技术领域

[0001] 本发明涉及分子生物学与生物技术领域， 特别涉及一种利用生物酶催化技术制 备 3d-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸的方法及其制备用 7α-类固醇脱氢酶。

背景技术

[0002] 3d-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸又名 7-酮石胆酸， 是制备熊去氧胆酸的重要中间体。

而熊去氧胆酸是名贵中药熊胆的主要有效成分 ， 具有增加胆汁酸分泌、 并使胆 汁成分改变、 降低胆汁中胆固醇及胆固醇脂等功效， 主要用于治疗胆石疾病。 众所周知， 熊胆是一种非常稀缺的资源， 原因在于其获取的传统途径主要是依 赖于人工养殖活熊取胆的方法。 目前， 这种周期长、 收率低且不人道的传统途 径逐渐被人工合成方法所取代， 而现知的人工合成熊去氧胆酸的方法中， 3d-羟 基 -7氧代 -5β-胆烷酸都是极为重要的中间体。

[0003] 目前 3ot-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸的工业化生产多采用化学法， 但是存在操作条件 苛刻、 选择性低、 污染环境、 使用大量有机溶剂、 存在有机溶剂残留、 有毒有 害等缺点。 为了解决化学法存在的诸多缺点， 人们另辟蹊径， 寻找更好的生产 途径。 中国发明专利 CN1912192B公幵了一种采用电化学合成制备 3d-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸的方法， 但是此种方法依然需要使用有机溶剂， 并且成本较高。 中国 发明专利申请 CN105368828A公幵了一种采用全细胞催化制备 3ot-羟基 -7氧代 -5β- 胆烷酸的方法， 但是此种方法需进行细胞发酵培养， 存在反应吋间长、 操作繁 琐、 产物复杂等缺点。

技术问题

[0004] 本发明的目的在于提供一种 30C-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸的新的制备方法， 以解决 上述背景技术中提到的现有制备方法所存在的 有机溶剂残留、 条件苛刻、 反应 吋间长、 操作繁琐、 成本较高、 污染环境等缺点， 本发明同吋提供了该新制备 方法适用的生物酶。

问题的解决方案 技术解决方案

[0005] 为实现上述目的， 发明人经过长期大量的实验摸索， 在经历上百次的失败尝试 之后， 终于筛选出适用于细胞外生物催化制备 3d-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸的生物酶 ， 并在此序列基础上进行优化， 获得了活性提高和去除底物抑制的突变体酶， 从而幵发出一种新的制备 3α-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸的方法， 其特征在于： 以鹅去 氧胆酸为底物， 在 NAD、 乳酸脱氢酶、 丙酮酸钠以及缓冲溶液存在的条件下， 用 7α-类固醇脱氢酶催化鹅去氧胆酸制备 3d-羟基 -7氧代 -5β胆烷酸， 所述 7oc-类固 醇脱氢酶来源于盐单胞菌 Hal画觀 jeotgali sp.， 所述乳酸脱氢酶的核苷酸序列 如 SEQ ID

NO : 3所示， 在整个催化反应体系中， 所述底物的浓度为 50〜100mg/mL， 所述 NAD的浓度为 0.01〜0.25mg/mL， 所述丙酮酸钠的浓度为 10〜30mg/mL。

[0006] 上述方法中所使用的两种酶的具体存在形式包 括液态酶、 固态酶以及各种固定 化酶， 可以是未经纯化的粗酶形式， 也可以是经部分纯化或完全纯化的形式。

[0007] 优选地， 控制所述催化过程在温度为 25〜35°C， pH值为 7.5〜8.5的条件下进行

[0008] 优选地， 所述缓冲溶液为 50〜100mM磷酸钾缓冲液。

[0009] 优选地， 上述制备方法还包括如下提纯步骤： 待所述催化过程反应结束后， 调 节 pH值为 1.0〜2.0， 搅拌 20〜30min， 待冷却后再经过滤水洗干燥后即得 3oc-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸成品。

[0010] 更优选地， 上述制备方法还包括如下精制步骤： 将获得的 3α-羟基 -7氧代 -5β-胆 烷酸成品用 8- 15倍无水乙醇 50-60。C水浴条件下搅拌回流 0.5-lh， 过滤， 取滤液进 行真空减压浓缩至 1/4- 1/5体积， 再加入 4-5倍纯水搅拌 lh， 过滤， 将滤饼真空干 燥过夜， 即得 3α-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸精制品。

[0011] 优选地， 上述制备方法中所使用的 7α-类固醇脱氢酶为如下 （a) 或 （b) 的蛋 白质：

[0012] (a) 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2所示的蛋白质，

[0013] (b) 在 （a) 限定的氨基酸序列中经过取代、 缺失或添加一个或几个氨基酸并 且在 NAD存在下以鹅去氧胆酸为底物具有比氨基酸序 列如 SEQ ID NO: 2所示的 亲本高的 7α-类固醇脱氢酶催化活性的由 （a) 衍生的蛋白质。

[0014] 更优选地， 所述 7ot-类固醇脱氢酶与如 SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列相比在 选自至少一个下述位点处具有至少一个突变： 第 67位、 第 68位、 第 97位、 第 99 位、 第 117位以及第 192位。

[0015] 更优选地， 所述 7ot-类固醇脱氢酶具有至少一个下述突变： C67R、 D68W、 G97

D、 G99A、 L117E以及 T192E。

[0016] 本发明还提供了一种 7α-类固醇脱氢酶， 所述 7α-类固醇脱氢酶来源于盐单胞菌

Halomonas jeotgali

sp.， 用于催化鹅去氧胆酸制备 3α-羟基 -7氧代 -5β胆烷酸， 所述 7α-类固醇脱氢酶 为如下 （a) 或 （b) 的蛋白质：

[0017] (a) 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2所示的蛋白质，

[0018] (b) 在 （a) 限定的氨基酸序列中经过取代、 缺失或添加一个或几个氨基酸并 且在 NAD存在下以鹅去氧胆酸为底物具有比氨基酸序 列如 SEQ ID NO: 2所示的 亲本高的 7α-类固醇脱氢酶催化活性的由 （a) 衍生的蛋白质。

[0019] 优选地， 所述 7ot-类固醇脱氢酶与如 SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列相比在选 自至少一个下述位点处具有至少一个突变： 第 ₆₇ 位、 第 ₆₈ 位、 第 ₉₇ 位、 第 ₉₉ 位

、 第 117位以及第 192位。

[0020] 优选地， 所述 7ot-类固醇脱氢酶具有至少一个下述突变： C67R、 D68W、 G97D 、 G99A、 L117E以及 T192E。

发明的有益效果

有益效果

[0021] 1、 与现有的 3α-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸的制备方法相比， 本发明提供的方法具 有操作简单、 反应条件温和易控、 反应吋间短、 不使用有机溶剂、 无毒无污染 且成本低廉的优点， 经实践证明， 本发明提供的方法的反应吋长仅需 4〜12小吋 ， 其对底物的转化率高达 99.7%以上， 所获得的产品的含量在 97.5%以上。

[0022] 2、 本发明筛选出了适用于细胞外生物催化制备 3ot-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸的 7ot- 类固醇脱氢酶基因， 并在此序列基础上进行优化， 获得了活性提高和去除底物 抑制的突变体酶， 这些突变体酶表现出高的选择性使得该方法不 会形成副产物 ， 这些突变体酶的高催化活性和高专一性使得 3α-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸酶法大规 模生产的成本更低， 具有较高的工业应用价值。 本发明的实施方式

[0023] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细 说明， 以下实施例是对本发明的 解释， 本发明并不局限于以下实施例， 实施例中未注明具体条件者， 按常规条 件或者制造商建议的条件进行。

[0024] 本发明提供的 3α-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸的制备方法的具体实施过程如下：

[0025] 将鹅去氧胆酸悬浮于 50〜100mM磷酸钾缓冲液 （pH8.0) 中， 用 10M的 NaOH调 节 pH到 8.0， 再加入终浓度为 10〜30mg/mL的丙酮酸钠并用 10M的 NaOH调节 pH 到 8.0， 加入 7α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶， 最后加入终浓度为 0.01〜0.25mg/m L的 NAD， 底物终浓度为 50〜100mg/mL， 反应在温度 25〜35°C、 200〜400rpm和 pH7.5〜8.5进行， 反应吋间为 41！〜 12h。 每隔一定吋间取反应液用流动相稀释 50 〜100倍， 微孔过滤后进样进行液相分析。 液相检测使用 Phenomenx Gemini 110Α 250x4.6mm为分析柱， 流动相为乙腈：缓冲溶液 （取磷酸二氢 钠 0.78g,溶解 1L水中， 用磷酸调 pH值为 3， 即可） ：甲醇 =30:37:40， 用 0.45um滤 膜过滤后备用。 柱温为 40°C， 示差检测器 （RID) ， 流速为 0.8mIJmin。 待催化 过程反应结束后， 在快速搅拌的情况下加入盐酸至 pH为 1.0〜2.0， 继续搅拌 20〜 30min , 待冷却后过滤、 经水洗三次后真空干燥后即得 3d-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸 成品。 成品再用 8- 15倍无水乙醇 50-60°C水浴条件下搅拌回流 0.5-lh， 过滤， 取滤 液进行真空减压浓缩至 1/4- 1/5体积， 再加入 4-5倍纯水搅拌 lh， 过滤， 将滤饼真 空干燥过夜， 即得 3α-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸精制品。

[0026] 上述方法中所使用的两种酶的具体存在形式包 括液态酶、 固态酶以及各种固定 化酶， 可以是未经纯化的粗酶形式， 也可以是经部分纯化或完全纯化的形式。

[0027] 实施例 1

[0028] 含有亲本基因的共表达重组质粒 pET22b-AHSDH2-LDH的制备

[0029] 将来源于盐单胞菌 Halomonas jeotgali sp 的 7α-类固醇脱氢酶基因 AHSDH2 和来源于魏斯氏菌 （ Weissella sp) 的乳酸脱氢酶基因 LDH分别利用引物对 5'CGCCATATGATGTACGACCCGA AGAACTT3'和 5'

CCGGAATTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGAT3'以及弓 |物对 5'CCGGAATTCAAG

ATTCCACCGCAATGC3'通过 PCR扩增技术获得 PCR产物后经过酶切处理， 同吋 插入到表达载体 pET22b (+) 的 Nde I和 EcoR I位点以及 EcoR I位点和 Xho I位点 ， 得到共表达重组质粒 pET22b-AHSDH2-LDH。 经 DNA测序， 确定该被克隆的 亲本 7ot-类固醇脱氢酶的核苷酸序列如 SEQ ID NO: 1所示， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2所示； 确定该被克隆的亲本乳酸脱氢酶的核苷酸序列 如 SEQ ID NO: 3 所示， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 4所示。

[0030] [0030]实施例 2

[0031] 含有 7α-类固醇脱氢酶突变体的共表达重组质粒的� �备

[0032] 通过反向 PCR技术对 7α-类固醇脱氢酶亲本进行定点突变， 在突变位置通过设 计反向引物， 利用上下游突变引物扩增目的片段， 并在引物上引入相应突变， 以重组质粒 pET22b-AHSDH2-LDH作为模板进行反向 PCR， PCR产物经 Z¾?«I酶消 化模板处理后转化到大肠杆菌 Ro _Se tt _a (de3)， 经过 Amp的筛选后挑取菌落送测序 。 突变位点及引物设计如表 1所示。

[0033] PCR体系为： TaKaRa EX Taq HS 0.25ul； ΙΟχΕχ Taq Buffer

5ul; 模板质粒 lul; dNTP (2.5mM each) 4ul; 上游引物 lul;下游引物 lul; 无菌 水 up to 50 ul。

[0034] PCR程序为： 首先 98。C2min; 然后 98。C10s， 55-56°C30s , 72。C7min， 30个循环 ； 最后 72°C10min。

[0035] 表 1

[] [表 1]

[0036] 实施例 3

[0037] 酶液的制备

[0038] 将实施例 1和实施例 2制备的亲本和突变体共表达重组质粒分别转� �大肠杆菌 Ro setta(de3), 再将获得的重组大肠杆菌接种在小体积的 LB培养基 （含有 10(Vg/mL 的 Amp) ， 30〜37°C过夜培养后， 以 1〜5<¾的接种量转接到一定体积的 LB培养 基中 （含有 10(Vg/mL的 Amp) ， 在 30〜37°C继续培养 OD ₆₀₀ 达到 0.6〜1.0加入终 浓度为 0.1mM〜lmM的异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)， 在 20〜37°C诱导表达 1 0〜20h后离心收集菌体。 发酵菌体悬浮于一定体积的 50〜100mM的磷酸钾缓冲 液 （pH8.0) 中并超声波破胞， 离心即得含有乳酸脱氢酶与 7α-类固醇脱氢酶亲本 或者与 _7α -类固醇脱氢酶突变体的粗酶液， 可用于酶活力的测定以及 3d-羟基 -7氧 代 -5β-胆烷酸的生物催化制备。

[0039] 实施例 4

[0040] 酶活力的测定

[0041] 7ot-类固醇脱氢酶的酶活测定方法： 以鹅去氧胆酸为底物， 在一个 3mL的反应 体系中加入 lOuL的 150mM鹅去氧胆酸， lOOuL的稀释酶液， NAD +

终浓度为 0.2mM， 在 pH8.0和 25°C反应一定吋间， 在 340nm处测定吸光值增加。 [0042] 乳酸脱氢酶的酶活测定方法： 以丙酮酸钠为底物， 在一个 3mL的反应体系中加 入 lOOuL的 50mM丙酮酸钠， lOOuL的稀释酶液， NADH终浓度为 0.2mM， 在 pH8. 0和 25°C反应一定吋间， 在 340nm处测定吸光值减少。

[0043] 酶活力的测定结果如表 2所示， 其中 LDH为乳酸脱氢酶， 7ot-HSDH为 7ot-类固醇 脱氢酶。

[0044] 表 2

[] [表 2]

[0045] 实施例 5

[0046] 3ot-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸的制备

[0047] 参照前述 3α-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸的制备方法的具体实施过程， 使用实施例 3 制备的粗酶液， 酶液的投入量以酶液的重量占整个反应体系的 体积计， 控制底 物鹅去氧胆酸的终浓度为 100mg/mL， 其余各具体参数如表 3所示。 反应 41！〜 12h 后测得， 底物转化率在 99.7%以上， 成品含量在 97.5%以上， 收率为 85〜95%。

[0048] 表 3

[] [表 3]

[0049] 实施例 6

[0050] 3ot-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸的制备

[0051] 总体系 1L， 取 50g含量为 99%的鹅去氧胆酸， 悬浮于 lOOmM的磷酸钾缓冲液 （p H8.0) ，用 lO M NaOH的调节 pH到 8.0后加入终浓度 25g/L的丙酮酸钠， 并依次加 入 0.08g7ot-类固醇脱氢酶冻干粉 （L117E突变体酶） 和 0.07g乳酸脱氢酶冻干粉， 最后加入终浓度为 0.15g/L的 NAD， 底物终浓度为 50g/L。 在 25°C、 250rpm和 pH8. 0左右进行反应 6h， 转化率达 99.9%。 反应结束后， 反应液滴加盐酸溶液至 pH为 1 .2, 继续搅拌 30min后待冷却过滤、 经水洗三次后真空干燥得到 3oc-羟基 -7氧代 -5β -胆烷酸成品 60g。 成品用 900ml无水乙醇 60°C水浴条件下搅拌回流 lh， 过滤取滤 液进行真空减压浓缩至 200ml体积， 再加入 1L纯水搅拌 lh， 过滤， 将滤饼真空干 燥过夜即得 3α-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸精制品 52g。