Protein ohne Zu¬ gabe weiterer Stoffe durch Abkühlen der Lösung in die Nähe des Gefrier¬ punkts und/oder durch Stehenlassen ausfällen. So ist es in vielen Fällen ausreichend, wenn die Lösung auf + 5°C abgekühlt wird und über Nacht ohne weiteres Zutun gelagert wird.

Selbstverständlich ist es möglich, die konzentrierte Proteinlösung auch durch Zusatz von Proteinfällungsmitteln zu behandeln und dadurch die Pro¬ teine auszufällen. Diese Vorgehensweise ist jedoch nicht so sehr bevor¬ zugt. Als Proteinfällungsmittel können beispielsweise lösliche Alkalime- tallsalze in Mengen von 1 bis 5 Gew.-% oder wassermischbare organische Lösungsmittel in Mengen von 5 bis 20 Gew.-% oder wasserlösliche Polymere in Mengen von 0,1 bis 5 Gew.-% eingesetzt werden. An löslichen Alkalime- tallsalzen sind Natriumchlorid, Natriumsulfat, Calciumchlorid und der¬ gleichen bevorzugt und hier zu nennen. Geeignete wassermischbare Lösungs¬ mittel sind mono- und difunktionelle Alkohole wie beispielsweise Ethylen- glykol, Propylenglykol oder auch Methanol, Ethanol oder Aceton. Geeignete wasserlösliche Polymere sind Polyethylenglykol oder Polyacrylamid.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen gefällten Proteine können in üblicher Weise weiterverarbeitet werden. So können daraus wä߬ rige oder wäßrig-organische Proteinlösungen, beispielsweise Enzymkonzen¬ tratlösungen hergestellt werden. Andererseits ist auch die Konfektio¬ nierung zu Festprodukten möglich, in dem man die gefällten Proteine trocknet oder zusammen mit Zuschlagstoffen beispielsweise zu festen Enzymzubereitungen konfektioniert.

B e i s p i e l e

Beispiel 1

Durch Fermentation eines Bacillus lieheniformis-Stammes, der eine exocellu- läre Protease von Bacillus lentus erzeugt, wurden 200 1 einer Fermenter¬ brühe mit einer spezifischen Proteaseaktivität von 34850 HPE/g hergestellt und wie folgt weiterverarbeitet.

Mikrofiltration

Apparat:

Typ Rohrmodule

Pilot-Anlage 2S151, Fa. TECHSEP, Frankreicn

F lterflache 2 x 3,4 m ² (2 Module in Reihe)

Membranmaterial Typ M14, Zirkonoxid auf Graphit

Trenngrenze 0,14 μ

Betriebsbedingungen:

Arbeitstemperatur 40 °C pH im Retentat 8 mit 30%iger NaOH eingestellt

Retentatüberströmung 4,8 m/s (= 75 m ³ /h Umlauf) Retentatzulauf 1000 1/h mittlerer Trans- wurde für jedes Modul durch membrandruck 0,5 bar Korrektur des Permeatdrucis eingestellt

Zusatz des Fällungsmittels:

Ein Aluminiumoxidchloridhydrat (Handelsname L0CR0N ( ^R )) wurde in Mengen von 50 g/1 der Proteaselösung zugesetzt. Mit Natronlauge wurde ein pH-Wert von 8,0 eingestellt.

Vorverdünnung:

Die 200 1 Kulturlösung wurden zur Verringerung des Feststoffgehaltes und der Viskosität mit 140 1 Salzlösung (NaCl Gewerbesalz, techn. 90%) verdünnt.

Salzkonzentration 10 g/1

Verdünnung 7 0,59

Diafiltration:

Unter Beibehalten des eingestellten Konzentrierungsfaktors 7 = 0,59 wurden insgesamt 850 1 Salzlösung (NaCl) zum Retentat nachdosiert.

Salzkonzentration 10 g/1 relatives Diafiltratvolumen 4.25 1/1 Per eatstromdichte 29 l/m ² h

Aufkonzentrierung:

Abschließend wurde das Retentat bis auf 170 1 eingeengt.

Konzentrierung 7 1-2

Ergebnis:

Insgesamt fielen aus Diafiltration und Aufkonzentrierung 1020 1 en- zymhaltiges Per eat an.

spezifische Proteaseaktivität 4520 HPE/g

ültrafiltration

Apparat:

Typ M llipore Spiralmodul

Filterfläche 5.6 m2

Membranmaterial Polysulfon

Trenngrenze 10000 Dalton

Betriebsbedingungen:

Arbeitstemperatur 25°C

Rententatzulauf 2500 1/h mittl. Transmembrandruck 1 bar

Aufkonzentrierung:

Die Aufkonzeritrierung wird bis auf ca. 30 1 vorgenommen. Dies ent¬ spricht einer Volumenreduktion um den Faktor 34, bzw. verglichen mit der Ausgangsmenge Kulturlösung

Kortzentrierung 7 . 6-6

Die Permeatstromdichte sinkt während der Aufkonzentrierung von 20 l/m2h auf 5 l/m h.

Ergebnis:

30 1 Konzentrat spezifische Proteaseaktivität 112000 HPE/g.

Thermische Aufkonzentrierung

Apparat:

Typ Dünnschichtverdampfer

Centritherm

CT1B-2, Fa. oc-Laval

Heizfläche 0.09 M ² Verdampferleistung 50 kg/h (Wasser)

Betriebsbedingungen:

Primäre Dampftemperatur 80°C sekundäre Dampftemperatur 35°C sekundärer Dampfdruck 0.01 bar

Die Leistung des Apparates liegt bei 12 kg/h (Zulauf).

Aufkonzentrierung:

Die Aufkonzentrierung erfolgte über das übliche Maß hinaus. Auf die Ausgangsmenge wurde eine Volumenreduktion von über 40 erreicht.

Konzentrierung in der Stufe 7 6

Ergebnis:

4.9 kg DSV-Konzentrat mit

Trockensubstanz 42.4 % Proteaseaktivität 755000 CPE/g.

Das opak trübe Dünnschichtverdampferkonzentrat wurde über Nacht bei

5°C stehen gelassen. Es entstand ein weißer in einer Filternutsche abtrennbarer Niederschlag, der sich als ausgefälltes Enzymprotein erwies.

HPE-Einheiten:

Bei der standardisierten HPE-Methode wird die Protease mit denatu¬ riertem Casein bei 50°C, pH 8,5 über 15 Minuten inkubiert, überschüs¬ siges Substrat durch Trichloressigsäure ausgefällt und die Ex¬ tinktion des alkalisierten Überstandes bei 290 nm gemessen (lösliche aromatische Peptide). Nach Standardbedingungen entsprechen 0,5 Ex¬ tinktionseinheiten 10 HPE. Die HPE-Methode ist mit der Anson-Methode vergleichbar.

Enzymaktivitätseinheit CPE:

Das Testprinzip basiert auf dem prσteolytischen Abbau von N,N-Di- methylcasein in Natrium-Sulfit-Lösung bei 50°C und anschließender Farbreaktion der freigesetzten Aminogruppen mit Trinitrobenzolsul- fonsäure. Der Farbkomplex wird bei 425 nm photometrisch quantifi¬ ziert und gegen einen Proteasestandard ausgewertet.