INDIVIDUS TRAITES PAR DES IMMUNOSUPPRESSEURS

Domaine de l'invention

L ^' invention concerne des composés pour la prévention ou le traitement des infections non virales chez les individus sous immunosuppresseur.

Arrière-plan technique

Les infections du tractus urinaire, compliquées ou non de pyélonéphrite aiguë, sont provoquées essentiellement par Escherichia coli uropathogène (UPEC). Elles représentent la plus fréquente complication infectieuse des transplantations rénales compromettant ainsi le devenir du greffon à long terme (1-3). Malgré l'amélioration des procédures chirurgicales et l'utilisation d'un traitement antibiotique prophylactique post-opératoire, la fréquence des infections urinaires chez les sujets transplantés reste supérieure à celle de la population normale (4). Ainsi, les données épidémiologiques les plus récentes font état d'une incidence de 60% d'infections urinaires dans la première année qui suit la greffe rénale, dont le tiers sont sévères, c'est-à-dire affectent le parenchyme rénal (pyélonéphrite du greffon). Ces infections surviennent préférentiellement chez des sujets porteurs d'une bactériurie d ^* abord asymptomatique. Pour autant, prescrire dès ce stade asymptomatique une antibiothérapie adaptée est inefficace pour prévenir les pyélonéphrites (9). C'est un problème de santé publique, puisque les pyélonéphrites du greffon sont volontiers diffuses (tandis qu'elles sont très localisées chez la femme immuno-compétente, le terrain de prédilection de la pyélonéphrite) et peuvent compromettre la durée de vie du greffon pour plusieurs raisons : récupération incomplète de la fonction rénale, précipitation d'un rejet aigu cellulaire en induisant une inflammation locale par des cellules présentatrices de Γ antigène, activation de processus de réparation fibrogéniques, etc. On estime que 8% des greffons implantés dans l'ère moderne sont perdus dans les suites d'une ou plusieurs pyélonéphrites ( 10). En dépit de cette situation, il n'y a aujourd'hui aucune stratégie prophylactique ayant démontré son efficacité.

En effet, bien que de multiples facteurs incluant l'âge, le sexe et différentes conditions de co-morbiditc jouent un rôle dans la susceptibilité aux infections (4-6), les agents immunosuppresseurs utilisés au long cours pour prévenir le rejet aigu de greffe, augmentent le risque d'infections bactériennes et fongiques dans le cadre de la transplantation chez les receveurs (5, 6). Les deux inhibiteurs de la calcineurine, la Cyclosporine A et le Taerolimus, constituent de puissantes drogues immunosuppressives très largement utilisées pour prévenir le rejet de greffe. Leur fonction principale est d'inhiber l'activité phosphatase de la calcineurine, qui régule la translocation nucléaire du facteur de transcription "Nuclear factor of activated T-cells" (NFATs) (7). Cette activation altérée de NFAT prévient la transcription de gènes codant pour des cytokines essentielles à l'allo-réponse (notamment l'IL-2), dans les cellules T activées (8).

Les Immunoglobulines intraveineuses (IglV) sont des préparations thérapeutiques dïmmunoglobulines polyspécifiques purifiées à partir de pools plasmatiques de plusieurs milliers de donneurs sains (16). Utilisées initialement pour le traitement des déficits immunitaires, les IglV ont récemment vu leur utilité démontrée en tant qu'agent immunorégulateur dans le traitement de pathologies auto-immunes et inflammatoires systémiques ( 1 1 - 13).

Description de l ^' invention

La présente invention découle de la mise en évidence inattendue, par les inventeurs, que l'administration d ' Immunoglobulines Intraveineuse (IglV) à des patients transplantés présentant des antécédents de pyclonéphrites aiguës et recevant un traitement immuno suppresseur prévenait les infections bactériennes chez ces individus.

Sans vouloir être liés à une théorie particulière, les inventeurs pensent que Γ activation et la survie prolongée des polynucléaires neutrophiles (PN) induites par de faibles concentrations IglV, observées in vivo dans le cadre d'un déficit fonctionnel des PN, lui- même induit par le traitement immunosuppresseur, permettrait l'augmentation des défenses contre les pathogènes microbiens in vivo, et ce, notamment chez les patients transplantés rénaux traités par immunosuppresseurs au long cours.

Ainsi, la présente invention concerne des Immunoglobulines Intraveineuses (IglV) pour leur utilisation dans la prévention ou le traitement, notamment dans la prévention, d ^' une infection non virale chez un individu traité par au moins un immunosuppresseur.

La présente invention concerne également une méthode de prévention ou de traitement infection non virale chez un individu traité par au moins un immunosuppresseur, dans laquelle on administre à Γ individu une quantité prophy 1 act i q ucm en t ou therapeutiquement efficace d'IgIV. La présente invention concerne également l'utilisation d ^' IglV pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'une infection non virale chez un individu traité par au moins un immunosuppresseur. Description détaillée de l ^' invention

Les immunoglobulines Intraveineuses (IglV) sont bien connues de l'homme du métier. Elles sont notamment décrites dans la revue suivante : Kazatchkine & Kaveri (2001) Immunomodulation of autoimmune and infiammatory diseases with intravenous immune globulin. N. Engl. J. Med. 345:747-755 (12). Elles sont en particulier commercialisées sous le nom CLAIRYG®, GAMMAGARD®, IOVIG®, OCTAGAM®, PRIGIVEN®, SANDOGLOBULINE®, SANDOGLOBULINE 120 MG/ML®, ou TEGELINE®. De préférence, les IglV sont utilisées selon l'invention à une dose inférieure à 0,6 g/kg. Par ailleurs, comme cela apparaîtra de manière claire à l'homme du métier, les IglV sont administrées de préférence par la voie intraveineuse. De préférence, les IglV selon l'invention sont standards, c'est-à-dire (i) qu ^' elles sont issues d'individus qui ne sont pas sélectionnés en fonction de propriétés particulières, notamment en terme de spécificité, de leurs immunoglobulines ; (ii) qu ^' elles ne sont pas issues d ^' individus ayant reçu l'administration d'un ou de plusieurs antigènes destinés à diriger la spécificité de leurs immunoglobulines dans le cadre de la production d'IglV, et (iii) qu'elles ne sont pas sélectionnées pour une spécificité particulière.

Comme on l'entend ici, une infection non virale désigne toute infection qui n ^' est pas uniquement due à un virus ; il peut notamment s'agir d'une infection bactérienne, fongique ou par un protozoaire. De préférence, l ^' infection selon l'invention est une infection bactérienne ou fongique. De manière plus préférée, l'infection selon l'invention est une infection bactérienne, qui n ^' est notamment pas due à une bactérie du genre Staphylococcus. De manière particulièrement préférée, l ^' infection selon l'invention est une infection à Escherichia coli.

L'individu selon l'invention est traité par un immunosuppresseur. De préférence, P immunosuppresseur selon l ^' invention est choisi dans le groupe constitué de la ciclosporinc, la prednisolone, la prédnisone, le tacrolimus, l'azathioprine, le daclizumab, et le mycophénolate mofétil. De manière particulièrement préférée, Γ immunosuppresseur selon l'invention est la ciclosporinc.

De préférence, l'individu selon l'invention présente un taux d'immunoglobuline de type G (IgG) sérique supérieur ou égale à 7 g/L. De préférence, l'individu selon invention présente un déficit fonctionnel partiel ou total des polynucléaires neutrophiles (PN), à savoir notamment le déficit partiel ou total de l ^' une au moins des fonctions suivantes : l'expression de la L-sélectine et/ou du CDl lb à la surface des PN, la capacité de phagocytose des PN, la production de formes réactives de l'oxygène par les PN, la durée de vie des PN. Ainsi, de préférence, les PN de l 'individu selon l'invention présente une expression inférieure de la L-sélcction et/ou du CDl lb, et/ou une capacité de phagocytose inférieure, et/ou une production de formes réactives de l'oxygènes inférieure, et/ou une durée de vie inférieure, par rapport aux PN d'un individu sain, les PN étant prélevés de manière similaire chez l'individu selon l'invention et l ^' individu sain et les fonctions étant mesurées de la même manière, notamment comme cela est illustré dans les Exemples et: les Figures, non limitatifs, qui suivent. Par ailleurs, de préférence, l'utilisation des IglV est associée à une correction du déficit fonctionnel des PN ou à la correction du déficit de l'une au moins des fonctions suivantes : l'expression de la L-sélectine et/ou du CDl lb à la surface des PN, la capacité de phagocytose des PN, la production de formes réactives de l'oxygène par les PN, la durée de vie des PN. La détermination du déficit fonctionnel des PN et de sa correction sont explicitées dans les Exemples.

De préférence, notamment dans le cadre de la prévention d'une infection, l'individu selon l'invention ne présente pas de symptômes d'une infection non virale. De préférence également, l ^' individu selon l'invention a préalablement été atteint au moins une fois de l'infection non virale.

De préférence, l ^' individu selon l ^' invention a subi une transplantation d ^' organe. A ce titre, de préférence, les IglV selon l'invention sont utiles pour prévenir ou traiter l'infection non virale de l'organe transplanté. De manière particulièrement préférée, l'individu a subi une transplantation rénale et l'infection non virale est une infection urinai re bactérienne, notamment une pyélonéphrite aiguë, en particulier à E. coli.

Habituellement, lorsqu'un individu traité par un immunosuppresseur présente une infection, on réduit la quantité d' immunosuppresseur afin que les défenses immunitaires de l'individu puissent lutter contre l'infection. Avantageusement, l ^' administration des IglV selon l ^' invention permet d'éviter de réduire la quantité d ^' immunosuppresseur. Aussi, dans un mode de réalisation préféré de l ^' invention, l'utilisation des IglV n'est pas associée à une réduction de 1 ' immunosuppression. Description des figures

Figure 1

Expression de la L-sclcctine et du CDl lb à la surface des PN à l'état basai (non stimules) chez les témoins (n=3) et les patients transplantés (n=3) avant (jO) et à différents temps (en jours) suivant Γ administration des IgIV. Les échantillons de sang total sont conservés à 4°C et incubés en présence des anticorps monoclonaux anti-CDl lb et anti-CD62L. Les résultats sont exprimés en Moyenne d'Intensité de Fluorescence et les valeurs sont représentées en moyenne +/-SEM. Le symbole * indique une différence significative par rapport aux témoins (p<0.05).

Figure 2

Expression du CD1 l b à la surface des PN stimulés chez les témoins (n=3) et les patients transplantés (n=3) avant (jO) et à différents temps suivant l'administration des IgIV. Les échantillons de sang total ont été incubés en présence de PBS (témoin négatif), de LPS (10 ng/ml) ou de TNF (10 ng/ml) pendant 45 minutes, ou en présence de fMLP (10 ^"6 M) pendant 5 minutes, puis incubés en présence de l'anticorps monoclonal anti-CDl lb. Les résultats sont exprimés en Moyenne d'Intensité de Fluorescence (MIF). Les valeurs sont représentées en moyenne +/-SEM. Le symbole * indique une différence significative par rapport aux témoins (p<0.05).

Figure 3

Capacité de phagocytose des PN des témoins (n=3) et des patients transplantés (n=3) avant (jO) et à différents temps suivant l'administration des IgIV. Les résultats sont exprimes en % de PN ayant phagocyté E. Coli (% de PN FITC ¹ ). Les valeurs sont représentées en moyenne +/-SEM. Le symbole * indique une différence significative par rapport aux témoins (p<0.05).

Figure 4

Production de Formes Réactives de l'Oxygène (FRO) par les PN en réponse au fMLP, formyl peptide dérivé bactérien, chez les témoins (n=3) et les patients transplantés (n=3) avant (jO) et à différents temps suivant l ^' administration des IgIV. Les échantillons de sang total ont été préincubés en présence de dihydroéthidine (1000 ng/ml) pendant 15 minutes, traites en présence de LPS (10 ng/ml) ou TNF (10 ng ml) pendant 45 minutes puis stimulés par le fMLP ( 10 ^~h M) pendant 5 minutes. Les résultats sont exprimés en Index de Stimulation (moyenne d'intensité de fluorescence de réthidium dans l'échantillon « primé » (c'est à dire pré-activé) par le LPS ou le TNF puis stimulé par le fMLP / moyenne d'intensité de fluorescence de Féthidium dans l'échantillon non « primé » (c'est-à-dire non pré-activé)). Les valeurs sont représentées en moyenne +/-SEM. Le symbole * indique une différence significative par rapport aux témoins (p<0.05).

Fi ure 5

Survie des PN chez les témoins (n=3) et les patients transplantés (n=3) avant (jO) et à différents temps suivant l'administration des IgIV. Les échantillons de sang total ont été incubés pendant 20 heures à 37°C en présence de C0 ₂ , en présence de PBS, de GM-CSF (1 ng/ml ), LPS ( 10 ng/ml) ou MDP ( 10 μ&ιηΐ). L ^' apoptose a été quantifiée par marquage avec l'annexine V et la 7-AAD. Les résultats sont exprimés en % d'inhibition de l'apoptose [l-(% de PN annexine V+ dans l'échantillon stimulé)/% de PN annexine V+ dans l'échantillon contrôle incubé en présence de PBS)]. Le symbole * indique une différence significative par rapport aux témoins (p<0.05).

EXEMPLE

MATERIEL ET METHODES Patients :

3 patients transplantés rénaux présentant des antécédents de pyélonephrites aiguës et traités par ciclosporine ont été inclus dans l'étude. Ces patients ont reçu une perfusion de 0,4 gr/kg d'IgIV. Le prélèvement d'un tube additionnel de 10 ml de sang veineux sur héparinate de lithium a été réalisé lors du bilan sanguin réalisé avant (jO) et après (j2, j 14-, j30 et j60) l'administration d'iglV, dans le cadre de la surveillance de la fonction rénale chez ces sujets recevant un traitement parfois néphrotoxique. Aucune élévation notable de la créatinine sérique n'a été notée chez ces patients après l'administration d'IgIV.

En parallèle, des échantillons de sang total ont été obtenus à partir de donneurs sains. Méthodes :

L'étude a été réalisée, par cytométrie en flux, dans des conditions de sang total afin d'éviter tout artéfact de stimulation lié aux procédures d'isolement des polynucléaires neutrophiles (PN) (15, 16) et ce en accord avec des travaux antérieurs ( 14, 17. 18). Incubation des échantillons de sang total en présence de stimulants des PN. Les échantillons de sang total ont été traités à 37°C, pendant des temps variables, en présence de PBS, de Tumor Necrosis Factor (TNF) (R&D System), de Granidocyte Macrophage Colony- Stimulating Factor (GM-CSF) (R&D System), de peptide formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) (Sigma Chemical CO., St Louis, MO) ou de différents agonistes des récepteurs de type Toll (TLR) (Invivogen, San Diego, CA), tel que le lipopolysaccharide (LPS), ou des protéines Nod, tel que le muramyl dipeptide (MDP) (Invivogen, San Diego. CA).

Expression des molécules d'adhérence à la surface des PN. L'expression à la surface des PN de la L-sélectine (CD62L) et de la 2-intégrine CD1 lb/CD18, est évaluée à l'aide d'anticorps monoclonaux dirigés spécifiquement contre ces molécules. Certains échantillons de sang total sont conservés à 4°C afin d'évaluer l'état basai des PN, d'autres ont été incubés en présence des différents stimuli, comme indiqué ci-dessus, afin d'évaluer la capacité de réponse des PN. Capacité de phagocytose des PN. Elle est évaluée en présence d' 'Escherichia Coli directement conjugué à un fluorochrome.

Production de Formes Réactives de l 'Oxygène. Elle est évaluée par la technique d'oxydation de l'hydroéthidine (HE) ( 19), produit non fluorescent, qui diffuse rapidement à l'intérieur des cellules. En présence d'anion superoxyde (0 ₂ ^" ), métabolite primaire produit par le complexe NADPH oxydase actif lorsque le PN est stimulé, ΗΕ est oxydé en éthidium (E* ), hautement fluorescent. La fluorescence résultante de FE ⁺ est reliée linéairement à l 'intensité de l'explosion oxydative (19, 20).

Survie des PN. Le pourcentage de cellules en apoptose est évalué par un double marquage à l'annexine V (externalisation de la phosphatidylscrine) et un colorant vital, la 7-Amino Actinomycine D (7-AAD) ( 19). RESULTATS ET DISCUSSION

1. Expression des molécules d'adhérence à la surface des PN

L'expression à la surface des PN à l'état basai de la L-sélectine et du CDl l b (molécules impliquées respectivement dans le « rolling » et l ^' adhérence ferme des PN à la barrière endothéliale) a été étudiée.

A la surface des PN à l'état basai (non stimulés), la L-sélectine, est exprimée de façon constitutive à la membrane cellulaire alors que seulement 10% du stock de CDl lb est exprimé à la surface (90% des molécules de CD 1 1 b étant en effet stockées dans les granules spécifiques intra-cytoplasmiques). Après stimulation du PN, la L-sélectine subit un clivage protéolytique et est relarguée dans le milieu extra-cellulaire ; ceci conduit à une diminution d'expression de la L-sélectine à la surface cellulaire. A l'opposé, le CDl lb est transloqué à partir des granules intra-cytoplasmiques vers la membrane cellulaire, ce qui conduit à une augmentation de son expression.

On observe, chez les patients transplantés rénaux, une diminution de l ^' expression à la surface cellulaire de la L-sclectine ; celle-ci ne peut-être rapportée à une activation des PN in vivo chez les patients dans la mesure où elle ne s'associe pas à une augmentation du CD l l b (Figure 1). Elle témoigne donc d'une diminution du stock de L-sélectine présente à la surface des PN à l'état basai. Un tel déficit est susceptible de diminuer les interactions entre la L-sélectine et les E- et P-sélectines présentes à la surface de l'endothélium et de ce fait inhiber le phénomène de « rolling ».

De façon intéressante, la diminution de l'expression de la L-sélectine observée chez les patients est normalisée dès le 2 ^eme jour suivant l'administration des IglV.

Comme indiqué ci-dessus, l'expression du CD1 1b à la surface des PN, minoritaire en cas de PN à l'état basai, est fortement augmentée après stimulation. Les inventeurs ont donc évalué la capacité des PN à transloquer d'éventuels stocks intra-granul aires vers la membrane après activation. On observe, chez les patients, une très forte diminution de l'expression maximale du CDl lb après stimulation par le LPS. le fMLP ou le TNF (Figure 2). Cette anomalie pourrait perturber l'adhérence ferme du PN à l'endothélium ainsi que sa migration à travers la matrice extra-cellulaire.

De façon intéressante, cette diminution d'expression du CDl lb à la surface des PN stimulés observée chez les patients est normalisée dès le 2 ^eme jour suivant l'administration des IglV.

2. Capacité de phagocytose des PN

Arrivés au niveau du site infectieux, les PN englobent l'agent pathogène dans une vacuole de phagocytose au sein de laquelle les différents mécanismes effecteurs mis en jeu par le PN permettront de tuer les microorganismes. Les inventeurs ont donc évalué la capacité de phagocytose en présence d'E. coli opsonisés conjugués à la tluorescéine (FITC).

On observe chez les patients une diminution du pourcentage de PN ayant phagocyté les bactéries (Figure 3). L ^' utilisation d ^' E. coli opsonisés permet de s'affranchir de l'éventuelle implication d ^' un déficit en Immunoglobulines dans l'anomalie observée, les Immunoglobulines intervenant en effet comme des opsonines facilitant la reconnaissance et la phagocytose des bactéries par les PN. Le résultat observé témoigne donc d'un déficit intrinsèque de la capacité des PN des patients à phagocyter les agents pathogènes.

De façon intéressante, cette diminution de la capacité des PN à phagocyter des bactéries est normalisée au 2 ^aTie jour suivant l'administration d'IgIV.

3. Production de Formes Réactives de l'Oxygène par les PN

La production de Formes Réactives de l'Oxygène par les PN est sous la dépendance d ^' un complexe enzymatique, la NADPI I oxydase, formé de différents composants dispersés au sein du PN au repos entre le cytoplasme et la membrane basale. La stimulation des PN conduit à la phosphorylation de certains composants cytosoliques permettant ainsi leur translocation à la membrane plasmique et de ce fait le regroupement des différentes sous- unités du complexe. La NADPH oxydase est alors active et permet le transfert d'un électron à partir du NADPH sur 1 ^" oxygène moléculaire conduisant à la formation d'anion superoxyde, précurseur des autres Formes Réactives de l'Oxygène. Ces différents médiateurs induisent des altérations des protéines, des lipides et des acides nucléiques et jouent donc un rôle majeur dans la destruction des agents pathogènes.

Il a été précédemment montré que dans des conditions de sang total, il est nécessaire de pré-activer les PN par un 1 ^er agoni ste afin de déclencher une réponse oxydative ultérieure à un second agoniste. Les échantillons de sang total ont donc été prétraités par un agoniste des TLR (LPS) ou une cytokine (TNF) puis stimulés par un formyl peptide bactérien (fMLP).

Nous observons, chez les patients, une diminution de la production de formes réactives de l'oxygène en réponse au fMLP, dérivé bactérien, après « priming » par le LPS ou le TNF. Une telle anomalie pourrait conduire à une insuffisance de destruction des agents pathogènes.

De façon intéressante, cette diminution de la production de Formes Réactives de l ^' Oxygène est corrigée au 15ème jour suivant l'administration d'IglV (Figure 4).

4. Survie des PN

Les PN sont les cellules immunitaires ayant la plus courte durée de vie. Au niveau du foyer infectieux, les médiateurs inflammatoires prolongent leur survie, en retardant leur entrée en apoptose, afin de permettre une activité bactéricide efficace. Les inventeurs ont donc testé la capacité de différents médiateurs inflammatoires à retarder Γ apoptose des PN.

On observe chez les patients une diminution de la capacité à retarder l'apoptose des PN exercée par le GM-CSF (puissant facteur anti-apoptotique du PN), de l'agoniste de Nod2 (MDP) et du LPS (Figure 5).

De façon intéressante, cette diminution de la survie des PN induite par les médiateurs inflammatoires est corrigée dès le 2 ^ème jour suivant l'administration d'IglV. CONCLUSIONS

Les données montrent, chez les patients transplantés sous immunosuppresseurs au long cours, un déficit fonctionnel majeur des Polynucléaires Neutrophiles (PN), cellules qui constituent une des premières barrières de défense de l'organisme contre l'introduction d'un agent pathogène. En effet, on observe une diminution de l'expression des molécules d'adhérence L-sélectine et CDl lb, une diminution de la phagocytose, une diminution de l'explosion oxydative en réponse au formyl peptide bactérien après pré-activation par différents médiateurs inflammatoires, et une diminution de la survie induite par différents médiateurs inflammatoires. De ce fait, le déficit fonctionnel de ces cellules interviendrait dans la survenue des infections urinaires à répétition chez ces patients.

Parallèlement, les inventeurs montrent que l'administration d'Immunoglobulines Intraveineuses (IglV) à faibles doses stimule fortement les fonctions et la survie des PN. Par ailleurs, il est rapporté que l'administration d'IglV à une concentration aussi faible ne comporte aucun effet secondaire notable.

Ceci conduit donc à proposer une nouvelle indication thérapeutique de l'utilisation des Immunoglobulines Intraveineuses (IglV) dans la prévention de la survenue d'infections non virales, telles que les pyélonéphrites, chez les patients, notamment transplantés rénaux, traités par immunosuppresseurs, en particulier au long cours.

Ainsi, en particulier, compte-tenu du risque majeur de rejet de greffe rénale induit lors de la survenue de pyélonéphrite, et de l'absence d ^' effets secondaires notables d'IglV à faibles doses, l'administration préventive d'IglV chez les patients transplantés rénaux permettrait, en renforçant les fonctions des PN, de diminuer la morbidité et la mortalité liées à la transplantation rénale.

De fait, les 3 patients traités par IglV à faibles doses n'ont pas présenté de pyélonéphrite aiguë au cours de la période de suivi, la fréquence habituelle de survenue de pyélonéphrite aiguë dans une cohorte de patients transplantés et traités par immunosuppresseurs étant de 20% (3).

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