ZERNIY EVGENIY YURIEVICH (RU)
GOROKHOVETS NEONILA VASILIEVNA (RU)
KUZNETCOVA NATALIA VIKTOROVNA (RU)
MAKAROV VLADIMIR ALEKSEEVICH (RU)
SAVVATEEVA LIUDMILA VLADIMIROVNA (RU)
TARASOV VADIM VLADIMIROVICH (RU)
| RU2603054C2 | 2016-11-20 |
VORA H. ET AL.: "A scaleable manufacturing process for pro- EP -B2, a cysteine protease from barley indicated for celiac sprue", BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, vol. 98, no. I, 2007, pages 177 - 185, XP009143875
| ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Биологически активный белковый препарат, обладающий специфической активностью папаин-подобных цистеиновых протеиназ, характеризующийся тем, что белок экспрессируется в растворимой форме и представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ Ш NO:2-4. 2. Способ получения биологически активного белкового препарата по п.1, обладающего специфической активностью папаин-подобных цистеиновых протеиназ, характеризующийся тем, что включает трансформацию клеток плазмидами, содержащими ДНК, кодирующую белок с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ Ш NO: 2-4, культивирование и выделение биологически активного препарата. 3. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что для трансформации плазмидами, содержащими последовательности ДНК, кодирующие белки с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ Ш NO:2-3, используют клетки E.coli штамма Rosetta gami В (DE3), в качестве среды культивирования используют среду LB с добавлением ампициллина и инкубируют при 37°С в аэробных условиях в течение 12-14 ч, посевным материалом инокулируют питательную среду, растят культуру до достижения оптической плотности А6оо 0.6- 0.8, индуцируют 1 мМ изопропилтио-Р-О-галактозидом и растят еще 20 ч при 18°С с накоплением растворимой формы белка, а выделение биологически активного препарата осуществляют осаждением путем центрифугирования экспрессионной культуры, после чего осадок ресуспендируют в 0.02 М фосфатном буфере, рН 8.0, содержащем 0.5 М NaCl и 0.01 М имидазол (буфер А), и гомогенизируют на ультразвуковом дезинтеграторе в течение 1 мин при 4°С, полученный лизат центрифугируют, надосадочную жидкость наносят на колонку с активированной ионами никеля иминодиацетат-сефарозой, уравновешенную буфером А, сорбент последовательно промывают уравновешивающим буфером А, затем белок элюируют буфером А с содержанием 0.3 М имидазола, далее раствор белка диализуют против 0.02 М фосфатного буфера, рН 8.0 и после определения концентрации и протеолитической активности белка в полученном препарате, аликвотируют по стеклянным флаконам, замораживают и лиофилизуют. 4. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что для трансформации плазмидой, содержащей последовательность ДНК, кодирующую белок с аминокислотной последовательностью SEQ Ш NO:4, используют клетки P.pastoris штамма GS 115, в качестве среды культивирования используют среду YPD и инкубируют при 30°С в шейкер-инкубаторе до достижения оптической плотности Абоо 1.5, клеточные суспензии растирают на чашке Петри с минимальной безгистидиновой агаризованной средой и инкубируют при 30°С до появления колоний, затем одной колонией полученных трансформантов Pichia pastoris GS 1 15/pPIC9-Triticain-a-GM, содержащих одну или две копии фрагмента гена усеченного тритикаина-альфа, инокулируют питательную среду BMGY и наращивают клеточную массу при 30°С в шейкер-инкубаторе до оптической плотности 5 о. е. (Mut+) или 25 о.е. (Muts), выделение биологически активного препарата осуществляют осаждением путем центрифугирования, полученный осадок ресуспендируют в среде BMMY с последующим инкубированием в течение 96 ч при 30°С и 300 об/мин, добавляя каждые 24 ч в качестве индуктора экспрессии метанол до конечной концентрации 0.7%, затем клетки осаждают, отбирают супер натанты; далее надосадочную культуральную жидкость фильтруют (0.45 мкм) и диализуют против 0.02 М раствора фосфата натрия, рН 8.0 при 4°С в течение 24 ч, диализат концентрируют и наносят на колонку с сорбентом Sephacryl S-200HR, уравновешенную 0.02 М фосфатным буфером, рН 8.0, содержащим 130 мМ NaCl, далее собирают белковые фракции по 6 мл и анализируют на присутствие белка методами электрофоретического анализа и определяют концентрацию и протеолитическую активность, далее биологически активный белковый препарат аликвотируют по стеклянным флаконам, замораживают и лиофилизуют. 5. Нуклеиновая кислота, кодирующая биологически активный белковый препарат, обладающий специфической активностью папаин-подобных цистеиновых протеиназ, по п.1 , характеризующаяся тем, что предназначена для использования в способе по п. 2. 6. Вектор экспрессии, характеризующийся тем, что содержит нуклеиновую кислоту по п. 5 для использования в способе по п. 2. 7. Вектор экспрессии по п. 6, характеризующийся тем, что представляет собой вектор на основе рЕТ15Ь или рР1С9. 8. Клетка-хозяин, характеризующаяся тем, что содержит нуклеиновую кислоту по п. 5, кодирующую биологически активный белковый препарат по п. 1, для использования в способе по п. 2. 9. Клетка-хозяин по п. 8, характеризующаяся тем, что представляет собой клетку E.coli штамма Rosetta gami В (DE3) или P. astoris штамма GS 115. ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет) <120> ПРЕПАРАТ ЦИСТЕИНОВОИ ПРОТЕИНАЗЫ ПШЕНИЦЫ ТРИТИКАИНА- АЛЬФА, ПОЛУЧЕННОЙ В РАСТВОРИМОЙ ФОРМЕ, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА <160> SEQ ID ΝΟ: 1 Met His His His His His His Ala cat atg cat cat cat cat cat cat gcc Ndel Met Arg Ser Ser Met Ala Leu Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Leu Ala Ala Ala Ala atg agg age tec atg gcc etc ttg gcg gcg gcg ctg ctg ctg ctg gtg tcg ctg gcg gcg gcg gcg Asp Met Ser He Val Ser Tyr Gly Glu Arg Ser Glu Glu Glu Val Arg Arg Met Tyr Ala Glu Trp gac atg teg ate gtg tcg tac ggg gag egg age gag gag gag gtg egg egg atg tac gcc gag tgg Met Ser Glu His Arg Arg Thr Tyr Asn Ala He Gly Glu Glu Glu Arg Arg Phe Glu Val Phe Arg atg tec gag cac cgc agg acg tac aac gcc ate ggc gag gag gag cgc cgc ttc gag gtc ttc agg Asp Asn Leu Arg Tyr He Asp Gin His Asn Ala Ala Ala Asp Ala Gly Leu His Ser Phe Arg Leu gac aac etc cgc tac ate gac cag cac aac gcc gcc gcc gac gcc ggg etc cac tec ttc cgc etc Gly Leu Asn Arg Phe Ala Asp Leu Thr Asn Glu Glu Tyr Arg Ser Thr Tyr Leu Gly Ala Arg Thr ggc etc aac cgc ttc gcc gac etc acc aac gag gag tac cgc age acg tac ctg ggc gcc egg acc Lys Pro Asp Arg Glu Arg Lys Leu Ser Ala Arg Tyr Gin Ala Asp Asp Asn Glu Glu Leu Pro Glu aag ccg gac egg gag egg aag etc age gcc agg tac cag gcc gac gac aac gag gag ctg ccg gag Thr Val Asp Trp Arg Lys Lys Gly Ala Val Ala Ala He Lys Asp Gin Gly Gly Cys Gly Ser acc gtc gac tgg agg aag aag ggg gcc gtt get gcc ate aag gac cag ggc ggc tgc ggg age tgc Trp Ala Phe Ser Ala He Ala Ala Val Glu Gly He Asn Gin He Val Thr Gly Asp Met He Pro tgg get ttc tea gca ata gca get gtt gaa ggc ate aac cag att gtt acg ggc gac atg ate cct Leu Ser Glu Gin Glu Leu Val Asp Cys Asp Thr Ser Tyr Asn Glu Gly Cys Asn Gly Gly Leu Met ctg tec gag caa gag ctt gtt gac tgt gac act tea tac aac gag gga tgc aat gga ggt ctg atg Asp Tyr Ala Phe Glu Phe He He Asn Asn Gly Gly He Asp Ser Glu Glu Asp Tyr Pro Tyr Lys gac tat gcg ttt gag ttc ate att aac aat ggc ggt ate gac tct gag gag gac tac ccc tac aag Glu Arg Asp Asn Arg Cys Asp Ala Asn Lys Lys Asn Ala Lys Val Val Thr He Asp Gly Tyr Glu gag agg gac aac cgt tgc gat get aac aag aaa aat gcg aag gtt gtt acc att gat ggg tac gag Asp Val Pro Val Asn Ser Glu Lys Ser Leu Gin Lys Ala Val Ala Asn Gin Pro He Ser Val Ala gat gtg ccc gtg aac agt gag aag agt ctg cag aag gca gtt gca aac cag ccc ate agt gtt gcg He Glu Ala Gly Gly Arg Ala Phe Gin Leu Tyr Lys Ser Gly He Phe Thr Gly Thr Cys Gly Thr att gag get ggt ggc agg gca ttc cag etc tac aaa tcg ggt ate ttc act gga acc tgt gga аса Ala Leu Asp Ш Gly Val Ala Ala Val Gly Tyr Gly Thr Glu Asn Gly Lys Asp Tyr Trp Leu Val gca ctt gac cat ggt gtc gcc gcc gtt ggt tat ggt аса gag aac ggc aag gac tac tgg etc gtc Arg Ser Trp Gly Thr Val Trp Gly Glu Asp Gly Tyr He Arg Met Glu Arg Asn He Lys Ala agg aac tec tgg ggt acc gtc tgg gga gag gat ggt tac ate egg atg gag cgt aac ate aag gca Ser Ser Gly Lys Cys Gly He Ala Val Glu Pro Ser Tyr Pro Thr Lys Thr Gly Glu Asn Pro Pro tec agt ggc aaa tgt ggt att gcc gtt gag cct tec tac ccg acg aag acg ggc gag aac ccc cct Asn Pro Gly Pro Thr Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Ser Ser Val Cys Ш>mm mm aac ccc ggc cca act cca cca tct ccc gcc cca ccg tct tec gtc tgt gac age tac aac gag tgc liiil iii ill iii ill ШШ ili ill: ill l ili iiiiiii ccc gcg age acg acc tgc tgc tgc ate tac gag tac ggc aag gag tgc ttc gcc tgg ggc tgt tgc 1 cca etc gag ggt get acc tgc tgc gat gat cac tac age tgc tgc cct cat aac tat ccc ate tgc Шт Ш mmmm Шт Leu Ala Ala Lys Asp Ser Pro Leu Ser Val Lys Ala Gin Arg Arg aac acc cag cag gga acc tgc ctt gcg gcc aag gac agt cca ctg tea gtg aag get cag agg cgt Thr Leu Ala Lys Pro He Gly Ala Phe Ser Val He Ala Thr Asp Gly Lys Lys Ser Ser Ala # acc ctg gcc aag cct ate ggt get ttc tct gtc att gca act gac ggc aag aaa agt age gcg taa gga tec BamHI <160> SEQ Ш NO:2 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His cat atg ggc age age cat cat cat cat cat cac age age ggc ctg gtg ccg cgc ggc age cat Ndel Met Ser He Val Ser Tyr Gly Glu Arg Ser Glu Glu Glu Val Arg Arg Met Tyr Ala Glu Trp Met atg tcg ate gtg tcg tac ggg gag egg age gag gag gag gtg egg egg atg tac gcc gag tgg atg Ser Glu His Arg Arg Thr Tyr Asn Ala He Gly Glu Glu Glu Arg Arg Phe Glu Val Phe Arg Asp tec gag cac cgc agg acg tac aac gcc ate ggc gag gag gag cgc cgc ttc gag gtc ttc agg gac Asn Leu Arg Tyr He Asp Gin His Asn Ala Ala Ala Asp Ala Gly Leu His Ser Phe Arg Leu Gly aac etc cgc tac ate gac cag cac aac gcc gcc gcc gac gcc ggg etc cac tec ttc cgc etc ggc Leu Asn Arg Phe Ala Asp Leu Thr Asn Glu Glu Tyr Arg Ser Thr Tyr Leu Gly Ala Arg Thr Lys etc aac cgc ttc gcc gac etc acc aac gag gag tac cgc age acg tac ctg ggc gcc egg acc aag Pro Asp Arg Glu Arg Lys Leu Ser Ala Arg Tyr Gin Ala Asp Asp Asn Glu Glu Leu Pro Glu Thr ccg gac egg gag egg aag etc age gcc agg tac cag gcc gac gac aac gag gag ctg ccg gag acc Val Asp Trp Arg Lys Lys Gly Ala Val Ala Ala He Lys Asp Gin Gly Gly Cys Gly Ser Trp gtc gac tgg agg aag aag ggg gcc gtt get gcc ate aag gac cag ggc ggc tgc ggg age tgc tgg Ala Phe Ser Ala He Ala Ala Val Glu Gly He Asn Gin He Val Thr Gly Asp Met He Pro Leu get ttc tea gca ata gca get gtt gaa ggc ate aac cag att gtt acg ggc gac atg ate cct ctg Ser Glu Gin Glu Leu Val Asp Cys Asp Thr Ser Tyr Asn Glu Gly Cys Asn Gly Gly Leu Met Asp tec gag caa gag ctt gtt gac tgt gac act tea tac aac gag gga tgc aat gga ggt ctg atg gac Tyr Ala Phe Glu Phe He He Asn Asn Gly Gly He Asp Ser Glu Glu Asp Tyr Pro Tyr Lys Glu tat gcg ttt gag ttc ate att aac aat ggc ggt ate gac tct gag gag gac tac ccc tac aag gag Arg Asp Asn Arg Cys Asp Ala Asn Lys Lys Asn Ala Lys Val Val Thr He Asp Gly Tyr Glu Asp agg gac aac cgt tgc gat get aac aag aaa aat gcg aag gtt gtt acc att gat ggg tac gag gat Val Pro Val Asn Ser Glu Lys Ser Leu Gin Lys Ala Val Ala Asn Gin Pro He Ser Val Ala He gtg ccc gtg aac agt gag aag agt ctg cag aag gca gtt gca aac cag ccc ate agt gtt gcg att Glu Ala Gly Gly Arg Ala Phe Gin Leu Tyr Lys Ser Gly He Phe Thr Gly Thr Cys Gly Thr Ala gag get ggt ggc agg gca ttc cag etc tac aaa tcg ggt ate ttc act gga acc tgt gga аса gca Leu Asp ШШ Gly Val Ala Ala Val Gly Tyr Gly Thr Glu Asn Gly Lys Asp Tyr Trp Leu Val Arg ctt gac cat ggt gtc gcc gcc gtt ggt tat ggt аса gag aac ggc aag gac tac tgg etc gtc agg й Ser Trp Gly Thr Val Trp Gly Glu Asp Gly Tyr He Arg Met Glu Arg Asn He Lys Ala Ser aac tec tgg ggt acc gtc tgg gga gag gat ggt tac ate egg atg gag cgt aac ate aag gca tec Ser Gly Lys Cys Gly He Ala Val Glu Pro Ser Tyr Pro Thr Lys Thr Gly # agt ggc aaa tgt ggt att gcc gtt gag cct tec tac ccg acg aag acg ggc taa etc gag Xhol 2 <160> SEQ Ш NO:3 Met Ala Asp atg gcg дас Ncol Met Ser He Val Ser Tyr Gly Glu Arg Ser Glu Glu Glu Val Arg Arg Met Tyr Ala Glu Trp Met atg teg ate gtg tcg tac ggg gag egg age gag gag gag gtg egg egg atg tac gcc gag tgg atg Ser Glu His Arg Arg Thr Tyr Asn Ala He Gly Glu Glu Glu Arg Arg Phe Glu Val Phe Arg Asp tec gag cac cgc agg acg tac aac gcc ate ggc gag gag gag cgc cgc ttc gag gtc ttc agg gac Asn Leu Arg Tyr He Asp Gin His Asn Ala Ala Ala Asp Ala Gly Leu His Ser Phe Arg Leu Gly aac etc cgc tac ate gac cag cac aac gcc gcc gcc gac gcc ggg etc cac tec ttc cgc etc ggc Leu Asn Arg Phe Ala Asp Leu Thr Asn Glu Glu Tyr Arg Ser Thr Tyr Leu Gly Ala Arg Thr Lys etc aac cgc ttc gcc gac etc acc aac gag gag tac cgc age acg tac ctg ggc gcc egg acc aag Pro Asp Arg Glu Arg Lys Leu Ser Ala Arg Tyr Gin Ala Asp Asp Asn Glu Glu Leu Pro Glu Thr ccg gac egg gag egg aag etc age gcc agg tac cag gcc gac gac aac gag gag ctg ccg gag acc Val Asp Trp Arg Lys Lys Gly Ala Val Ala Ala He Lys Asp Gin Gly Gly Cys Gly Ser W8. Trp gtc gac tgg agg aag aag ggg gcc gtt get gcc ate aag gac cag ggc ggc tgc ggg age tgc tgg Ala Phe Ser Ala He Ala Ala Val Glu Gly He Asn Gin He Val Thr Gly Asp Met He Pro Leu get ttc tea gca ata gca get gtt gaa ggc ate aac cag att gtt acg ggc gac atg ate cct ctg Ser Glu Gin Glu Leu Val Asp Cys Asp Thr Ser Tyr Asn Glu Gly Cys Asn Gly Gly Leu Met Asp tec gag caa gag ctt gtt gac tgt gac act tea tac aac gag gga tgc aat gga ggt ctg atg gac Tyr Ala Phe Glu Phe lie lie Asn Asn Gly Gly lie Asp Ser Glu Glu Asp Tyr Pro Tyr Lys Glu tat gcg ttt gag ttc ate att aac aat ggc ggt ate gac tct gag gag gac tac ccc tac aag gag Arg Asp Asn Arg Cys Asp Ala Asn Lys Lys Asn Ala Lys Val Val Thr He Asp Gly Tyr Glu Asp agg gac aac cgt tgc gat get aac aag aaa aat gcg aag gtt gtt acc att gat ggg tac gag gat Val Pro Val Asn Ser Glu Lys Ser Leu Gin Lys Ala Val Ala Asn Gin Pro He Ser Val Ala He gtg ccc gtg aac agt gag aag agt ctg cag aag gca gtt gca aac cag ccc ate agt gtt gcg att Glu Ala Gly Gly Arg Ala Phe Gin Leu Tyr Lys Ser Gly He Phe Thr Gly Thr Cys Gly Thr Ala gag get ggt ggc agg gca ttc cag etc tac aaa tcg ggt ate ttc act gga acc tgt gga аса gca Leu Asp Gly Val Ala Ala Val Gly Tyr Gly Thr Glu Asn Gly Lys Asp Tyr Trp Leu Val Arg ctt gac cat ggt gtc gcc gcc gtt ggt tat ggt аса gag aac ggc aag gac tac tgg etc gtc agg Asm Ser Trp Gly Thr Val Trp Gly Glu Asp Gly Tyr He Arg Met Glu Arg Asn He Lys Ala Ser aac tec tgg ggt acc gtc tgg gga gag gat ggt tac ate egg atg gag cgt aac ate aag gca tec Ser Gly Lys Cys Gly He Ala Val Glu Pro Ser Tyr Pro Thr Lys Thr Gly Leu Glu His His His agt ggc aaa tgt ggt att gcc gtt gag cct tec tac ccg acg aag acg ggc etc gag cac cac cac His His His # cac cac cac tga etc Xhol <160> SEQ Ш NO:4 Met Arg Phe Pro Ser l e Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Ш Шш mm М ЖШ mm mm ί 58ί mm Ш; ί 58ί i se; ; mm ;#M Ш т Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gin He Pro Ala Glu Ala Val He Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly WMi WMi mm wm М М WM ЖШШШ mm Asp Phe Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu Phe He Asn Thr Thr mm mm ЖШ- Ш£! т-а - тшт mm ЖШ lie Ala Ser He Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val Ser Leu Glu Lys Arg^Slu Ala Glu Ala Tyr Val Glu •att gcc шд Ш ; mm Ш& mm Ш mm mm mm :g&m ШЛ tac gta gaa EcoRI Phe Ser He Val Ser Tyr Gly Glu Arg Ser Glu Glu Glu Val Arg Arg Met Tyr Ala Glu Trp Met Ser ttc tec ate gtg tcg tac ggg gag egg age gag gag gag gtg egg egg atg tac gcc gag tgg atg tec EcoRI Glu His Arg Arg Thr Tyr Asn Ala He Gly Glu Glu Glu Arg Arg Phe Glu Val Phe Arg Asp Asn Leu gag cac cgc agg acg tac aac gcc ate ggc gag gag gag cgc cgc ttc gag gtc ttc agg gac aac etc 3 Arg yr He Asp Gin His Asn Ala Ala Ala Asp Ala Gly Leu His Ser Phe Arg Leu Gly Leu Asn Arg cgc tac ate gac cag cac aac gcc gcc gcc gac gcc ggg etc cac tec ttc cgc etc ggc etc aac cgc Phe Ala Asp Leu Thr Asn Glu Glu Tyr Arg Ser Thr Tyr Leu Gly Ala Arg Thr Lys Pro Asp Arg Glu ttc gcc gac etc ace aac gag gag tac cgc age acg tac ctg ggc gcc egg ace aag ccg gac egg gag Arg Lys Leu Ser Ala Arg Tyr Gin Ala Asp Asp Asn Glu Glu Leu Pro Glu Thr Val Asp Trp Arg Lys egg aag etc age gcc agg tac cag gcc gac gac aac gag gag ctg ccg gag acc gtc gac tgg agg aag Lys Gly Ala Val Ala Ala He Lys Asp Gin Gly Gly Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Ala He Ala aag ggg gcc gtt get gcc ate aag gac cag ggc ggc tgc ggg age tgc tgg get ttc tea gca ata gca Ala Val Glu Gly He Asn Gin He Val Thr Gly Asp Met He Pro Leu Ser Glu Gin Glu Leu Val Asp get gtt gaa ggc ate aac cag att gtt acg ggc gac atg ate cct ctg tec gag caa gag ctt gtt gac Cys Asp Thr Ser Tyr Asn Glu Gly Cys Asn Gly Gly Leu Met Asp Tyr Ala Phe Glu Phe He He Asn tgt gac act tea tac aac gag gga tgc aat gga ggt ctg atg gac tat gcg ttt gag ttc ate att aac Asn Gly Gly He Asp Ser Glu Glu Asp Tyr Pro Tyr Lys Glu Arg Asp Asn Arg Cys Asp Ala Asn Lys aat ggc ggt ate gac tct gag gag gac tac ccc tac aag gag agg gac aac cgt tgc gat get aac aag Lys Asn Ala Lys Val Val Thr He Asp Gly Tyr Glu Asp Val Pro Val Asn Ser Glu Lys Ser Leu Gin aaa aat gcg aag gtt gtt acc att gat ggg tac gag gat gtg ccc gtg aac agt gag aag agt ctg cag Lys Ala Val Ala Asn Gin Pro He Ser Val Ala He Glu Ala Gly Gly Arg Ala Phe Gin Leu Tyr Lys aag gca gtt gca aac cag ccc ate agt gtt gcg att gag get ggt ggc agg gca ttc cag etc tac aaa Ser Gly He Phe Thr Gly Thr Cys Gly Thr Ala Leu Asp His Gly Val Ala Ala Val Gly Tyr Gly Thr tcg ggt ate ttc act gga acc tgt gga аса gca ctt gac cat ggt gtc gcc gcc gtt ggt tat ggt аса Glu Asn Gly Lys Asp Tyr Trp Leu Val Arg Asn Ser Trp Gly Thr Val Trp Gly Glu Asp Gly Tyr He gag aac ggc aag gac tac tgg etc gtc agg aac tec tgg ggt acc gtc tgg gga gag gat ggt tac ate Arg Met Glu Arg Asn He Lys Ala Ser Ser Gly Lys Cys Gly He Ala Val Glu Pro Ser Tyr Pro Thr egg atg gag cgt aac ate aag gca tec agt ggc aaa tgt ggt att gcc gtt gag cct tec tac ccg acg Lys Thr Gly # aag acg ggc taa gcggccgc Notl 4 |
ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА
Область техники
Изобретение относится к области молекулярной биологии, препаративной биохимии, биотехнологии, биофармакологии, а именно к созданию способов получения рекомбинантных белков семейства цистеиновых протеиназ пшеницы (Triticum aestivum) в растворимой форме и препараты белка тритикаина- альфа, состоящие из фрагмента тритикаина-альфа пшеницы. Изобретение может быть использовано в исследовательских целях для изучения функционирования папаин- подобных цистеиновых протеиназ, а также в медицине для разработки ферментных терапевтических препаратов.
Уровень техники
Тритикаины (triticain-α, -β, -γ) - высококонсервативные папаин-подобные цистеиновые эндопротеазы пшеницы, состоящие из сигнального (лидерного) пептида, удаляющегося при активации про-пептидного домена, гранулин-подобного домена [GenBank АВ267407] и каталитического домена с каталитической триадой Cys-His-Asn [Т. Kiyosaki, Т. Asakura, I. Matsumoto, et al. J Plant Physiol, 2009, 1, 166(1), 101-6]. Цистеиновые протеиназы распространены в растениях и экспрессируются в их различных органах [К. Muntz, М.А. Belozersky, Y.E. Dunaevsky, et al. J Exp Bot, 2001, 52, 1741-52, J.Q. Ling, T. Kojima, M. Shiraiwa, et al. Biochim Biophys Acta, 2003, 1627, 129-39]. Предполагается, что эти ферменты участвуют в стадиеспецифическом расщеплении и пост -трансляционных модификациях запасающих белков [A. Capocchi, М. Cinollo, L. Galleschi, et al. JAgric Food Chem, 2000,48, 6271-79, T. Okamoto, T. Shimada, I. Hara-Nishimura, et al. Plant Physiol, 2003, 132, 1892-1900]. Среди папаин-подобных цистеиновых протеиназ растений наиболее широко изучены ферменты риса и ячменя - оризаины (oryzain-α, - β, -γ) и эндопептидазы ЕРВ (barley cysteine proteinase B-l, -2) [A. Mikkonen, I Porali, M. Cercos, et al. Plant Mol Biol, 1996, 31(2), 239-54, H. Kondo, K. Abe, I. Nishimura, et al. J Biol Chem, 1990, 15, 265(26), 15832-37], однако протеазы пшеницы начали изучать относительно недавно [Т. Kiyosaki, Т. Asakura, I. Matsumoto, et al. J Plant Physiol, 2009, 1, 166(1), 101-6, T. Kiyosaki, I. Matsumoto, T. Asakura, et al. FEBS J, 2007, 274, 1908-17]. Основным преимуществом папаин-подобных цистеиновых протеиназ из семян растений на данный момент является их эндопептидазная активность, в частности, глютеназная активность - способность эффективно гидролизовать пептиды глютена (запасного белка пшеницы, состоящего из смеси мономерных глиадинов и полимерных глютенинов) или родственных запасных белков ржи и ячменя. Это свойство растительных ферментов позволяет считать их перспективными объектами при разработке лекарственных средств для борьбы с целиакией. Целиакия (глютеновая энтеропатия) представляет собой комплексное воспалительное заболевание человека, которое развивается при наличии соответствующей генетической предрасположенности в ответ на обогащенные остатками пролина и глутамина пептиды, являющиеся продуктами происходящего в пищеварительном тракте частичного протеолиза глютена [N. McGough, J.H. Cummings. Proc Nutr Soc, 2005, 64(4), 434-50, J.S. Leeds, A.D. Hopper, D.S. Sanders. Br Med Bull, 2008, 88(1), 157-70]. Распространенность глютеновой энтеропатии во взрослой популяции большинства стран мира оценена как 1 : 100 - 1 :250 или 0.5-1% от общей популяции [WGO - OMGE: Practice guidelines. World Gastroenterology News, 10 (2, 2), 2005, 1-8]. Доказанной эффективной терапией целиакии является пожизненная строгая безглютеновая диета, позволяющая предотвратить развитие осложнений и исключить клинические симптомы заболевания [S. Rashtak, J.A. Murray. Aliment Pharmacol Ther, 2012, 35(7), 768-81]. Однако главным недостатком безглютеновой диеты является сложность ее соблюдения из-за ее ограничительного характера, обусловленного как высокой стоимостью, так и сложностью подбора глютен-несодержащих продуктов питания.
В связи с этим, исследование и разработка способов получения высокоспецифичных протеиназ, стабильных и активных в присутствии эндогенных ферментов желудочно-кишечного тракта человека (т.е. в месте предполагаемого действия лекарственного препарата на их основе) имеет большое значение в терапевтических целях [L.V. Savvateeva, A. A. Zamyatnin. Curr Pharm Des, 2016, 22(16), 2439-49].
Из литературы известен метод получения проэнзимной формы цистеиновой протеиназы ячменя ЕР-В2 (ргоЕР-В2) в E.coli. [Н. Vora, J. Mclntire, P. Kumar, et al. Biotechnol Bioeng, 2007, 1, 98(1), 177-85, заявка WO2008115428 A2, 25.09.2008].
В рамках данного изобретения была выбрана протеиназа пшеницы Triticum aestivum - тритикаин-альфа, т.к. пшеница играет существенную роль как источник питания в России, а значит, наиболее подходящая для разработки отечественных терапевтических препаратов для лечения целиакии.
Молекула полноразмерного тритикаина- альфа состоит из 461 аминокислотного остатка с молекулярным весом 50,4 кДа. Впервые фермент был клонирован и экспрессирован в зародыше и алейроновом слое пшеницы для выяснения его роли в процессе созревания семян [Т. Kiyosaki, Т. Asakura, I. Matsumoto, et al. J Plant Physiol, 2009, 1, 166(1), 101-6]. Однако непосредственно белок тритикаин-альфа выделен не был.
Биосинтез рекомбинантного тритикаина-альфа для исследования его протеолитических функций был осуществлен нами ранее [L.V. Savvateeva, N.V. Gorokhovets, V.A. Makarov, et al. Int J Biochem Cell Biol, 2015, 62, 115-24, Патент RU 2603054 C2, 20.11.2016]. В описанном способе рекомбинантный тритикаин-альфа (фрагмент полноразмерного белка) синтезировался в бактериальных клетках в нерастворимой форме, что требовало включения дополнительной, трудно валидируемой, стадии рефолдинга в процессе выделения целевого белка. Также, полученные препараты обладали меньшей активностью, чем полученные препараты в настоящей заявке, а также обладали меньшим выходом при выделении и меньшей чистотой.
Раскрытие изобретения
Задачей, решаемой в рамках настоящей заявки, является расширение ассортимента ферментативных препаратов, с потенциалом использования в качестве лекарственного средства, а также разработка эффективного способа получения высокоочищенного и высокоактивного препарата белка с последующим потенциальным применением в промышленных условиях. Существует необходимость разработки усовершенствованных экономически целесообразных технологий получения таких белков с сохранением высокого качества (степень чистоты, выход и активность) препаратов для исследовательских и прикладных целей.
Техническим результатом настоящего изобретения является получение высокоочищенного и высокоактивного препарата фрагмента протеазы пшеницы тритикаина-альфа, состоящего из пропептидного (продомена) и каталитического доменов полноразмерного тритикаина-альфа пшеницы (т.е. без лидерного пептида и гранулин-подобного домена), в растворимой форме с высоким выходом при выделении, для фундаментальных и прикладных исследований (в частности, для использования в составе ферментных терапевтических средств).
Поставленная задача решается биологически активным белковым препаратом, обладающим высокой специфической активностью папаин-подобных цистеиновых протеиназ, состоящим из фрагмента (SEQ Ш NO:2-4) последовательности тритикаина-альфа (SEQ Ш ΝΟ: 1), экспрессирующегося в растворимой форме, чистота которого составляет не менее 85%. При этом препарат в котором фрагмент тритикаина-альфа содержит гексагистидиновую последовательность на Ν-конце, имеет последовательность SEQ Ш NO:2, препарат, имеющий гексагистидиновую последовательность на С -конце, имеет последовательность SEQ Ш NO:3, а препарат, не содержащий гексагистидиновую последовательность на С- и Ν-концах, имеет последовательность SEQ Ш NO:4.
Поставленная задача также решается способом получения биологически активного белкового препарата, обладающего специфической активностью папаин- подобных цистеиновых протеиназ, рекомбинантной экспрессией в бактериальной системе, заключающийся в том, что проводят культивирование клеток Е.соИ штамма Rosetta gami В (DE3), трансформированных плазмидами pET15-6HIS-Triticain-a-GM или pET15-Triticain-a-GM-6HIS, содержащими последовательности ДНК, кодирующие белки с SEQ Ш NO:2-3, соответственно, в среде LB с добавлением ампициллина при 37°С в аэробных условиях в течение 12- 14 ч, посевным материалом инокулируют питательную среду, растят культуру до достижения оптической плотности А 6 оо 0.6-0.8, индуцируют 1 мМ изопропилтио-Р-О- галактозидом и растят еще 20 ч при 18°С с накоплением растворимой формы белка с SEQ ID NO:2-3; далее осажденные центрифугированием экспрессионные культуры ресуспендируют в 0.02 М фосфатном буфере, рН 8.0, содержащем 0.5 М NaCl и 0.01 М имидазол (буфер А), и гомогенизируют на ультразвуковом дезинтеграторе в течение 1 мин при 4°С, полученную после центрифугирования лизатов соответствующую надосадочную жидкость наносят на колонку с активированной ионами никеля иминодиацетат-сефарозой, уравновешенную буфером А, сорбент последовательно промывают уравновешивающим буфером А, затем белок элюируют буфером А с содержанием 0.3 М имидазола, далее раствор белка диализуют против 0.02 М фосфатного буфера, рН 8.0 и после определения концентрации и протеолитической активности белка с SEQ Ш NO:2-3, в полученном препарате, аликвотируют по стеклянным флаконам, замораживают и лиофилизуют. При этом используют нуклеиновую кислоту, кодирующую белок с SEQ Ш NO: 2- 3, а в качестве вектора экспрессии используют вектор на основе рЕТ15Ь.
Поставленная задача также решается способом получения биологически активного белкового препарата, обладающим высокой специфической активностью папаин-подобных цистеиновых протеиназ, рекомбинантной экспрессией в дрожжевой системе, заключающийся в том, что проводят культивирование клеток P.pastoris штамма GS 115 (His " , Mut + /Mut s ), трансформированных плазмидой рР1С9- Triticain-a-GM, содержащей последовательность ДНК, кодирующей белок с SEQ Ш NO:4 в среде YPD при 30°С в шейкер-инкубаторе до достижения оптической плотности Абоо 1.5, клеточные суспензии растирают на чашке Петри с минимальной безгистидиновой агаризованной средой и инкубируют при 30°С до появления колоний, затем одной колонией полученных трансформантов Pichia pastoris GS 1 15/pPIC9-Triticain-a-GM, содержащих одну или две копии фрагмента гена усеченного тритикаина-альфа, инокулируют питательную среду BMGY и наращивают клеточную массу при 30°С в шейкер-инкубаторе до оптической плотности 5 о. е. (Mut + ) или 25 о.е. (Mut s ), осаждают центрифугированием и осадки ресуспендируют в среде BMMY с последующим инкубированием в течение 96 ч при 30°С и 300 об/мин, добавляя каждые 24 ч в качестве индуктора экспрессии метанол до конечной концентрации 0.7%, затем клетки осаждают, отбирают супернатанты; далее надосадочную культуральную жидкость Pichia pastoris GS 1 15/pPIC9-Triticain-a-GM фильтруют (0.45 мкм) и диализуют против 0.02 М раствора фосфата натрия, рН 8.0 при 4°С в течение 24 ч, диализат концентрируют и наносят на колонку с сорбентом Sephacryl S-200HR, уравновешенную 0.02 М фосфатным буфером, рН 8.0, содержащим 130 мМ NaCl, далее собирают белковые фракции по 6 мл и анализируют на присутствие белка (SEQ ID NO:4) методами электрофоретического анализа и определют концентрацию и протеолитическую активность, далее биологически активный белковый препарат аликвотируют по стеклянным флаконам, замораживают и лиофилизуют. При этом для реализации способа используют нуклеиновую кислоту, кодирующую белок с последовательностью SEQ ID NO:4 для использования в способе получения биологически активного белкового препарата и вектор экспрессии на основе рР1С9.
Краткое описание чертежей На фиг. 1 приведена электрофореграмма в 12% полиакриламидном геле в присутствии SDS: лизатов клеток штамма-продуцента E.coli Rosetta gami B(DE3) / pET15-6HIS-Triticain-a-GM до индукции (дорожка 1), лизатов клеток штамма- продуцента E.coli Rosetta gami B(DE3) / pET15-6HIS-Triticain-a-GM после индукции изопропилтио-Р-О-галактозидом (дорожка 2); растворимая клеточная фракция (дорожка 3), нерастворимая клеточная фракция (дорожка 4); рекомбинантный усеченный тритикаин-альфа (SEQ Ш NO:2, 6HIS-Triticain-a-GM, дорожка 5) после хроматограф ического выделения; М - белковые маркеры молекулярной массы (кДа).
На фиг. 2 приведена электрофореграмма в 12% полиакриламидном геле в присутствии SDS: лизатов клеток штамма-продуцента E.coli Rosetta gami B(DE3) / Triticain-a-GM-6HIS до индукции (дорожка 1), лизатов клеток штамма-продуцента E.coli Rosetta gami B(DE3) / Triticain-a-GM-6HIS после индукции изопропилтио-Р-О- галактозидом (дорожка 2); растворимая клеточная фракция (дорожка 3), нерастворимая клеточная фракция (дорожка 4); рекомбинантный усеченный тритикаин-альфа (SEQ Ш NO:3, Triticain-a-GM-6HIS, дорожка 5) после хроматограф ического выделения; М - белковые маркеры молекулярной массы (кДа).
На фиг. 3 Рекомбинантный усеченный тритикаин-альфа (SEQ Ш NO:4, у- Triticain-a-GM, экспрессированный в клетках P.pastoris) после хроматографического выделения в 14% полиакриламидном геле в присутствии SDS (М - белковые маркеры молекулярной массы, кДа); (М-белковые маркеры молекулярной массы, кДа);
На фиг. 4 приведена гистограмма, демонстрирующая специфическую (протеолитическую) активность вариантов рекомбинантных белков усеченного тритикаина-альфа и папаина (как контроля цистеиновых папаин-подобных протеиназ): 1 - папаин; 2 - рекомбинантный фрагмент тритикаин-альфа из нерастворимой фракции; 3 - усеченный тритикаин-альфа, экспрессированный в клетках P.pastoris (SEQ ID NO:4, y-Triticain-a-GM); 4 -усеченный тритикаин-альфа с Ν-концевой полигистидиновой последовательностью (SEQ ID NO:2, 6HIS-Triticain- α-GM); 5 - усеченный тритикаин-альфа с С-концевой полигистидиновой последовательностью (SEQ ID NO:3, Triticain-a-GM-6HIS).
Осуществление изобретения
В перечне последовательностей в SEQ Ш ΝΟ: 1 указана аминокислотная и нуклеотидная последовательности рекомбинантного полноразмерного тритикаина- альфа, экспрессирующегося в E.coli (TRIT-α, курсивом выделена последовательность от экспрессионной плазмиды рЕТ-42а(+); курсивом и подчеркиванием выделены сайты узнавания рестриктазами; подчеркиванием выделен лидерный пептид; курсивом и цветом выделена каталитическая триада Cys- His-Asn, определяющая принадлежность белка к цистеиновым протеазам; цветом выделен гранулин-подобный домен; подчеркиванием выделены сайты узнавания рестриктазами); SEQ Ш NO:2 - аминокислотная и нуклеотидная последовательности рекомбинантного усеченного тритикаина-альфа с Ν-концевой полигистидиновой последовательностью, экспрессирующегося в E.coli в растворимой форме (, 6HIS- Triticain-a-GM; курсивом выделена последовательность от экспрессионной плазмиды рЕТ-15Ь; подчеркиванием выделены сайты узнавания рестриктазами; курсивом и цветом выделена каталитическая триада Cys-His-Asn, определяющая принадлежность белка к цистеиновым протеазам); SEQ Ш NO:3 - аминокислотная и нуклеотидная последовательности рекомбинантного усеченного тритикаина-альфа с С-концевой полигистидиновой последовательностью, экспрессирующегося в E.coli в растворимой форме (, Triticain-a-GM-6HIS; курсивом выделена последовательность от экспрессионной плазмиды рЕТ-15Ь; подчеркиванием выделены сайты узнавания рестриктазами; курсивом и цветом выделена каталитическая триада Cys-His-Asn, определяющая принадлежность белка к цистеиновым протеазам); SEQ Ш NO:4 - аминокислотная и нуклеотидная последовательности рекомбинантного усеченного тритикаина-альфа, экспрессирующегося в P.pastoris (, y-Triticain-a-GM; курсивом выделена последовательность от экспрессионной плазмиды рР1С9; цветом выделен α-фактор; стрелкой выделен сигнал отщепления α-фактора; подчеркиванием выделены сайты узнавания рестриктазами);
Настоящее изобретение поясняется конкретными примерами выполнения, которые не ограничивают заявленный объем притязаний, при этом наглядно демонстрируют возможность достижения требуемого технического результата.
Пример 1. Клонирование усеченных фрагментов гена тритикаина-альфа для бактериальной экспрессии белков в растворимой форме.
На основе известной последовательности мРНК пшеницы (Triticum aestivum), кодирующей полноразмерный ген тритикаина-альфа (GenBank АВ267407), синтезируют комплементарную ДНК (кДНК) с использованием обратной транскриптазы мышиного вируса лейкемии Молони и праймера на 3'- нетранслируемую область мРНК 5'- gggggatccttacgcgctacttttcttgccg. Амплификацию кодирующей транслируемую область гена полноразмерного тритикаина-альфа ДНК, фланкированную сайтами рестрикции Ndel и ВатШ (TRIT-α, SEQ Ш ΝΟ: 1), проводят с использованием следующих прямого и обратного праймеров: 5'- ccccatatgcatcatcatcatcatcatgccatgaggagctccatggccctc и 5'- g g g g gatccttac gc gctacttttcttgcc g (сайты рестрикции Ndel и ВатШ выделены подчеркиванием). Продукт амплификации и плазмидную ДНК рЕТ-42а(+) обрабатывают рестриктазами Ndel и ВатШ, соединяют при помощи лигазной реакции, после чего реакционную смесь трансфицируют в компетентные клетки E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL. Трансформированные клетки высевают на агаризованную среду LB, содержащую антибиотик (канамицин). Из отобранных методом ПЦР (с помощью универсальных праймеров для рЕТ-векторов) клонов выделяют целевую плазмидную ДНК (pET_TRIT-a). Нуклеотидную последовательность встроенного фрагмента подтверждают секвенированием по Сенгеру. Отобранные клоны наращивают для оценки продуктивности, устойчивости к антибиотикам и стабильности трансформации.
Конструирование новой последовательности ДНК, кодирующей усеченный фрагмент гена тритикаина-альфа (6HIS-Triticain-a-GM, без лидерного пептида и гранулин-подобного домена, с Ν-концевой полигистидиновой последовательностью, SEQ ID NO:2) для экспрессии в бактериальной системе, осуществляют на основе плазмидной ДНК pET_TRIT-a в качестве матрицы и праймеров: 5'- tatacatatgtc gatcgtgtc gtac gg (сайт рестрикции Ndel выделен подчеркиванием) и 5'- ttctegagttagcccgtcttcgtcgg (сайт рестрикции Xhol выделен подчеркиванием). Продукт амплификации клонируют в экспрессионную плазмиду pET-15b (Novagen, Germany) по сайтам рестрикции Ndel и Xhol, используя штамм E.coli Rosetta garni В (DE3). Скрининг колоний проводят методом рестрикционного анализа и последующего секвенирования.
Аналогичным образом осуществляют конструирование новой последовательности ДНК, кодирующей усеченный фрагмент гена тритикаина-альфа (Triticain-a-GM-6HIS), без лидерного пептида и гранулин-подобного домена, с С- концевой полигистидиновой последовательностью, SEQ ID NO:3), используя следующую пару праймеров: 5'-ataccatggcgctgccggagaccgtcg и 5'- attctegagtcagtggtggtggtggtggtggcccgtcttcgtcgggt и сайты рестрикции Ncol и Xhol соответственно (выделены подчеркиванием). Пример 2. Клонирование фрагмента гена тритикаина-альфа для дрожжевой экспрессии белка в растворимой форме.
Конструирование новой последовательности ДНК, кодирующей усеченный фрагмент гена тритикаина-альфа (y-Triticain-a-GM, SEQ ID NO:4) для экспрессии в дрожжевой системе, осуществляют на основе плазмидной ДНК pET_TRIT-a в качестве матрицы и праймеров: 5 '-tgaattetccatcgtgtcgtacggg (сайт рестрикции EcoRI выделен подчеркиванием) и 5'-attgcggccgcttagcccgtcttcgtcgg (сайт рестрикции Notl выделен подчеркиванием). Продукт амплификации клонируют в экспрессионный вектор Pichia pastoris рР1С9 по указанным сайтам, который позволяет получать целевой белок в секретируемом виде за счет сигнальной последовательности (а- фактора).
Пример 3. Экспрессия фрагмента тритикаина-альфа пшеницы в растворимой форме в E.coli.
Штамм E.coli Rosetta gami В (DE3), трансформированный плазмидой рЕТ15- 6HIS-Triticain-a-GM выращивают в среде LB (10 г/л триптон, 5 г/л дрожжевой экстракт, 5 г/л NaCl) при 37°С в аэробных условиях с добавлением ампициллина (до конечной концентрации 50 мг/мл) в течение 12-14 ч (посевной материал), инокулируют новую порцию питательной среды в соотношении 1 :50, растят культуру до достижения оптической плотности А 6 оо 0.6-0.8, охлаждают во льду в течение 15 мин и индуцируют изопропилтио-Р-О-галактозидом (ИПТГ) до конечной концентрации 1 мМ, после чего клетки продолжают инкубировать 20 ч при 18°С. При индукции ИПТГ происходит биосинтез рекомбинантного 6HIS-Triticain-a-GM (SEQ ID NO:2), который накапливается в клетках как в растворимой форме, так и в тельцах включения (фиг.1). Отбирают пробы клеточной суспензии до и после индукции в количестве, соответствующем 0.1 оптических единиц (о. е.), осаждают центрифугированием, суспендируют в лизирующем буфере (0.03 М Трис-HCl, рН 6.8, 10% глицерин, 1% додецилсульфат натрия, 3% меркаптоэтанол, 0.005% бромфеноловый синий), нагревают 5 мин при 95°С, и образцы объемом 20 мкл анализируют электрофорезом в 12% полиакриламидном геле с додецил сульфатом натрия. Гель прокрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют для определения относительного количества белка в полосе целевого белка (фиг.1). По данным сканирования содержание рекомбинантного 6HIS-Triticain-a-GM составляет 15-20% от всех клеточных белков. Аналогичным образом осуществляют экспрессию фрагмента тритикаина- альфа Triticain-a-GM-6HIS (SEQ ID NO:3), используя трансформированные плазмидой pET15-Triticain-a-GM-6HIS клетки штамма Rosetta gami В (DE3). Результат биосинтеза рекомбинантного белка анализируют электрофорезом в 12% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (фиг.2). По данным сканирования геля содержание рекомбинантного Triticain-a-GM-6HIS составляет 15- 20% от всех клеточных белков, причем целевой белок синтезируется в бактериальных клетках исключительно в растворимой форме.
Пример 4. Получение высокоочищенного препарата рекомбинантного фрагмента тритикаина-альфа из E.coli.
Очистку целевых белков 6HIS-Triticain-a-GM (SEQ ID NO:2) и Triticain-a- GM-6HIS (SEQ ID NO:3) проводят методом аффинной (металл-хелатной) хроматографии. Получение рекомбинантного 6HIS-Triticain-a-GM и Triticain-a-GM- 6HIS из клеток штаммов-продуцентов Rosetta gami В (DE3)/pET15-6HIS-Triticain-a- GM и Rosetta gami В (DE3)/pET15-Triticain-a-GM-6HIS соответственно, включает несколько стадий. Осажденную центрифугированием клеточную биомассу экспрессионной культуры ресуспендируют в 0.02 М фосфатном буфере, рН 8.0, содержащем 0.5 М NaCl и 0.01 М имидазол (буфер А), и гомогенизируют на ультразвуковом дезинтеграторе в течение 1 мин (12x5 с) при 4°С. Полученную после центрифугирования лизата (10000xg, 4°С, 15 мин) надосадочную жидкость наносят на колонку с активированной ионами никеля иминодиацетат-сефарозой, уравновешенную буфером А. Процесс хроматографии проводят на системе BioLogic (BioRad) с детекцией при 280 нм. Сорбент последовательно промывают уравновешивающим буфером А. Связавшийся с сорбентом белок элюируют буфером А с содержанием 0.3 М имидазола. Раствор диализуют против 0.02 М фосфатного буфера, рН 8.0 при 4°С в течение 24 ч, трижды производя замену буфера на свежий. Концентрацию целевого белка определяют с помощью ВСА-реагента (бицинхониновой кислоты), аликвотируют по стеклянным флаконам, замораживают и лиофилизуют.
Выход полученных таким способом рекомбинантных вариантов усеченного тритикаина-альфа в растворимой форме составляет не менее 15 мг (15-24 мг) с 1 л для бактериальной культуры Rosetta gami В (DE3)/pET15-6HIS-Triticain-a-GM и не менее 5 мг с 1 л - для Rosetta gami В (DE3)/pET15-Triticain-a-GM-6HIS. Чистота полученных препаратов по данным электрофоретического анализа составляет не менее 85% (фиг. 1, 2; следует отметить, что целевые белки 6HIS-Triticain-a-GM (SEQ
ID NO:2) и Triticain-a-GM-6HIS (SEQ ID NO:3), проявляющие протеолитическую активность, подвергаются автопротеолизу в процессе выделения).
Пример 5. Экспрессия фрагмента тритикаина-альфа пшеницы в растворимой форме в P.pastoris.
Для трансформации клеток Pichia pastoris дрожжевой экспрессионной плазмидой pPIC9-Triticain-a-GM был использован ауксотрофный по гистидину штамм Pichia pastoris GS 115 (His " , Mut + ). Плазмиду pPIC9-Triticain-a-GM линеаризуют по сайту BglU. Трансформацию клеток Pichia pastoris проводят методом электропорации. Клетки штамма GS115 высевают на чашку с агаризованной средой YPD (1% дрожжевой экстракт, 2% пептон, 2% глюкоза) и инкубируют при 30°С 2 дня до появления отдельных колоний. Одной колонией инокулируют 5 мл среды YPD в колбе объемом 50 мл и наращивают клетки в течение ночи при 30°С в шейкер-инкубаторе при 300 об/мин. Далее 200 мл свежей среды YPD засевают 0.2 мл ночной культуры и снова наращивают клетки в течение ночи при 30°С в шейкер-инкубаторе до достижения оптической плотности клеточной суспензии А 6 оо 1.5. Клетки осаждают центрифугированием (1500х g, 5 мин, 4°С), осадок дважды промывают 200 мл и 100 мл охлажденной во льду стерильной воды соответственно, после чего клетки снова осаждают и ресуспендируют в 8 мл холодного 1 М сорбита. Затем клетки снова осаждают и ресуспендируют в 0.6 мл ледяного 1 М сорбита. 40 мкл клеточной суспензии смешивают с 5 мкг линеаризованной плазмиды в 10 мкл буфера ТЕ (0.01 М Трис- НС1, 0.001 М ЭДТА, рН 8.0). Смесь помещают в охлажденную 2 мм кювету и охлаждают во льду 5 мин. Затем кювету помещают в отсек шоковой камеры электропоратора и генерируют единичный импульс. Кювету извлекают из камеры и быстро добавляют 1 мл ледяного 1 М сорбита. Содержимое кюветы переносят в стерильные микропробирки. По 100, 300 и 600 мкл клеточной суспензии, трансформированной линеаризованной плазмидой pPIC9-Triticain-a-GM, растирают на чашке Петри с минимальной безгистидиновой агаризованной средой. Для контроля выживаемости по 10 мкл клеточных суспензий после электропорации суспендируют в 100 мкл 1 М сорбита и по 10 мкл растирают на чашках Петри с агаризованной YPD средой. Чашки инкубируют при 30°С до появления колоний (2-4 дня). В зависимости от способа рекомбинации и локуса встраивания линеаризованной плазмиды трансформированные клетки Pichia pastoris GS 115 (Mut + ) могут приобретать Mut s фенотип. Для подтверждения Mut + и Mut s фенотипов трансформантов колонии высевают на чашки с минимальной агаризованной средой, содержащей метанол и глюкозу (ММ и MD соответственно), подразумевая, что дрожжевые клетки фенотипа Mut s делятся в ММ среде медленнее, чем в MD среде (что визуально определяется сравнением размеров колоний на ММ и MD чашках через 2-3 суток инкубации при 30°С). Точную принадлежность дрожжевых трансформантов к Mut + или Mut s фенотипу подтверждают методом полимеразной цепной реакции. Для этого из выбранных клонов с ММ и MD чашек выделяют ДНК и анализируют методом ПЦР с использованием прямого 5 ΆΟΧ1 (gactggttccaattgacaagc) и обратного 3 ΆΟΧ1 (gcaaatggcattctgacatcc) праймеров при условиях амплификации: 95°С 3 мин, денатурация 95°С 30 с, 30 циклов, отжиг 54°С 30 с, элонгация 72°С 2 мин, затем 72°С 5 мин. Пробы анализируют методом горизонтального электрофореза в 1% агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием. По размерам ампликонов ДНК клонов Mut + и Mut s фенотипа (2140 п.н. и 1476 п.н. соответственно) выявляют преобладающий фенотип (Mut + ). Полученные трансформанты Pichia pastoris GS 115/pPIC9-Triticain-a-GM содержат как минимум одну копию фрагмента гена тритикаина-альфа. По результатам анализа отбирают несколько клонов Mut + и Mut s фенотипов для экспрессии целевого рекомбинантного белка.
Для получения двойных трансформантов линеализированную по сайту рестрикции Sail плазмиду pPIC9K-Triticain-a-GM трансформировали в полученные ранее клетки Pichia pastoris GS115/pPIC9-Triticain-a-GM (Mut + и Mut s ). Отбор двойных трансформантов проводили на генетицин-содержащей среде (0, 15 мг/мл).
Для исследования способности трансформантов P.pastoris Mut + и Mut s фенотипов секретировать y-Triticain-a-GM (SEQ Ш NO:4) одной колонией каждого клона трансформанта и контрольных штаммов со свежих чашек инокулируют 4 мл среды BMGY (1% дрожжевой экстракт, 2% пептон, 1.34% YNB, 4х10 "5 % биотин, 1% глицерин, 0.1 М фосфат калия, рН 6.0). Клеточную массу наращивают при 30°С в шейкер-инкубаторе при 300 об/мин до достижения А 6 оо 1 о. е. (для Mut + ) и А 6 оо 5 о. е.
(для Mut s ). Для АОХ-контролируемой индуции экспрессии клеточные суспензии в объеме, содержащем 5 о. е. (Mut + ) или 25 о. е. (Mut s ), осаждают центрифугированием и осадки ресуспендируют в 5 мл среды BMMY (1% дрожжевой экстракт, 2% пептон, 1.34% YNB, 4xl0 "5 % биотин, 0.5% метанол, 0.1 M фосфат калия, Н 6.0). Клетки инкубируют в течение 96 ч при 30°С и 300 об/мин. Каждые 24 ч добавляют метанол до конечной концентрации 0.7%. После окончания инкубации клетки осаждают центрифугированием (4000xg, 5 мин, 4°С). Супернатанты отбирают, замораживают в жидком азоте и хранят при -70°С до последующего анализа. Наличие рекомбинантного y-Triticain-a-GM в супернатантах клеточной культуры P. pastoris определяют методом электрофореза в 14% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия.
Пример 6. Получение высокоочищенного рекомбинантного y-Triticain-a-GM из Pichia pastoris.
Надосадочную культуральную жидкость Pichia pastoris GS115/pPIC9- Triticain-a-GM фильтруют (0.45 мкм) и диализуют против 0.02 М раствора фосфата натрия, рН 8.0 при 4°С в течение 24 ч, трижды производя замену буфера на свежий. Диализат концентрируют ультрафильтрацией на ячейке Amicon с мембраной RC-10 (Millipore) и наносят на колонку с сорбентом Sephacryl S-200HR, уравновешенную 0.02 М фосфатным буфером, рН 8.0, содержащем 130 мМ NaCl. Процесс гель- фильтрации проводят со скоростью 0,5 мл/мин, фракции по 6 мл собирают и анализируют на присутствие целевого белка методами электрофоретического анализа и определения протеолитической активности. Очищенный белок концентрируют на ячейке Amicon с мембраной RC-10 (Millipore), определяют концентрацию с помощью ВСА-реагента (бицинхониновой кислоты), аликвотируют по стеклянным флаконам, замораживают и лиофилизуют.
Выход полученного таким способом рекомбинантного y-Triticain-a-GM (SEQ ID NO:4) составляет 80-300 мг с 1 л дрожжевой культуры (с чистотой не менее 90% по данным электрофоретического анализа, фиг. 3; следует отметить, что целевой белок y-Triticain-a-GM (SEQ Ш NO:4) в процессе секреции подвергается автопротеолизу) .
Пример 7. Определение протеолитической активности вариантов рекомбинантных белков усеченного тритикаина-альфа (6HIS-Triticain-a-GM, Triticain-a-GM-6HIS и y-Triticain-a-GM).
Ферментативную (протеолитическую) активность рекомбинантного усеченного тритикаина-альфа определяют по способности гидролизовать синтетический модельный пептидный субстрат PLVQ-AMK, конъюгированный с 7-
Амино-4-метилкумарином (АМК), с определением продуктов гидролиза по интенсивности флуоресценции свободного АМК. Последовательность и структура выбранного пептида PLVQ (пролин-лейцин-валин-глутамин), представляющего собой фрагмент глютена, являются оптимальными для связывания и гидролиза тритикаином-альфа [заявка WO2008115428 А2, 25.09.2008].
Анализ проводят при 25°С в реакционной смеси, состоящей из 20 нМ целевого белка (рекомбинантного тритикаина-альфа) и 50 мкМ PLVQ-AMK в 200 мМ ацетатном буфере, рН 5.6, содержащем 100 мМ NaCl, 15 мМ 2-меркаптоэтанол, 0.6 мМ ЭДТА, 0.5 % ДМСО. Количество гидролизованного субстрата PLVQ-AMK определяют по интенсивности флуоресценции свободного АМК с использованием многорежимного автоматического спектрофлуориметра при длине волны возбуждения флуоресценции, равной 360 нм, и длине волны испускания флуоресценции, равной 460 нм. Скорость реакции определяли по графику зависимости количества субстрата (моль) от времени гидролиза (с) с последующей обработкой полученных данных с применением метода линейной регрессиии. Для репрезентативности данные по специфической активности представлены в виде гистограммы (фиг. 4).
Сравнивали активность полученных препаратов усеченного тритикаина- альфа, полученного в растворимой форме, с препаратами усеченного тритикаина- альфа, полученного ранее в нашей лаборатории в нерастворимой форме и папаином.
Активность белковых препаратов усеченного тритикаина-альфа, полученного в растворимой форме 6HIS-Triticain-a-GM (SEQ ID NO:2) и Triticain-a-GM-6HIS (SEQ Ш NO:3) значительно превысила активность препарата усеченного тритикаина-альфа 6HIS-Triticain-a-GM, полученного в нерастворимой форме, а также папаина, что является существенным преимуществом препаратов, полученных нами в рамках данной заявки. Активность препарата усеченного тритикаина-альфа y-Triticain-a-GM (SEQ ID NO:4), полученного в дрожжевой экспрессионной системе, оказалась ниже, чем активность препарата усеченного тритикаина-альфа 6HIS- Triticain-a-GM, полученного в нерастворимой форме, и папаина, однако, принимая во внимание высокое содержание в препарате и высокий выход при экспрессии белка y-Triticain-a-GM, такой результат также является промышленно применимым и технически значимым.
Преимуществами заявленного технического решения являются, во-первых, получение протеолитически активного препарата тритикаина-альфа, состоящего из пропептидного (продомена) и каталитического доменов полноразмерного тритикаина-альфа пшеницы, который может быть использован для создания новых более эффективных лекарственных энзиматических средств,а также в исследовательстких целях, в частности, для изучения функционирования папаин- подобных цистеиновых протеиназ; во-вторых, возможность получения вариантов протеолитически активного тритикаина-альфа в растворимой форме как в бактериальных, так и в дрожжевых клетках; в-третьих, упрощенная методика выделения вариантов рекомбинантного белка из Е.соИ за счет исключения стадии рефолдинга in vitro, т.е. времязатратной и сложно валидируемой процедуры, что в последствии послужит основой для создания ферментных лекарственных средств в терапии некоторых заболеваний (в частности, целиакии).
Next Patent: ROTOR FLIGHT VEHICLE