La presente invención se llevó a cabo gracias al apoyo y asesoramiento cientifico del Dr. Gerardo Heinze Martin y del Dr. Ramón de la Fuente Muñiz, asi como al financiarαiento otorgado por la Fundación Gonzalo del Rio Arronte y por el Instituto Nacional de Psiquiatría Ramón de la Fuente Muñiz.

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con un proceso para la preparación y uso de una vacuna bivalente contra la adicción a la morfina-heroina, la cual es capaz de inducir una robusta respuesta inmunológica humoral contra estas dos drogas adictivas opiáceas a través de la inmunización activa en el ser humano. El proceso para la preparación de dicha vacuna bivalente consiste en el diseño, sintesis, purificación, aplicación y validación de la misma. El diseño estructural de esta vacuna consiste en la sintesis inicial y haptenización del derivado morfina-β-hemisuccinato al toxoide tetánico como proteina acarreadora, a través de un brazo molecular espaciador sintetizado secuencialmente a partir de la condensación covalente de dos reactivos heterobifuncionales de entrecruzamiento covalente, el 1-etil- 3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y el N- (e- Trifluoroacetilcaproiloxi) -succinimida-éster (TFCS) . Esta respuesta inmunológica humoral se caracteriza por la presencia de altos y sostenidos títulos de anticuerpos policlonales circulantes, los cuales reconocen y se unen con especificidad a estas dos drogas opiáceas en el torrente circulatorio y evitan su permeación hematoencefálica al tejido nervioso cerebral. La alteración de la farmacocinética de estas dos drogas, por el decremento significativo de la permeabilidad hematoencefálica de la fracción plasmática de morfina-heroina libre por la formación de complejos inmunes anticuerpo-opiáceo, es el mecanismo inmunoprotector que evita que estas dos sustancias opiáceas sean capaces de producir efectos adictivos en el modelo animal del roedor vacunado activamente con este inmunógeno durante la aplicación de paradigmas farmacológicos de autoadministración intravenosa adictiva de estas dos sustancias opiáceas. Por lo tanto, la presente invención, describe un proceso para la preparación de una vacuna bivalente contra la adicción a la morfina- heroína, la cual representa un nuevo inmunofármaco o composición farmacéutica o formulación terapéutica para aplicar, valorar y validar una nueva terapéutica antiadictiva contra estas dos drogas opiáceas, a través de su uso en procedimientos de vacunación activa en humanos . — o ~~

ANTECEDENTES DE IA INVENCIÓN

El abuso del consumo de sustancias ilícitas con acción psicotrópica adictiva es un problema serio de salud pública al nivel mundial y nacional. Por ejemplo, solo en los Estados Unidos, casi 48 millones de ciudadanos han aceptado el empleo de drogas ilícitas dentro de un periodo de un año (Neurobiological Adaptations to Psychostimulants and opiates as basis of treatment development. In: New Medications for Drug Abuse, K. Severino, A. Olivito and T. Rosten, 2000) . La problemática que se deriva de este problema de salud impacta seriamente el entorno de la estructura de vida pública, social, económica y médica de los países afectados. Desde el punto de vista nacional e internacional, las drogas de más alta morbilidad de consumo adictivo están representadas por psicoestimulantes del tipo de la cocaína y las anfetaminas, así como opiáceos del tipo de la heroína y en menor grado la morfina. En el entorno nacional, los datos epidemiológicos de la última encuesta nacional de adicciones (M. E. Medina-Mora y E. Rojas Guiot, Salud Mental, 26(2) : 1-11, 2003), muestran un incremento alarmante en el consumo de estas sustancias en regiones geográficas del centro y el norte fronterizo del país. Desde el punto de vista médico, existen diversas patologías co-mórbidas ligadas al abuso adictivo de sustancias ilícitas. Ejemplos representativos de éstas son el alto índice de muertes por los efectos tóxicos por sobredosis de estas sustancias, la inducción de efectos teratogénicos del recién nacido frecuentemente asociados al consumo crónico de madres embarazadas adictas, la alta incidencia a la adquisición de coinfecciones de tipo viral como el síndrome de inmunodeficiencia adquirida, frecuentemente observados en heroinómanos, así como aumentos en los índices de crimen, violencia y delincuencia asociados al comercio y consumos ilícitos de estupefacientes. En este contexto, es obvio el planteamiento de que existe una urgente necesidad de desarrollar programas gubernamentales de salud más eficaces para combatir, desde el punto de vista de la terapéutica médica, la adicción a sustancias de abuso ilegal. El estudio de las bases neurobiológicas de las adicciones ha comenzado en forma sistemática desde hace más de tres décadas. Desde el punto de vista de la adicción, estos estudios se han centrado en las dos grandes áreas generales de la farmacología; la farmacocinética y farmacodinamia. Desde el punto de vista farmacocinético, diversas consideraciones hay que resaltar en cuanto a sustancias químicas con potencial adictivo, ya que ellas poseen características farmacocinéticas muy particulares, de las cuales dependen importantemente la alta eficacia psicotrópica adictiva de sustancias como la cocaína y opiáceos del tipo de la heroína y morfina. La morfina, es un alcaloide con estructura química fenantrénica (ver ejemplo 1) derivado del extracto lechoso (goma de opio) de la planta Papaver somniferum, y es el compuesto mayoritario (> 10%) de este extracto junto con otros compuestos estructuralmente análogos como la codeína, tebaína y papaverina (C. P. O'Brien, Drug Abuse, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics . pp. 621-642, lOth ed. J. G. Hardman and L. E. Limbird, eds . McGraw HiIl, New York, 2001) . La heroína, es un derivado semisintético de la morfina, el cual a diferencia de ésta última que posee un grupo hidroxilo en posición 3 del anillo fenólico y otro hidroxilo alcohólico en la posición 6, tiene condensados dos grupos acetilo en estas mismas posiciones de la estructura anillada fenantrénica opiácea (C. P. O'Brien, Drug Abuse, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics. pp. 621-642, lOth ed. J. G. Hardman and L. E. Limbird, eds. McGraw HiIl, New York, 2001) . En general, la morfina y la heroína son absorbidas a partir de diferentes compartimientos, como son el tracto gastrointestinal, el tracto respiratorio, la mucosa bucal, así como del espacio subcutáneo, intramuscular, intravascular e intratecal. Desde el punto de vista adictivo, una característica farmacocinética notoria de estos dos opiáceos, es su alta capacidad para permear la barrera hematoencefálica debido a su alta lipofilicidad (C. P. O'Brien, Drug Abuse, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics. pp. 621-642, lOth ed. J. G. Hardman and L. E. Limbird, eds . McGraw HiIl, New York, 2001) . De hecho, la heroína es relativamente más liposoluble que la morfina y por lo tanto, permea más rápidamente la barrera hematoencefálica que esta última droga. La mayor via catabólica de la morfina es su conjugación enzimática, fundamentalmente en hígado, con el ácido glucurónido en las posiciones de los grupos hidroxilo 3 y 6 de su estructura fenantrénica, formándose asi, los intermediarios morfina 3, morfina 6 y en menos proporción, morfina 3-6-glucurónido. No obstante que estos intermediarios catabólicos son las formas estructurales de excreción (principalmente urinaria) de la morfina, todos ellos y más notoriamente la morfina-6- glucurónido, poseen importantes capacidades analgésicas y psicotrópico-adictivas, ya que una vez generados por sistemas enzimáticos específicos en el hígado, permean rápidamente la barrera hematoencefálica y activan el subtipo de receptor opioide mu (L. M. Kamendulis y col., J Pharmacol. Exper. Ther. 279:713-717, 1996; C. W. Hutto Jr y W. Crowder, Pharmacol. Biochem. Behav. 58 (1) : 133-140, 1997; A. J. Halliday y col., Life Sci. 65(2)225-236, 1999 y D. E. Selley y col., Biochem. Pharmacol. 62:447-455, 2001) . De hecho, estudios farmacocinéticos recientes (ver revisión en J. Halliday y col., Life Sci. 65(2)225-236, 1999) apoyan la idea de que las acciones analgésicas y/o adictivas de la morfina no son ejercidas predominante y directamente por ella misma al nivel central del sistema nervioso, sino más bien, por sus metabolitos de biotransformación final glucorinados . Diversos estudios (ver revisión en L. M. Kamendulis y col., J Pharmacol. Exper. Ther. 279:713-717, 1996 y A. J. Halliday y col., Life Sci. 65(2)225-236, 1999) muestran hallazgos farmacocinéticos y farmacodinámicos de la heroína similares a los de la morfina, ya que la heroína, una vez administrada, un porcentaje muy importante de ella es rápidamente catabolizada enzimáticamente, antes de llegar al tejido nervioso, en el plasma y/o el hígado, al compuesto intermediario de biotransformación monoacetil-6-morfina y subsiguientemente este último a morfina, y ésta a su vez, finalmente, a los derivados glucorinados antes mencionados (R. E. Aderjan y G. Skopp, Ther. Drug Monit., 20(5) : 561-9, 1998) . Estos hallazgos apoyan el concepto actual de que los verdaderos compuestos responsables de la adicción a la heroína, son entonces sus metabolitos intermediarios (V.g., 6-monoacetil-morfina y morfina) y finales de biotransformación (morfina-3-, morfina-6- y morfina-3-6- glucurónidos) , y no esta droga per se (A. J. Halliday y col., Life Sci. 65(2) : 225-236, 1999; D. E. Selley, y col., Biochem. Pharmacol. 62: 447-455, 2001 y C. P. O'Brien, Drug Abuse, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics . pp. 621-642, lOth ed. J.G. Hardman and L. E. Limbird, eds . McGraw HiIl, New York, 2001J . Desde el punto de vista farmacodinámico, existen una cantidad importante de estudios (ver revisión en E. J. Nestler, Nat. Neuroci. 5:1076-1079, 2002 y P. N. Deslandes y col., J. Pharmacy and Pharmacol. 54:885-895, 2002), los cuales nos han permitido identificar que el consumo crónico y la adicción a psicotrópicos adictivos como los opiáceos tipo heroína y morfina, causan el desarrollo y establecimiento a largo plazo de importantes y múltiples adaptaciones neurobiológicas de tipo electrofisiológico, neuroquimico y genómico en el sistema nervioso central del adicto a estas sustancias. Estas alteraciones tienen un curso temporal de desarrollo progresivo a lo largo del proceso adictivo de un sujeto y, además, se establecen y consolidan a largo plazo (V.g., años) en el cerebro del adicto. Asi, por lo tanto, el correlato de alteraciones conductuales sigue un curso temporal de aumento en la complejidad e intensidad de la sintomatologia del síndrome adictivo a estos opiáceos. Por ejemplo, el individuo que emplea la administración repetida de heroína realiza un conjunto de conductas compulsivas dirigidas a consumir la sustancia con formas y ritos estereotipados de administración, con fenómenos de tolerancia y abstinencia (K. Severino y col., Ann. NY Acad. Sci 909: 51- 87, 2000) . Asi, el consumo del opiáceo se convierte en la necesidad con mayor prioridad en el individuo, y aparece una gran facilidad para la reinstauración del consumo compulsivo después de un periodo de abstinencia. La neuroadaptación en el sindrome adictivo a opiáceos es causada por la acción repetida de la morfina/heroína sobre las neuronas de áreas cerebrales especificas, como son el locus coeruleus, el hipocampo, el hipotálamo lateral, el área ventral-tegmental, el complejo amigdalino, el núcleo acumbens, y la corteza prefrontal (K. Severino y col., Ann. NY Acad. Sci 909: 51-87 2000) . Estas áreas cerebrales forman, en conjunto, el sustrato neuroanatómico donde los opiáceos y otras drogas adictivas como la cocaína ejercen sus acciones biológicas de recompensa y reforzamiento al consumo de éstas sustancias (K. Severino y col., Ann. NY Acad. Sci 909: 51-87, 2000) . En general, la administración crónica sistémica de un opiáceo como la heroína y morfina, provoca el desarrollo de una serie de mecanismos homeostáticos sobre las neuronas de estas áreas cerebrales, consistentes en una serie de cambios en el funcionamiento neuronal al nivel electrofisiológico, bioquímico y genómico, cambios que en forma global están destinados a recuperar el nivel funcional previo a la acción de la droga (K. Severino y col., Ann. NY Acad. Sci 909: 51- 87,2002) . Una vez producida la neuroadaptación, si se deja de consumir la droga en forma abrupta, se produce una nueva serie de alteraciones en estas neuronas a los mismos niveles funcionales antes descritos, que es la base neuropatológica del sindrome de abstinencia durante la adicción. El sindrome de abstinencia a opiáceos del tipo de la morfina/heroina, a diferencia del producido por psicoestimulantes como la cocaína y anfetaminas, es particularmente intenso al nivel de alteraciones en el funcionamiento físico y mental del adicto a estas drogas (H. Ghodse, Drugs of abuse and dependence. In: Drugs and Addictive Behaviour, a guide to treatment, Blackwell Science Ltd, ed., Oxford, UK, pp. 72-119, 1995; G. F. Koob, Ann. N. Y. Acad. Sci. VoI. 909: 185 y K. Severino y col., Ann. N.Y. Acad. Sci. VoI. 909: 51-87, 2000) . Este síndrome está caracterizado desde el punto de vista clínico por cuatro diferentes etapas de desarrollo gradual. En las primeras horas (1-7 horas), se presentan alteraciones conductuales importantes en el adicto abstinente, caracterizadas por un deseo compulsivo y ansiedad extrema de búsqueda de consumo de la droga. En una segunda etapa (después de las 8-15 horas), se añaden alteraciones físicas como el intenso lagrimeo, así como extrema sudoración, rinorrea y aletargamiento. Más adelante, entre las 16-24 horas, los signos de alteración funcional se caracterizan por midriasis, piloerección, calambres musculares, oleadas de alteración en el control de la temperatura corporal con la percepción de intenso frío y calor, algias difusas, anorexia e irritabilidad general. Posteriormente, después de algunos días (2-6 días) , se agregan alteraciones conductuales como el insomnio, febrícula, retardo motor, dolor abdominal, náuseas, vómitos, diarrea, aumento de la frecuencia respiratoria, del pulso y de la presión arterial. La duración y gravedad del síndrome de abstinencia a estos opiáceos depende de la dosis total diaria usada de ellos, el tiempo de uso de ellos, el estado físico del paciente y los factores psicológicos de su personalidad. Asi, dada la complejidad de la historia natural de la enfermedad adictiva a morfina/heroina, los únicos tratamientos farmacológicos disponibles en la actualidad están dirigidos hacia la modificación de las acciones farmacodinámicas de estos dos opiáceos en las neuronas del tejido nervioso (D. M. Grilly, Opioids (narcotics) and their antagonists. In: Drugs and human behaviour, 4th ed. pp.238- 262, Allyn and Bacon, eds . USA, 2002) . El tratamiento inicial del adicto crónico a estas dos sustancias es de urgencia y fundamentalmente sintomático, y pueden prescribirse benzodiacepinas y/o neurolépticos sedantes . A diferencia del tratamiento desintoxicante contra estos dos opiáceos, durante el síndrome de abstinencia a ellos, se desaconseja administrar opiáceos que cronifiquen la demanda, como es el caso de la metadona y/o buprenorfina, y más aún, antagonistas de receptores opioides del tipo de la naloxona y/o naltrexona. En general, el tratamiento del síndrome de abstinencia y de manutención a estos opiáceos requiere de ingreso hospitalario y cuidados clínicos especializados, por lo cual, se necesitan cuidados de personal especializado, que en la mayoria de los casos es de alto costo económico. Al igual que el síndrome de abstinencia, la desintoxicación del enfermo adicto (abandono del consumo de la droga) a la morfina/heroína es una problemática de salud importante. Como se mencionó anteriormente, si tomamos en cuenta la variada gama de alteraciones funcionales del cerebro que produce el consumo crónico de opiáceos, alteraciones que se establecen a largo plazo en estos pacientes, entonces comprendemos la dimensión de la dificultad para restablecer el funcionamiento homeostático cerebral previo al consumo de estas sustancias por la terapéutica desintoxicante disponible en la actualidad. Así por ejemplo, un tratamiento desintoxicante ideal debería de contemplar y satisfacer los siguientes objetivos: a) eliminar la dependencia fisiológica y mental al opiáceo, restableciendo el equilibrio funcional de los sistemas neurales alterados por el consumo crónico a estas sustancias; b) disminuir o inhibir las alteraciones físicas y conductuales que aparece en el síndrome de abstinencia inducido terapéuticamente, haciendo de éste una experiencia tolerable; c) proporcionar un tratamiento humano y seguro que facilite la inicial suspensión del consumo, y reorientar al adicto hacia otras modalidades de tratamiento (V.g., psicoterapéutico) y, adicionalmente, evitar las recaídas subsiguientes de consumo a estos opiáceos después de haberse logrado la desintoxicación. Como se nota, en forma global, los retos terapéuticos de la adicción a la morfina/heroina son enormes, y en la mayoria de los casos, dificiles de lograr. Los principales obstáculos a los que se enfrenta, son la deficiencia en un número adecuado de centros hospitalarios especializados en estos tratamientos, el alto costo económico que estos tratamientos implican usualmente para los pacientes adictos a estas sustancias, e importantemente, la falla en el seguimiento, valoración clinica y tratamiento psicoterapéuticos de apoyo a largo plazo (V.g., años) que requieren estos individuos para evitar las recaidas en el cuadro adictivo otra vez. Adicionalmente, otra problemática a la que se enfrentan los esquemas terapéuticos antiadictivos contra estos dos opiáceos, es la toxicidad colateral que muchos de estos agentes farmacológicos inducen por su dosificación crónica en forma individual o combinada, durante los esquemas de desintoxicación aguda, durante el tratamiento de manutención en el sindrome de abstinencia y durante el tratamiento a largo plazo para evitar las recaídas al consumo adictivo a estos opiáceos (K. Sevarino y col., Ann. N. Y. Δcad. Sci 909: 51-87, 2000) . Por ejemplo, los tratamientos desintoxicantes del síndrome adictivo a estos opiáceos empleados más frecuentemente en la actualidad, emplean fármacos agonistas de los receptores OÍ-2 adrenérgicos como la clonidina, guanfacina y la lofexidina para disminuir los signos y sintonías de la abstinencia por la supresión abrupta del consumo de la morfina/heroína. Los efectos secundarios más importantes producidos por estos fármacos son la sedación e hipotensión, ansiedad extrema y astenia. Un fármaco que se emplea rutinariamente en las clinicas especializadas de desintoxicación para bloquear el sindrome de abstinencia opiácea es la metadona (M. J. Kreek, Ann. N. Y. Acad. Sci, 909:186-216, 2000) . Esta sustancia es un agonista parcial del receptor opioide mu, el subtipo de receptor opioide que es activado y a través del cual es mediada más importantemente la adicción por la morfina y heroina. Los efectos secundarios más importantes del tratamiento con metadona, son trastornos en el dormir, ansiedad y alteraciones importantes sobre funciones de cognición y del talante emocional. Asimismo, en algunos casos, no es extraño observar el desarrollo de dependencia y adicción a este fármaco, dado que es un agonista del receptor mu, por lo cual, la supresión del tratamiento con esta sustancia ocasiona diversos grados de sindrome de abstinencia opiácea. Otros opiáceos como la buprenorfina y pentazocina, agonistas parciales del receptor opioide mu, también son empleados, predominantemente, en la clinica de manutención para el tratamiento del sindrome de abstinencia a la morfina/heroina (M. J. Kreek, Ann. N. Y. Acad. Sci, 909:186-216, 2000) . Sin embargo, los efectos colaterales que producen estas sustancias son muy similares a los producidos por la metadona. En términos de los tratamiento farmacológicos de manutención, para evitar las recaidas del paciente desintoxicado al consumo adictivo a la morfina/heroina, los fármacos más empleados en la actualidad son la naloxona y naltrexona, dos antagonistas del receptor opioide mu (M. J. Kreek, Ann. N. Y. Acad. Sci, 909:186-216, 2000) . Los efectos colaterales por la dosificación a largo plazo de estas dos sustancias están relacionados al bloqueo de la transmisión opioide endógena del sistema nervioso en las esferas de funciones de cognición y del talante emocional. En resumen, podemos concluir que, no obstante que existen diversos tratamientos farmacológicos disponibles en la actualidad para la desintoxicación, manutención durante la abstinencia, asi como el tratamiento preventivo de recaidas a la adicción a la morfina/heroina, ninguno de ellos ha mostrado todavía eficacia óptima y, más aún, los distintos fármacos empleados para estos fines terapéuticos, desarrollan importante efectos colaterales tóxicos en los pacientes en tratamiento, sobre todo en aquellos sometidos a largos periodos de terapéutica de manutención de la abstinencia y de la prevención de las recaidas (T. Kosten y D. Biegel, Expert Rev. Vaccines, 1(3) : 89-97, 2002) . Asi, por lo tanto, existe la urgente necesidad de desarrollar nuevas estrategias terapéuticas antiadictivas, a través del proceso de preparación y uso de nuevos fármacos con más eficacia y menos toxicidad colateral durante su administración a largo plazo en estas terapias. Es por eso, que se dan a conocer los documentos del estado de la técnica relacionados con la presente invención, los cuales se mencionan a continuación con el propósito de incluirlos tan solo como referencias. En este contexto, diversos grupos de investigación han diseñado, aplicado y validado diversas estrategias terapéuticas al nivel pre-clinico, en modelos animales de experimentación, las cuales están basadas en un mecanismo farmacocinético común. Este último, a diferencia de la farmacologia antiadictiva clásica, se basa en la aplicación de intervenciones experimentales para disminuir significativamente y/o evitar la permeación hematoencefálica de la fracción de "droga libre" plasmática de sustancias con alta potencia farmacológica adictiva. Estos acercamientos experimentales, están dirigidos a evitar importantemente la permeación hematoencefálica de adictivos mediante anticuerpos especificos que reconozcan y unan a estas sustancias en el espacio intravascular sistémico. Ya que las inmunoglobulinas (anticuerpos) normalmente no permean la barrera hematoencefálica, la formación de complejos droga-anticuerpos disminuye importantemente la fracción plasmática de "droga libre" que sería la única disponible para permear esta barrera orgánico-funcional en el cerebro. Esta alteración farmacocinética de las drogas adictivas conlleva finalmente a la ausencia de acciones farmacodinámicas en las células neurales del cerebro, y así por lo tanto, la administración de la droga adictiva no causa el desarrollo y percepción del efecto reforzante en el consumidor de ella, el cual es el placer intenso. Ya que uno de los factores farmacocinéticos importantes que comparten las drogas con alta potencia farmacológica es su alta cinética de permeación hematoencefálica, el cual parece ser esencial para ejercer sus acciones de generación de recompensa placentera y, por lo tanto, de desarrollar efectos reforzantes importantes al consumo reiterado de estas sustancias, el antagonismo de permeación hematoencefálica por anticuerpos específicos contra drogas adictivas ha demostrado efectos imunoprotectores para mantener la abstinencia del consumo adictivo de drogas como la cocaína y la nicotina en el modelo animal del roedor (T. Kosten y D. Biegel, Expert Rev. Vaccines, 1 (3) : 89-97, 2002 y K. Kantak, Drugs, 63(4) : 342- 352, 2003) . En relación a la cocaína, diferentes grupos de investigación han logrado implementar y desarrollar estrategias experimentales centradas en el diseño, síntesis, aplicación y validación de diferentes preparaciones de conjugados inmunogénicos de proteínas acarreadoras-cocaína (Kantak y col., Psychopharmacology 148:251-262 2000; Fox, B. S. y col., Nat. Medicine, 2:1129-1132, 1996; Sparenborg y col., Therapeutics 293 (3) : 952-961, 2000; Carrera y col., Nature, 378:727-730, 1995, Carrera, R y col., Proc. Nat. Acad. Sci, USA, 97(11)6202-6206, 2000) . El tipo de proteinas acarreadoras usadas han sido la BSA y la KLH, las cuales se han acoplado covalentemente, a través de diversos procedimientos quimicos, a la cocaína, con el fin de generar inmunógenos que confieran inmunogenicidad a esta droga en procedimientos de inmunización activa en el roedor. Adicionalmente, otro acercamiento experimental inmunoprotector contra la adicción a la cocaína, ha usado la generación de anticuerpos monoclonales convencionales y/o catalíticos y el uso de ellos en la inmunización pasiva contra esta droga en el modelo animal del roedor (Metz y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:10176-10180, 1998; Fox y col., Nat. Med. 2:1129-1132, 1996 y Landry y col., Science, 239:1899-1901, 1993) . Los efectos inmunoprotectores antiadictivos de estas estrategias experimentales han sido demostrados a través del bloqueo de conductas adictivas en el roedor, mediante el empleo de paradigmas farmacológicos de autoadministración intravenosa de diferentes dosis de cocaína. El mecanismo común antiadictivo de estas estrategias experimentales, se basa en la disminución significativa y/o la inhibición total de la permeación hematoencefálica de la fracción plasmática de "droga libre" de cocaína, a través de su unión física en el espacio intravascular sistémico por anticuerpos específicos séricos en animales hiperinmunes vacunados activamente (Kantak y col., Psychopharmacology, 148:251-262, 2000; Carrera y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 97 (11) : 6202-6206, 2000; Carrera y col., Nature, 378:727-730, 1995), o por la administración intravenosa de anticuerpos monoclonales contra esta droga (Metz y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 95:10176-10181, 1998; Fox y col., Nat. Med. 2:1129-1132, 1996, Benowitz, Pharmacol. Toxicol. 72:3-12, 1993) . Esta alteración inmunológica, en la farmacocinética de la cocaína, resulta finalmente en una disminución significativa y/o ausencia de la unión de dicha droga a los transportadores aminérgicos neuronales, y por ende, a la incapacidad de esta droga para aumentar las concentraciones sinápticas de estos transmisores y, asi por lo tanto, en el incremento del tono funcional de los sistemas transmisores catecolaminérgico-dependientes. El escenario conductual final de estos eventos neuroquimicos es la ausencia de la intensa recompensa "placentera" que produce la administración de cocaína en los mamíferos. Por lo tanto, si la cocaína no produce "placer" o "bienestar" como recompensa cuando se administra en animales inmunes a ella, esta droga pierde su capacidad adictiva en ellos, al inhibirse el comportamiento de búsqueda y su consumo subsiguiente, al no existir el efecto reforzante y la conducta de "búsqueda compulsiva" (craving, por sus siglas en inglés) de esta droga. No obstante los beneficios prometedores de la inmunoprotección para el tratamiento antiadictivo contra la cocaína, los trabajos experimentales de fase pre-clinica relacionados al desarrollo y validación de este acercamiento terapéutico han sido aplicados en el roedor, con el diseño y síntesis de preparaciones inmunogénicas (V.g., vacunas) que emplean proteínas acarreadoras (V.g., BSA y KLH) las cuales no tienen un empleo permitido en la preparación de vacunas para su aplicación en esquemas de inmunización en el humano (Carrera y col, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 2001; Carrera y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 2000; Carrera y col., Nature, 378:727-730,1995; Kantak y col., Psychopharmacology, 148:251-262, 2000; Ettinger y col., Pharmacol . Biochem. Behav. 58:215-220, 1997 y Fox, Drug and Alcohol Depend. 48:153-158, 1997) . Asimismo, la inmunoterapia pasiva anticocaina con anticuerpos monoclonales convencionales y/o catalíticos de ratón, solo se ha experimentado en roedores, y tiene la limitación de conferir inmunoprotección solamente a corto plazo, debido a la rápida depuración metabólica sérica a las que son sujetas las inmunoglobulinas cuando son dosificadas en forma pasiva (Goldsby y col., Vaccines . In: Kuby Immunology, 4th ed. Freeman and Co. New Cork, NY, pp. 449-466, 2000) . Asimismo, el empleo potencial de estos anticuerpos monoclonales anti-cocaina como agentes inmunológicos-terapéuticos de la adicción a esta droga en el humano, requiere previamente del trabajo experimental de la humanización molecular de las porciones estructurales Fc de estas inmunoglobulinas, mediante técnicas moleculares de recombinación del ADN. Adicionalmente, existe un solo estudio reciente que muestra el desarrollo de una vacuna anti-cocaina diseñada estructuralmente para su aplicación en esquemas de vacunación activa contra esta droga en el humano. Esta vacuna, en la cual la cocaína es acoplada covalentemente a una preparación de toxina recombinante del cólera como proteina acarreadora, demostró inicialmente efectos inmunoprotectores óptimos contra la adicción a esta droga en el modelo animal del roedor (Kantak y col., Psychopharmacology, 148 :251-262, 2000) . Desafortunadamente, los resultados preliminares de estudios de Fase Clínica I de vacunación activa con este inmunógeno en humanos voluntarios (R. Rosten y col., Vaccine 2559:1-9, 2001), resultaron poco promisorios, ya que la inmunización activa con esta preparación inmunogénica generó una muy pobre respuesta inmunológica humoral contra la cocaína, caracterizada por muy bajos títulos séricos de anticuerpos específicos (0.001-0.05 mg/ml de suero) en humanos voluntarios. Debido a esta problemática y limitaciones experimentales, se están actualmente desarrollando nuevas vacunas contra la cocaína con distintas proteínas acarreadoras, con el objeto de generar alta inmunogenicidad contra esta droga en el humano en estudios de Fase Clínica I, y asi, estar disponibles para su evaluación subsiguiente de sus capacidades de generar inmunoprotección humoral contra la adicción a este psicoestimulante en la Fase Clínica II, en humanos voluntarios, exadictos a esta droga, en estadio de abstinencia, los cuales sean sometidos al reto farmacológico de readquisición del patrón de consumo adictivo a este mismo psicoestimulante. En relación a la nicotina, existen al menos dos preparaciones inmunogénicas de esta droga cuya formulación química ha sido diseñada para su dosificación en humanos (T. Rosten y D. Biegel, Expert Rev. Vaccines, l(3) :89-97, 2002; K. Kantak, Drugs, 63(4) : 341-352, 2003) . Desde el punto de vista de estudios pre-clinicos, estas dos vacunas muestran capacidad para generar respuestas moderadas (V.g., 0.05-0.2 mg/ml de suero) de títulos de anticuerpos séricos específicos contra la nicotina en roedores vacunados activamente. Adicionalmente, la vacunación activa con estas preparaciones inmunogénicas de nicotina, ha demostrado efectos inmunoprotectores contra la adquisición de conductas de autoadministración intravenosa adictiva de esta droga en el roedor, a través del mecanismo farmacocinético de la disminución significativa de la permeabilidad hematoencefálica de nicotina por la unión de anticuerpos séricos específicos a esta droga en el espacio intravascular sistémico. Los estudios de Fase Clínica para la evaluación de la toxicidad e inmunogenicidad de estas dos vacunas han sido reportados como exitosos, en forma independiente, tanto por la Compañía Nabi Pharmaceuticals (Vacuna anti-nicotina NicVAX) y por el grupo farmacéutico Xenova en Bélgica. En los próximos dos años se esperan reportes sobre la evaluación de la capacidad inmunoprotectora de estas dos vacunas contra la adicción a la nicotina en estudios de Fase Clínica II en humanos voluntarios adictos a esta droga. El desarrollo del acercamiento experimental de vacunación para el tratamiento de la adicción a drogas fue de hecho, generado en forma pionera, no para drogas como la cocaína ni la nicotina, sino para la morfina/heroina. En retrospectiva, a principios de la década de los 70's, diversos trabajos experimentales mostraron la factibilidad de generar respuesta inmunológica humoral contra estos opiáceos en diversos modelos animales de vacunación como la rata y el conejo (S. Spector y C. W. Parker, Science, 168:1347- 1348,1970; S. Spector, J. Pharmacol . Exp. Ther, 178:253-258, 1971; E. L. Adler y C. Liu, J. Immunol, 106:1684-1685, 1971; H. Van Vunakis y col., J. Pharmacol. Exp. Ther. 180:514-521, 1972; B. H. Wainer y col., Science, 176:1143-1145, 1972; B.H. Wainer y col., Science, 178:647-648, 1972 y B.H. Wainer y col., J. Immunol. 110:667-673, 1973) . El objetivo central de estas lineas experimentales fue la generación de anticuerpos policlonales contra la morfina, con capacidad de reconocimiento inmunológico cruzado para la heroina y otros análogos estructurales como la codeina, meperidina, e hidromorfona, con fines del uso de estos anticuerpos, en el diseño e implementación de inmunoensayos (V.g., radioinmunoensayo y ensayos inmunoenzimáticos de ELISA) para detectar y cuantificar estos opiáceos en líquidos biológicos del humano. De hecho, en estos trabajos se diseñaron y validaron procedimientos básicos de química orgánica para condensar covalentemente proteínas acarreadoras como la BSA a los grupos hidroxilo de las posiciones 3 y 6 de la estructura fenantrénica de la morfina, los cuales todavía siguen vigentes en su uso para estos fines experimentales . Adicionalmente, cabe mencionar que ninguno de estos procedimientos fue ulteriormente reportado y reclamado con registro de patente, por lo cual, se consideran de uso clásico general de libro de texto en la química orgánica de activación de enlace covalente de la morfina, a través de los grupos hidroxilo en la posición 3 y 6 de la estructura fenantrénica de este opiáceo. En este contexto, dos distintos derivados estructurales de la morfina han sido rutinariamente preparados por diversos grupos de investigación. Por un lado, se ha sintetizado un derivado carboximetil éter de la morfina en la posición 3-orto (3-0-carboximetilmorfina, ver ejemplo 2) (S. Spector y C. W. Parker, Science, 168:1347, 1970; S. J. Spector, J. Pharmacol. Exp. Ther, 178:253, 1971; H. Van Vunakis y col., J. Pharmacol. Exp. Ther, 180:514, 1972 y S. Gross y col., Immunochemistry 11: 453-456, 1974) . De hecho, existen dos registros idénticos de patente publicados el 13 de septiembre de 1991 (CH 678394 A5) y el 15 de mayo 1996 (EP 0 496 839 Bl) por Erich Hugo Cerny, los cuales describen la sintesis y reclaman la formulación estructural de una vacuna contra la morfina. Sin embargo, es pertinente mencionar que en estos registros de patente, no existe realmente novedad ni invención en esta formulación terapéutica, ya que este autor uso la conjugación covalente de este opiáceo a la proteina acarreadora KLH, a través del mismo procedimiento estándar de síntesis reportado previamente para la generación de este derivado 3-O-carboximetilmorfina, a partir de la reacción de morfina base con el reactivo beta-cloracetato de sodio en presencia de alcohol absoluto. Adicionalmente, el otro derivado usualmente sintetizado para la activación de enlace covalente de la morfina con proteínas acarreadoras, es un succinil éster de la morfina en la posición 6 de su estructura fenantrénica (morfina-6-hemisuccinato, ver ejemplo 3) (B. H. Wainer y col., Science, 176:1143, 1972, A. Akbarzadeh y col., Biotechnol. Appl. Biochem, 30:139-145, 1999) . Al igual que en el caso antes mencionado, para el procedimiento de síntesis del derivado 3-O- carboximetilmorfina, también ha sido otorgado, y en nuestra evaluación científica injustificadamente, un registro de patente de vacuna anti-morfina (CN1196955) en China, a Han Ying y colaboradores el 28 de octubre de 1998, ya que estos autores reclaman innovación y novedad del procedimiento de síntesis y la formulación estructural de preparaciones de vacunas de diversos opiáceos alcaloides incluyendo a la morfina, a través del uso del método estándar de síntesis del derivado morfina-6-hemisuccinato reportado previamente para lograr la activación de condensación covalente y haptenización de este opiáceo a la proteina acarreadora BSA. En el diseño y la síntesis de todos los inmunógenos dónde la morfina se haptenizó con proteínas acarreadoras como la KLH y la BSA, reportados en los trabajos científicos experimentales y en los registros de patente antes mencionados, los autores han invariablemente usado el acoplamiento covalente de los dos derivados estructurales activados de la morfina antes mencionados (V.g., 3-0- carboximetilmorfina y morfina-6-hemisuccinato) , con estas proteínas acarreadoras, a través del uso de un reactivo químico heterobifuncional de entrecruzamiento covalente llamado l-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) . Este compuesto, reacciona inicialmente con los grupos carboxilo libres disponibles en los derivados 3-0- carboximetilmorfina o de la morfina-6-hemisuccinato, para formar los dos correspondientes intermediarios O-acilurea, los cuales son capaces de reaccionar químicamente para formar enlaces covalentes de tipo amida, a través de los grupos amino epsilón de la cadena lateral de los residuos de lisinas de las proteínas acarreadoras BSA o KLH (ver ejemplo 4) . Los diversos reportes experimentales que demostraron la factibilidad de generar respuesta inmunológica humoral contra la morfina y sus congéneres estructurales como la heroína, sirvieron de base para la generación de un estudio, reportado hace casi 30 años, por el grupo de trabajo de Bonese y colaboradores (K. F. Bonese y col., Nature, 252:708-710, 1974), en el cual se demostró, por primera vez, la eficacia del uso de un inmunoconjugado de la morfina en vacunación activa para inducir respuesta inmunológica humoral contra esta droga, en solamente un animal de experimentación, un primate no humano de la especie Macacus rhesus. Para la síntesis de este inmunoconjugado se haptenizó covalentemente la morfina a la proteína acarreadora BSA a partir de la síntesis inicial del derivado morfina-6-hemisuccinil condensado a la l-etil-3- (3-Dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) . La síntesis inicial de este conjugado inmunogénico, consistió en la generación inicial de un intermediario reactivo de la morfina a través de la condensación covalente del anhídrido succinico por un enlace éster al grupo hidroxilo alcohol de la posición 6 de la estructura fenantrénica de la morfina. La administración subcutánea repetida de este inmunógeno en este primate fue capaz de generar una respuesta inmunológica humoral de anticuerpos séricos específicos para la morfina, con afinidad equivalente para su análogo estructural, la heroína. Asimismo, la vacunación activa con este inmunógeno fue capaz de antagonizar significativamente el restablecimiento de la conducta de autoadministración intravenosa adictiva de heroína en este primate pre-entrenado a autoadministrarse adictivamente este opiáceo. Sin embargo, no obstante que este reporte pionero mostraba la eficacia del procedimiento de antagonismo de anticuerpo sobre la conducta adictiva contra la heroína, jamás se patento, ni se reportaron estudios sistemáticos subsiguientes para reproducir estos datos de inmunoprotección antiadictiva contra estas drogas en el primate, ni tampoco en otras especies animales (V.g., roedor y humano) . Asimismo, tampoco se generaron ni publicaron reportes experimentales subsiguientes dirigidos hacia el diseño, síntesis y validación de nuevos modelos estructurales de vacunas anti-morfina/heroina con proteínas acarredoras adecuadas para vacunación humana, ya que la BSA, empleada originalmente por el grupo de Bonese en este reporte, no es de uso permitido en vacunación humana. Quizá, la justificación principal del porqué no se llevaron a cabo estos estudios, fue principalmente debida al intenso, simultáneo y constante desarrollo desde entonces, de otros acercamientos neurofarmacológicos antiadictivos contra la morfina-heroina, con fármacos de acción agonista débil sobre el receptor opioide mu, como la metadona y/o, para la prevención de las recaídas del síndrome adictivo a estas dos drogas mediante el empleo de fármacos con acción antagonista sobre este subtipo de receptor opioide como la naltrexona y la naloxona. Un trabajo experimental desarrollado recientemente, que sirvió como base para el desarrollo de la presente invención de vacuna bivalente contra la adicción a la morfina-heroina, es un trabajo experimental preliminar llevado a cabo por nuestro grupo de trabajo sobre el diseño, síntesis y valoración experimental de la inmunogenicidad de una nueva generación de modelos estructurales de vacunas anti-morfina/heroina (B. Antón and P. Leff., 31st Annual Meeting of the Society for Neuroscience . San Diego, CA. Noviembre, 10-16, 2001), sintetizadas a partir de la condensación covalente del derivado morfina-6-hemisuccinato (M-6-H) a diversas proteínas acarreadoras como la BSA, KLH y subunidad B de la toxina del cólera recombinante a través del la metodología estándar de entrecruzamiento covalente con 1- etil-3- (3-Dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) . Los resultados experimentales de estos estudios hicieron posible la identificación de proteinas acarreadoras candidatas para la haptenización covalente de la morfina. Es pertinente aclarar, que este trabajo fue solamente presentado en forma de sesión oral en este Congreso Internacional de Neurociencias, pero ningún dato experimental de diseño, síntesis y métodos de dosificación de estas nuevas vacunas fueron revelados. Asimismo, tampoco la estructura molecular ni los procedimientos de diseño, síntesis, purificación, aplicación, uso y validación de los efectos antiadictivos contra la morfina-heroina revelados en la presente invención de formulación terapéutica de vacuna bivalente contra estos opiáceos fueron tampoco mencionados ni mostrados en esta presentación científica. En adición a los datos de Bonese y colaboradores, también se ha evaluado y demostrado el efecto inmunoprotector de la inmunización pasiva contra la morfina sobre el comportamiento de la autoadministración intravenosa adictiva de heroína en el roedor (P. R. Pentel y col., Pharmacol . Biochem. And Behavior, 9:347-352, 1991) . Desde el punto de vista del potencial terapéutico, a diferencia del procedimiento de inmunización activa, la inmunoprotección pasiva contra la adicción a opiáceos del tipo de la morfina y la heroína tiene importantes limitaciones como terapéutica a largo plazo, específicamente en la manutención de la abstinencia del síndrome adictivo a estas drogas en el humano. En primer término, existen múltiples estudios en el campo experimental de la inmunoprotección pasiva (R. A. Goldsby, Vaccines. In: Kuby Immunology, 4th ed. Freeman and Co, New Cork, N. Y., pp. 449-466, 2000), los cuales han demostrado una vida media biológica relativamente corta (3-23 dias, dependiendo de la clase e isotipo de inmunoglobulina) de anticuerpos monoclonales murinos administrados in vivo en otras especies animales. Así, cuando se administran pasivamente anticuerpos de esta naturaleza, los efectos inmunoprotectores que ellos confieren al huésped son generalmente de corta duración. Adicionalmente, tanto los anticuerpos monoclonales o policlonales empleados normalmente en terapias de inmunización pasiva, son producidos en otras especies animales (V.g., ratón, conejo, etc.), y por lo tanto, estas inmunoglobulinas serían vistas como proteínas extrañas y antigénicas en el humano. En este contexto, un paciente dosificado con estas inmunoglobulinas generaría una rápida respuesta inmunológica humoral contra estas moléculas, lo cual conllevaría a la neutralización de su capacidad funcional y reducción significativa de su vida media biológica. Finalmente, una vez generada esta respuesta antigénica por el huésped, la administración pasiva subsiguiente de estos anticuerpos generaría la inducción de respuestas inmunológicas patológicas de hipersensibilidad. OBJETIVOS Y VENTAJAS DE LA INVENCIÓN

En forma global, y en base a todos los antecedentes descritos con anterioridad en relación a las terapéuticas antiadictivas contra opiáceos como la morfina y heroína, podemos concluir que todavía no existen fármacos eficaces y atóxicos para la manutención a largo plazo de la abstinencia y de la prevención de las recaídas del consumo adictivo a estas sustancias en el humano. En este contexto, entonces, es obvia la justificación de la necesidad actual que existe por el desarrollo, aplicación y validación, tanto de nuevos fármacos, asi como de nuevas estrategias terapéuticas para mantener la abstinencia y evitar las recaídas a la adicción a estos dos opiáceos de alta morbilidad y potencia farmacológica adictiva en el humano. Ya se mencionó con anterioridad, que existen diversos reportes experimentales en estudios de fases pre-clinicas en modelos animales de experimentación, los cuales hacen factible apoyar el potencial terapéutico importante que representan las diferentes estrategias de inmunoprotección contra la adicción a drogas como la cocaína, nicotina y opiáceos como la morfina y heroína, como nuevos tratamientos farmacológicos de antagonismo de anticuerpos para la manutención a largo plazo de la abstinencia y/o de la prevención de las recaídas de la adicción a estas sustancias en el humano. De hecho, el mayor legado que nos han dejado estos estudios pre-clinicos inmunoprotectores contra la adicción, es la identificación de los logros experimentales que se necesitan alcanzar al nivel experimental preclinico y de estudios de Fase Clínica I-II-III, para validar en el humano, el empleo rutinario de estas estrategias inmunológicas para el tratamiento de manutención de la abstinencia y/o prevención de las recaídas a síndromes adictivos contra estas sustancias de abuso ilegal. En este contexto, podemos mencionar los siguientes objetivos: a) Diseño y síntesis de formulaciones estructurales de vacunas antiadictivas donde la droga hapténica sea acoplada estructuralmente y por enlaces covalentes muy estables (V.g., amida) , a través de compuestos químicos bifuncionales de entrecruzamiento covalente de muy escasa complejidad estructural y baja inmunogenicidad, a proteínas acarreadoras de uso permitido en vacunación humana, de probada atoxicidad, y que confieran una muy alta inmunogenicidad a la droga hapténica cuando el conjugado sea dosificado en esquemas de inmunización activa; b) Evaluación sistemática y completa de las respuesta inmunológica humoral a la droga hapténica del conjugado, de tal forma que, se caractericen los parámetros funcionales de títulos séricos, especificidad y avidez de los anticuerpos generados contra la droga adictiva por la administración de su inmunoconjugado a través de la aplicación de un esquema de vacunación activa ad hoc; c) Monitoreo sistemático de la respuesta inmunológica humoral durante la vacunación activa con el conjugado inmunogénico de la droga hapténica, de tal forma que se logre identificar la consolidación de memoria humoral a largo plazo contra la droga antigénica después de la aplicación completa de un esquema de inmunización activa y; d) Capacidad y eficacia de esta nueva formulación terapéutica de vacuna contra la adicción a la morfina-heroina, que administrada subcutáneamente en un esquema de vacunación activa, es capaz de conferir inmunoprotección contra estas dos drogas a largo plazo para evitar la readquisición de la conducta adictiva a estas mismas sustancias en sujetos desintoxicados y abstinentes a ellas . Es asi, que la presente invención se relaciona con el diseño, síntesis, purificación, aplicación y validación de un nuevo modelo estructural de vacuna contra la adicción a la morfina y heroína, que cumple con todos los requisitos funcionales antes mencionados. Se revela la descripción en detalle de los procedimientos de síntesis y la estructura de este conjugado de proteina acarreadora-morfina, asi como el procedimiento de inmunización activa, de monitoreo del establecimiento y consolidación de la respuesta inmunológica humoral y los títulos y especificidad de los anticuerpos generados contra la droga hapténica. Adicionalmente, se revelan datos experimentales que demuestran la eficacia de la presente invención de formulación terapéutica de vacuna bivalente anti-morfina-heroina, para generar una respuesta inmunológica humoral de altos y sostenidos títulos de anticuerpos séricos contra la morfina, con reactividad inmunológica cruzada equivalente para la heroína, en sujetos desintoxicados y en estado de abstinencia a estos dos opiáceos. Estos anticuerpos son capaces de antagonizar la readquisición de la conducta de consumo adictivo y mantener el estado de abstinencia a estas dos sustancias, en sujetos hiperinmunes, sometidos al reto de un paradigma farmacológico estándar de autoadministración intravenosa adictiva de estos dos opiáceos . Un objetivo inicial de la presente invención, es revelar y proveer el método de síntesis y la formulación estructural de un nuevo inmunógeno de morfina, el cual tiene las siguientes ventajas estructurales y funcionales, que no han presentado con anterioridad ningún otro inmunógeno sintetizado para esta droga: a) Haptenización de la morfina al toxoide tetánico, una proteina acarreadora con capacidades demostradas para conferir muy alta inmunogenicidad a haptenos de baja masa molecular y de uso permitido en protocolos de vacunación activa en el humano; b) Haptenización de la morfina al toxoide tetánico a través del uso secuencial y condensación covalente con dos reactivos de entrecruzamiento covalente, los cuales dan origen a la formación de un brazo molecular espaciador entre la proteina acarreadora y el hapteno significativamente más largo y con muy baja inmunogenicidad; c) Este nuevo inmunógeno de morfina fue dosificado en paradigmas de vacunación activa en sujetos, y demostró una probada eficacia para generar una robusta y sostenida respuesta inmunológica humoral con anticuerpos séricos de alta especificidad para este opiáceo y su análogo estructural la heroina. Otro objetivo de esta invención, es revelar y validar un paradigma de inmunización activa con este conjugado para optimizar una respuesta inmunológica humoral con altos títulos de anticuerpos anti-hapteno y con memoria a largo plazo. Otro objetivo de esta invención, es mostrar la optimización del titulo y especificidad de estos anticuerpos para demostrar su capacidad de reconocimiento inmunológico cruzado contra la heroina, pero no para otros opiáceos estructuralmente relacionados a la morfina ni para sustancias peptidicas opioides endógenas . Otro objetivo de esta invención, es validar el empleo de este inmunógeno, como una composición farmacéutica o formulación terapéutica, para conferir inmunoprotección contra la adquisición de conductas adictivas contra la morfina y heroina y para la manutención del estado de abstinencia en sujetos experimentales desintoxicados del estadio adictivo a estos dos opiáceos. Otro objetivo adicional de la presente invención, es proveer la síntesis y estructura de una formulación terapéutica de vacuna contra la morfina/heroina, validada en estudios preclinicos en el modelo animal del roedor, la cual, al emplear toxoide tetánico como proteina acarreadora inmunogénica para la haptenización covalente de la morfina, tiene el potencial de ser empleada en fases clínicas de experimentación, para evaluar sus efectos de generar inmunoprotección a largo plazo, para mantener la abstinencia y evitar las recaídas de sujetos desintoxicados del síndrome adictivo a estas drogas. Finalmente, otro objetivo de la presente invención, es revelar la metodología general para diseñar, desarrollar, aplicar y validar una terapéutica eficaz y atóxica, que a diferencia de las composiciones terapéuticas clásicas disponibles actualmente, su mecanismo de acción se basa en el principio de alteración de la farmacocinética de drogas adictivas, a través de un mecanismo de disminuir significativamente la permeación hematoencefálica de estas sustancias, una vez que son administradas por un sujeto hiperinmune a estas drogas. Es asi, como en la presente invención, se dan a conocer el proceso de preparación de derivados intermediarios para la síntesis de la vacuna morfina/heroina, composiciones farmacéuticas o formulaciones terapéuticas, métodos y usos terapéuticos contra la adicción a la morfina-heroína.

BREVE DESCRIPCIÓN DE IAS FIGURAS

Otras particularidades y ventajas de la invención, serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, de los objetivos y modalidades preferidas, de las reivindicaciones anexas y de los dibujos o figuras que se acompañan, en donde: La Figura 1, muestra un ensayo inmunoenzimático representativo de ELISA donde se demuestra la capacidad del nuevo inmunógeno de toxoide tetánico-morfina para inducir una robusta respuesta inmunológica humoral con muy altos títulos de anticuerpos séricos contra esta droga; La Figura 2, muestra un gráfico representativo del monitoreo de la respuesta inmunológica humoral y la cuantificación de los títulos séricos de anticuerpos de morfina/heroína por ensayos de ELISA por captura de anticuerpo durante el paradigma de vacunación activa con cuatro consecutivas re-inmunizaciones con el nuevo inmunógeno de toxoide tetánico-morfina; La Figura 3, muestra un gráfico representativo de ensayos inmunoenzimáticos de ELISA por captura de anticuerpo para monitorear el comportamiento de la respuesta inmunológica humoral después de una re-inmunización (cuarta) con el inmunógeno de toxoide tetánico-morfina; La Figura 4, corresponde a una gráfica representativa de ensayos inmunoenzimáticos de ELISA por captura de anticuerpo para monitorear la recuperación de los títulos de anticuerpos específicos de morfina/heroina inducida después de una subsiguiente etapa de re-inmunización; La Figura 5, representa los estudios de ensayos inmunoenzimáticos de ELISA competitivo para evaluar el reconocimiento inmunológico cruzado de los anticuerpos séricos anti-morfina/heroina hacia diferentes análogos estructurales de la morfina y la heroína empleados en la terapéutica antiadictiva clásica contra estos dos opiáceos, hacia metabolitos de biotransformación de estas dos drogas, asi como a distintos neuropéptidos opioides importantes en el funcionamiento neural; La Figura 6, muestra el efecto inmunoprotector de la vacunación activa con el inmunógeno de toxoide tetánico- morfina, para bloquear el comportamiento de auto¬ administración farmacológica intravenosa adictiva de morfina en el modelo animal del roedor; y La Figura 7, muestra el efecto inmunoprotector de la vacunación activa con el inmunógeno de toxoide tetánico- morfina, para bloquear el comportamiento de auto- administración farmacológica intravenosa adictiva de heroina en el modelo animal del roedor.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE IA INVENCIÓN

La literatura científica referida en esta sección detalla y establece el conocimiento disponible para aquellos experimentadores expertos en el campo. La presente invención revela y provee una terapéutica para el tratamiento de la adicción a la morfina/heroina. Esta terapéutica está basada en el principio farmacológico de la vacunación activa de un sujeto previamente adicto y desintoxicado contra estos dos opiáceos con una nueva formulación estructural de conjugado de droga hapténica-proteina acarreadora. La composición química de este conjugado terapéutico, de la presente invención, esta compuesta por la morfina como droga hapténica, y por el toxoide tetánico representativo de una proteina acarreadora altamente inmunogénica de uso permitido en protocolos de vacunación humana. Este conjugado, altamente inmunogénico de la morfina, es capaz de estimular la producción de altos y sostenidos títulos de anticuerpos séricos contra la morfina haptenizada, cuando esta composición terapéutica es administrada a un sujeto adicto desintoxicado contra esta droga. La aplicación de un paradigma farmacológico de inmunización activa adecuado, facilita la sintesis y establecimiento de títulos séricos lo suficientemente altos de anticuerpos anti-morfina, los cuales, en presencia subsiguiente de la droga, son capaces de reconocer y unirse a la fracción plasmática de "droga libre", neutralizando significativamente y/o evitando su permeación hematoencefálica en forma dada tal que, disminuye importantemente o evita el desarrollo de sus efectos psicofarmacológicos adictivos y reforzantes. Asi por lo tanto, la morfina y/o la heroína son neutralizadas antes de que lleguen al parénquima nervioso cerebral, y asi por lo tanto, el adicto desintoxicado a esta droga, no recibirá el potente efecto gratificante placentero que produce estas dos drogas, que es el principal reforzante para el consumo con patrón farmacológico adictivo de estos dos opiáceos. La capacidad neutralizante de este paradigma de inmunización activa es de larga duración, debido a la duración de varios meses (V.g., 3-6) del curso temporal de la respuesta inmunológica humoral de anticuerpos séricos específicos contra la droga hapténica en sujetos vacunados con la vacuna bivalente contra la adicción a la morfina-heroína de la presente invención. Asi, en este contexto, es de esperarse que el establecimiento de la respuesta de altos títulos de anticuerpos anti-droga hapténica generado por el empleo de la composición terapéutica de la presente invención, al ser estables por varios meses, represente un mecanismo inmunológico eficaz para la manutención del estado abstinente y/o de la prevención a las recaídas de la adicción a la morfina y la heroína en el sujeto previamente desintoxicado a estas drogas. Adicionalmente, el acercamiento terapéutico de vacunación contra la adicción a la morfina/heroina de la presente invención, es compatible con otras terapias empleadas actualmente en la clínica de manutención de la abstinencia y/o prevención de las recaídas de la adicción a estos dos opiáceos. En este contexto, un amplio número de agentes farmacológicos empleados para estos fines pueden ser co-dosificados, los cuales se seleccionan dentro del grupo que consiste de metadona, buprenorfina, naloxona, naltrexona, etc., sin que estos se consideren como limitativos. La descripción anterior y los siguientes ejemplos tienen como propósito el ilustrar modos particulares de llevar a cabo la invención y no deben ser considerados como limitativos del alcance de protección de la misma.

EJEMPLOS

1. ESQUEMA DE LA ESTRUCTURA MOLECULAR DE LA FORMULACIÓN QUÍMICA COMERCIAL DE LA MORFINA USADA COMO HAPTENO PARA LA PREPARACIÓN DE LA VACUNA BIVALENTE CONTRA LA ADICCIÓN A LA MORFINA-HEROÍNA. La formulación comercial (Sigma-Aldrich) química de sal de sulfato de morfina pentahidratada (PM 758.8, C34H40N2O10S) fue usada como compuesto inicial para producir morfina base (ver más abajo, en el inciso (a) , de la sección de "PROCESO DE REACCIÓN PARA LA PREPARACIÓN DE LOS DERIVADOS INTERMEDIARIOS PARA LA SÍNTESIS DE LA VACUNA BIVALENTE CONTRA LA ADICCIÓN A LA MORFINA-HEROÍNA") , a partir de la cual se llevó a cabo la síntesis del derivado intermediario de morfina-6-hemisuccinato, el cual fue subsiguientemente haptenizado a grupos epsilón amino libres de la cadena lateral de Usinas del toxoide tetánico, a través del acoplamiento covalente secuencial con los reactivos heterobifuncionales de entrecruzamiento covalente EDC y TFCS.

2. REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE LA FORMULACIÓN ESTRUCTURAL DEL DERIVADO INTERMEDIARIO 3-O-CARBOXIMETIL-MORFINA.

Este derivado intermediario de la morfina ha sido sintetizado y usado por diversos grupos de investigación, y además en la presente invención de una vacuna bivalente alterna, contra la adicción a la morfina-heroina, para la haptenización covalente de este opiáceo al toxoide tetánico.

3-O-Carboximetil Morfina

3. REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE LA FORMULACIÓN ESTRUCTURAL DEL DERIVADO INTERMEDIARIO MORFINA-6-HEMISUCCINATO.

Este derivado intermediario de la morfina ha sido sintetizado y usado por diversos grupos de investigación, incluyendo en la presente invención de vacuna bivalente contra la adicción a la morfina-heroína, para la haptenización covalente de este opiáceo al toxoide tetánico.

Morfina 6-hemisuccínatα

4. REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE LA FORMULACIÓN ESTRUCTURAL DE LOS DERIVADOS INTERMEDIARIOS 3-0-CARBOXIMETIL-MORFINA Y MORFINA-6-HEMISSUCINATO CONDENSADOS COVALENTEMENTE A LA 1- etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) .

El reactivo químico l-etil-3- (3-dimetilaminopropil) - carbodiimida (EDC) , ha sido usado por otros grupos de investigación en reacciones de haptenización covalente del derivado intermediario 3-0-carboximetil-morfina a proteínas acarreadoras como la KLH y BSA, y para la haptenización covalente del derivado intermediario de la morfina-6- hemisuccinato al complejo molecular de derivado intermediario toxoide tetánico-TFCS en la presente invención de vacuna bivalente contra la adicción a la morfina-heroína (ver los esquemas de reacción de síntesis química de los ejemplos 5 (a- c) y 7 (a y b) .

a

Intermediarto EDC-{3-0-Carboximβt¡l morfina) Intermediario EDC-{morf¡na 6-hβmisuccinato)

-SÍNTESIS DE LA VACUNA BIVALENTE CONTRA LA ADICCIÓN A LA MORFINA-HEROÍNA.

La síntesis del conjugado inmunógénico de morfina de la presente invención, requiere de la modificación química inicial de la molécula de morfina nativa, para generar un derivado estructural de este opiáceo altamente reactivo, que provee grupos químicos reactivos carboxilo libre, para su condensación covalente con dos reactivos heterobifuncionales de entrecruzamiento covalente, los cuales forman el brazo molecular espaciador y de unión a grupos amino epsilón de la cadena lateral de los residuos del aminoácido Usina del toxoide tetánico, la proteina acarreadora usada en la " presente invención (ver ejemplo 6) . Los procedimientos de química orgánica de modificación estructural de los dos grupos hidroxilo de la morfina en las posiciones 3 y 6 del anillo fenantrénico para su activación de enlace covalente es muy limitada (Robert T. Morrison y Robert N. Boyd, Organic Chemistry, 7th Ed., 2003), y existen pocos métodos reportados para estos fines experimentales. En este contexto, desde principios de la década de los 70's, diversos grupos de investigación (B. Wainer y col., Science 176: 1143-1145, 1972; B. Wainer y col., Science 178: 647, 1972; B. Wainer y col., J. Immunol. 110 (3) : 667-673, 1973; Wainer y col., Nature, 241:537-538, 1973 y B. HiIl y col., J. Immunol.114:1363-1368, 1975) reportaron un método químico tradicional, también descrito en los libros de texto clásicos de química orgánica y nunca patentado, que emplea anhídrido succinico como reactivo para modificar estructuralmente el grupo hidroxilo alcohol en el átomo de carbono 6 de la estructura fenantrénica de la morfina nativa. Este intermediario primario se denomina morfina-6-hemisuccinato (ejemplo 3, y estructura (b) del ejemplo 5) y, a diferencia de la morfina nativa, es reactivo a la condensación covalente a través del grupo funcional de ácido carboxilico libre del grupo succinil-éster condensado a la morfina (ver estructura (a) en ejemplo 5) , a reactivos químicos heterobifuncionales como la l-Etil-3- (3-Dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) (ver ejemplo 3, y estructura (c) en ejemplo 5) , una sustancia usada ampliamente en la química de entrecruzamiento covalente entre dos moléculas donadoras de grupos funcionales libres tipo amino y carboxilo (S. Hockfield y col. Molecular Probes of the Nervous System: Selected Methods for Antibody and Nucleic Acid Probes, VoI. 1, CoId Spring Harbor Laboratory Press, New Cork, 1993) . La generación de respuestas inmunológicas humorales con altos títulos de anticuerpos específicos contra moléculas de escasa complejidad estructural, como la morfina, es un reto complejo de trabajo metodológico, ya que estas no son normalmente per se muy inmunogénicas . En el caso de la presente invención, se diseño la estructura y se sintetizó un conjugado de morfina donde se generó inicialmente el derivado morfina-6-hemisuccinato (estructura (b) en ejemplo 5) , el cual se haptenizó covalentemente a residuos de Usinas del toxoide tetánico usado como proteina acarreadora, a través de la síntesis secuencial de una brazo molecular espaciador formado por el l-Etil-3- (3-Dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC, por sus siglas de abreviación como compuesto comercial, ver ejemplo 5) y el N- (e-Trifluoroacetilcaproiloxi) - succinimida-éster (TFCS, por sus siglas de abreviación como compuesto comercial, ver ejemplo 6) . El procedimiento de acoplamiento covalente de la morfina haptenizada al toxoide tetánico a través de este brazo molecular espaciador, sintetizado secuencialmente por la condensación covalente del EDC y TFCS, permite la preservación necesaria de la integridad estructural de la morfina, una vez que es haptenizada al toxoide tetánico, en una forma dada tal que, esta droga debe permanecer fija en una configuración estructural estérica para ser químicamente libre y para contribuir con determinantes estructurales antigénicos, no localizados en dominios estructurales de este opiáceo que contribuyen a la haptenización covalente con la proteina acarreadora, los cuales queremos sean reconocidos predominantemente por la respuesta inmunológica humoral en la molécula nativa de esta droga. Adicionalmente, la naturaleza de la composición estructural hidrocarbonada predominante de este brazo molecular espaciador (ver ejemplo 6), lo hace inerte al nivel de reactividad química, y le confiere escasa inmunogenicidad per se, lo cual contribuye al papel epitogénico inmunopredominante de la morfina en esta formulación estructural de vacuna bivalente de morfina/heroina. Asi, por ejemplo, nuestra propuesta de las capacidades, ventajas estructurales y funcionales de la presente , vacuna se ven apoyadas por los resultados experimentales que muestran su eficacia para producir una robusta respuesta inmunológica humoral (ver figuras 1 y 2) , con altos y sostenidos títulos de anticuerpos séricos específicos (ver figuras 3 y 4), con especificidad equivalente para reconocer inmunológicamente, no solo a la conformación estructural de la morfina libre no haptenizada, sino que también, a sus análogos estructurales como la heroína y los catabolitos intermediarios 6-monoacetilmorfina y glucorinados adictivos de estas dos drogas (V.g., morfina- 3-6-glucurónidos) (ver figura 5) . La explicación más plausible para explicar la especificidad de esta respuesta inmunológica humoral, está relacionada al proceso de presentación antigénica inmunológica de los diferentes dominios estructurales de la morfina en nuestro nuevo modelo de vacuna contra este opiáceo, que debido a la longitud de su brazo molecular espaciador de la morfina al toxoide tetánico, permite la presentación antigénica contra determinantes estructurales de la estructura fenentrénica de la morfina, también compartidos por otros análogos estructurales de este opiáceo (V.g., heroína y morfina-3-6-glucorónidos) .

5. PROCESO DE REACCIÓN PARA LA PREPARACIÓN DE LOS DERIVADOS INTERMEDIARIOS PARA LA SÍNTESIS DE LA VACUNA BIVALENTE CONTRA LA ADICCIÓN A LA MORFINA-HEROÍNA.

a) Preparación inicial de morfina base a partir de la formulación química comercial de la sal de sulfato de morfina pentahidratada. La morfina base (estructura (a) del ejemplo 5), se sintetizó a partir de la formulación quimica comercial sulfatada (Sigma-Aldrich) de este opiáceo, de acuerdo a un procedimiento quimico clásico reportado en 1972 por E. J. Simón (E. J. Simón y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 69: 1835-1837, 1972). Para llevar a cabo esta reacción, se disolvieron a temperatura ambiente y en agitación constante 64 mg de sulfato de morfina/ml de H2O destilada. El pH de esta solución fue ajustado a 8.0 con NH4OH. La morfina base fue subsiguientemente cristalizada por precipitación a pH 8, filtrada y secada por evaporación al vacio a 60 0C.

b) Preparación del derivado intermediario morfina-6- hemisuccinato (M-6-H) . La M-6-H fue preparada a partir de morfina base, de acuerdo al siguiente protocolo modificado de diversos protocolos estándares reportados en forma pionera en la década de los 70's (B. Wainer y col., Science 176: 1143-1145, 1972; B. Wainer y col., Science 178: 647, 1972; B. Wainer y col., J. Immunol. 110 (3) :667-673, 1973; Wainer y col., Nature, 241:537-538, 1973 y B. HiIl y col., J. Immunol.114: 1363-1368, 1975) . La formula consiste en la reacción de 2 gramos de anhídrido succinico (Sigma-Aldrich) por cada gramo de morfina base y la mezcla se incubó con 20 mi de piridina o benceno seco en reflujo en un matraz de vidrio. Después de 6 horas de calentamiento a temperatura de reflujo (70-800C) , la mezcla de reacción se enfrió lentamente a temperatura ambiente, se decantó el exceso de piridina o benceno y se evaporó el resto de estos componentes orgánicos a presión reducida o por chorro de corriente de nitrógeno puro, lo cual rinde un residuo de producto seco representado por la M-6-H, el cual fue lavado 10 veces con etanol al 60 % en H2O destilada para recristalizar el residuo (ejemplo 5 (b) ) . El porcentaje de rendimiento del producto, se cuantificó a través de un método reportado previamente (B. Wainer y col., Science 176:1143-1145, 1972) de análisis de cromatografía en placa fina (TLC, por su nomenclatura convencional de la técnica en el inglés) . En este método, 100 μg del residuo de síntesis de la M-6-H y una cantidad equivalente de morfina base (compuesto usado como control de referencia) son disueltos en una solución de sistema de solventes de acetato de etilo:metanol:hidróxido de amonio (85:10:5 v:v:v), cargados en alícuotas de 1 μl/linea de corrimiento, secados a temperatura ambiente y cromatografiados en la placa fina de silica con el mismo sistema de solventes antes mencionado. En este sistema cromatografico, el residuo de síntesis de la M-6-H presentó un patrón de corrimiento cromatografico con coeficientes de movilidad relativa (Rf, por sus siglas convencionales en el inglés) de alrededor de 0.1-0.15, mientras que la morfina base libre presentó Rf's de aproximadamente 0.3-0.4, cuando la placa fina de silica fue estimulada con una lámpara de UV a 285 nm después de la corrida cromatográfica de los compuestos, una longitud de onda en la cual el cromóforo responsable es el anillo fenólico excitado de la estructura fenantrénica de la morfina libre y de la M-6-H. El rendimiento promedio del producto M-6-H en una reacción estándar de síntesis fue generalmente cercano o mayor a valores del 95 %.

c) Preparación del derivado intermediario EDC- (morfina-6- hemisuccinato. Para lograr la haptenización covalente de la M-6-H a la proteina acarreadora, este derivado ' intermediario de morfina fue acoplado a través de su grupo carboxilo libre del grupo succinil, al reactivo entrecruzador covalente heterobifuncional EDC (l-Etil-3- (3-dimetilaminopropil) - carbodiimida (Pierce) (ver figura (c) en ejemplo 5) , de acuerdo al protocolo estándar descrito por este manufacturador. En esta reacción de condensación covalente, la EDC no reaccionada a los grupos carboxilicos, es altamente inestable y es hidrolizada rápidamente a un compuesto intermediario no reactivo. Una reacción estándar de acoplamiento consiste en la mezcla de 100 mg de EDC por cada 100 mg de M-6-H disueltos en 100 mi de H2O bidestilada, a un pfí de 5.5 ajustado con una solución IN HCl. La mezcla de reacción debe ser incubada a 370C por 2 horas en agitación constante. Bajo estas condiciones de reacción, se obtienen regularmente rendimientos cercanos al 98% del producto EDC- (M-6-H) . Estos estimados fueron obtenidos a través de la titulación de grupos carboxilicos libres en una alícuota representativa equivalente de M-6-H control y del producto de reacción EDC- (M-6-H) , con una solución de IN NaOH, un método estándar de bioquímica que demuestra la presencia de grupos carboxilicos libres, usualmente a valores de pK alrededor de 4.2. Estas condiciones finales de reacción generan rendimientos óptimos de síntesis del derivado intermediario EDC- (M-6-H) , el cual es usualmente inestable en soluciones acuosas y debe ser rápidamente reaccionado con grupos amino primarios donados por el derivado intermediario de toxoide tetánico, cuya síntesis se revela en la invención y que sirve como proteina acarreadora empleada en la presente invención de vacuna bivalente contra la adicción a la morfina-heroina. Síntesis de vacuna Morfina/Heroína

Reflujo

Piridina o Benceno

Morfina Evaporación de piridina al vacío

Intermediario EDC-(morf¡na β-hemisuccinato) 6. PROCESO DE REACCIÓN PARA LA PREPARACIÓN DEL DERIVADO INTERMEDIARIO DE TOXOIDE TETÁNICO USADO COMO PROTEÍNA ACARREADORA (PA) CONDENSADO COVALENTEMENTE CON EL N- (e- Trifluoroacetilcaproiloxi) succinimida éster (TFCS) : COMPLEJO PA-TFCS.

El toxoide tetánico usado como proteina acarreadora (PA) , en la presente invención de vacuna bivalente contra la adicción a la morfina-heroina, fue conjugado covalentemente a través de sus grupos amino epsilón de la cadena lateral de residuos de usina, a moléculas de brazo espaciador representadas por el TFCS. La preparación de toxoide tetánico usada como proteina acarreadora (PA) en la presente invención de vacuna bivalente contra la adicción a la morfina-heroina, tiene estándares certificados por el manufacturador de ≥ 98% de pureza y de ausencia total de actividad tóxica. Esta preparación de toxoide tetánico, es la cadena polipeptidica H de la toxina tetánica, conformada estructuralmente por aproximadamente 858 residuos de aminoácidos en longitud. La cadena H tiene una masa molecular aproximada de 100 kDa, la cual es producida por metodologías estándares de recombinación del ADN a partir del gen que codifica la toxina tetánica, una proteina de 1315 aminoácidos con una masa molecular de 150,700 daltones, que es producida por el Clostridium tetan!. Para lograr la síntesis del intermediario de toxoide tetánico-TFCS en la presente invención de vacuna bivalente contra la adicción a la morfina-heroina, esta proteina acarreadora debe ser reaccionada y condensada covalentemente con el N- (e-Trifluoroacetilcaproiloxi) succinimida éster (TFCS, Pierce) (ver figuras (a) , (b) , y (c) en ejemplo 6) , a través de los grupos amino epsilón libres de las cadenas laterales del aminoácido usina, el cual esta codificado en un número de 68 copias dentro de la estructura primaria de aminoácidos de esta preparación de toxoide tetánico. El TFCS es un reactivo químico entrecruzador covalente heterobifuncional, que a través de un grupo funcional terminal N-hidroxisuccinimida éster, se usa para acoplar covalentemente, a pH de 7-7.5, grupos amino epsilón libres de la cadena lateral de los residuos de usina de proteínas para formar derivados intermediarios de proteina- TFCS, a través de uniones muy estables por grupos amida. El esquema de reacción para la síntesis del intermediario reactivo de toxoide tetánico-TFCS, para la síntesis de la presente invención de vacuna bivalente contra la adicción a la morfina-heroina, se describe en la figura (b) en el ejemplo 6. Una formulación de reactivos y condiciones experimentales para llevar a cabo la síntesis de este intermediario de toxoide tetánico-TFCS en la presente invención, consiste en la preparación inicial, inmediatamente antes de su uso, de una solución stock de 40 mg/ml de TFCS (134 mM) disuelto en una solución de 10-20% de DMSO/90-80% H2O desionizada (v:v) . Una vez preparado, este reactivo debe ser inmediatamente mezclado con el toxoide tetánico en un exceso molar 10-20 veces mayor que esta proteina. Asi por ejemplo, una reacción típica usa 100 mg (0.5 mM) de toxoide tetánico disuelto en 4 mi de una solución amortiguadora de fosfatos/0.15 mM NaCl, pH 7.2, la cual se mezcla con 50 μl de la solución stock de TFCS (la concentración final de este último compuesto en esta solución de reacción con el toxoide tetánico deberá ser de 6.7 mM y de 0.5-1% del DMSO) . Es importante lograr una dilución final de 1:10-20 (v:v) de la concentración inicial del DMSO en la solución de reacción de condensación con el toxoide tetánico, con el objetivo de evitar la inducción de precipitados de toxoide tetánico en esta solución de reacción, durante la condensación covalente de esta proteina con el TFCS. La reacción de condensación covalente entre el toxoide tetánico y el TFCS debe ser incubada por 60-90 minutos a temperatura ambiente, y una vez sintetizado, el intermediario reactivo de toxoide tetánico- TFCS, este último compuesto todavía mantiene protegido un grupo amino reactivo por un grupo químico protector trifluoroacetil (ver figura (b) en ejemplo 6) , el cual es subsiguientemente hidrolizado, por una incubación adicional de 2-3 horas a temperatura ambiente en la misma solución de reacción con un valor de pH básico de 8-8.5, ajustado con una solución concentrada de 10 N NaOH, para generar grupos amino reactivos libres, en el complejo de toxoide tetánico-TFCS, en el extremo protegido de este último compuesto (ver figura (b) en el ejemplo 6) . La purificación final del intermediario reactivo del complejo molecular del toxoide tetánico-TFCS, debe llevarse a cabo mediante procedimientos estándares de diálisis durante 24 horas a 4°C, contra tres cambios de 6 litros, cada 8 horas, de una solución amortiguadora de fosfatos 0.1 M a pH 7.2, en membranas de diálisis de 1OkDa de corte molecular (Sigma-Aldrich) . Protβina acarreadora 0 1 M Ue PO4 Ha2 Síntesis ele PA con brazo espaciador 0 15 NaCI pH 7.2 Subproducto

Subproducto

1 M pH 7 7. PROCEDIMIENTO DE CONDENSACIÓN COVALENTE DEL DERIVADO INTERMEDIARIO EDC-(M-6-H) AL COMPLEJO MOLECULAR DEL TOXOIDE TETANICO-TFCS Y SÍNTESIS LA FORMULACIÓN ESTRUCTURAL FINAL DE LA VACUNA BIVALENTE CONTRA LA ADICCIÓN A LA MORFINA-HEROÍNA.

Finalmente, la condensación covalente del derivado intermediario EDC- (M-6-H) de la morfina al complejo molecular sintetizado del toxoide tetánico-TFCS (ver figura (a) en ejemplo 7) , se logra a través de la formación de un grupo amida de enlace covalente, por la reacción entre el grupo reactivo, a grupos amino libres, del extremo molecular del EDC-(M-β-H), y los grupos amino libres desprotegidos del TFCS del complejo molecular del toxoide tetánico-TFCS (ver figura (b) en ejemplo 7) . Ya que el procedimiento de sintesis y purificación del complejo molecular intermediario del toxoide tetánico- TFCS, se lleva a cabo en forma completa en un tiempo aproximado de 24 horas, es importante mencionar entonces, que la sintesis del derivado intermediario EDC-(M-β-H) debe de llevarse a cabo, justo después de este periodo de sintesis y purificación del complejo molecular del toxoide tetánico- TFCS, ya que este derivado intermediario de la morfina es muy inestable y fácilmente hidrolizable en condiciones de almacenamiento prolongado (V.g., más de dos horas), aún a temperaturas por debajo de los 10 grados centigrados. Otras consideraciones importantes que deben ser tomadas en cuenta para la optimización de esta reacción de condensación covalente, entre el derivado intermediario de EDC-(M-β-H) y el complejo molecular del toxoide tetánico-TFCS, es la proporción de la concentración en la que ambos compuestos deben ser adicionados en esta reacción quimica. El toxoide tetánico usado como proteina acarreadora en la sintesis de la presente invención de vacuna bivalente contra la morfina- heroina, tiene un peso molecular estimado de aproximadamente 100 kDa, y aproximadamente un número total de 68 residuos de usina, que son los sitios activos donantes de grupos amino epsilón, a través de los cuales se condensa covalentemente el TFCS. Asi por lo tanto, por cada μmol de toxoide tetánico (100 mg) , tendremos aproximadamente 0.07 μmol de sitios activos de grupos amino libres desprotegidos, condensados covalentemente a través del TFCS en el complejo molecular sintetizado con el toxoide tetánico. Nuestra reacción de condensación covalente entre el derivado intermediario de EDC-(M-δ-H) y el complejo molecular del toxoide tetánico- TFCS, usa una relación estequiométrica mol:mol de 100 μmol de EDC-(M-β-H) por cada 0.07 μmol de sitios activos de grupos aminos libre del complejo molecular de toxoide tetánico-TFCS. Una formulación típica de concentración de reactivos y condiciones de reacción para llevar a cabo la condensación covalente entre el derivado intermediario de EDC-(M-β-H) y el complejo molecular del toxoide tetánico-TFCS, usa la mezcla de 100 mg de complejo molecular de toxoide tetánico-TFCS (1 μmol Toxoide tetánico-TFCS = 0.07 μmol sitios activos, más 30 mg (70 μmol de sitios activos de condensación covalente) del derivado intermediario EDC-(M-β-H) (siendo la masa molecular calculada de este último compuesto de 426.37 daltones) , en un volumen final de reacción de 100 mi de solución amortiguadora de 0.1 M de fosfatos/0.15 M NaCl, con un pH ajustado a 7-7.5. La reacción debe incubarse por 2-3 horas a temperatura ambiente y con agitación lenta y constante. Después de este tiempo de incubación y síntesis, la purificación final del compuesto de la vacuna de morfina-6-hemisuccinil-toxoide tetánico, de los subproductos de reacción como la urea y moléculas no haptenizadas del derivado intermediario de EDC- (M-6-H) , debe llevarse a cabo mediante procedimientos estándares de diálisis durante 48 horas a 4°C, contra seis cambios de 6 litros, cada 8 horas, de una solución amortiguadora de fosfatos 0.1 M a pH 7.2, en membranas de diálisis de 10 kDa de corte molecular (Sigma-Aldrich) . Después de este procedimiento de purificación, la solución de reacción debe esterilizarse a través de la filtración con presión positiva en filtros con membrana de 0.45 μm de tamaño de poro (Gelman Sci) y se liofilizan alícuotas de 1 mi en frascos estériles de vidrio, los cuales se sellan al vacio y se almacenan a 40C para su preservación. Diversos agentes químicos usados normalmente para estabilizar y prevenir la destrucción durante la liofilización y almacenamiento de vacunas (E. Harlow y D. Lañe, Antibodies : A laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, New York, 1988), pueden ser adicionados a la formulación terapéutica de invención de vacuna bivalente contra la adicción de la morfina-heroina. Ejemplos de estas sustancias se seleccionan dentro del grupo que consiste de gelatina, peptona, dextrina, metil-celulosa, sacarosa, lactosa, maltosa, glucosa, fructuosa, sorbitol, glicerol, manitol, inositol, ácido cítrico, ácido tartárico, polietilenglicol y polivinilpirrolidona, entre otras. Cada vial de producto de vacuna bivalente contra la adicción a la morfina-heroina contiene una dosis promedio aproximada de 1 mg de producto liofilizado de toxoide tetánico usado como "unidad de dosis de referencia". La concentración de proteina de cada unidad de dosis de vacuna bivalente contra la adicción a la morfina- heroina, fue determinada por el método estándar de cuantificación proteica del ácido bicinconinico, de acuerdo a procedimientos recomendados por el maufacturador del "kit" de reacción (Pierce Chemical) . La cuantificación del porcentaje de conjugación del derivado intermediario EDC- (M-6-H) a los grupos amino libres del complejo molecular del toxoide tetánico-TFCS, fue llevada a cabo a través de un procedimiento estándar de titulación del número de grupos amino libres del complejo molecular de toxoide tetánico-TFCS, usando el reactivo de o-ftalaldehido (J. Cashman y col., J. Pharmacol. Exper. Ther. 293: 952-961, 2000) . En general, la presente invención de vacuna bivalente contra la adicción a la morfina-heroina, muestra porcentajes promedio de conjugación del hapteno (morfina) a la proteina acarreadora (toxoide tetánico) del 75-85%. Es pertinente hacer notar que la proteina acarreadora también se puede seleccionar dentro del grupo que consiste de otras proteínas acarreadoras como la ovalbúmina, albúmina de suero de conejo, tiroglobulina, fibrinógeno, KLH, membranas de eritrocitos de cabra, flagelina, y otros toxoides como los derivados de la toxinas diftérica, del cólera y botulinica, las cuales pueden ser condensadas covalentemente al derivado intermediario de M-6-H a través de procedimiento de síntesis con la EDC y el TFCS antes descritos, para fines experimentales de inmunización activa contra la morfina- heroina, y/o para fines experimentales de uso como antigenos de adsorción en inmunoensayos . En la presente invención, un conjugado de morfina-6- hemisuccinil-BSA fue también sintetizado en paralelo al del la vacuna anti-morfina-heroina, usando un protocolo de síntesis análogo al revelado en la presente invención para la síntesis de este último inmunoconjugado. El objetivo de la síntesis de este conjugado adicional de morfina fue dirigido a su uso como preparación de antigeno de adsorción de morfina a la fase sólida de los ensayos inmunoenzimáticos de ELISA por captura de anticuerpo para identificar, monitorear, cuantificar (figuras 1, 2, 3 y 4) y validar la especificidad (figura 5) de la respuesta inmunológica humoral por la vacunación activa con la presente invención de formulación terapéutica de vacuna bivalente contra la morfina-heroina.

Purificación Vacuna Diálisis por 48 horas a 4 "C con cambio cada 8 horas Buffer Fosfatos 0.1 M pH 7.4 Subproducto (Urea) 8. ESTRUCTURA MOLECULAR DE LA VACUNA BIVALENTE CONTRA LA ADICCIÓN A LA MORFINA-HEROÍNA.

La presente formulación estructural de vacuna bivalente contra la adicción a la morfina-heroina comprende y muestra por primera vez, el uso del compuesto químico TFCS para la síntesis de un brazo molecular espaciador de la morfina y/o heroína haptenizada al toxoide tetánico. El tamaño molecular total calculado de este brazo espaciador, que separa a la morfina y/o heroína haptenizada a través de su átomo de carbono en la posición 6 de su estructura fenantrénica, es de 20.15 Á, y es significativamente más grande (ver figura del ejemplo 8) que los reportados previamente para la síntesis de inmunógenos de morfina, donde los derivados 3-0-carboximetilmorfina y M-6-H, fueron acoplados en forma covalente solo únicamente a través de la EDC, a grupos amino epsilón libres de la cadena lateral de residuos de lisina de las proteínas BSA y KLH usadas como proteínas acarreadoras. Por ejemplo, los conjugados inmunogénicos reportados para el derivado morfina-6- hemisuccinil-BSA/KLH, presentan un tamaño de brazo espaciador aproximado de 12.4 Á, ya que carecen de la extensión de un espaciador molecular de una cadena hidrocarbonada de 6 átomos de carbono como el TFCS, compuesto que brinda la oportunidad de aumentar en aproximadamente 7.74 Á la longitud de nuestro brazo espaciador total (ver figura del ejemplo 8) . Como ya se mencionó anteriormente, esta innovación estructural de longitud aumentada en el brazo espaciador de nuestro nuevo modelo estructural de vacuna anti-morfina-heroina, revelado en la presente invención, ha probado brindar capacidades funcionales ventajosas de esta formulación terapéutica de inmunógeno, también probadas y reveladas en la presente invención, para generar una alta inmunogenicidad contra la morfina y/o heroína haptenizadas, asi como para la generación de una respuesta inmunológica humoral con altos y sostenidos títulos de anticuerpos séricos específicos (figuras 1, 2, 3 y 4), para el reconocimiento inmunológico de la morfina y de su análogo estructural, la heroína, con especificidades equivalentes (figura 5) . Asimismo, es plausible plantear la hipótesis de que la longitud aumentada de este nuevo brazo espaciador, en nuestro nuevo modelo de vacuna bivalente contra la morfina-heroina, brinda también la ventaja estructural-funcional de este inmunógeno para generar una respuesta inmunológica humoral con anticuerpos séricos con capacidad para reconocer en forma equivalente epitopes inmunogénicos de la molécula de la morfina, que también están presentes en las estructuras de las moléculas de heroína y de sus metabolitos intermediarios de biodegradación, como la 3- monoacetil-morfina y los derivados glucorinados 3 y 6 de la morfina (figura 5) . Asimismo, esta respuesta inmunológica humoral lograda con la vacunación activa del presente inmunógeno bivalente de morfina-heroina, también demuestra ser un procedimiento terapéutico eficaz para inmunoproteger contra la adquisición de patrones conductuales de consumo adictivos a estos dos opiáceos adictivos, y por la producción endógena del huésped adicto a estas dos sustancias, de sus metabolitos de biodegradación también potencialmente adictivos, en sujetos desintoxicados y abstinentes del consumo adictivo a estas dos sustancias opiáceas (figuras 6 y 7) . En resumen, el brazo espaciador tiene un tamaño molecular total de 20.15 Á, en el cual la distancia de 7.74 Á corresponde al segmento hidrocarbonado introducido por el reactivo TFCS, conjugado covalentemente al grupo amino epsilón de la cadena lateral del aminoácido usina del toxoide tetánico; el segmento de 7.44 Á esta conformado por el átomo de carbono alfa y los cuatro átomos de carbono de la cadena lateral de la usina; y el segmento de 4.97 Á está conformado estructuralmente por el residuo hemisuccinil condensado covalentemente a través de un grupo éster, al átomo de carbono en posición 6 de la estructura fenantrénica anillada de la morfina, tal y como se muestra en la siguiente fórmula:

En adición a la revelación del procedimiento de iQ síntesis, purificación y de la formulación estructural y usos terapéuticos de la presente invención de vacuna bivalente contra la adicción a la morfina-heroina, también se revela en forma complementaria un procedimiento de síntesis y purificación de una nueva formulación estructural adicional ic de vacuna bivalente contra la adicción a la morfina-heroina. Esta formulación estructural adicional de vacuna anti- morfina-heroina, consiste en la síntesis alterna de un derivado intermediario de EDC-3-O-carboximetilmorfina, mediante procedimientos de síntesis previamente reportados en 2Q la literatura (S. Spector y C. W. Parker, Science, 168:1347, 1970; S. J. Spector, J. Pharmacol. Exp. Ther, 178:253, 1971; H. Van Vunakis y col., J. Pharmacol. Exp. Ther, 180:514, 1972 y S. Gross y col., Immunochemistry 11: 453-456, 1974), el cual es acoplado covalentemente al intermediario de toxoide 95 tetánico-TFCS de conformidad con el procedimiento de síntesis revelado para la presente invención de formulación estructural de la vacuna bivalente anti-morfina-heroina, de acuerdo al siguiente esquema de reacción de sintesis:

Intermediario EDC-( 3-O-Carboxιmetιl Morfina) Síntesis de vacuna añil Morfϊna/Haroina 2 horas a Temperatura ambiente con buffer de fosfatos 01 M pH 7 2-74

Este modelo alternativo de vacuna bivalente anti- morfina-heroina, tiene las caracteristicas de un nuevo brazo espaciador con un tamaño molecular total de 16.47 Á, en el cual la distancia de 9.03 Á, esta conformada por el segmento hidrocarbonado introducido por el reactivo TFCS, conjugado covalentemente por uno de sus extremos, a través de un enlace amida, al residuo EDC-3-O-carboximetil en posición 3 de la estructura fenantrénica anillada de la morfina; y un segmento adicional de 7.44 Á conformado por el átomo de carbono alfa y los cuatro átomos de carbono de la cadena lateral de la lisina del toxoide tetánico, la cual esta condensada covalentemente al otro extremo del TFCS, también a través de la formación de un enlace covalente de tipo amida, por la reacción de condensación covalente del grupo amino epsilón de la cadena lateral de este aminoácido, tal y como se muestra en la siguiente fórmula:

ADYUVANTES

No obstante, la gran masa molecular y la multiplicidad de epítopes inmunogénicos presentados por inmunoconjugados con haptenos de escasa complejidad estructural acoplados covalentemente a proteínas acarreadoras de alta masa molecular, como es el caso de nuestro nuevo modelo de vacuna contra la adicción a la morfina-heroina, se requiere de la adición a ella, para su administración a un sujeto, de una sustancia adyuvante en función de facilitar una respuesta inmune primaria competente (E. Harlow y D. Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, New York, pp 96-97, 1988) . Los adyuvantes inducen una potente respuesta inmunológica humoral y/o celular a una variedad de antigenos que incluyen carbohidratos, péptidos y proteínas . Diversas formulaciones químicas de adyuvantes han sido usados y validados para estos propósitos para protocolos de vacunación activa de diferentes especies animales, y estos incluyen formulaciones disponibles comercialmente como emulsiones agua-aceite con o sin Mycobacterium tuberculosum inactivado por calor (Sigma-Aldrich) , RIBI (RIBI Immunochem Research, Inc.), diversos polímeros biodegradables y liposomas (ver revisión en J. Kohn y col., J. Immunol. Methods, vol.95, pp 31-38, 1986). En el caso particular de la vacunación en el humano, el único adyuvante validado y autorizado después de décadas de experimentación, son formulaciones de hidróxido de aluminio. La preparación de una composición farmacéutica o formulación terapéutica, que incluya la "vacuna contra la adicción a la morfina y heroína" de la presente invención, se puede llevar a cabo mediante el empleo de técnicas estándares bien conocidas por los expertos en la materia en combinación con cualesquiera de los portadores, auxiliares y/o excipientes farmacéuticamente aceptables descritos en el estado de la técnica, incluyendo pero no limitando, una variedad de sustancias adyuvantes. Una formulación típica de dosificación de vacuna bivalente contra la adicción a la morfina-heroina con adyuvante para la vacunación activa en especies animales y en el humano, consiste en la mezcla en proporción de 1:2 (v:v) de 1 mi de vacuna bivalente contra la adicción a la morfina-heroina, resuspendida en H2O desionizada estéril, con 2 mi de una solución stock de 45 mg/ml de hidróxido de aluminio (Imject- R-Alum, Pierce) adicionado en forma lenta a goteo lento, en un tiempo no menor de 3 minutos, con agitación moderada, constante y a temperatura ambiente. La mezcla de reacción debe incubarse en estas condiciones por un periodo de 1-2 horas . La concentración final del hidróxido de aluminio no deberá exceder el valor de 1.12-2.25 mg/100 μl en la solución de mezcla, con el conjugado de vacuna bivalente contra la adicción a la morfina-heroina. Esta formulación de vacuna bivalente anti-morfina-heroína/adyuvante hidróxido de aluminio deberá ser cargada a jeringas de plástico estéril, después de este periodo de incubación en condiciones de agitación de la mezcla de reacción, y deberá de administrarse siempre a través de la via parenteral (V.G., subcutánea o intramuscular) , pero nunca por la via intravenosa. Otros inmunoadyuvantes que pueden ser mezclados y dosificados con la presente invención de vacuna bivalente contra la adicción a la morfina-heroina, se pueden también seleccionar dentro del grupo que consiste de fosfato de aluminio, interferones, interleucinas, esteres de ácido poliláctico, copolimeros biodegradables de esteres del ácido poliglicólico, liposomas, lipopolisacáridos de membranas de bacterias, muropéptidos bacterianos y RIBI. Estas formulaciones y/o composiciones toman la forma farmacéutica de soluciones inyectables, suspensiones, polvos y los similares .

INMUNIZACIÓN ACTIVA

La manera preferida de aplicar la presente invención de vacuna bivalente anti-morfina-heroina mezclada con el adyuvante de hidróxido de aluminio, es mediante el suministro via intramuscular, aunque otras rutas de administración como la subcutánea y la intraperitoneal pueden alternativamente también ser viables. La vacuna contra la adicción a la morfina-heroina de la presente invención o de la composición farmacéutica o formulación terapéutica que la contiene, se administra en una cantidad terapéuticamente efectiva con un régimen de dosis unitaria conveniente a un individuo que padece de la adicción a la morfina y heroína, pero en estado abstinente y destoxificado. Dicho régimen se puede ajustar de conformidad con el grado de aflicción o adicción. Un esquema tipico de inmunización activa usa la administración intramuscular de una dosis unitaria inicial del conjugado de droga hapténica-proteina acarreadora de aproximadamente 1-2 mg/kg de peso corporal del individuo (V.g., ratas macho de 250-350 mg de peso, de la cepa Wistar o Sprague-Dawley) . Esta inoculación primaria debe ser seguida por 3-6 revacunaciones interespaciadas cada 14 dias, usando la misma dosis inicial/revacunación. La inmunización activa de los grupos de sujetos controles se llevó a cabo con adyuvante (hidróxido de aluminio) o con adyuvante mas proteina acarreadora (hidróxido de aluminio + toxoide tetánico) . El suero de los sujetos vacunados con este protocolo debe ser muestreado 10-12 días después de cada reinmunización, usando protocolos estándares para estos objetivos experimentales (E. Harlow y D. Lañe, Antibodies : A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, New York, 1988) , con el objeto de monitorear la respuesta inmunológica humoral contra la morfina-heroina y sus metabolitos de biodegradación. Para estos fines experimentales, los distintos grupos experimentales de vacunación fueron sangrados (100 μl/animal) y la fracción de suero fue obtenida mediante la coagulación de la sangre a 4 C por 24 horas y la centrifugación de la fracción coágulo/sobrenadante a 14 000 x g. Las fracciones de sueros obtenidos fueron congeladas a 20 0C hasta su uso ulterior. Se llevaron a cabo ensayos inmunoenzimáticos de ELISA por captura de anticuerpo para la identificación y monitoreo de la respuesta inmunológica humoral contra estos dos opiáceos, después de cada revacunación con el protocolo de inmunización activa antes descrito. Estos resultados nos permitieron asegurar la eficacia de nuestra nueva vacuna anti-morfina- heroina para generar una respuesta inmunológica humoral robusta contra estas sustancias. Asimismo, estos resultados también permitieron identificar y establecer el número óptimo de reinmunizaciones para inducir una respuesta humoral con niveles máximos y estables de anticuerpos séricos contra estos dos opiáceos. En conjunto, estos datos experimentales sirven para definir animales hiperinmunes candidatos a los protocolos de inmunoprotección antiadictiva contra estos dos opiáceos en el modelo de autoadministración intravenosa adictiva de estas drogas, en el modelo animal de la rata (ver más adelante figuras 6 y 7) . Un protocolo experimental típico de ensayo inmunoenzimático de ELISA por captura de anticuerpo para monitorear la respuesta inmunológica humoral contra la morfina-heroína, a partir del suero de sujetos vacunados activamente con nuestra formulación terapéutica de vacuna anti-morfina-heroína, consiste en la síntesis de la fase sólida del ensayo, con la adsorción 3-4 μg de la preparación antigénica de morfina-6-hemisuccinil-BSA /pozo de placas de 96 pozos (Inmunolon I, Gorning) . La captura de anticuerpos séricos contra la morfina-heroína por la fracción antigénica de la fase sólida, se lleva a cabo a partir de la incubación de alícuotas de 50 μl/pozo de diluciones seriadas progresivas de los diferentes antisueros obtenidos de los animales inmunizados (V.g., 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10 000, 1:100 000 y 1:1000 000) . Después de 6 horas de incubación a temperatura ambiente, los pozos se lavan extensivamente con una solución de 1% BSA/0.3% Tween-20/PBS, pH 7.4, y se agrega un segundo anticuerpo anti-IgG (H+L) de rata (Vector Laboratories) , conjugado con peroxidasa de rábano. Después de 2-3 horas de incubación a temperatura ambiente y del lavado extensivo para remover el exceso de segundo anticuerpo, las señales inmunopositivas de los pozos, se desarrollan mediante la adición de un sustrato cromogénico (OPD, SIGMA) . De la lectura espectrométrica de los valores de absorbancia a una longitud de onda de 490 nm de los pozos ensayados en un lector de ELISAs, se obtiene finalmente los valores de captura antigénica a la fase sólida de los anticuerpos. Finalmente, el valor de títulos de anticuerpos son definidos de acuerdo a procedimientos estándares de normalización, en función del valor inverso de la dilución del los sueros que den el 50% de la respuesta máxima de absorbancia. La figura 1, muestra un resultado representativo de ELISA por captura de anticuerpo para identificar inicialmente la eficacia de nuestra nueva vacuna bivalente contra la adicción a la morfina-heroína para inducir una respuesta inmunológica humoral de altos títulos (V.g., un valor promedio de título de «1:100 000), de anticuerpos contra la morfina, tan pronto como después de la segunda reinmunización en una población de 10 sujetos inmunizados muestreados. Como se observa en dicha figura, la concentración de anticuerpos específicos determinado por su absorbancia a 490 nm decae proporcionalmente en función de la dilución seriada de los antisueros . En la figura 2, se muestran datos representativos del monitoreo cuantitativo por el ensayo de ELISA por captura de anticuerpo, del curso temporal de los títulos séricos de anticuerpos contra la morfina-heroína después de cada re¬ inmunización (1-7) . Posterior a la inoculación inicial con la nueva formulación terapéutica de vacuna bivalente contra la adicción a la morfina-heroina en el modelo animal del roedor (rata) , los títulos de anticuerpos séricos contra estos opiáceos fueron monitoreados después de 10-12 dias de cada reinmunización (4-7) . Como se muestra en dicha figura, existe un incremento progresivo en la concentración de anticuerpos circulantes contra estos dos opiáceos hasta la cuarta re¬ inmunización en un grupo representativo de 10 sujetos vacunados activamente, con valores de títulos promedio de 1:800 000-1.1000 000. Sin embargo, etapas adicionales de reinmunización activa con el inmunógeno (5-7) no fueron eficaces para inducir un incremento significativo adicional en el titulo de anticuerpos específicos, en animales considerados hiperinmunes a estas dos drogas opiáceas (dato no mostrado en la figura) . Este resultado, hace plausible la postulación del uso de esquemas cortos de inmunización activa con nuestra nueva formulación terapéutica de vacuna anti- morfina-heroina, para lograr una respuesta inmunológica humoral máxima contra estos dos opiáceos. Uno de los objetivos centrales a lograr por toda vacuna y su correspondiente uso, a través de esquemas de inmunización activa, es la demostración de que ambos son eficaces para la inducción de respuestas inmunológicas de tipo humoral y/o celular con la consolidación de memoria ( inmunológica a largo plazo. En la figura 3, se muestran datos representativos de un proceso tipico de decaimiento temporal de la respuesta inmunológica humoral de anticuerpos anti¬ morfina-heroína, después de la cuarta reininunización de un grupo de 10 sujetos vacunados activamente con nuestra nueva formulación terapéutica de vacuna anti-morfina-heroína. Nótese que los animales hiperinmunes, no re-inmunizados, muestran un decaimiento progresivo en el título de los anticuerpos séricos en un curso temporal de 120 días. El título inicial promedio de los antisueros posterior a la última re-inmunización (1.8000-1:1000 000) presentó un decaimiento de aproximadamente 40-50 veces (1:20,000) . Estos datos muestran y apoyan la postulación, de que la inmunización activa con la presente nueva formulación terapéutica de vacuna anti-morfina-heroína, es capaz de inducir una clásica respuesta inmunológica humoral, al menos después de la cuarta inmunización. Esta propuesta se apoya fuertemente a partir de los datos experimentales obtenidos de ELISA por captura de anticuerpo de la figura 4, donde se muestra la consolidación a largo plazo de memoria inmunológica humoral contra estos dos opiáceos después de esta cuarta reinmunización. En esta figura, se muestran datos promedio de un grupo de 10 sujetos experimentales revacunados después de un periodo de 6 meses después de la cuarta reinmunización. La re-inmunización activa con la presente invención de formulación terapéutica de vacuna anti-morfina- heroína, es capaz de inducir una recuperación rápida y estable (V.g., en los primeros 5-10 dias post-inmunización) , de los niveles máximos preexistentes de los títulos séricos de anticuerpos contra estos dos opiáceos, con un patrón de decaimiento temporal similar al mostrado después de la cuarta reimunización (ver en figura 3) en animales hiperinmunes no re-inmunizados (V.g., nivel máximo del titulo alcanzado a los 15-20 dias posteriores a la reimunización, siguiendo una cinética de decaimiento lenta y progresiva durante los restantes 30 dias hasta alcanzar los niveles más bajos detectados en los titulos de los antisueros a los 120 dias, datos no mostrados en la figura) . Una vez evaluada y validada la eficacia de nuestra nueva formulación terapéutica de vacuna anti-morfina-heroína, para su uso en esquemas de vacunación activa, para generar una respuesta inmunológica humoral caracterizada por altos y sostenidos titulos de anticuerpos séricos contra estos dos opiáceos, se diseñaron y desarrollaron estudios inmunológicos subsiguientes de ELISA competitivo para evaluar e identificar la especificidad de los anticuerpos séricos anti-morfina- heroína. Nuestro ensayo de ELISA competitivo de valoración de especificidad de anticuerpos, emplea el mismo diseño experimental descrito con anterioridad para el ensayo de ELISA no competitivo. La diferencia del ensayo competitivo, consiste en la preabsorción de los antisueros de animales hiperinmunes a estos dos opiáceos con diferentes concentraciones (V.g., en el rango nM-μM) de diferentes antigenos potencialmente competidores del reconocimiento inmunológico de los anticuerpos contra la morfina. Estas sustancias incluyeron a la morfina como control positivo de sustancia competidora, y adicionalmente a los tres principales metabolitos de biotransformación de la heroina-morfina (6-monoacetilmorfina, morfina-3-glucurónido y morfina-6-glucurónido) con potencial adictivo, al análogo estructural sintético de la morfina, la heroína, el cual tiene un orden de magnitud mayor, a dosis equivalente, de más alta potencia farmacológica adictiva que su congénere natural, a dos neuropéptidos opioides representativos de los mamíferos, la Leucina-encefaliña y la beta-endorfina, asi como a un antagonista competitivo de los receptores opioides, dosificado en algunos esquemas antiadictivos contra la heroína, como es el caso de la naltrexona. En este ensayo, los pozos de reacción que muestren una ausencia de señales significativas de absorción a 490 nm después de completar el ensayo, nos permitirla identificar, una ausencia de unión de anticuerpos específicos séricos al antigeno de adsorción de la fase sólida de los pozos, que es la morfina-6-hemisuccinil-BSA. Esta última condición experimental, es seria indicativa de que los anticuerpos séricos generados por la vacunación activa con nuestra nueva formulación de vacuna anti-morfina-heroina, tendrían un patrón de reconocimiento inmunológico cruzado por alguno de los antígenos competidores usados en el ensayo. Los datos representativos de la figura 5, muestran ensayo inmunoenzimático de ELISA competitivo, el cual muestra la especificidad de reconocimiento inmunológico equivalente entre la morfina y la heroína, por los anticuerpos generados con la administración de la nueva formulación terapéutica de vacuna anti-morfina-heroina (concentraciones farmacológicas similares al valor de referencia de IC50 de alrededor de 0.6- 0.8 μM para ambas curvas de competición) . Adicionalmente, estos ensayos también mostraron el reconocimiento inmunológico cruzado de los anticuerpos séricos anti¬ morfina/heroína, solamente contra los metabolitos de biotransformación de estos dos opiáceos (6-monoacetil- morfina, morfina-3-glucurónido y morfina-6-glucurónido) , pero no por las otras sustancias ensayadas. En conjunto, estos resultados hacen plausible proponer la ausencia de interferencia inmunológica de la vacunación activa con este inmunógeno en la terapia clínica clásica antiadictiva en el humano con antagonistas competitivos de receptores opioides (V.g., naltrexona y naloxona) . Adicionalmente, también es factible asumir que nuestra nueva formulación terapéutica de vacuna contra la adicción a la morfina-heroina, no es capaz de generar una respuesta inmunológica humoral del tipo autoinmune, ya que los anticuerpos generados por esta vacuna, no son capaces de reconocer neuropéptidos opioides de los mamíferos, como la Leucina-encefaliña y la beta-endorfina, los cuales son sintetizados endógenamente en los tejidos del animal vacunado, incluyendo al humano, y tienen funciones criticas en la fisiología del sistema nervioso.

EVALUACIÓN Y VALIDACIÓN DE IA EFICACIA DE LA PRESENTE INVENCIÓN DE FORMULACIÓN TERAPÉUTICA DE VACUNA BIVALENTE CONTRA LA ADICCIÓN A LA MORFINA-HEROÍNA

Una vez evaluada la eficacia de la presente formulación terapéutica de vacuna bivalente anti-morfina-heroína para conferir hiperinmunicidad contra la morfina y la heroína a través del inicio, desarrollo y consolidación de una respuesta con memoria inmunológica humoral, con altos y sostenidos títulos de anticuerpos séricos específicos para estas dos drogas y sus metabolitos de biotransformación en los sujetos inmunizados, decidimos explorar los efectos inmunoprotectores de la presente formulación terapéutica de vacuna bivalente anti-morfina-heroína, contra la adquisición de conductas adictivas a estos dos opiáceos en grupos de sujetos hiperinmunes a estas dos drogas. Estos experimentos se llevaron a cabo, empleando un paradigma farmacológico de autoadministración intravenosa adictiva de morfina y heroína en el roedor, el cual se implemento a partir de paradigmas farmacológicos de esta naturaleza reportados por otros grupos de trabajo (J. M. Van Ree y col., J. Pharm. Exp. Ther., 204 (3) :547-557, 1978 ; J. M. Van Ree y D. de Wied, Life Sci. 21:315-320, 1977; T. J. Martin y col., J. Pharmacol. Exp. Ther. 272:1135-1140, 1995; P. Hyytia y col., Psychopharmacology, 125:248-254, 1996; T. J. Martin y col., Brain. Res. 755:313-318, 1997; C. W. Hutto, Jr. y W. F. Crowder, Pharmacol. Biochem. Behav. 58 (1) : 133-140, 1997; R. Ranaldi y E. Munn, Neuroreport, 9:2463-2466, 1998; S. Martin y col., Brain Res. 821:350-355, 1999; I. M. Maisonneuve y S. D. Glick, Eur. J. Pharmacol, 383:15-21. 1999; S. D. Comer y col., Psychopharmacology, 143327-338, 1999; S. Semenova y col., Eur. J. Pharmacol. 378:1-8, 1999; M. R. A. Carrera y col., Psychopharmacology, 144:111-120, 1999; Z-X. Xi y E. A. Stein, J. Pharm. Exp. Ther. 290:1369-1374, 1999 y L. J. Sim- Selley y col., J. Neurosci. 20 (12) : 4555-4562, 2000) . Los paradigmas farmacológicos de autoadministración de drogas adictivas como la morfina y la heroína en el roedor, han sido ampliamente utilizados para explorar los mecanismos neurobiológicos involucrados en los síndromes adictivos a estas drogas, asi como para evaluar los efectos antiadictivos de fármacos como la metadona, naloxona y naltrexona. Estos paradigmas farmacológicos permiten evaluar los efectos motivacionales y reforzantes de las conductas adictivas a esta clase de sustancias opiáceas, en forma independiente de los efectos farmacológicos que estas producen en el sistema nervioso (V.g., activación psicomotora) , cuando se emplean esquemas de administración farmacológica especificos. La valoración y validación de los efectos inmunoprotectores contra la adicción a la morfina-heroina, inducidos por el uso de la presente invención de formulación terapéutica de vacuna bivalente anti-morfina-heroina, requirió del diseño, desarrollo y validación, en nuestro laboratorio, de un paradigma farmacológico de autoadministración intravenosa adictiva de estos dos opiáceos en el modelo animal de la rata.

a) .- Implementaσión metodológica del paradigma farmacológico de autoadministración intravenosa adictiva de morfina y heroina en el modelo animal de la rata

La implementación del modelo farmacológico adictivo de estos dos opiáceos en la rata, se estandarizó a partir de diversos protocolos reportados previamente por varios grupos de trabajo (J. M. Van Ree y col., J. Pharm. Exp. Ther., 204 (3) :547-557, 1978 ; J.M. Van Ree y D. de Wied, Life Sci. 21:315-320, 1977; T.J. Martin y col., J. Pharmacol . Exp. Ther. 272:1135-1140, 1995; P. Hyytiá y col., Psychopharmacology, 125:248-254, 1996; T. J. Martin y col., Brain Res. 755:313-318, 1997; C. W. Hutto, Jr. y W. F. Crowder, Pharmacol. Biochem. Behav. 58 (1) :133-140, 1997; R. Ranaldi y E. Munn, Neuroreport, 9:2463-2466, 1998; S. Martin y col., Brain Res. 821:350-355, 1999; I. M. Maisonneuve y S. D. Glick, Eur. J. Pharmacol, 383:15-21. 1999; S. D. Comer y col., Psychopharmacology, 143327-338, 1999; S. Semenova y col., Eur. J. Pharmacol. 378:1-8, 1999; M. R. A. Carrera y col., Psychopharmacology, 144:111-120, 1999; Z-X. Xi y E. A. Stein, J. Pharm. Exp. Ther. 290:1369-1374, 1999 y L. J. Sim- Selley y col., J. Neurosci. 20 (12) :4555-4562, 2000). En forma general, se usan animales previamente implantados a través de procedimientos quirúrgicos al nivel intravenoso en la yugular externa, con catéteres estériles de teflón. Subsiguientemente, los animales implantados, son expuestos por separado a nuestro paradigma de autoadministración intravenosa de morfina y heroína, durante sesiones continuas de 4h/dia en cajas de condicionamiento operante de Skinner, controladas por el observador mediante señales computarizadas . Por lo tanto, mediante el empleo de este modelo farmacológico, la infusión intravenosa de una "unidad de dosis" completa de cada uno de estos dos opiáceos, está determinada en función del número fijo de respuestas operantes de "palanqueos" que realiza el animal sobre una palanca retráctil, localizada en las cajas operantes de Skinner, en intervalos de tiempo especificados. Por ejemplo, la infusión de dosis unitarias adictivas de morfina (V.g., 1900 μg/0.2 ml/kg de peso) y de heroína (60 μg/0.2 ml/kg) , se llevan a cabo cuando el animal consigue realizar un número fijo de respuestas de "palanqueos" (V.g., 1, 3, 5, 10) después de un intervalo de tiempo definido (V.g., 1, 10, 20 segundos) , durante el cual, la palanca retráctil es inactivada. Es entonces que a través de esta metodología operante, se puede evaluar la conducta de consumo de droga, mediante la estimación del número total de infusiones logradas en sesiones diurnas de un tiempo dado de duración (V.g., 1, 2, 3 y 4 horas), asi como de la conducta de búsqueda de estos dos opiáceos, a través de la cuantificación del número total de palanqueos logrados durante los intervalos de tiempo de inactivación de la palanca retráctil. En estos modelos farmacológicos, los sujetos entrenados, indican cuando reciben una inyección de una unidad de dosis adictiva de estos opiáceos. Asimismo, este paradigma farmacológico, también permite llevar a cabo un procedimiento cuantitativo y reproducible de cuantificar las dosis acumuladas de autoinyección/animal/sesión/dia y las dosis acumuladas de autoinfusión/animal/ a lo largo de un esquema temporal dado de entrenamiento (V.g., 10, 15, 30 días acumulados) . La capacidad de la morfina o heroína para inducir la respuesta correcta (V.g., depresión de la palanca retráctil y autoinfusión de la droga) es definida como la propiedad reforzante que tienen estas drogas para discriminar el estímulo. En este contexto, una respuesta inmunológica humoral de altos y sostenidos títulos de anticuerpos séricos anti-morfina-heroína, en animales vacunados activamente con la presente invención de vacuna bivalente contra estos dos opiáceos, que son sujetos a este paradigma de autoadministración intravenosa adictiva de morfina-heroína, debe de neutralizar los efectos neurofisiológicos de estas dos drogas y por lo tanto, estos animales disminuyen significativamente sus repuestas de autoinfusión de estos dos opiáceos, al no haber estímulo reforzante. En resumen, el empleo de este paradigma de reforzamiento farmacológico de la autoadministración intravenosa adictiva de morfina-heroína, permitió obtener perfiles farmacológicos básales relacionados con la conducta operante de autoconsumo adictivo de estos dos opiáceos. Sobre este último parámetro farmacológico de consumo adictivo a la morfina y heroína, se basaron las cuantificaciones comparativas entre grupos de animales inmunizados con la presente invención de formulación terapéutica de vacuna bivalente anti-morfina-heroína y los grupos control (no inmunizados o inmunizados con coadyuvante y codayuvante/proteína acarreadora, ver resultados representativos en las figuras 6 y 7) .

1.-Implementación funcional de cajas de condicionamiento operante de Skinner Se implemento la instalación y funcionamiento de un mínimo de 8 cajas completas operantes de Skinner de aluminio y acrilico transparente, especialmente diseñadas para la autoadministración intravenosa de líquidos y fármacos en el modelo animal de la rata, de acuerdo a estándares funcionales recomendados por el manufacturador (Operant Behavior Conditioning Systems for lab animáis, TSE Systems, Homburg, Alemania) .

2.-Implementación del paradigma de aprendizaje condicionante de obtención de recompensa de alimento por palanqueo Se usaron ratas machos de la cepa Wistar (260-320 gr.), los cuales se entrenaron en el modelo aprendizaje de tareas operantes relacionadas con la localización, presión de palancas retráctiles de respuesta operante y de la obtención recompensante de un máximo de 200 pastillas de alimento de 45 mg/pza (Noyes Traditional Food Precisión Pellets; Research Diets, Inc., Lancaster, NH), en sesiones de entrenamiento de 4 h durante 5-7dias. En este contexto experimental, los animales fueron inicialmente condicionados a obtener recompensa de pastillas de alimento como estimulo reforzante, cada vez que deprimieran la palanca retráctil, en asociación con la presencia de un estimulo de luz, en la caja controlada en linea por una computadora, en un régimen fijo de reforzamiento 1 (FRl), durante una sesión diaria de 4 horas. Después de estos 7 dias, la duración de la sesiones fue acortada a 30 minutos con un tiempo de intervalo de inactivación de la palanca de 1 segundo (TOl) , el cual fue gradualmente incrementado a 20 segundos en los siguientes 5 dias . Cada animal fue entrenado hasta adquirir respuestas totales/sesión de ganancia de 50 pastillas de alimento en un régimen fijo de reforzamiento FRl TO de 20 segundos durante las sesiones de 30 minutos de duración. Los animales fueron regresados a un régimen de alimentación ad libitum una vez que lograron este criterio de reforzamiento. De esta forma, los animales que lograron el aprendizaje conductual condicionante, en este paradigma de obtención de recompensa condicionante de alimento, fueron ulteriormente registrados y preparados como animales candidatos para recibir la implantación quirúrgica subsiguiente de un catéter intravenoso de teflón en la vena yugular externa, para poder iniciar en ellos, la etapa subsiguiente de procedimientos experimentales de inmunoprotección contra el consumo adictivo de morfina y heroina, durante la autoadministración intravenosa adictiva de estos dos opiáceos .

3.-Implantación quirúrgica de catéteres yugulares intravenosos Los animales experimentales entrenados en el aprendizaje condicionante operante de obtención de alimento, fueron expuestos a la implantación quirúrgica de un catéter estéril de teflón/animal en la yugular externa, bajo anestesia general y condiciones asépticas de cirugía, de acuerdo a un protocolo quirúrgico estándar descrito por K. M. Kantak y colaboradores (Psychopharmacology, 148:251-262, 2000) .

4.- Desarrollo y establecimiento de respuestas básales de autoadministración intravenosa de morfina y heroína Una vez verificada la funcionalidad de permeación de líquidos a través de los catéteres implantados, y después de 7 dias de recuperación postquirúrgica, los animales operados fueron expuestos a un paradigma farmacológico de autoadministración intravenosa de morfina y heroína en sesiones diurnas de 4 horas. Inicialmente, diferentes grupos de animales fueron expuestos por separado a un entrenamiento de autoadministración intravenosa de una dosis adictiva unitaria de morfina (1900 μg/kg/0.2 mi de solución salina/10 segundos de duración de inyección) o de heroína (60 μg/kg/0.2 mi de solución salina/10 segundos de duración de inyección) , siguiendo un esquema fijo de reforzamiento 1 (FRl) TO-20 segundos, por 4 horas por sesión/día/7 dias consecutivos. La diferencia de estos valores de dosis unitaria adictiva entre la morfina y la heroína, ha sido escogida en función de datos reportados en la literatura (J. M. Van Ree y col., J. Phar. Exp. Ther. 204 (3) : 547-557, 1977 y C. W. Hutto, Jr. y W. F. Crowder, Phar. Biochem. Behav. 58 (1) : 133-140, 1997), donde se ha demostrado que una relación farmacológica de dosis en una proporción de 32:1 de morfina¡heroína, es capaz de producir una elección equivalente de autoinfusión intravenosa adictiva de estos dos opiáceos en paradigmas farmacológicos de autoadministración intravenosa en el roedor. Después de este periodo total de entrenamiento, los animales adquirieron lineas básales estables de autoadministración adictiva de los dos opiáceos, aproximadamente después de 7-10 dias subsiguientes de entrenamiento, con niveles promedio aproximados de línea basal de 25 ±3 y 20 +5 autoinfusiones respectivamente de dosis unitarias adictivas de heroína y morfina. En nuestro protocolo, se consideraron experimentalmente establecidas y consolidadas las líneas básales de autoinfusión de estas dos drogas, cuando se logró la obtención de coeficientes de variación no mayores del 10%, durante al menos cinco días consecutivos de experimentación. Después de establecer esta primera línea basal de autoinfusión de morfina y heroína, se procedió a llevar a cabo el establecimiento de la primera fase de extinción de la líneas básales de autoinfusión adictiva, a través de la sustitución durante los subsiguientes 3-5 días de los dos opiáceos por solución vehiculo de inyección (V.g., solución vehiculo = solución salina al 0.9% de NaCl en H2O desionizada estéril) . La extinción de las respuesta adictivas de autoinfusión de morfina y heroína fueron definidas, cuando se observó que los valores promedio del número de autoinfusiones/sesión por dia de solución vehiculo hablan llegado a los niveles promedio de 3 + 2 autoinfusiones de solución vehiculo en ambos grupos de animales pre-entrenados para la adquisición de lineas básales de autoinfusión de morfina y heroína. Para consolidar la conducta de autoadministración intravenosa adictiva de estos dos opiáceos, se aplicaron dos ciclos subsiguientes de re¬ adquisición-extinción de la autoinfusión de estas dos drogas . En este contexto experimental, 15 dias después de haberse obtenido los niveles básales promedio de la fase de extinción de autoinfusión adictiva de estos dos opiáceos, se procedió a evaluar el efecto de antagonismo de anticuerpos séricos anti- morfina-heroina, sobre la readquisición de la conducta de autoinfusión intravenosa adictiva de estos dos opiáceos, en animales hiperinmunes y pre-entrenados con estos paradigmas farmacológicos, después de haber sido inmunizados activamente con la presente formulación terapéutica de la vacuna bivalente contra la adicción a estos dos opiáceos, usando el esquema de vacunación revelado en la presente invención. 5.-Valoración del efecto inmunoprotector contra la adicción a la morfina-heroína por el procedimiento de inmunización activa con la presente invención de vacuna anti¬ morfina-heroína Los animales pre-entrenados con conductas adquiridas de autoinfusión adictiva de morfina y heroína por el procedimiento de autoadministración intravenosa a estas drogas, se vacunaron activamente con la formulación terapéutica de vacuna bivalente de la presente invención contra estos dos opiáceos y con las sustancias control (V.g., solamente con coadyuvante representado por hidróxido de aluminio o con este coadyuvante más toxoide tetánico como proteina acarreadora) , usando el mismo protocolo de inmunización revelado en la presente invención. Una vez alcanzado y consolidado el patrón característico de respuesta inmunológica humoral contra esas dos drogas (ver figuras 1, 2, 3 y 4) en los animales inmunizados, éstos fueron re- expuestos al paradigma farmacológico de autoadministración intravenosa adictiva de estos dos opiáceos, y se evaluó el efecto inmunoprotector de la vacunación, a través de la cuantificación de la adquisición del número de autoinfusiones (comportamiento de consumo adictivo) , a lo largo de 15-20 sesiones diarias consecutivas. Estos mismos estudios se llevaron a cabo en los grupos control inmunizados, únicamente con el adyuvante o con el adyuvante más acarreador proteico. Los datos fueron expresados como número acumulativo promedio de autoinfusiones/dia/por grupo experimental de animales durante el periodo total de sesiones diarias (15-20), ensayadas para la valoración del efecto inmunoprotector. El análisis estadístico de los datos, se llevó a cabo a través de análisis de varianza (ANOVA) con mediciones repetidas seguidos por una prueba de Newman-Keuls para el análisis post-hoc de comparaciones. En este contexto experimental, los grupos experimentales incluyeron animales hiperinmunes a la morfina-heroina (PA- MORFINA, n=8) y los grupos control (inmunizados con adyuvante de hidróxido de aluminio (ALUMINA) o con la proteina acarreadora más adyuvante (PA+ALUMINA, n=8 por grupo) , los cuales fueron dosificados con unidades de dosis adictivas de heroína o morfina durante el protocolo de auto-administración intravenosa adictiva de estos dos opiáceos revelado en la presente invención. Los resultados representativos de los valores promedio de lineas básales del número de autoinfusiones de ambos opiáceos y de la solución vehículo control (V.g., salina isotónica) por sesión diaria de 4 horas de autoadministración, por 15 dias consecutivos, son mostrados en la figuras 6 y 7. En la figura 6, se muestra un resultado representativo del efecto inmunoprotector de la vacunación activa, con la formulación terapéutica de vacuna bivalente anti-morfina- heroína de la presente invención, contra la conducta de auto¬ administración farmacológica intravenosa adictiva de morfina en el modelo animal del roedor. Los grupos de ratas inmunizadas con la presente invención de vacuna, y los grupos controles inmunizados con adyuvante y con adyuvante mas proteina acarreadora fueron sujetos a los paradigmas farmacológicos de auto-administración de morfina. Los animales controles, que recibieron únicamente hidróxido de aluminio (ALUMINA) como inmunógeno, no mostraron cambios significativos de los valores promedio de autoinfusiones de morfina/sesión (17 ± 4, error estándar de la media E.S.M.), cuando se compararon con los valores control promedio pre- inmunización (18 ± 5, error estándar de la media E.S.M.) . Por el contrario, los animales vacunados con la preparación inmunogénica de morfina (PA-morfina) , mostraron una significativa reducción en el número promedio de autoinfusiones de heroina/sesión (4 ± 3, error estándar de la media E.S.M., p < 0.005), en comparación con animales inmunizados con adyuvante (ALUMINA) o con adyuvante más la proteina acarreadora (PA-solo) . Es interesante notar, la similitud en el patrón farmacológico del número promedio de autoinfusiones de solución vehículo control, logrado por los animales inmunizados con estas tres preparaciones de vacuna (3 ± 2 con inmunización de ALUMINA, 3 + 2 con ALUMINA+PA y de 3 ± 2 con la vacuna bivalente anti-morfina-heroina de la presente invención) . En la figura 7 se muestra un resultado representativo, del efecto inmunoprotector de la vacunación activa con la formulación terapéutica de vacuna bivalente anti-morfina- heroina de la presente invención, contra la conducta de auto¬ administración farmacológica intravenosa adictiva de heroína en el modelo animal del roedor. Los grupos de ratas inmunizadas con la presente vacuna, y los grupos controles inmunizados con adyuvante y con adyuvante mas proteina acarreadora, fueron sujetos a los paradigmas farmacológicos de auto-administración de heroína. Los animales controles, que recibieron únicamente hidróxido de aluminio (ALUMINA) como inmunógeno, no mostraron cambios significativos de los valores promedio de autoinfusiones de heroina/sesión (24 ± 4, error estándar de la media E.S.M.) comparados con los valores control promedio pre-inmunización (21 ± 3, error estándar de la media E.S.M.) . Por el contrario, los animales vacunados con la preparación inmunogénica de morfina (PA-morfina) , mostraron una significativa reducción en el número promedio de autoinfusiones de heroina/sesión (6 + 2, error estándar de la media E.S.M., p < 0.005) en comparación con animales inmunizados con adyuvante (ALUMINA) o con adyuvante más la proteina acarreadora (PA-solo) . Es interesante notar, la similitud en el patrón farmacológico del número promedio de autoinfusion.es de solución vehiculo control, logrado por los animales inmunizados con estas tres preparaciones de vacuna (3 + 2 con inmunización de ALUMINA, 2 + 3 con ALUMINA+PA y de 3 + 1 con la vacuna bivalente anti-morfina-heroina de la presente invención) . Finalmente, la aplicación de este tipo de estrategias terapéuticas está siendo evaluada para ser utilizada en humanos con problemas de adicción a la morfina y heroina. Debe ser evidente, para aquellas personas expertas en la técnica, que otras variaciones no dadas a conocer especificamente en la presente invención, pero que, sin embargo, se proponen mediante la presente descripción detallada y que se consideran, que quedan dentro del alcance de protección de este invento. Por lo que, la invención no debe quedar limitada mediante la descripción de las modalidades especificas dadas a conocer, sino únicamente mediante las siguientes.