CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención pertenece al campo de la Biología molecular y la Biomedicina, y más concretamente al campo de la proctología en relación al diagnóstico, pronóstico y tratamiento del cáncer colorrectal. Se establece una asociación entre esta tipología de cáncer y una firma de metilación asociada a los genes ZNF543, ZNF3970S y/o TMEM106A en pacientes con diferentes grados de obesidad, abriendo las puertas a nuevas herramientas de diagnóstico, pronóstico y terapias personalizadas. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El cáncer colorrectal (CCR) es una de las formas más comunes de cáncer, ocupando la tercera posición en el mundo en cuanto a número de fallecimientos anuales relacionados con cáncer. Existen numerosas evidencias que relacionan el desarrollo de cáncer y la probabilidad de muerte, con factores de riesgo conductuales y dietéticos tales como ingesta reducida de frutas y verduras, índice de masa corporal (IMC) elevado, falta de actividad física y consumo de alcohol y tabaco.

En la actualidad la obesidad es uno de los principales problemas de salud pública en el mundo occidental, y su prevalencia ha ido aumentando constantemente en las últimas décadas. Diferentes estudios sugieren que la obesidad en un factor oncogénico de primer orden y que más del 20% de todos los cánceres están relacionados con ella (Calle et al. N Engl J Med 2003; 348(17): 1625-38). En el caso del cáncer colorrectal la relación con la obesidad ha sido bien documentada, y aunque el mecanismo que gobierna esta relación está aún bajo discusión, los estudios realizados se centran en mutaciones genéticas, vía de señalización de la insulina y factores de crecimiento similares a la insulina, inflamación crónica, y niveles alterados de adipocinas (Zheng et al. Tumour Biol 2017; 39(3): 1010428317695020). Sin embargo, la influencia del exceso de masa corporal en el riesgo de muerte por cáncer no ha sido caracterizada completamente.

En un estudio prospectivo de cohortes, la obesidad antes del diagnóstico de CCR se asoció con peor supervivencia en comparación con el pre-diagnóstico de peso normal (Campbell et al. J Clin Oncol 2012; 30(1): 42-52). Además, en otro estudio publicado se sugiere que la obesidad es un factor pronóstico negativo, asociándose a una disminución de la supervivencia entre los pacientes de CRC tratados con cirugía (Parekh et al. Annu Rev Nutr 2012; 32: 311-42). Sin embargo, estudios recientes ponen de manifiesto algunos resultados contradictorios respecto a la asociación entre el IMC y el pronóstico del cáncer colorrectal (Freisling et al. Br J Cáncer 2017; 1 16(11): 1486-1497).

La metilación de ADN es uno de los mecanismos epigenéticos que influyen en la transcripción de genes, la estructura de la cromatina, la estabilidad genómica y la inactivación de genes improntados y del cromosoma X. La metilación se produce preferentemente en dinucleótidos citosina-guanina (formándose una metilcitosina), que cuando se ubica en regiones promotoras del gen se asocia con el silenciamiento transcripcional. De hecho, la metilación anormal de los promotores de los genes supresores de tumores es común en diversos cánceres, por lo que la utilización de la metilación de ADN como biomarcador en oncología clínica es una herramienta prometedora, especialmente para el desarrollo de marcadores moleculares de diagnóstico y pronóstico, y como nuevas dianas terapéuticas (Laird PW. Nat Rev Cáncer 2003; 3(4): 253-66; Sharma et al. Carcinogenesis 2010; 31 (1): 27-36). Aunque la contribución epigenética al CCR se ha estudiado extensamente en los últimos treinta años, todavía hay mucho que no entendemos acerca de cómo las medidas antropométricas se asocian con diferentes subconjuntos moleculares de esta enfermedad. La mayoría de estos trabajos se centraron en el estudio de la función que desempeña la metilación del ADN, ya que los cánceres colorrectales generalmente muestran una hipometilación del genoma que ocurre en fases tempranas de la progresión del adenoma-carcinoma (Elliott et al. Cell Mol Life Sci 2015; 72(21): 4139- 56). Estudios de asociación del genoma completo (GWAS) para evaluar la susceptibilidad de los genes y disease modifiers podrían ofrecer nuevas respuestas a todos los interrogantes que plantea el CCR. De hecho, el establecimiento de diferencias de riesgo potencial entre subtipos moleculares de CCR podría conducir a un mejor entendimiento de la enfermedad, y consecuentemente a una mejor prevención y tratamiento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Un primer aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, predicción y/o pronostico del desarrollo de cáncer colorrectal en individuos, de ahora en adelante primer método de la invención, que comprende determinar en una muestra biológica el perfil de metilación de ADN en al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en ZNF543, ZNF3970S y TMEM106A. Preferiblemente el gen seleccionado es ZNF543 y/o ZNF3970S, y aún más preferiblemente ZNF543.

En una realización más preferida de este aspecto de la invención, la determinación del perfil de metilación comprende determinar la presencia o ausencia de metilación de ADN en dos o más islas CG (CGI) o CpG del gen definidas como:

- orilla (shore), para cada una de las secuencias de 2 kb que flanquean una isla CpG o CGI;

- arrecife (shelf) para cada una de las secuencias de 2 kb junto a una orilla; y

- mar abierto (open sea), para el ADN no incluido en ninguna de las secuencias anteriores, y que la metilación se produzca en el promotor (1 ^o exón, 5°UTR, 1500/200 upstream) y/o se evaluó la asociación potencial entre el IMC y los niveles de metilación del ADN (valores β) mediante la prueba del coeficiente de Spearman.

Preferiblemente la muestra biológica es una muestra de tejido tumoral colorrectal. En otra realización preferida los individuos presentan un índice de masa corporal igual o superior a 25.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, el perfil de metilación del ADN se mide por un método seleccionado del grupo que consiste en secuenciación con bisulfito y método basado en bisulfito (por ejemplo, RRBS, secuenciación con bisulfito, Infinium, GoldenGate, COBRA, MSP, MethyLight), pirosecuenciación, o cualquiera de sus combinaciones.

Otro aspecto de la invención se refiere a método para predecir y/o pronosticar el desarrollo de cáncer colorrectal que comprende los pasos del primer método de la invención y además comprende asignar a los pacientes con presencia de metilación al grupo de individuos con diferentes IMCs con más o menos riesgo de padecer cáncer colorectal. Preferiblemente, los pacientes con mayor presencia de metilación se asocian con un peor pronóstico en el desarrollo de la enfermedad.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, el perfil de metilación del ADN se mide por un método seleccionado del grupo que consiste en secuenciación con bisulfito y método basado en bisulfito (por ejemplo, RRBS, secuenciación con bisulfito, Infinium, GoldenGate, COBRA, MSP, MethyLight), pirosecuenciación, o cualquiera de sus combinaciones. Un kit o dispositivo, de ahora en adelante kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos y/o reactivos necesarios para identificar el perfil de metilacion de ADN de los genes ZNF543, ZNF3970S y/o TMEM106A. Preferiblemente de los genes ZNF543 y ZNF3970S, y aún más preferible del gen ZNF543. Más preferiblemente, el kit o dispositivo comprende cebadores y sondas específicos para determinar la presencia o ausencia de metilacion, y/o calcular el nivel de metilacion expresado como valor β, para determinar la presencia o ausencia de metilacion de ADN en dos o más islas CG (CGI) o CpG del gen definidas como:

- orilla (shore), para cada una de las secuencias de 2 kb que flanquean una isla CpG o CGI;

- arrecife (shelf) para cada una de las secuencias de 2 kb junto a una orilla; y

- mar abierto (open sea), para el ADN no incluido en ninguna de las secuencias anteriores, donde la metilacion se produzca en el promotor (1 ^o exón, 5°UTR, 1500/200 upstream). Otro aspecto se refiere al uso del kit o dispositivo de la invención para el diagnóstico, predicción y/o pronóstico de cáncer colorrectal en un individuo. Preferiblemente el individuo presenta un índice de masa corporal igual o superior a 25.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método de selección de agentes terapéuticos útiles para cáncer colorrectal, de ahora en adelante método de selección de agentes terapéuticos de la invención, que comprende los pasos de:

(a) establecer el perfil de metilacion de ADN de los genes ZNF543, ZNF3970S y/o TMEM106A en células de una muestra de tejido de cáncer colorrectal.

(b) enfrentar una sustancia o composición de potencial valor terapéutico a células de cáncer colorrectal cuyo perfil de metilacion de ADN fue establecido en el paso (a) (c) establecer el perfil de metilacion de ADN de los genes ZNF543, ZNF3970S y/o TMEM106A de las células tratadas en el paso (b)

(d) comparar el perfil de metilacion de ADN obtenido en los pasos (a) y (c), asignando un valor terapéutico a aquellos compuestos o composiciones que reduzcan la metilacion de ADN definida en el paso (a). Preferiblemente el paso c) comprende establecer el perfil de los genes ZNF543 y ZNF3970S, y aún más preferible del gen ZNF543. En otra realización preferida de este aspecto los pasos (a) y (c) consisten en determinar la presencia o ausencia de metilación de ADN en dos o más islas CG (CGI) o CpG del gen definidas como: - orilla (shore), para cada una de las secuencias de 2 kb que flanquean una isla CpG o CGI;

- arrecife (shelf) para cada una de las secuencias de 2 kb junto a una orilla; y

- mar abierto (open sea), para el ADN no incluido en ninguna de las secuencias anteriores, y/o calcular el nivel de metilación expresado como valor β.

Otro aspecto se refiere a una sustancia o composición obtenida, de ahora en adelante sustancia o composición de la invención, obtenida u obtenible mediante el método de selección de agentes terapéuticos de la invención.

Otro aspecto se refiere a la sustancia o composición de la invención para su uso en medicina.

Otro aspecto se refiere a la sustancia o composición de la invención para su uso en el tratamiento del cáncer colorrectal.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han identificado un perfil de metilación de ADN diferencial en muestras tumorales de colon de personas obesas que, dadas las características de este grupo de pacientes en términos de riesgo de padecer la enfermedad y supervivencia, se presenta como una herramienta con capacidad de diagnóstico, predicción y/o pronóstico para el CCR. En particular, los autores han identificado un perfil diferencial de metilación en sitios CpG asociados a los genes ZNF543, ZNF3970S y TMEM106A. También han demostrado como cambios en la metilación de estos genes se traducen en cambios en la expresión de los mismos.

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere al uso de los genes ZNF543, ZNF3970S y/o TMEM106A, o cualquiera de sus combinaciones, o de sus productos de expresión, para la detección, diagnóstico, predicción y/o pronóstico del CCR, o para seguir la eficacia de un tratamiento para esta enfermedad. El término "ZNF543" ó "zinc finger protein 543" como se usa aquí se refiere a un gen que codifica un conjunto de proteínas miembro de la familia de las proteínas denominadas "dedos de zinc". ZNF543 pertenece a la familia de Kruppel asociada a la caja (KRAB) que contienen proteínas dedo de zinc, que funcionan como factores de transcripción.

A no ser que se indique lo contrario, cuando se utiliza en el presente documento el término "ZNF543", se refiere tanto al gen como a la proteína "ZNF543" humana. En el contexto de la presente invención, ZNF543 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína ZNF543, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 2, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 2. en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína ZNF543. Entre otras posibles secuencias nucleotídicas que codifican ZNF543 se encuentra, pero sin limitarse, la SEQ ID NO: 1.

Gene ID: 125919

Localización del gen: 19q13.43 SEQ ID NO: 1

AGGATTGGCCCTGGAACAGTGTGGGGCCTGGACCGCTGGGTAGGCGCGTCCAG CGGCCTGAGCAGGGGAGGGTAATGAGGCTGTTACGCGCCTTCTCCGCATCTTGG CGGGAGCCTGACGCCCCGCTTCTTCCCTAACGGGGTGTTCCACCGGCGCCTGCC GAGGCCTAGGCCTCCGCAGCCGCCCTCCGTCTCCTCAGCCCCGACGCTGCGCC CGCTTTGTGCGCATTTTTCTCTGGGGAAACTGAGGCTCCGAGTGCGAAAGTCAGC CGAGGTCGCCCCGCCCAGGACAGAGAAGGGCTGGGGGTCGGCTGAGCCGCGG CATTCCCGGGCCCCGCTAGGGCTGCAGGGTCTCAGGATGGCAGCCTCGGCGCA GGTGTCTGTGACCTTTGAGGATGTGGCTGTGACATTCACCCAGGAGGAGTGGGG ACAGTTGGATGCAGCCCAGAGAACCTTGTATCAGGAGGTGATGCTGGAGACCTG CGGACTTCTCATGTCTCTGGGCTGTCCTTTGTTCAAACCAGAGCTGATCTACCAGT TGGATCACAGACAGGAGCTATGGATGGCTACAAAAGACCTCTCCCAAAGCTCCTA TCCAGGTGACAACACAAAACCCAAGACCACAGAGCCTACCTTTTCTCACCTGGCC TTGCCTGAGGAAGTCTTACTCCAGGAACAACTGACACAAGGAGCCTCAAAGAACT CCCAATTAGGGCAATCCAAGGATCAGGATGGGCCATCTGAAATGCAAGAAGTCCA CTTGAAAATAGGGATAGGCCCCCAGCGGGGGAAGCTGCTGGAGAAAATGAGTTC TGAACGTGATGGTTTGGGGTCAGATGATGGTGTATGTACAAAGATTACACAGAAA CAAGTTTCAACAGAAGGTGATCTCTATGAATGTGATTCACATGGACCAGTTACAGA TGCCTTGATTCGCGAAGAGAAAAATTCCTATAAATGTGAGGAATGCGGGAAAGTG TTTAAAAAGAATGCCCTCCTTGTTCAGCATGAACGGATTCACACTCAAGTGAAGCC CTATGAATGCACAGAGTGTGGGAAAACCTTTAGCAAGAGCACTCATCTTCTTCAGC ACCTCATCATCCACACTGGGGAGAAGCCCTATAAGTGCATGGAGTGTGGGAAGG CTTTTAACCGCAGGTCACACCTCACACGGCACCAGCGGATTCACAGTGGAGAGAA GCCTTATAAGTGCAGTGAATGTGGAAAGGCCTTCACCCACCGCTCCACTTTTGTC TTGCATCACAGGAGCCACACTGGAGAAAAACCCTTTGTGTGCAAAGAGTGTGGCA AAGCCTTTCGAGATAGGCCAGGTTTCATTCGACACTACATCATCCACACGGGAGA GAAGCCCTATGAGTGCATTGAGTGTGGGAAGGCCTTCAACCGCCGGTCATACCTC ACGTGGCACCAACAGATTCACACTGGAGTGAAACCCTTTGAATGCAACGAGTGTG GAAAAGCTTTTTGCGAGAGTGCAGACCTCATTCAACACTACATTATCCACACTGGG GAGAAGCCCTATAAGTGCATGGAGTGTGGGAAGGCGTTCAACCGTAGGTCACAC CTCAAGCAGCATCAACGGATTCACACTGGGGAGAAGCCTTATGAATGCAGTGAAT GTGGAAAGGCCTTCACCCACTGCTCCACTTTTGTCTTGCATAAAAGGACCCACAC AGGAGAAAAACCCTATGAATGCAAAGAATGTGGAAAAGCCTTTAGTGATAGGGCA GACCTCATTCGCCACTTCAGCATCCACACTGGAGAGAAACCCTATGAGTGCGTGG AGTGTGGAAAGGCCTTCAACCGCAGCTCACACCTCACGAGGCACCAACAGATTCA CACTGGAGAGAAACCCTATGAATGCATCCAGTGTGGGAAAGCCTTTTGCCGGAGC GCAAACCTTATTCGACACTCCATCATTCACACTGGAGAGAAGCCGTATGAATGCA GTGAGTGTGGAAAGGCTTTTAATCGCGGCTCATCCCTCACACATCATCAAAGGAT TCATACTGGGAGAAACCCTACCATTGTAACAGATGTGGGAAGACCTTTTATGACTG CACAGACTTCAGTCAACATCCAGGAACTTTTATTAGGGAAAGAGTTTTTGAATATC ACCACTGAAGAAAATCTGTGGTGAAAGGGAACATCTTACCATCTGGCCATTCACA CTGAAGAGAAACTTCATAAGCATCCTCTCTTTGAGAAAACGTGTAATAGATGATCA TTTGTCGTCTAAACAATCAAGTTAGAAATTGAACCAGCCTGGAGTCTTATTCTCCA CCTGAGAATTCACCCATGAGAGAGACCCAGTGGTTGCTATGCACTTAGGAAAACT TTCAGCCACATCTTTCTTCTTAGTTTACAGTGAAATATTATCTCAGGGATATTTTTTT TTTTTTTTTGAGACGGAGTCTCGCTCTGTCGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCGGG ATCTCGGCTCACTGCAAGCTCCGCCTCCCGGGTTCACGCCATTCTCCTGCCTCAG CCTCCCAAGTAGCTGGGACTACAGGCACCCGCCACTACGCCTGGCTAATTTTTTG TATTTTTAGTAGAGACGGGGTTTCACCGTTTTAGCCGGGATGGTCTCGATCTCCTG ACCTCGTGATCCGCCCGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTGAG CCACCGCGCCCGGCCATCTCAGGGATATTTAAACAAAGGAAGAGGAAATATAGGG AAGAGAAAGAAACCACAGCTTCTTTTAGACTTGTCTGACAAGCCTATGGCAATTTT GTCGTCCCTTTGTTATTTTATGTGGGAGAGGGAAATGTTTCAGAAACGAAAGATCT CATCCCCTTTATTTTTCTGTGTATGCATTCACTGCTGCCCAGTGTCAGAACAGTTAT ACAAACGAGGGCTTGAAAACATTTTGTGAAAACTTGCTTAGTCCTGCAACGTTCTC CACTCTCGAGGTGCAGAAGCATACATCTTTATAAAAAATATGGAGGCTTGAGTTAT GAAACACTTTTATAAGGAGATAAGGATGTACATATGTTTGGACACATTGTCCACTT CAGATGCTTGTTTAAAAAAATGTTTCACCATGTGTCTTTACCCAATACACATACTTT TTCTTGATGTGGATTTACTTTTTTTTTTTTTTTTTAAGTTTTCCTGGGATAGGGATGA TAGTGTAATTGTTCATGCCCACAGTAATCCTGGGAATCTTAGTTTTTTCCTATGATT GTGGTTTCTCAGCTTCTTTACCTCTCCTTTGAGTTAGGTCCACCTCAGTTTTCTAAA GGTCAAATTAAGGCCCCCCCAAAAATACAGTATGTAGCTGAATTCCTTTGAAAGAT CATGATAAACTCAGAAGAACAAACATAGAAGGAATGTCATTTTTAATCTTTTTAAAG AGTGTGTGAAAATTCACTTTAACTGGAATTTTAACAGGCAAGCCGGCATGCATATA TGTAGGGATGTGTGACTTTCACAGTTGTCACCATGGACTTAGGCTTGATTAAAATG CTACACATTTAGAGCGTTTTGTAATTCCTTTTTTATATTTTTAAGACTAGATTTTGAG CCATGTGATAGTTTTACCTCATATTAAATATATTGTACAGAAGTAAAAATAATCATG TATTCACTTTGAACTCCTC

SEQ ID NO: 2 MAASAQVSVTFEDVAVTFTQEEWGQLDAAQRTLYQEVMLETCGLLMSLGCPLFKPEL IYQLDHRQELWMATKDLSQSSYPGDNTKPKTTEPTFSHLALPEEVLLQEQLTQGASK NSQLGQSKDQDGPSEMQEVHLKIGIGPQRGKLLEKMSSERDGLGSDDGVCTKITQK QVSTEGDLYECDSHGPVTDALIREEKNSYKCEECGKVFKKNALLVQHERIHTQVKPYE CTECGKTFSKSTHLLQHLIIHTGEKPYKCMECGKAFNRRSHLTRHQRIHSGEKPYKCS ECGKAFTHRSTFVLHHRSHTGEKPFVCKECGKAFRDRPGFIRHYIIHTGEKPYECIEC GKAFNRRSYLTWHQQIHTGVKPFECNECGKAFCESADLIQHYIIHTGEKPYKCMECG KAFNRRSHLKQHQRIHTGEKPYECSECGKAFTHCSTFVLHKRTHTGEKPYECKECGK AFSDRADLIRHFSIHTGEKPYECVECGKAFNRSSHLTRHQQIHTGEKPYECIQCGKAF CRSANLIRHSIIHTGEKPYECSECGKAFNRGSSLTHHQRIHTGRNPTIVTDVGRPFMTA QTSVNIQELLLGKEFLNITTEENLW El término "ZNF3970S" ó "zinc finger and SCAN domain containing 30" (también llamado en la literatura ZSCAN30; ZNF917; ZNF-WYM) como se usa aquí, y a no ser que se indique lo contrario, se refiere tanto al gen como a la proteína "ZNF3970S" humana. En el contexto de la presente invención, ZNF3970S se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína ZNF3970S, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 4, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 4. en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína ZNF3970S. Entre otras posibles secuencias nucleotídicas que codifican CRABP1 se encuentra, pero sin limitarse, la SEQ ID NO: 3.

Gene ID: 100101467 Localización del gen: 18q12.2

SEQ ID NO: 3

AGGGCTGCCGAGAATTAACCCCCGAACCGCCGCGAGCTGTCCCTAGCAGTGCCT TAGCCAGGGACCTGCTTGGCCAGCGACAGATCCTTTGCTGCTCTGTCTGCCGGTT CTTGAGATGGCAGGATGGTGGCTGGCAAAGTGTTGATGGCAAAGCAAGAAATTGT TGAATGTGTAGCCTCAGCAGCTATGATATCGCCGGGAAAACTTCCTGGAGAAACA CATTCCCAACGGATAGCTGAAGAAGCTTTGGGAGGTCTGGACAACTCTAAGAAGC AAAAGGGAAATGCTGCAGGGAACAAAATCAGTCAGCTTCCTTCCCAGGACAGACA TTTCAGTCTGGCAACCTTCAACAGAAGAATCCCCACAGAACACAGTGTCCTTGAAT CTCATGAGAGTGAAGGAAGTTTCAGTATGAATTCAAATGATATTACACAACAGAGC GTTGACACTAGGGAAAAGCTCTATGAGTGCTTTGACTGTGGGAAGGCCTTTTGCC AGAGCTCAAAGCTGATTAGACATCAGAGAATTCATACTGGAGAGAGACCTTATGC ATGTAAAGAATGTGGCAAAGCCTTCAGTTTGAGCTCAGACCTTGTTAGACATCAGA GAATTCATAGTGGTGAAAAACCCTATGAATGTTGTGAATGTGGAAAAGCCTTCAGG GGCAGTTCAGAGCTCATCAGGCATCGGAGAATCCACACTGGAGAGAAGCCTTATG AATGTGGAGAATGTGGGAAGGCCTTCAGCCGGAGCTCAGCCCTTATTCAGCATAA GAAAATTCACACTGGAGATAAAAGCTATGAATGTATTGCATGTGGTAAGGCTTTTG GTAGGAGTTCTATCCTTATTGAACATCAAAGAATTCACACTGGAGAGAAACCTTAT GAATGTAATGAATGTGGAAAATCCTTCAATCAGAGCTCAGCCCTCACCCAGCACC AGAGAATTCACACTGGAGAGAAGCCTTATGAATGTAGTGAATGTAGAAAAACATTT AGGCATAGGTCAGGCCTTATGCAGCATCAGAGAACACACACCAGAGTTTAACTCT GTGGGTAAGAGTTGTACAATTGTGAAATGCAAGGAGTTCACTGTAGGGGTGAGAC TCCACAGAAAAGAAAAGTTTCCTGAGAGCAGAACTTCTGTCCTTCCCTCCCAGTTC GGTACTATAAGAAGACATGCACACAAAGATGTTTGTTATGATTATTGAAGTGTTAAA TGGAAGAAAAATGTTACCCAAGTCTTCTCCAAAAAGAATGGTAGATATTTCCTTGA AATGCCTAACCCATTTCTGGATGAGACTCATCAATATCCCCTTCACTCCACTCTCT GCCAACTCAGATATAATTTCCATTGGGCACCTTCACAGTAATGCCAGGATTGGGG CAGAGATCCTGAAAGAGCTTCTTATAAGATGGCAAATGTGCCTGGCAAGAGCATT TGTATTTTGTCAGGTGGAGGCATGTGCTGAGAGTTATTCAACTATCTGAAATGTTG AATTTGGAGGTTGTGAAAATATTGAATTATGCTATTAGTTTAATAATATCTGAGGCA GTAAAATAGTACCTGAGGAATGGTGCCTCATTCTGCCCCCTTGCCAGTTGTCTCCT CAATCCTGAGCTTCCTGCTGAGGTTAATTCAAGTCTACTAGTTTATTGAGCACCTG CTATGTGCTAGGCATTGAGGTAGACCTGGTCATTGCCCTCCCAGAGTTAAGGGCT AATAGGATATGCATATATACTAAACAGTAATTACAGTAAAGTGTGGTAAGTGCTTTG GTAGGAAAAATGCGGGTTTCCATCAAAGTACATGGCAGGGATACCTAAATCTGGT CTATGAGTCACTAAAGACTTCCTGGATATGATGGTATCTCAGACATAAAGGTGGGT AGAAGGTAGCAAGGGCAGGGGAGAAGAGAACAGGATCTGGAGACACTCCATGAA GACTCTTCTCTACTGCAGAAATTGTCATAGACCTAATTTTTAAAAAAATGAATCTGA AGGAGTAATTCAACAAATATTTATTGCCCTCAAGTATAATAGCTCAGGGCCTGCAA GCCTGGTAAGGAGGGGTGTGGGCAGGGAATGGGGAATAGCAGAGCCTGGGAAG GCAGATCACCGTGTTCCTTTATACTTCCCACTGCCTGAGTCCCAGAGTCATGGGA CACAAACACTCCAGTCCCCACTGTCTCTCTAGCCTCTGATATGCATTCTTTCCCTG TGTATATACATGCCTTTTCCCATAAAATGCACCAGTCTCTCACCACACTAATTCTGA GTACTTCAGAGTCTCACAGGTCATTCTGGGTCTAGAATAGGCTCCCCAACTCAGT GATTATAAGTAGGAAGAGGAAAAGCAACACATGGGGATTCTGAGCCAGGCTTTAT GACAACTAATTCCTGCTGGAGAGAAGAGTCCTGATGATGGGCTGTCTCCAGATCC TATCTTATCTTCATGCCATTGTATGGGCTATAACCTCTGCCTGTAACTCTCTCTGCT AATTTTTATTTTGGCAGTTTTAATTAACCCACAATTGCTGAGGGCAATTAATACCTA AAAGAAAGTTTGATTCCTCTTCTAAGATATCCTAGGTAGTGTCATTTCTAAAGAAGA CTTGGTGATCACTGCTTGTATTAGTCCATTTTCACAGTGCTATGAAGATACTACCT GATACTGGGTAATTTATTAAAAAAAAAAAAGAGGTTTAATTGACTGACAGTTCTGCA GGGCTGGGGAGGCCTCAGGAAACTTAAATCATGGTGGAAGGCGAAGGGGAAGCA AGCACCTTCTTCACAAGGTGGCAAGAGAGAGTGCAGGGGAAATGCTAGGCACTTA TCAATCAGCCAAATCTCATGAGAATTCACTATCATGAGAACAAGGGGGAAATCTGC TCCCATGATCTAATCACCTCCCACCACGACCCTCCCTCAACACCTGGGGATTACT ATTGGAGATTTGGGTGGGGACACAAGAGCCAAACCATATCACTGCTGTTGTGGGT AATAGGGGAGGTGAAATTGGGGGGACAATTCGGCCTCTTTGTGTCCAGAGGTTGT GCAGTTATCGAGTGAGGTCGATCAGAAGTCTAAAGGGATCTTTCAAATGGATAGT GAGTTGCCTTTTCCTATAGGTGACAATCAGAGATTTAATGTTTTAAGTATCATATAA TAGGTTTTTCTCCTGATTGTGAATTGTAAGTGTTGGTAATACAGAAAATGAGAAAGT ATAAACCACCCCCAATCCCAATGCCCATAGAAACGTTGTTAACATTTTGGAGTACT TTCTATTAGTGTTTATTTTTCCCAATCCTAGTATTTTTAGTAAAACTACTGTTTAGTA AATGATTTTTGGTAACTAATTTCAAAATTTATACTTCAACCGTTTATTATTAGAATGT AATGCAAGATGTATTGCAATAAAACTTGAGTTTTAAAAGTTT

SEQ ID NO: 4 MVAGKVLMAKQEIVECVASAAMISPGKLPGETHSQRIAEEALGGLDNSKKQKGNAAG NKISQLPSQDRHFSLATFNRRIPTEHSVLESHESEGSFSMNSNDITQQSVDTREKLYE CFDCGKAFCQSSKLIRHQRIHTGERPYACKECGKAFSLSSDLVRHQRIHSGEKPYEC CECGKAFRGSSELIRHRRIHTGEKPYECGECGKAFSRSSALIQHKKIHTGDKSYECIAC GKAFGRSSILIEHQRIHTGEKPYECNECGKSFNQSSALTQHQRIHTGEKPYECSECRK TFRHRSGLMQHQRTHTRV

El término "TMEM106A" ó "transmembrane protein 106A" como se usa aquí, a no ser que se indique lo contrario, se refiere tanto al gen como a la proteína "TMEM106A" humana. En el contexto de la presente invención, TMEM106A se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína TMEM106A, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 6, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 6. en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína TMEM106A. Entre otras posibles secuencias nucleotídicas que codifican MC3R se encuentra, pero sin limitarse, la SEQ ID NO: 5 Gene ID: 113277

Localización del gen: 17q21.31

SEQ ID NO: 5

ACTTCCCTGGGCACTGAGTCAAAGCTTGAGGGGAGTGTTCGCTCCCGCATTTTCG ATTCCACTCTCTTCCGTTTCTGTCGCTGCAGTCGTCCGCGGTGCGGCACATTCGT TCCCCTAGGACTCCGGCCGGTTGCCGGCCCCAGGCGGTGCTTCTCCCCACCACC GCCCAGCTCAGCTCAGCCCAGCCCAGCCCACTCTGCCCTTAGAGGCCCTTCTCC CCAAAGACGCACTCCAGAAGTCTCGCCCTCGTGCGGCTGAGGAGCCTGGGATCC CAGACCTGAACAAGTGAAACCCCCGCCCCTGAAGAATGGGTAAGACGTTTTCCCA GCTGGGCTCTTGGCGGGAGGATGAGAACAAGTCAATCCTGTCCTCCAAACCAGC CATTGGCAGCAAGGCTGTCAACTACTCCAGCACCGGTAGCAGCAAGTCTTTTTGT TCCTGTGTGCCTTGTGAAGGAACTGCTGATGCCAGCTTCGTGACTTGTCCCACCT GCCAGGGCAGTGGCAAGATTCCCCAAGAGCTGGAGAAGCAGTTGGTGGCTCTCA TTCCCTATGGGGACCAGAGGCTGAAGCCCAAGCACACGAAGCTCTTTGTGTTCCT GGCCGTGCTCATCTGCCTGGTGACCTCCTCCTTCATCGTCTTTTTCCTGTTTCCCC GGTCCGTCATTGTGCAGCCTGCAGGCCTCAACTCCTCCACAGTGGCCTTTGATGA GGCTGATATCTACCTCAACATAACGAATATCTTAAACATCTCCAATGGCAACTACT ACCCCATTATGGTGACACAGCTGACCCTCGAGGTTCTGCACCTGTCCCTCGTGGT GGGGCAGGTTTCCAACAACCTTCTCCTACACATTGGCCCTTTGGCCAGTGAACAG ATGTTTTACGCAGTAGCTACCAAGATACGGGATGAAAACACATACAAAATCTGTAC CTGGCTGGAAATCAAAGTCCACCATGTGCTTTTGCACATCCAGGGCACCCTGACC TGTTCATACCTGAGCCATTCAGAGCAGCTGGTCTTTCAGAGCTATGAATATGTGGA CTGCCGAGGAAACGCATCTGTGCCCCACCAGCTGACCCCTCACCCACCATGACC TGTCTGCTGTCCCTGTACTCCAGGCACCTGCAACCCTGGTCTATATCTCCCACAA CTCCCTGGTGACTAAGGAAGGACTACAGAGGCTTTGCCAAAGGAGAAGCCCTGC CTCATCACACCCTTACCTCCCACCCCCTCAGCACAGGAAGCTTGCTTTGAAGTTAA CTTCATACACACACACTCATATCCTCCAGTTTCCCCCAGATTCTTTCAGGGGCTGC CATCAGATTCTGCCCTTGGTTAGTTTTTTGTTTTTTTTTTGGTAGAGACAGAGTCTC ACTGTTGGTCCAGGTTGGTTTTGAACTCCTGGGCTCAAGCGATCCTCCCTTCTTG GCCTCCCAAAGCACTTGGATTACAGATGTGAGCCTGTGCCTGGCTGGTCTTTCTT GAGGAAAATCTGACCTGGCATTTTCTTGAGGCACCTTAGATTCCCTGGAGTGGCA CCTGGCCTTTCTGTACTGAGCACCTGGTCAGTCTGAAGGGGGCATTTCACCCCAG CTCCATCAGGGCTGGCTGTCCCGTCTGAATGTGGAGAGAGCTGTAGTTTTATCTG GCTTTTAAAACATGGACCTGCCGGCTGGGCGCAGTGGCTTACACCTGTAATCCCA GTACTTTGGGAGGCCGAAGTGGGTGGATCACTTGAGGGCAGGAGTTCGTGACCA GCCTGGTCAACATGGTGAAACCTTGTCTCTACTAAAAATACAAAAATTAGCTGGGT GTGGTGGCATGCGCCTGTAATCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCAGCAGAATC ACTTGAAACCGGAAGGCAGAGGTTGCAGTGAGCCAAGATCGTGCAACTGCACTC CAGCCTGGGCAAAAGAGCAAAACTTTGTCTCAAAAAAAGACTCTTTTCAAGTTTTC TACCCTCTGATAAGAAAATTTGGGGATATCCAGTGCCATCTCCAAGGACTTTCAGG GGATCATAGATGCTTTTCTGTGCCTATCTGCTTTGACCATGTGAAAAAGTGATAGT CTGCTTCTCTCTGGTAACTTGTCTGCCACCCATCTGATAGTAAGATTAGCCAAGGC CCTTTAGCCCTCTGTCCTTTCTGGTTATTGACTGTCCCTGGTTCCTAGGAAGACAG AGTTGTTCTCCAGCTAAAGCGTCTCCTCTCTATAAAGTAGTTTTACTATTCTTTTCA TAGCAGGAGCCAAAATAGTAGAGGAGGGGAGAGAGGCACCTGGCACTCTGCGG GCCTGCACAGGAAAAACAGAGCCAAAGACAGAATCATTGTATAAGATATTTATTAA AGGAGAGCCTCTAAGTCCACATCCTGAGCCCATGTGAGTGGACACAGGTAGGTAA AACGGTGGGTCCAGCTGCTGTCATCTGAAAGCCTTCAGGAGATGAAGCTATCAGT ATCCAGCTGAAGGCTGCTGGGTTCTGTTCCACCACCACCTTAGCACCAGGGCCCT CTCTGGTCCCAGAGGCCTCATCTCTCCTTGGGCTTTGACAATGTGGAGCAGCACA TCAGCAGGGACTGGTCTAGACCCTCCCTTTCCTGTCACTTAGCTGGAGCTAAGCT CCAGATAACCCCTAGGTTCCCACTGGCTCCTAGTAGAAATAGTTTCTGTACTTTAG CAGAACAGGAAGGATATTTGTTCATTAAAGGTGGCTTGGTCTTACAGCTGGGTGC AGTGGTATATACCTGTAGTCCCAGCTACTCAGGAAGCTGAGGTGAGAGGATCTCT AGAGCCCAGGAATTCAAGTTTAACATGAGCAGCAACATTAGCAAGACCCCGTTTA AAAAAAAAAAAAGAGCTGGGCGTAATGGCGCACACCTGTAATCCCACCTACTCAG GAGGCTGAGGCAGGAGAATCACTTGAACCTGGGAGGCAGAGGTTGCAGTGAGCC AAGATCGCACCACTGCACTCCAGCCTGGGCAACAAGGGCGAGACTCTGTCTCAA AAAAAAAAAAAAAAAAAGATGGCTGTCTCTTTATCATTCAGACAGAACGATGAACA CAGGTGAGCAGGGAAAGCTAATTTTGAAGTAGGATGCATGGAGAGGGAGAAGTG GTGACAGAACTTGGTAACTAGCTGGCTGGGGGAACGAGGGGAAGGAAGGAGACT GCTGTCTCCAAGCTGAGGTCAGGGTGGTGTTGGCAAGAGCGCAAAAGTCCAGGG AAGCCAGGCTGGAGCTGCTGTGTATAGACTGCCAAATGTGAAGTATTTATATTGTA TTCAATAAACTATACTTAAGAGTGTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAA

SEQ ID NO: 6 MGKTFSQLGSWREDENKSILSSKPAIGSKAVNYSSTGSSKSFCSCVPCEGTADASFV TCPTCQGSGKI PQELEKQLVALIPYGDQRLKPKHTKLFVFLAVLICLVTSSFIVFFLFPR SVIVQPAGLNSSTVAFDEADIYLNITNILNISNGNYYPIMVTQLTLEVLHLSLVVGQVSN N

LLLHIGPLASEQMFYAVATKIRDENTYKICTWLEIKVHHVLLHIQGTLTCSYLSHSE QLV

FQSYEYVDCRGNASVPHQLTPHPP

MÉTODOS DE LA INVENCIÓN Un segundo aspecto de la invención se refiere a un método, de ahora en adelante primer método de la invención, para la obtención de datos útiles para el diagnóstico, predicción y/o pronóstico de CCR, que comprende la determinación del perfil de metilación de los genes ZNF543, ZNF3970S y/o TMEM106A, y/o cualquiera de sus combinaciones, y/o sus productos de expresión, a partir de una muestra biológica de un individuo.

Una "muestra biológica", como se define aquí, es una pequeña parte de un sujeto, representativa del conjunto y puede estar constituido por una biopsia o una muestra de fluido corporal. Las biopsias son pequeñas piezas de tejido y pueden ser frescas, congeladas o fijas, como fijada con formalina y embebidas en parafina (formalin- fixed and paraffin embedded FFPE). Muestras de fluidos corporales puede ser sangre, plasma, suero, orina, esputo, líquido cefalorraquídeo, leche o muestras de fluido ductal y pueden asimismo ser frescos, congelados o fijadas. Las muestras se pueden extirpar quirúrgicamente, mediante extracción es decir, por agujas hipodérmicas o de otro tipo, por microdisección o captura láser. La muestra debe contener cualquier material biológico adecuado para detectar el perfil de metilación deseado/s, por lo tanto, dicha muestra debe, comprender ventajosamente material de las células del sujeto.

En una realización preferida de este aspecto, los genes seleccionados son ZNF543 y/o ZNF3970S, y/o su combinación, y/o sus productos de expresión. Más preferiblemente es el gen ZNF543. En una realización aún más preferida, la determinación del perfil de metilación consiste o comprende la determinación de la presencia o ausencia de metilación de ADN en dos o más islas CG (CGI) o CpG del gen definidas en el Anexo I, y que la metilación se produzca en el promotor (1 ^o exón, 5°UTR, 1500/200 upstream). El sitio de inicio de transcripción 200 y el sitio de inicio de transcripción 1500 indican las regiones de 200 o 1500 pb desde el sitio de inicio de la transcripción, respectivamente

En otra realización preferida de este aspecto la muestra biológica utilizada para la obtención de datos útiles es una muestra de tejido colorrectal de un individuo. En una realización aún mas preferida, las muestras de tejido colorrectal corresponden a individuos que presentan un índice de masa corporal (IMC) igual o superior a 25.

El término "índice de masa corporal (IMC)", como se utiliza en la presente invención, se refiere a un indicador simple de la relación entre el peso y la talla que se utiliza frecuentemente para identificar el sobrepeso y la obesidad en los adultos. Se calcula, tal y como es definido por la Organización Mundial de la Salud (OMS), dividiendo el peso de una persona en kilogramos por el cuadrado de su talla en metros (kg/m ² ). De este modo, en el caso de personas adultas y siguiendo el criterio establecido por la OMS, los pacientes se clasifican dentro del grupo de no obesos para valores de IMC inferiores a 25, dentro del grupo de sobrepeso para valores de IMC iguales o superiores a 25 e inferiores a 30, y dentro del grupo de obesos para valores de IMC iguales o superiores a 30.

A efectos de la presente invención los pacientes pertenecientes según la OMS al grupo de sobrepeso y al grupo de obesos se clasificará en un mismo y único grupo, al que nos referiremos como grupo de pacientes obesos (IMC≥25).

En otra realización preferida de este aspecto de la invención el proceso de obtención de datos útiles puede ser total o parcialmente automatizado y/o computerizado.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para predecir y/o pronosticar el desarrollo de cáncer colorrectal que comprende (a) la obtención de datos útiles según el primer método de la invención, y además comprende (b) asignar a los pacientes con presencia de metilación al grupo de individuos con riesgo de padecer cáncer colorrectal o al grupo de individuos con peor pronóstico en el desarrollo de la enfermedad.

En una realización preferida de este aspecto de la invención los datos útiles obtenidos en el paso (a) servirán para asignar a los pacientes en el paso (b) al grupo de pacientes con peor pronóstico en el desarrollo de la enfermedad.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el perfil de metilación del ADN se mide por un método seleccionado del grupo que consiste, pero sin limitarse, en secuenciación con bisulfito y método basado en bisulfito (por ejemplo, RRBS, secuenciación con bisulfito, Infinium, GoldenGate, COBRA, MSP, MethyLight), pirosecuenciación, etc. , más preferiblemente por secuenciación con bisulfito y método basado en bisulfito, y aun más preferiblemente por pirosecuenciación. En otra realización preferida de este aspecto de la invención el proceso para la aplicación del método puede ser total o parcialmente automatizado y/o computerizado.

Otro aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo que comprende los elementos y/o reactivos necesarios para identificar el perfil de metilacion de ADN de los genes ZNF543, ZNF3970S y/o TMEM106A, y/o cualquiera de sus combinaciones, y/o sus productos de expresión, en una muestra biológica, preferiblemente, una muestra de tejido colorrectal.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, los genes seleccionados son ZNF543 y/o ZNF3970S, y/o su combinación, y/o sus productos de expresión, y más preferiblemente el gen ZNF543.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención el kit o dispositivo comprende cebadores y sondas específicos para determinar la presencia o ausencia de metilacion de ADN en uno o más islas CG como se definen como:

- orilla (shore), para cada una de las secuencias de 2 kb que flanquean una isla CpG o CGI;

- arrecife (shelf) para cada una de las secuencias de 2 kb junto a una orilla; y

- mar abierto (open sea), para el ADN no incluido en ninguna de las secuencias anteriores.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de un kit, según el aspecto anterior de la invención, para el diagnóstico, predicción y/o pronóstico de cáncer colorrectal en individuos, preferiblemente para el pronóstico.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, los individuos presentan un índice de masa corporal igual o superior a 25.

MÉTODOS DE SCREENING Otro aspecto de la invención se refiere a un método de selección de agentes terapéuticos útiles en la prevención, mejora y/o tratamiento del CCR que comprende:

(a) establecer el perfil de metilacion de ADN de los genes ZNF543, ZNF3970S y/o TMEM106A en células de una muestra de tejido de cáncer colorrectal.

(b) enfrentar una sustancia o composición de potencial valor terapéutico a células de cáncer colorrectal cuyo perfil de metilacion de ADN fue establecido en el paso (a) (c) establecer el perfil de metilación de ADN de los genes ZNF543, ZNF3970S y/o TMEM106A de las células tratadas en el paso (b)

(d) comparar el perfil de metilación de ADN obtenido en los pasos (a) y (c), asignando un valor terapéutico a aquellos compuestos o composiciones que reduzcan la metilación de ADN definida en el paso (a).

En una realización preferida de este aspecto de la invención, para el paso (a) y (c) el gen seleccionado es ZNF543 y/o ZNF3970S, y/o su combinación, y más preferiblemente el gen seleccionado es ZNF543.

En otra realización aún más preferida de este aspecto de la invención, los pasos (a) y (c) consisten en determinar la presencia o ausencia de metilación de ADN en uno o más sitios CpG o islas CG como;

- orilla (shore), para cada una de las secuencias de 2 kb que flanquean una isla CpG o CGI;

- arrecife (shelf) para cada una de las secuencias de 2 kb junto a una orilla; y

- mar abierto (open sea), para el ADN no incluido en ninguna de las secuencias anteriores.

Los compuestos del paso (b) que se presenten como agentes desmetilantes se identificarían como terapéuticos potenciales frente a CCR.

Los agentes terapéuticos identificados por el método de selección aquí descrito pueden ser usados en un modelo animal o de otro tipo para determinar el mecanismo de acción de dicho agente.

AGENTES TERAPÉUTICOS

Otro aspecto de la invención se refiere a la sustancia o composición obtenida u obtenible según el método de selección de agentes terapéuticos descrito en el aspecto de la invención anterior.

Otro aspecto de la invención se refiere a la utilización de la sustancia o composición obtenida para su uso en medicina, y preferiblemente, para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer colorrectal.

EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN A continuación se ilustra la invención mediante un estudio realizado sobre 56 pacientes diagnosticados de cáncer colorrectal (CCR) donde se analiza la correlación entre esta enfermedad, el perfil de metilación de ADN y el índice de masa corporal.

Materiales y métodos. Participantes del estudio

En este estudio poblacional se contó con muestras de tejido tumoral de 56 pacientes tratados con cirugía, mediante hemicolectomía, anterior ileostomía causada por un carcinoma de colon y/o recto, seguida de escisión mesocolorectal total (TME). Los casos fueron reclutados de modo que todos los pacientes padecieron cáncer colorrectal (CCR) durante los años 2012-2013, y eran mayores de 55 años; este criterio se incluyó para asegurar la homogeneidad con respecto a la edad de ambos grupos.

Fueron excluidos aquellos pacientes que recibieron tratamiento quimioterapéutico neo- adyuvante, y tenían enfermedad cardiovascular, artritis, enfermedad inflamatoria aguda, enfermedad infecciosa, enfermedad renal, estaban recibiendo fármacos que podían alterar el perfil de lípidos o glucosa o si consumían más de 20g etanol diarios en el momento de la inclusión en el estudio. Todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito, y el estudio fue revisado y aprobado por el Comité de Ética del Hospital Universitario Virgen de la Victoria de Málaga (España). Las muestras diseccionadas quirúrgicamente para examen patológico se sumergieron en formalina para su fijación durante la noche y se incluyeron sistemáticamente en bloques de parafina, del siguiente modo: Inspección de la preparación histológica más representativa con mayor contenido tumoral (evitando seleccionar mucosa sana, áreas de abundante infiltrado inflamatorio o infiltración de margen radial y necrosis). La profundidad de infiltración del tumor se evaluó cortando a intervalos de 3-4 mm. Las secciones adicionales incluyeron los márgenes proximal y distal, el margen radial y el colorrecto no comprometido.

Se tomaron datos de altura y el peso de los pacientes antes de la cirugía. El índice de masa corporal (IMC) se calculó como el peso de un paciente en kilogramos, dividido por la altura al cuadrado en metros, y posteriormente, para evaluar el efecto del exceso de peso corporal, se clasificó según los criterios de la Organización Mundial de la Salud (OMS): normal/bajo peso, IMC <25; sobrepeso (IMC≤ 25) o obesidad (IMC> 25).

Preparación de ADN y conversión bisulfito El ADN de las muestras de parafina (FFPE) (10 secciones de 14 μηι) se extrajeron usando el E.Z.N.A. FFPE DNA kit (Omega Biotek), con un lavado con xileno para eliminar la parafina. Para cada muestra de tejido tumoral, secciones subsiguientes se tiñeron con hematoxilina y eosina para confirmación histológica de la presencia (>50%) de células tumorales. El ADN obtenido se trató con RNaseA durante 1 h a 45°C. Todas las muestras de ADN se cuantificaron utilizando el método fluorométrico (Quan-iT PicoGreen DsDNA Assay, Life Technologies) y se evaluó su pureza por las medidas del ratio 260/280 y 260/230 utilizando un NanoDrop (Thermo Scientific). El ADN de FFPE (300 ng) se procesó usando el kit de metilación EZ-96 DNA Mthylation kit (Zymo Research Corp.) siguiendo las recomendaciones del fabricante para los ensayos de Infinium.

Análisis de Metilación de ADN

Infinium Human Methylation 450 BeadChip array

El análisis de metilación de ADN basado en microarrays se llevó a cabo con Infinium Human Methylation 450 BeadChip (450k array). Se realizaron pruebas de calidad de ADN, modificación de bisulfito, hibridación, normalización de datos, filtrado estadístico y cálculos de valor β como se ha descrito previamente (Sandoval J, et al. Epigenetics 2011 ; 6(6): 692-702). Se seleccionaron muestras de ADN de alta calidad obtenidas de tumores colorrectales (discovery cohorte; n = 28) para la conversión de bisulfito (Zymo EZ-96 DNA Methylation™ Kit) y la hibridación con el Infinium Human Methation 450 BeadChips (lllumina) siguiendo el protocolo de metilación lllumina Infinium HD. La concentración de ADN de los patrones de la muestra de control de calidad se midió usando el método PicoGreen (Invitrogen) acoplado con evaluaciones de pureza de ADN basadas en el ratio A260/A280 (rango entre 1 ,75 y 1 ,95) y ratio A260/A230 (rango entre 2,00 y 2,20). El análisis con electroforesis en gel de agarosa al 1 % permitió la exclusión de muestras con posible fragmentación de ADN o contaminación por ARN. El Infinium Human Methylation 450 BeadChip proporciona una cobertura de >450.000 sitios CpG o islas CG. Los chips fueron diseñados para cubrir los genes codificantes y no codificantes sin sesgo en contra de aquellos que carecen de islas CpG. El diseño pretendía además abarcar no sólo regiones reguladoras promotoras sino también CpGs a través de las regiones génicas para incluir las regiones 5' no traducidas (5' UTR), los primeros exones, los cuerpos génicos y las regiones 3 'no traducidas (UTRs 3'),

Un total de 600ng de las muestras de ADN de alta calidad se convirtió en bisulfito. La amplificación del genoma entero y la hibridación se realizaron con un BeadChip y a continuación por "single-base extensión" y análisis en un HiScan SQ module (lllumina) para evaluar los estados de metilación de citosina. La anotación de las islas CG (CGI) utilizó la siguiente categorización: 1) Costas, para cada una de las secuencias de 2 kb que flanquean un CGI; 2) Estante, para cada una de las secuencias de 2 kb junto a una costa; y 3) Mar abierto, para el ADN no incluido en ninguna de las secuencias anteriores o en CGIs. El sitio de inicio de transcripción 200 y el sitio de inicio de transcripción 1500 indican las regiones de 200 o 1500 pb desde el sitio de inicio de la transcripción, respectivamente.

Pyrosequencing analysis La pirosecuenciación se utilizó para evaluar los marcadores seleccionados en la cohorte de validación (n=28 FFPE tumor colorrectal). Las secuencias de cebadores utilizadas en este análisis se diseñaron usando el software PyroMark Assay Design 2.0 de Qiagen para hibridar con sitios libres de CpG para asegurar la amplificación independiente de metilación. El ADN genómico se aisló a partir de muestras de cáncer colorrectal fijadas con formalina fijadas en parafina (FFPE) usando el QIAmp DNA FFPE Tissue kit (Qiagen, Hilden, Germany) de acuerdo con los protocolos recomendados por el fabricante. Los análisis de metilación de ADN se realizaron utilizando ADN tratado con bisulfito seguido de un análisis cuantitativo basado en la pirosequenciación basada en PCR. La conversión de bisulfito se llevó a cabo con 2 μg de ADN genómico aislado y 0, 1 μΜ de solución de citrato de etanol. A continuación, se realizó la PCR en un volumen total de 25 μΙ, con una concentración de cebador final de 0,2 μΜ. Uno de los cebadores fue biotinilado con el fin de purificar el producto de PCR final usando perlas de sefarosa. La amplificación por PCR biotinilada se purificó usando la pirosecuenciación Vacuum Prep-Tool (Qiagen). Finalmente, 15 μί de los productos de la PCR fueron pirosequenciados usando el Sistema de Pirosecuenciación PyroMarkTMQ96 ID, usando 0,4 μΜ de un cebador de secuenciación. El nivel de metilación se expresó como el porcentaje de citosina metilada sobre la suma de citosinas metiladas y no metiladas. Se usaron residuos de citosina no-CpG como controles incorporados para verificar la conversión de bisulfito. Los valores se expresan como la media para todo el sitio. También se incluyó ADN no metilado y metilado como controles en cada ensayo (New England Biolabs). La precisión inter-ensayo (% CV) fue <2,5%, intra-ensayo (% CV) fue <1 ,0%.

Líneas celulares y tratamientos para el análisis funcional

Se usaron líneas celulares representativas de cáncer colorrectal humano (LOVO, CAC02, HT29, HCT1 16) de American Type Culture Collection (Manassas, VA) para evaluar la metilación del ADN y la expresión génica de ZNF543. Las células se cultivaron en DMEM que contenía 10% FBS, penicilina y strestomicina a 371 C y 5% C02. Para restaurar la expresión de ZNF543 metilado, se trataron las células CAC02 y LOVO con el agente desmetilante de ADN 5-aza-2'-desoxicitidina (A3656, Sigma) a 5 μΜ durante 72h. Todas las líneas celulares se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y se usaron con un pasaje inferior a 15. ATCC autentifica las líneas celulares rutinariamente siguiendo una prueba muy estricta que incluye perfiles de repetición en tándem corto (STR), cariotipo y ensayos cytochrome C oxidates I (COI). Ensayos de expresión por QRT-PCR

El ARN de los ensayos de cultivo celular se extrajo utilizando Thermo Scientific GeneJet RNA Purification Kit (Thermo Scientific, K0739, Waltham, MA, USA). Las concentraciones de ARN se midieron con un espectrofotómetro Nanodrop 2000 (Thermo Scientific). El ADNc se sintetizó utilizando el High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) con 2 μg de ARN total. qRT-PCR se realizó utilizando TaqMan Universal PCR Master Mix, TaqMan Probes (Applied Biosystems) y el Step OnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Todos los experimentos se realizaron por duplicado, y los niveles de expresión génica se normalizaron a los de la limpieza de genes ACTB o GAPDH, dependiendo de la muestra. El cambio de pliegue en la expresión génica se calculó usando el método de cuantificación relativa 2 ^_ΔΔα de acuerdo con las directrices del fabricante (Applied Biosystems), y los datos se muestran como la media geométrica (SEM).

Análisis estadístico

El nivel de metilación de cada citosina se expresó como un valor β, que se calculó como la relación de intensidad de fluorescencia de las versiones metiladas a las no metiladas de las sondas. Los valores β oscilaron entre 0 (no-metilada) y 1 (completamente metilado) de acuerdo a una combinación de las intensidades de fluorescencia Cy3 y Cy5. El ajuste del equilibrio del color y la normalización se realizaron para normalizar las muestras entre los dos canales de color utilizando el software Genome Studio lllumina (V2010.3). Genome Studio normaliza los datos utilizando diferentes controles internos que están presentes en el HumanMethylation 450 BeadChip. Este software también normalizó los datos dependiendo de las sondas de background interno. Los valores de β con con valores-p de detección > 0,01 se consideraron que estaban por debajo de la intensidad mínima y el umbral, y estos CpG fueron consecuentemente eliminados del análisis posterior. Aproximadamente el 96% de las islas CpG fueron cubiertas, junto con regiones proximales a las islas CpG ("CpG Costas") y los estantes CpG más distales. Además, las sondas que se localizaron en los cromosomas sexuales (1 1.234 CpGs del cromosoma X y 416 del cromosoma Y) y aquellas CpGs que contienen polimorfismos de nucleótido único (SNPs) a 10 pb del extremo 3' de de la sonda de interrogación (1.179 CpGs) fueron ignorados. Adicionalmente, las sondas 72 rs (controls SNPs probes) y 3,343 ch (no-CpG loci) fueron eliminadas.

Los CpG finalmente válidos para el estudio fueron 426.481. Para identificar patrones consistentes de sitios CpG diferencialmente metilados (DMCpGs) entre los tumores colorrectales de obesos y de peso normal, se realizaron pruebas no paramétricas de suma de rango de Wilcoxon. Realizamos Wilcoxon Rank test para el análisis en lugar de utilizar modelos lineales u otros métodos capaces de ajusfar para evitar errores a causa del tamaño muestral. Este ensayo ofrece resultados bastante robustos incluso para un pequeño número de sujetos. Los valores de P se ajustaron para comparaciones múltiples usando el procedimiento de Benjamini y Hochberg "false discovery rate (FDR)", aunque este análisis mostró un FDR no estadísticamente significativo (FD>0,05). Adicionalmente, se aplicó un umbral para los sitios significativos basándose en las diferencias de medias entre los grupos con un cambio de valor β mínimo de ±0, 15. Análisis de agrupamiento jerárquico de los CpGs significativos se realizaron utilizando la "heatmap function". Todos los análisis estadísticos mencionados se realizaron utilizando el software R (versión 3.2.0). El nivel de metilación global se comparó entre obesos y no obesos por Wilcoxon rank test. La distribución genómica de los CpGs diferencialmente metilados se comparó con la distribución de los CpGs en todos los sitios analizados en el InfinumHumanMethylation 450 BeadChip. Los valores de P se calcularon usando la prueba del chi-cuadrado para determinar la sobre- o sub-representación de los CpGs. Todos los análisis estadísticos mencionados anteriormente se realizaron utilizando el software R (versión 3.2.0).

Para estimar el enriquecimiento en procesos biológicos, se realizó una prueba h i pe rgeo métrica sobre los procesos biológicos definidos por la ontología génica (GO). Este análisis detectó la sobre-representación significativa de los términos GO en uno de los conjuntos (lista de genes identificados) con respecto al otro para todo el genoma. Los términos GO con un valor p ajustado <0,05 se consideraron significativos.

Con el software SPSS versión 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) para Windows XP (Microsoft, Redmond, WA), se evaluó la asociación potencial entre el IMC y los niveles de metilacion del ADN mediante el test de coeficientes de Spearman. Las diferencias en los niveles de metilacion del ADN y la expresión de los genes identificados entre los grupos se evaluaron mediante la prueba no paramétrica de Mann Whitney U. P≤ 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Además, las eficacias diagnósticas (porcentaje correctamente clasificado) de los genes candidatos que fueron diferencialmente metilados se calcularon como los porcentajes de acuerdo utilizando los análisis de curva ROC (receiver operating characteristic). Estos resultados se interpretan a menudo como una eficiencia insignificante (<20%), eficiencia mínima (20-40%), eficiencia moderada (41-60%), buena eficiencia (61-80%) y eficiencia excelente (> 80%).

Resultados

Características de los pacientes

De 28 pacientes con cáncer colorrectal evaluados en la discovery cohorte, el 64,3% fueron clasificados como sobrepeso/obeso (IMC> 25) y el 35,7% como peso normal. En la cohorte de validación (n=28), el 71 ,4% de los pacientes fueron clasificados como sobrepeso/obeso y el 28,6% como peso normal.

Análisis de metilación del ADN por estado de adiposidad

El perfil de metilación del ADN en tumores colorrectal implicó el análisis de aproximadamente 450.000 CpGs en relación con el IMC. Los tumores colorrectales presentados en pacientes obesos o con sobrepeso (IMC>25, grupo obeso) fueron comparados con los de pacientes con peso normal (IMC<25, grupo no obeso). Este análisis reveló diferencias estadísticamente significativas (p<5%) en 299 sitios CpG de un total de 426.481 CpGs válidos. Los CpGs diferencialmente metilados se caracterizan en su mayoría por cambios en la hipermetilación de CpG que ocurren durante el desarrollo del tumor en el grupo obeso (Figura 1A). Los sitios CpG identificados condujeron a 152 genes únicos y fueron capaces de separar las muestras en dos grupos de acuerdo a la adiposidad utilizando un enfoque de cluster jerárquico (Figura 1 B).

En cuanto a la distribución funcional (Figura 2), la mayoría (66%) de los sitios DMCpG se localizaron en región intergénica (38%) y cuerpo (28%, Figura 2A). Respecto al contexto CpG (Figura 2B), las diferencias en la metilación del ADN se distribuyeron principalmente en las regiones enriquecidas con CpG. De los 299 DMCpGs, encontramos 45 (15, 1 %) con menor, y 253 (84,9%) con mayores niveles de metilación del ADN en el grupo de obesos que en los no obesos. Por otra parte, los DMCpGs que perdieron la metilación en el grupo obeso con respecto a los no obesos se localizaron principalmente en promotor (TSS1500 y TSS 200 y 1 er exón) y cuerpo (Figura 2C), así como en CpG isla y costa (Figura 2D); mientras que DMCpGs que ganan metilación en el grupo de obesos se encontró principalmente en la región intergénica (Figura 2C) y mar abierto (Figura 2D).

Tabla 1 . Características de los sujetos de estudio de la cohorte de ensayo y validación.

Importancia biológica de los sitios DMCpG relacionados con la obesidad y los genes asociados en los tumores colorrectales

Se realizó un análisis GO para probar si, dentro de los 152 genes asociados con los 299 DMCpGs encontrados entre los grupos no obesos y los obesos, ciertas funciones moleculares o procesos biológicos aumentaron significativamente. Entre las categorías de procesos funcionales que mostraron significación estadística (FDR <0,05), encontramos la adhesión celular, la respuesta a las vías de señalización del receptor Wnt canónico, el proceso metabólico de la reserva de energía, las vías de señalización Notch, la diferenciación de células grasas, la regulación del transporte de proteína SMAD, el procesamiento de la insulina y la regulación del transporte de NF-kappaB (Figura 3A). Es importante destacar que el 42, 1 % de los genes diferencialmente metilados pertenecía a una red significativamente enriquecida en interacciones de proteínas (p<0,001), de acuerdo al análisis STRING (Figura 3B). Los sitios CpG que representan las regiones promotoras (TSS1500, TSS200, 5 'UTR y 1 ^er Exon) en las islas CpG/costas se seleccionaron para investigar la relevancia biológica. Esta selección produjo 63 CpGs que representan 46 genes únicos (Tabla 2).

Tabla 2. CpGs metilados diferencial mente (DMCpGs) en tumores colorrectales entre sujetos obesos y no obesos ubicados en el promotor (promoter), la isla (island) y la orilla (shore) y separado por el nombre del gen. Se destacan aquellos genes que fueron representados por más de 2 DMCpG. Para identificar firmas potencialmente novedosas de metilación del ADN en tumores colorrectales relacionados con la obesidad, se seleccionaron aquellos genes con más de 2 sitios CpG situados dentro de islas CpG/costa y promotores (Tabla 2 y Tabla 3). Con estos criterios, ADCY4, DLX4, GSX1 , SCAND3, SNCA, TIAM1 , ZNF3970S fueron representados por 2 sitios. Destacamos que TMEM 106A y ZNF543 fueron los genes más representados, con 4 y 6 CpGs, respectivamente, y que mostraron diferencias en valores-β superiores al 20% con alta significación estadística en la región promotora y la isla/costa.

Validación de genes candidatos en una cohorte independiente Para evaluar los niveles de metilación del ADN de ZNF3970S y ZNF543 en una cohorte independiente de muestras de parafina procedentes de tumores colorrectales (cohorte de validación, N=28 tumores colorrectales, Tabla 1), se utilizó la pirosecuenciación, una técnica que se considera muy factible para estudios de pacientes en hospitales. Cuando se analizaron los niveles de metilación en los tumores colorrectales según el estado de adiposidad, las diferencias estadísticas observadas en Infinity Human Methylation 450 BeadChip array entre el grupo obeso y el grupo no obeso se corroboraron por pirosecuenciación, con significación estadística en los niveles de metilación de ZNF543 y ZBF3970S en la misma cohorte (Figura 4A). Por otra parte, el patrón de metilación de los tres genes seleccionados fue validado por pirosecuenciación en una cohorte independiente (validación cohorte, n=28, Tabla 1), alcanzando significancia estadística en ZNF543 y ZNF3970S (Figura 4B).

Como sondeo de la relación entre los niveles de metilación de los DMCpGs seleccionados y el exceso de peso corporal, se encontró una correlación estadísticamente significativa entre el IMC y los valores β de los DMCpGs más relevantes (diferencia de valores β>0,20; p<0,01) en los genes ZNF543 (Figura 5A) y ZNF3970S (Figura 5B).

Se utilizaron curvas ROC (Receiver operating characteristic) para evaluar la capacidad de los niveles de metilación de estos DMCpG seleccionados para discriminar entre pacientes obesos y no obesos (Figura 5C). El área bajo la curva ROC (AUROC) de los niveles de metilación de ZNF543 fue de 0,73 (p=0,01) para discriminar el grupo obeso de no obeso. Los niveles de metilación de ZNF3970S evidenciaron también una excelente, y estadísticamente significativa, capacidad (AUC=0,78; p=0,003). Es importante destacar que cuando se combinaron los niveles de metilación de ZNF543 y ZNF3970S, la capacidad de discriminar entre pacientes obesos y no obesos mejoró de forma notable (AUROC=0,85, p<0,001 , Figura 5C).

Tabla 3. Genes relevantes que contienen más de dos CpG metiladas diferencialmente en tumores colorrectales dependiendo del estado de adiposidad y su función potencial. Debido a que los niveles de metilación de ZNF543 en el cáncer colorrectal no se han descrito previamente y que fue el gen más representado por los DMCpGs relacionados con la obesidad, se evaluó la asociación entre los niveles de metilación de ZNF543 y su expresión génica. En particular, los niveles medios de metilación de la región promotora de ZNF543 (Figura 6) evaluados en diferentes líneas celulares tumorales colorrectales por Infinity Human Methation 450 BeadChip array (Figura 6A) se correlacionaron inversamente con los niveles de transcripción de ZNF543 (Figura 6A). Además, después de tratar las líneas celulares de cáncer colorrectal que exhibieron hipermetilación de ZNF543 con el agente desmetilante 5-aza-2'-desoxicitidina, la expresión de este gen fue restaurada significativamente (Figura 6B), indicando que la metilación del ADN juega un papel funcional en el control transcripcional de ZNF543.