本发明涉及用于检测和定型感染食管细胞（例 如食管粘膜细胞） 的人 乳头瘤病毒的引物和方法。 背景技术

人乳头瘤病毒（human papi l loma virus , 简称 HPV)是一种小型、 无包 膜的 DNA病毒， 其具有双链闭环的 DNA基因组， 大小约为 7. 2-8kb， 相对 分子量约为 5 x l 0 ⁶ 。 HPV基因组可分为 3个区域：非编码的上游调节区； 早 期开放读码区， 包括 E6、 E7、 El、 E2、 E4、 E5; 晚期开放读码区， 编码主 要衣壳蛋白 L1和小衣壳蛋白 L2。根据编码主要衣壳蛋白 L1的开放读码框 (0RF)基因序列的不同， 可以对 HPV进行分型： 将 L1区 0RF的相似性小于 60%的 HPV分为不同的属， 相似性在 60-70%之间的 HPV分为不同的种， 相 似性在 71- 89%之间的 HPV则分为不同的型别。 目前已鉴定的 HPV约有 130 多型，根据其病毒致病力大小，可分为高危型 HPV，如 HPV16、 HPV18、 HPV31、 HPV33、 HPV35、 HPV39、 HPV45、 HPV51、 HPV52、 HPV56、 HPV58、 HPV59、 HPV66、 HPV68、 HPV73等，以及低危型 HPV，如 HPV6、 HPV11、 HPV42、 HPV43、 HPV44等。

HPV病毒是与多种肿瘤发生相关的感染因素。据 报道，全世界约有 15% 的人类肿瘤与 HPV病毒相关。 1982年， Syrjanen等首先发现高危型 HPV 感染可能和食管癌有关。

目前 HPV检测技术主要包括第二代杂交捕获技术（HC2 ) ， 荧光定量 PCR、 采用基质辅助激光解吸附 /电离飞行时间盾谱系统 （MALDI-T0F- MS ) 的质讲检测。 其中 HC2已成为临床 HPV检测领域的金标准。

第二代杂交捕获技术（HC2 )是美国 Digene公司发展的、唯一获得 FDA 批准的可在临床使用的一种检测 HPV DNA的技术。 该技术的原理是对抗体 捕获信号进行放大和对化学发光信号进行检测 。 该方法使用高危型和低危 型核糖核酸探针， 能检测 13种高危型 HPV ( HPV 16 , 18， 31 , 33 , 35 , 39 , 45 , 51， 52 , 56 , 58 , 59和 68 ) ， 是一种易于操作的液基杂交检测方法。 然而， 该方法并不能对 HPV进行精确分型， 也不能检测多重感染， 并且当 任何一种型别的 HPV DNA超过阔值时， 其检测结果均为阳性。 此外， 高危 型探针还可与其他型别的 HPV (例如 HPV 53、 66、 67和 73 )发生交叉反 应， 产生假阳性结果， 降低实验特异性。

荧光定量 PCR ( FQ-PCR )在常规 PCR的基础上把基因扩增、 分子杂交 和光化学融为一体， 使 PCR扩增和产物分析的全过程在单管封闭条件下 进 行， 实现了实时动态检测和结果自动化分析， 从根本上解决了扩增产物污 染和不能定量的问题。 该方法通过探针杂交进一步提高了 HPV DNA检测的 特异性， 具有快速、 简便、 灵敏度高、 特异性强等优点， 适用于临床工作 和大规模筛查。 然而， 目前该方法主要针对 HPV 6、 11、 16和 18感染， 易漏诊其他 HPV亚型。同时，与 HC2—样，荧光定量 PCR也不能实现对 HPV 进行精确分型， 即不能明确 HPV感染型别。

釆用基质辅助激光解吸附 /电离飞行时间质谱系统 （ MALD I - TOF- MS ) 的质谱检测可以同时检测 HPV型别的一种或几种， 具有高灵敏度， 高特异 性和高适量的特点， 且相对于其它的检测方法成本低。 然而， 该方法目前 主要用于检测和定型感染宫颈上皮细胞的 HPV, 应用受到了限制。 发明内容

本发明基于采用基质辅助激光解吸附 /电离飞行时间质谱系统 ( MALDI-T0F-MS ) 的质谱检测技术， 开发了新的用于检测和 /或分型样品 中的 HPV病毒， 特别地感染食管细胞的 HPV病毒的引物和方法。

目前已知的感染食管细胞的 HPV病毒主要有以下 15种型别： HPV3、 HPV6、 HPV11、 HPV16、 HPV18、 HPV26 , HPV3 HPV33. HPV45、 HPV52、 HPV56. HPV57、 HPV58、 HPV59和 HPV94。

因此， 在一个方面， 本发明提供了对样品中的 HPV 病毒进行检测和 / 或分型的方法， 其包括以下步骤：

(1) 根据所选择的待检测的 HPV型别 （即， 上述 15种 HPV型别） 的 基因序列， 在 GP5+/GP6+通用引物的基础上， 设计出特异于各个型别的扩 增引物，优选所述扩增引物在 5'端具有 10个碱基 acgt tggatg的标签序列； 设计延伸引物， 所述延伸引物的长度为 17-28个碱基， 并且在其 3'端包含 一个型别特异性多态性位点标记， 延伸引物选择的位置是 GP5+/GP6+序列 中相对保守的区域， 并且延伸产物和延伸引物之间分子量差异不小 于 9D， 且各个型别的延伸产物间的分子量差异不小于 30D;

(2) 通过用扩增引物进行 PCR扩增， 获得靶序列扩增产物； (3) 除去所述扩增产物中的 dNTP，优选通过使用 SAP酶处理所述扩增 产物来除去 dNTP;

(4) 使用延伸引物进行单碱基延伸反应， 以获得延伸产物；

(5) 纯化延伸产物， 优选通过树脂来进行纯化；

(6) 采用基质辅助激光解吸附 /电离飞行时间质谱系统对纯化后的产 物进行质谱检测， 从而检测和 /或分型 HPV型别。

在一个优选实施方案中， 本发明的方法所使用的扩增引物包含 23 种 引物，各引物的核苷酸序列分别如缺失 5'端前 10个碱基的 SEQ ID NO: 1-23 所示， 优选所述引物在 5'端还包含标签序列， 更优选各引物的核苷酸序列 分別如 SEQ ID NO: 1-23所示。 在一个优选实施方案中， 本发明的方法所 使用的延伸引物包含 15种引物， 各引物的核苷酸序列分别如 SEQ ID NO: 26-40所示。

在一个优选实施方案中， 样品优选是食管细胞， 例如食管粘膜细胞。 在一个优选实施方案中， 待检测和 /或分型的 HPV病毒选自 HPV 3、 6、 11、 16、 18、 26、 31、 33、 45、 52、 56、 57、 58、 59和 94中的一种或多种。

因此， 在另一个方面， 本发明提供了扩增引物组， 其包含 23种引物， 各引物的核苷酸序列分别如缺失 5'端前 10个碱基的 SEQ ID NO: 1-23所 示， 优选所述引物在 5'端还包含标签序列， 更优选各引物的核苷酸序列分 别如 SEQ ID NO: 1-23所示。 特别地， 本发明的扩增引物组可用于本发明 的方法中和 /或用于扩增感染食管细胞的 HPV病毒，例如 HPV3、HPV6、HPV11、 HPV16、 HPV18、 HPV26、 HPV31、 HPV33、 HPV45、 HPV52、 HPV56、 HPV57、 HPV58、 HPV59和 HPV94.

在另一个方面， 本发明提供了延伸引物组， 其包含 15 种引物， 各引 物的核苷酸序列分别如 SEQ ID NO: 26-40 所示。 特别地， 本发明的延伸 引物组可用于本发明的方法中， 以检测和 /或分型样品中的 HPV 病毒， 例 如感染食管细胞的 HPV病毒， 例如 HPV3、 HPV6、 HPV11、 HPV16、 HPV18、 HPV26、 HPV31、 HPV33, HPV45、 HPV52、 HPV56、 HPV57、 HPV58、 HPV59和 HPV94。

在另一个方面， 本发明提供了一种试剂盒， 其包含本发明的扩增引物 组和延伸引物组。 在一个实施方案中， 本发明的试剂盒还可以包含其他试 剂，例如用于 PCR扩增反应的酶和试剂，用于单碱基延伸反应 的酶和试剂， 用于纯化延伸产物的树脂等。

特别地， 本发明的试剂盒可用于检测和 /或分型样品中的 HPV 病毒， 例如感染食管细胞的 HPV病毒， 例如 HPV3、 HPV6、 HPV11、 HPV16、 HPV18、 HPV26、 HPV31、 HPV33、 HPV45、 HPV52、 HPV56、 HPV57、 HPV58、 HPV59和 HPV94。

在另一个方面， 还提供了本发明的扩增引物组和 /或延伸引物组用于 制备试剂盒的用途， 所述试剂盒用于检测和 /或分型样品中的 HPV 病毒， 例如感染食管细胞的 HPV病毒。

在另一个方面， 还提供了本发明的试剂盒的用途， 其用于对样品中的 HPV病毒进行检测和 /或分型， 其中待检测和 /或分型的 HPV病毒优选选自 HPV 3、 6、 11、 16、 18、 26、 31、 33、 45、 52、 56、 57、 58、 59和 94中 的一种或多种， 所述样品优选是食管细胞， 例如食管粘膜细胞。

在又一个方面， 本发明提供了对样品中的 HPV 病毒进行检测和 /或分 型的方法， 其包括以下步骤：

1 ) 用本发明的扩增引物组或本发明的试剂盒中的 扩增引物组 PCR扩 增样品中的 DNA, 从而获得扩增产物；

2 ) 除去所述扩增产物中的 dNTP, 优选通过使用 SAP酶处理所述扩增 产物来除去 dNTP;

3 ) 以步骤 2 ) 中获得的产物为模板， 使用本发明的延伸引物组或本 发明的试剂盒中的延伸引物组， 通过单碱基延伸反应获得延伸产物；

4 ) 纯化所述延伸产物， 优选通过树脂来进行纯化， 从而获得纯化产 物； 和

5 ) 用基质辅助激光解吸附 /电离飞行时间质谱系统对所述纯化产物 进行质傳检测， 从而对样品中的 HPV病毒进行检测和 /或分型；

在一个优选实施方案中， 待检测和 /或分型的 HPV病毒选自 HPV 3、 6、 11、 16、 18、 26、 31、 33、 45、 52、 56、 57、 58、 59和 94中的一种或多 种。 在一个优选实施方案中， 所述样品是食管细胞， 例如食管粘膜细胞。 发明的有益效果

与现有技术相比， 本发明的技术方案具有以下显著优点：

1 )使用的试剂耗材相对简单且稳定， 不需要荧光染料、 特殊的酶等 价格昂贵的试剂；

2 )反应可以在微量体系中进行， 减少了样品和各种消耗品的使用；

3 ) 由于质谱技术直接检测 DNA 的分子量 （质荷比）且直接确定碱基 的类型 （即， 不需要经过任何形式的信号转换） ， 因此， 理论上只要有一 个拷贝的 SNP片段被扩增即可识别， 从而杜绝了假阳性发生的可能； 4 )质谱技术还有自动化、 高通量检测等特点， 因此， 质谱技术与多 引物延伸技术相结合， 可以在一个反应体系中同时检测多种 HPV型别， 从 而大大减少了工作量， 提高了检测通量。

另外， 质谱分型系统从引物设计的角度而言， 特别适合于进行 HPV检 测。一方面，质谱分型系统要求前 PCR产物在 100-180bp的范围内为最佳， 而 HPV的 L1区通用引物 GP5+/GP6+扩增大约 140bp的片段，且扩增的有效 性已经得到证实。 即， 在本发明的方法中， 修改后的引物 GP5+/GP6+扩增 的产物长度满足质谱分型系统对前 PCR产物片段的长度的要求。另一方面， 质谱分型系统要求延伸产物和延伸引物之间的 分子量差异不小于 9D,且各 个型别的延伸产物间的分子量差异不小于 30D, 而本发明的方法中设计的 特异于上述 15型 HPV的延伸引物在质谱系统中能彼此区分， 满足了质谱 分型系统的要求。 因此， 本发明的引物和方法可以同时检测和分型上述 15 种 HPV型别。

特别地， 本发明的技术方案采用基盾辅助激光解吸附 /电离飞行时间 质谱系统（MALDI-T0F-MS ) , 通过设计一套全新的质谱延伸引物， 实现了 对上述 15种 HPV型别的检测和分型。 其与第二代杂交捕获技术和荧光定 量 PCR方法相比， 能够准确检测出 15种 HPV型别 （HPV3、 HPV6、 HPV11、 HPV16、 HPV18、 HPV26、 HPV31、 HPV33、 HPV45、 HPV52、 HPV56、 HPV57、 HPV58、 HPV59和 HPV94 )并对其进行精确分型， 与现有的飞行时间质谱技 术相比， 能够另外准确检测出 HPV3、 HPV26、 HPV57和 HPV94这四种 HPV 型别， 具有显著的优点。

本发明的引物和方法实现了对感染食管细胞的 15种 HPV型别的检测 和分型， 有利于研究 HPV感染型别与食管癌之间的关系， 对于研究食管癌 的发病机制有重要意义。 下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案 进行详细描述， 但是本 领域技术人员将理解， 下列附图和实施例仅用于说明本发明， 而不是对本 发明的范围的限定。 根据附图和优选实施方案的下列详细描述， 本发明的 各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说 将变得显然。 附图说明

图 1和 2为 HPV3质粒样品的检测结果。 具体而言， 图 1为质谱检测 峰图， 其显示， 在盾量 5407. 58处的峰（对应于产物峰）很高， 而在质量 5120. 39处的峰（对应于引物峰） 不存在。 这表明样品中含有病毒 HPV 3。 图 2显示质谱峰图分析软件的分析结果，其表明� �品中含有 HPV 3型病毒， 而不含其他 14种型别的 HPV病毒。

图 3和 4为 HPV33质粒样品的检测结果。 具体而言， 图 3为质傳检测 峰图， 其显示， 在质量 5446. 6 处的峰（对应于产物峰）很高， 而在质量 5175. 37处的峰（对应于引物峰）不存在。 这表明样品中含有病毒 HPV 33。 图 4显示质潘峰图分析软件的分析结果，其表明� �品中含有 HPV 3型病毒， 而不含其他 14种型别的 HPV病毒。 具体实施方式

本发明的实施例提供了对感染食管细胞的上述 15种 HPV型别进行检 测和分型的方法， 其包括如下的步驟。

(1) 根据所选择的待检测的 HPV型别 （即， 上述 15种 HPV型别） 的 基因序列， 在 GP5+/GP6+通用引物的基础上， 设计出特异于各个型别的扩 增引物，所述扩增引物在 3'端具有与其所针对的型别的基因序列完全匹� �� 的 12个碱基， 在 5'端具有 10个碱基 cgt tggatg )的标签序列； 设计延 伸引物， 所述延伸引物的长度为 17-28个碱基， 并且在其 3'端的包括延伸 碱基在内的 4个碱基中， 包含一个型别特异性多态性位点标记， 延伸引物 选择的位置是 GP5+/GP6+序列中相对保守的区域； 其中， 延伸产物和延伸 引物之间的分子量差异不小于 9D,且各个型别的延伸产物间的分子量差异 不小于 30D; 按照引物间， 引物与扩增产物 /延伸产物间不形成二聚体， 引 物自身不形成发夹结构， 以及引物与模板间不发生错配的原则设计引物 。

特别地， 用于质傳检测的延伸引物按照下列原则设计： 各延伸产物的 分子量相互间的差别不小于 30Da， 各延伸引物与各延伸产物之间的分子量 差异不小于 9Da， 延伸引物与延伸产物的分子量在 4500— 8500Da之间。 本 发明设计的针对所述 15种 HPV型别的扩增引物参见表 1，延伸引物参见表 2.

表 1: 针对所述 15种 HPV型别的 L1区 PCR扩增引物。

SEQ ID NO: 扩增引物名称 引物序列 W HPV型别

1 MSFA acgt tgga t gTTTGTTACTGTGGTGGATACTAC HPV 18正向引物

2 MSFB acgt tgga t gTTTGTTACCGTTGTTG ATACTAC HPV16、 HPV33正向引物

3 MSFC acgt tgga t gTTTGTTACTGTGGTGGATACCAC HPV31、 HPV52 , HPV 3正 向引物

4 MSF1 acgttggatgTTTGTTACTGTTGTGGACACTAC HPV45正向引物

5 MSF4 acgttggat gTTTGTTACTGAGGTAGATACCAC HPV11、 HPV6正向引物

6 MSF6 acgttggat gTTTGTTACCTGTGTTGATACCAC HPV26正向引物

7 MSF9 acgttggatgTTTGTTACTGTTGTAGATACTAC HPV59正向引物

8 MSF12 acgttggat gTTTGTTACCGTGGTTGATACCAC HPV58正向引物

9 MSF14 acgttggatgTTCCTAACAATGGTGGACACCAC HPV57正向引物

10 MSF16 acgttggat gTTTGTTACAATAGTAGATACTAC HPV56正向引物

11 MSF18 acgttggatgTTTGTGACTGTGGTGGACACCAC HPV94正向引物

HPV16, HPV18, HPV45,

12 MS G acgttggat gGAAAAATAAACTGTAAATCATATTCCT

HPV3反向引物

13 MSRH acgtt gga t gGAAAAATAAATTGTAAATCATACTC HPV6反向引物

14 MS I acgttggat gGAAATATAAATTGTAAATCAAATTC HPV52反向引物

15 MS 2 acgttggat gGAAATATAAATTGTAAATCGAATTC HPV31反向引物

16 MS 3 acgttggat gGAAAAATAAACTGTAAATCAAACTC HPV11反向引物

17 MSR4 acgttggat gGACTTATAGATTGTAATTCATATTC HPV26反向引物

18 MSR5 acgttggatgGAAAAACAGACTGTAGATCATATTC HPV33反向引物

19 MSR11 acgttggatgGAAAAATAAACTGCAAGTCATACTC HPV94反向引物

20 MSRI 2 acgt tggatgGAAATATAAACTGCAAATCAAATTC HPV59反向引物

21 MSRI 3 acgt tggatgGAAACACAAACTGTAAGTCATATTC HPV58反向引物

22 MSRI 5 acgttggat gGAACTATAAACTGCAAATCATATTC HPV57反向引物

23 MSRI 6 acgttggat gGAAAAACAAATTGTAATTCATATTC HPV56反向引物

24 PC03 acgt tggatgACACAACTGTGTTCACTAGC 内参

25 PC04 acgt tggatgCAACTTCACCCACGTTCACC 内参

表 2: 针对所述 15种 HPV型别的质讲延伸引物。

SEQ ID NO: 延伸引物名称 HPV型别 延伸 引物序列 W

26 HPV16 TTAAAGTTAGTATTTTTATATGTAGT HPV 16 T

27 HPV18A4 TACACAGTCTCCTGTACCTGGGC HPV 18 A

28 HPV33A2 ATGTACTGTCACTAGTT HPV 33 A

29 HPV45 CTACTATACTGCTTAAACTTAGTAG HPV45 G

30 HPV52 TGTGCTTTCCTTTTTAACCTCAG HPV52 C

31 HPV58 TGTACCTTCCTTAGTTACTTCAG HPV58 T

32 HPV6A TCCACATGACGCATGTACTC HPV6 T

33 HPV11A3 CATCTGTGTCTAAATCTGCT HPV11 A

34 HPV26A CACTCCATTTAAACCATCT HPV26 G

35 HPV31A4 CTGCAATTGCAAACAGTGAT HPV 31 A

36 HPV56A TCGTGCATCATATTTACTTAACTGTTC HPV56 T

37 HPV59A2 CGCAGCACCAATCTTT HPV59 C

38 HPV94A GTGGAGGCATCAGAAGGGACG HPV94 C 39 HPV57A2 GGACACCACGCGCAGCACAAATGTCTC HPV57 T

40 HPV 3 GTTTCTACTGAAACCTC HPV 3 G

41 HBB GGAGAAGTCTGCCGTT 内参 T

(2) 通过 PCR扩增， 获得靶序列扩增产物。 PCR扩增反应体系参见表 3。 其中， 所有试剂购买自 sequenom公司。

表 3

PCR反应条件为 94 'C , 15分钟； 94°C变性 20秒， 56'C退火 30秒， 72 'C延伸 1分钟， 共扩增 45循环； 最终 72 'C延伸 3分钟。 在本实施例中， 使 用的模板 DNA是 HPV 3质粒和 HPV 33质粒。 同时， 将无菌双蒸水作为阴性 对照。 阳性对照为 HPV18重组质粒（250拷贝 /ul)， 其中掺有 10ng/ul的经 检测无 HPV感染的人基因组 DM。 将对照样本与待测样本按照相同的反应过 程进行反应和测试， 以验证检测的有效性。

本实施例中所使用的 HPV质粒如下进行制备：

使用 L1区特异引物扩增 HPV3、 HPV6、 HPV11、 HPV16、 HPV18 , HPV26、 HPV31、 HPV33、 HPV45、 HPV52、 HPV56、 HPV57、 HPV58、 HPV59和 HPV94型 的 LI区基因片段，将扩增产物分别克隆入 PMD-T载体（Takara PMD-T连接试 剂盒）， 然后转化入大肠杆菌 DH5 ct。转化后的大肠杆菌经蓝白斑筛选以及二 次扩大培养后， 用于质粒提取。 使用质粒提取试剂盒 （AXYGEN)提取并纯化 质粒。 通过 DNA测序对质粒进行鉴定。

分别测定制备好的 HPV3、 6、 11、 16、 18、 26、 31、 33、 45、 52、 56、 57、 58、 59、 94型质粒的 0D值。 根据 0D值将各盾粒稀释为 500 pg/μΐ , 5 pg/ l , 0. 5 pg/μΐ三种浓度的存储液。 然后根据摩尔公式： lng质粒的拷贝 数" [ 1 *10—712*330* (栽体分子量 +插入片断分子量）] *6. 02*10"计算出 lng 质粒的拷贝数。根据这个值将各盾粒稀释为 10 ⁵ ， 10 ⁴ , 5000, 10 ³ , 10 ² , 10 ¹ 拷 贝 /ul 6个浓度梯度以进行灵敏度验证。

(3) 通过 SAP酶（虾碱性磷酸酶）处理， 除去步骤（2)获得的扩增产物 中含有的 dNTP。 SAP酶反应体系见表 4。 所有试剂购买自 sequenom公司。

表 4

SAP酶反应条件为 37°C温育 40分钟， 以去除 PCR扩增反应中剩余的 dNTP; 85°C温育 5分钟， 以使 SAP酶失活。

(4) 以（3)中获得的产物为模板， 通过延伸反应， 在延伸引物的 3， 端连 接一个碱基， 从而得到延伸产物。 延伸反应体系见表 5。 所有试剂购买自 sequenom公司。

表 5

*其中延伸引物混合物按照各引物的分子量大� �进行线性关系调整（即， 根据每种延伸引物的分子量计算每种引物的使 用量） 。

延伸反应条件为 941C , 30秒； 94 变性 5秒， 52 Ό退火 5秒， 801C延 伸 5秒， 共扩增 40个循环， 且在每个循环中退火和延伸进行 5个小循环； 最终 72'C延伸 3分钟。

(5) 釆用树脂（购买自 sequenom公司）纯化步骤（4)中获得的延伸产物� � 在延伸产物中加入 6 mg树脂， 18. 00 ul水， 垂直摇匀一小时。 经过本步反 应后， 树脂将与反应体系中的阳离子充分结合， 从而使反应体系脱盐。 反应 完成后的纯化产物可在 4。C保存数天，也可在 - 20'C保存数周。所得的纯化产 物在 4000 rpm离心 5分钟后， 取上清直接用于盾谱检测。

(6) 将纯化后的产物在 Sequenom MALDI- TOF质傳仪上进行盾 检测。 所得到的质谱峰图通过 HPV分析软件（由 sequenom公司提供）进行分析， 得到分型结果。

从图 1可知， 当使用 HPV 3质粒作为模板 DNA时， MALDI- T0F质傳检测 在质量 5407. 58处检测到峰， 所述峰经软件分析后， 被确认为特异于 HPV 3 的延伸产物的峰（如图 2所示） ， 从而确认样品中含有 HPV 3。 类似地， 当 使用 HPV 33盾粒作为模板 DNA时， MALDI- T0F质潘检测在质量 5446. 6处检 测到峰， 所述峰经软件分析后，被确认为特异于 HPV 33的延伸产物的峰 (参 见图 3和 4 ) , 从而确认样品中含有 HPV 33。 这些检测结果与已知的质粒型 别完全一致。

从以上实施例可知，本发明所开发的引物和方 法可以实现对感染食管细 胞的 HPV病毒（例如 HPV 3、 6、 11、 16、 18、 26、 31、 33、 45、 52、 56、 57、 58、 59和 94 ) 的检测和精确分型。