技术领域

本发明涉及制药领域， 具体地， 涉及一种抗肿瘤及抗感染的大蒜辣素注射 液的制备方法及其低温连续搅拌超滤装置。 背景技术

大蒜 （Alliium sativun L. )及其制剂已列入美国、 欧盟药典。 确认蒜氨 酸（Alliin)及大蒜辣素（Allicin)为主要功效成分 。 但是目前国内外上市的 大蒜制剂蒜氨酸或大蒜辣素的含量很低。 研发安全、 有效、 质量可控的大蒜高 效新制剂成为各国药学家的研究热点。

1、 蒜氨酸 （Alliin ) 化学名： S-烯丙基 -L-半胱氨酸亚砜 （S- Allyl -L-cysteine)o 熔点： 163- 165°C (分解、 炭化）， [ a ]D = +60o, 白色结粉末， 几乎无臭。

依据发明专利： 从鲜蒜中制备蒜氨酸的方法 （ZL 001012444)及从鲜蒜中 制备蒜氨酸的生产工艺 （ZL 03100420 · 2)： 符合药典规定的大蒜， 经脱皮、 纯 水洗净， 微波照射 5-10分钟或沸水煮沸 5-10分钟使蒜酶灭活。 打浆、 纯水或 5-70%乙醇提取、 浓縮、 精滤、 离子交换柱吸附、 氨水洗脱、 浓缩、 喷雾干燥、 重结晶等步骤， 制备蒜氨酸原料药。 HPLC测定含量 90%。 2、 蒜酶 （Alliinase, EC 4.4.1.4)又名蒜氨酸裂解酶、 烯丙基半胱氨酸 亚砜酶 (Alliin lyase, S-allyl-L- cysteine sulfoxide lyase ) ₀ 属二聚体糖 蛋白， 两个亚基分子量均为 51.5 KDa。 结晶呈黄色， 无臭， 等电点 pH:4.9。 依据发明专利： 从鲜蒜中制备蒜酶的生产工艺 （ZL 03100419 * 9): 在低温 车间 （0-3°C)， 符合药典规定的大蒜， 经脱皮、 纯水洗净、 胶体磨破壁打桨、 缓冲保护液提取蒜酶， 经 (NH4)2S04或 PEG- 4000〜8000沉淀蒜酶， 连续式低温 管式离心机收集沉淀， 缓冲保护液复溶。 两组超滤装置除去大分子和小分子， 冷冻干燥， 得到蒜酶原料药。 以蒜氨酸为底物， 经 HPLC测定， 蒜酶活力 1000 IU/g。

3、 大蒜辣素 （Alliicin)化学名： 二烯丙基硫代亚磺酸酯（2- propene-l- sulfinothioic acid S- 2- propenyl ester)。 常温下为淡黄色易挥发粘稠液体， 有浓烈气味。 密度： 1.112g/cm ³ 。 熔点： 25°C (分解）， 微溶于水。 在空气中数 小时即分解变质。 2 ₊ CH ₃ C(0COOH

丙酮酸盐

2 [C ₆ HnN0 ₃ S] =2 X 177.2二 354.4 [CeH ₁₀ 0S ₂ ] =162.3 两分子蒜氨酸被蒜酶催化裂解生成一分子大蒜 辣素。 即 354.4克蒜氨酸 (2[C6HnN0 ₃ S]=2X 177.2=354)可生成大蒜辣素 162.3克（[(^ ₁₍₎ 05 ₂ ]=162)。 加入蒜 氨酸纯度 "C"及反应系数（0.9)。 得到以下关系式：

162

大蒜辣素产量（克） =蒜氨酸重量（克） XCX ---― X0.9

354 发明内容

本发明的目的在于， 针对上述问题， 提出一种抗肿瘤及抗感染的大蒜辣素 注射液的制备方法， 以实现配方合理、 制备简单、 纯度高、 性能稳定的优点。

为实现上述目的， 本发明采用的技术方案是：

一种抗肿瘤及抗感染的大蒜辣素注射液的制备 方法， 分两步：

第一步， 提取大蒜辣素， 步骤为：

(1)、 在充满氩气或高纯氮的容器中加入脱氧纯水和 蒜酶， 其中脱氧纯水 ： 蒜酶： 1000〜2000 ml : 35. 4g， 此比例可按照产量和浓度的不同要求， 加以扩 大或縮小。 充分搅拌使蒜酶充分溶解， 调节水浴温度至 25- 35°C， 控制 _P H值在 6. 5-8. 5范围内;

(2)、 配制蒜氨酸溶液， 其中蒜氨酸 ： 脱氧纯水 = 35. 4 ： 500〜1000 ml , 将蒜氨酸溶液缓慢滴加入上述容器， 其中蒜氨酸 ： 蒜酶 = 1 mg _: 1〜2 IU, 充分搅拌， 并连续通入氩气或高纯氮使容器内充满高纯氮 或氩气；；

(3)、 滴加完毕后继续搅拌， 反应总时间 20〜40分钟。 得到含大蒜辣素等成 分的酶解反应溶液， 立即用冰水置换水浴中的温水， 水浴温度降至 0°C (有过量 冰块)， 最后利用 1000〜5000D超滤膜除去蒜酶得到大蒜辣素水溶液 。

第二步， 在洁净生物安全柜 （无菌）环境下， 将步骤一中提取的大蒜辣素 用预冷至 0-4°C的溶剂稀释得到大蒜辣素溶液；

将上述大蒜辣素溶液按照需要充氮或充氩气安 瓿灌封成不同规格的大蒜辣 素注射液， 用于静脉滴注， 治疗败血症或肿瘤等疾病。 所述大蒜辣素浓度为： 1. 0 mg/ml、 2. 0 mg/ml、 2. 5 mg/ml、 5. 0 mg/ml ; 规格： lml/Amp、 2ml/Amp 5ml/Amp及 10ml/Amp。 棕色盒装， 0〜- 20°C保存， 保存期 6-12个月。

进一步地， 所述溶剂为脱氧纯水、 含有抗冻剂乙醇的脱氧纯水、 含有丙二 醇的脱氧纯水中的一种。

进一步地， 所述蒜氨酸纯度大于 90%。

进一步地， 所述蒜酶活力大于 1000 IU/g。

进一步地， 所述搅拌速度为 60〜； I20rpm。

进一步地， 所述脱氧纯水是新煮沸放冷的纯水， 底部通入高纯氮或氩气 1 小时 /10L, 脱除水中存在的溶解氧。

本发明的另一目的， 是提供一种抗肿瘤及抗感染的大蒜辣素注射液 的低温 连续搅拌超滤装置， 包括设置有保温罩的广口容器和制冷平台， 所述广口容器 放置在制冷平台上， 所述广口容器的横截面通过超滤膜将容器分为 上下两部分， 所述广口容器上部设置有搅拌装置， 并设置有一进气口， 所述高纯氮或氩气由 此口进入； 所述广口容器下部配套设置有取液装置， 可将除蒜酶后的大蒜辣素 水溶液抽出。 药效学试验数据

将利用本发明方法制备的大蒜辣素注射液应用 在临床上进行药效学试验： 将 5. 0 mg/ml大蒜辣素注射液送上海美迪西生物医药公� ��及南京医科大学第一 临床医学院进行抗肿瘤及抗病原微生物实验， 实验效果明显， 大蒜辣素注射液 对多种致病微生物及肿瘤有效。为新药注册及 临床试验准备了试验样本和条件。 具体实验数据如下：

一、 上海美迪西生物医药公司抗肿瘤实验

表一 IC ₅ 。计算结果

结果显示， Taxol对多种细胞的半数抑制浓度在 ΙΟηΜ左右或 ΙΟηΜ以下，根 据抗肿瘤药效学指导原则的标准（植物提取纯 品的 IC _5Q <10 g/ml或植物粗提 物的 IC ₅ 。<20 U g/ml ), 反映其在体外对这几种细胞有显著的杀伤作用 。 大蒜辣 素对 13株肿瘤细胞的半数抑制浓度基本在 10 p g/ml以下， 说明大蒜辣素在体 外对这 13株肿瘤细胞有杀伤作用。

二、 南京医科大学第一临床医学院抗病原微生物实 验

通过一些列实验， 结果显示： 大蒜辣素对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌 (MRSA)、 不动杆菌、 大肠埃希菌、 幽门螺杆菌和白色假丝酵母菌（白念）等具 有明显的杀菌活性， 其中以 MRSA和幽门螺杆菌最为敏感。 其 MIC值约在 10〜 30mg/L; 其次白念对大蒜辣素的敏感性亦较高。 大蒜辣素有望替代万古霉素成 为治疗 MRSA感染的重要药物； 大蒜辣素或可用于治疗幽门螺杆菌引起的胃炎 和 胃溃疡； 大蒜辣素亦可作为酵母样真菌感染的治疗药物 （内服或外用）。

表一 IC50 计算结果

有益效果

本发明通过使用在国内外未见报道的惰性气体 保护及封闭式隔绝空气条件 下发生蒜酶催化裂解蒜氨酸产生大蒜辣素的反 应； 首创冰水浴超滤除蒜酶技术。 该技术和方法减少了大蒜辣素的分解， 产率 90%。 仪器和设备设置在生物无菌 柜中无菌操作 （洁净度： 100级）。

HPLC测定大蒜辣素含量后配制成大蒜辣素注射� �。 采用安瓿充氩气或高纯 氮灌封。 规格： 1. 0〜10. 0mg/ml X 1. 0 ml ; 1. 0〜10. Omg/ml X 2. 0 ml ; 1. 0— 10. 0mg/ml X 5. 0 ml; 1. 0〜 10. Omg/ml X 10. 0 ml。 0〜4°C避光处保存 6个月， 含量无明显改变。加入 20%乙醇及 /或丙二醇抗冻剂， -10°C避光处保存 24个月， 含量无明显改变。

本发明涉及酶催化动力学、 超滤等新技术研发新药。 以鲜蒜中提取的蒜氨 酸及蒜酶为原料， 在生物安全柜中的特殊装置中， 以氩气 （惰性气体）保护， 蒜酶催化裂解蒜氨酸， 生成大蒜辣素。 反应液经低温搅拌， 超滤膜除去蒜酶。 HPLC测定大蒜辣素含量，用脱氧注射用水或乙� �、丙二醇等特殊溶媒定量稀释。 安瓿充氮灌封制成注射液。 大蒜辣素注射液经药效学试验， 证明对多种致病性 微生物及肿瘤有效。 为新药注册及临床试验准备了试验样本和条件 。 附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解， 并且构成说明书的一部分， 与本发 明的实施例一起用于解释本发明， 并不构成对本发明的限制。 在附图中：

图 1为本发明的蒜酶催化裂解蒜氨酸产生大蒜辣� �装置示意图；

图 2为本发明的低温连续搅拌超滤装置示意图；

图 3为本发明 5. 0 mg/ml大蒜辣素注射液 HPLC色谱图。

结合附图， 本发明实施例中附图标记如下：

A-三口瓶； P-取液泵； M-封闭式搅拌器； I-水浴； G-进气口； R-生物安全 柜（100级洁净、 无菌）； C-保温罩； H-超滤膜； S-搅拌器； T-制冷平台。 具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明 ， 应当理解， 此处所描述的 优选实施例仅用于说明和解释本发明， 并不用于限定本发明。

实施例一

图 1 - 3为本发明的实施例示意图， 大蒜辣素注射液的制备方法如下：

(1)、 5000 ml硬质三口瓶 A中， 加脱氧纯水约 1000〜2000ml， 投入蒜酶 35. 4g， 搅拌 (M， 60rpm)使溶解。 调节水浴 I温度至 25-35°C， 检査确认 pH值为 6. 5-8. 5。

(2)、 在封闭式刻度分液漏斗中置脱氧纯水约 500〜： 1000ml ml, 加入规定量 蒜氨酸 35. 4g， 轻摇溶解。 高纯氮或氩气充满三口瓶 G空间。

(3)、 不断搅拌 （M，60rpm) 下， 蒜氨酸溶液由封闭式刻度分液漏斗经 B口进 入三口瓶 A， 速度约 50 ml/min。 滴加完毕后继续搅拌 10min， 反应总时间约 30分 钟。 得到含大蒜辣素等成分的酶解反应溶液。 立即用冰水置换水浴 I中的温水， 水浴温度降至 0°C。 装置见图 1。

酶解反应的条件为： 反应器温度 25- 35°C， 水相 pH=6. 5-8. 5。 反应时间约 30分钟。 保持大蒜辣素的化学形治稳定， 是成功的关键。 本专利采用惰性气体 保护， 隔绝空气的方法、 反应结束（从滴加蒜氨酸开始 30分钟）立即降至低温 (0°C )。

低温搅拌超滤装置（图 2) 安装在生物安全柜中。 取液泵 P吸出反应溶液 W， 转移至超滤装置。 的耐压瓶中。 调节制冷机平台 T温度至 - 2°C。 套上保温罩 C。 启动搅拌器 S,高纯高压氮气钢瓶与进气口 G连接。 在规定压力下， 溶液通过分子 量为 5000的超滤膜 H除去蒜酶等大分子， 得到除酶大蒜辣素溶液 A约 1500〜 3000ml。

在洁净生物安全柜中， 吸取除蒜酶后的大蒜辣素水溶液 A适量， HPLC测定大 蒜辣素含量。 加预冷 (0°C)的脱氧纯水 (或加适量抗冻剂乙醇或丙二醇的脱氧纯 水)稀释并得到 10. Omg/ml大蒜辣素溶液约 1500ml。 或得到 5. Omg/ml大蒜辣素溶 液约 3000mg。 HPLC再次测定含量， 应为表示量的 98%- 102%。 实施例二

大蒜辣素注射液的制备方法如下：

(1)、 在容器中加入脱氧纯水和蒜酶， 其中脱氧纯水 ： 蒜酶 = 1000 ml : 35. 4g, 充分搅拌使蒜酶充分溶解， 所述搅拌速度为 60rpm， 调节水浴温度至 25 V， 控制 pH值在 6. 5范围内， 蒜酶活力大于 1000 IU/g; 所述脱氧纯水是新煮 沸放冷的纯水， 底部通入高纯氮或氩气 1小时 /10L, 脱除水中存在的溶解氧。

(2)、 配制蒜氨酸溶液， 其中蒜氨酸 ： 脱氧纯水 = 35. 4 ： 500 ml的， 将蒜 氨酸溶液缓慢滴加入上述容器， 其中蒜氨酸 ： 蒜酶 = 1 mg _: 1 IU， 充分搅拌， 所述搅拌速度为 60rpm， 并连续通入氩气或高纯氮使容器内充满高纯氮 或氩气；， 述蒜氨酸纯度大于 90%;

(3)、 滴加完毕后继续搅拌， 反应总时间 20分钟。 得到含大蒜辣素等成分的 酶解反应溶液， 立即用冰水置换水浴中的温水， 水浴温度降至 0°C， 最后利用 1000D超滤膜除去蒜酶得到大蒜辣素水溶液。

第二步，在洁净环境下，将步骤一中提取的大 蒜辣素用预冷至 0Ό的溶剂稀 释得到大蒜辣素溶液； 溶剂为脱氧纯水、 含有抗冻剂乙醇的脱氧纯水和含有丙 二醇的脱氧纯水中的一种。

将上述大蒜辣素溶液按照需要充氮或充氩气安 瓿灌封成不同规格的大蒜辣 素注射液， 用于静脉滴注， 治疗败血症或肿瘤等疾病。

所述大蒜辣素浓度为： 1. 0 mg/ml; 规格： lml/Amp。 棕色盒装， 0〜- 20°C 保存， 保存期 6-12个月。

大蒜辣素注射液的低温连续搅拌超滤装置， 包括设置有保温罩的广口容器 和制冷平台， 广口容器放置在制冷平台上， 广口容器的横截面通过超滤膜将容 器分为上下两部分， 广口容器上部设置有搅拌装置， 并设置有一进气口， 所述 高纯氮或氩气由此口进入； 广口容器下部配套设置有取液装置， 可将除蒜酶后 的大蒜辣素水溶液抽出。 实施例三

(1)、 在容器中加入脱氧纯水和蒜酶， 其中脱氧纯水 ： 蒜酶 = 2000 ml : 35. 4g, 充分搅拌使蒜酶充分溶解， 所述搅拌速度为 120rpm， 调节水浴温度至 35°C , 控制 _P H值在 8. 5范围内， 蒜酶活力大于 1000 IU/g; 所述脱氧纯水是新 煮沸放冷的纯水， 底部通入高纯氮或氩气 1小时 /10L, 脱除水中存在的溶解氧。

(2)、 配制蒜氨酸溶液， 其中蒜氨酸 ： 脱氧纯水 = 35. 4 ： 1000 ml的， 将 蒜氨酸溶液缓慢滴加入上述容器， 其中蒜氨酸 ： 蒜酶 = 1 mg _: 2 IU， 充分搅 拌， 所述搅拌速度为 60rpm， 并连续通入氩气或高纯氮使容器内充满高纯氮 或氩 气；， 述蒜氨酸纯度大于 90%;

(3)、 滴加完毕后继续搅拌， 反应总时间 40分钟。 得到含大蒜辣素等成分的 酶解反应溶液， 立即用冰水置换水浴中的温水， 水浴温度降至 4°C， 最后利用 5000D超滤膜除去蒜酶得到大蒜辣素水溶液。

第二步，在洁净环境下，将步骤一中提取的大 蒜辣素用预冷至 4°C的溶剂稀 释得到大蒜辣素溶液； 溶剂为脱氧纯水、 含有抗冻剂乙醇的脱氧纯水和含有丙 二醇的脱氧纯水中的一种。

将上述大蒜辣素溶液按照需要充氮或充氩气安 瓿灌封成不同规格的大蒜辣 素注射液， 用于静脉滴注， 治疗败血症或肿瘤等疾病。

所述大蒜辣素浓度为： 2. 0 mg/ml ; 规格： 2ml/Amp。 棕色盒装， 0〜- 20°C 保存， 保存期 6-12个月。

大蒜辣素注射液的低温连续搅拌超滤装置， 包括设置有保温罩的广口容器 和制冷平台， 广口容器放置在制冷平台上， 广口容器的横截面通过超滤膜将容 器分为上下两部分， 广口容器上部设置有搅拌装置， 并设置有一进气口， 所述 高纯氮或氩气由此口进入； 广口容器下部配套设置有取液装置， 可将除蒜酶后 的大蒜辣素水溶液抽出。 实施例四

(1)、 在容器中加入脱氧纯水和蒜酶， 其中脱氧纯水 ： 蒜酶 = 1500 ml : 35. 4g， 充分搅拌使蒜酶充分溶解， 所述搅拌速度为 60rpm， 调节水浴温度至 35 "C 控制 pH值在 8. 5范围内， 蒜酶活力大于 1000 IU/g; 所述脱氧纯水是新煮 沸放冷的纯水， 底部通入高纯氮或氩气 1小时 /10L, 脱除水中存在的溶解氧。

(2)、 配制蒜氨酸溶液， 其中蒜氨酸 ： 脱氧纯水 = 35. 4 ： 800 ml的， 将蒜 氨酸溶液缓慢滴加入上述容器， 其中蒜氨酸 ： 蒜酶 = 1 mg ： 1. 5 IU, 充分搅 拌， 所述搅拌速度为 60rpm， 并连续通入氩气或高纯氮使容器内充满高纯氮 或氩 气；， 述蒜氨酸纯度大于 90%;

(3)、 滴加完毕后继续搅拌， 反应总时间 30分钟。 獰到含大蒜辣素等成分的 酶解反应溶液， 立即用冰水置换水浴中的温水， 水浴温度降至 2°C， 最后利用 5000D超滤膜除去蒜酶得到大蒜辣素水溶液。

第二步，在洁净环境下，将步骤一中提取的大 蒜辣素用预冷至 2°C的溶剂稀 释得到大蒜辣素溶液； 溶剂为脱氧纯水、 含有抗冻剂乙醇的脱氧纯水和含有丙 二醇的脱氧纯水中的一种。

将上述大蒜辣素溶液按照需要充氮或充氩气安 瓿灌封成不同规格的大蒜辣 素注射液， 用于静脉滴注， 治疗败血症或肿瘤等疾病。

所述大蒜辣素浓度为： 2. 5 mg/ml _; 规格： 5ml/Amp。 棕色盒装， 0〜- 20°C 保存， 保存期 6-12个月。

大蒜辣素注射液的低温连续搅拌超滤装置， 包括设置有保温罩的广口容器 和制冷平台， 广口容器放置在制冷平台上， 广口容器的横截面通过超滤膜将容 器分为上下两部分， 广口容器上部设置有搅拌装置， 并设置有一进气口， 所述 高纯氮或氩气由此口进入； 广口容器下部配套设置有取液装置， 可将除蒜酶后 的大蒜辣素水溶液抽出。

最后应说明的是： 以上所述仅为本发明的优选实施例而已， 并不用于限制 本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说 明， 对于本领域的技术 人员来说， 其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案 进行修改， 或者对其 中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内， 所作的任何修 改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。