Die Erfindung betrifft probiotisch wirksame Zusammensetzungen.

Der allgemeine Begriff "Milchsäurebakterien" umfaßt eine Katego¬ rie von Mikroorganismen, die in den letzten Jahren, bedingt durch ihre humanspezifischen und lebensmitteltechnologischen Eigenschaften, in den Mittelpunkt des wissenschaftlichen Inter¬ esses gerückt ist. Der Begriff "Probiotika" als Wachstumsförde¬ rer ursprünglich auf den Bereich der Futtermittel beschränkt, bezeichnet lebende Mikroorganismen, die als Nahrungszusatz das Gleichgewicht der Verdauungsorganismen günstig beeinflussen. Heute sind Probiotika jedoch generell für ein weites Feld von vorwiegend milchsäurehältigen Präparaten, Substraten, Lebens¬ und Futtermitteln relevant und werden sowohl im human- als auch veterinärmedizinischen Bereich sowie bei der Tierernährung ein¬ gesetzt. Taxonomisch beinhaltet das Spektrum der Milchsäurebak¬ terien derzeit im wesentlichen die Gattungen Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Enterococcus, Bifido- bacterium, Carnobacterium und Sporolactobacillus (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, IX. Aufl.). Einige dieser Vertreter (Lactobacillus, Bifidobacterium und Enterococcus) gelten als natürliche und nützliche Darmbewohner des Menschen (und auch der Tiere) und treten dort - in Abhängigkeit vom Darm¬ abschnitt, Lebensalter und Ernährungsgewohnheiten - in unter¬ schiedlich hohen Keimzahlen auf. Allgemein wird die Wirkung der Milchsäurebakterien in vier Haupteffekte unterteilt:

1. Biochemische (u.a. Verbesserung der NährstoffVerwertung)

2. Physiologische (v.a. Stimulierung der Darmperistaltik)

3. Antimikrobielle (z.B. Wachstumshemmung pathogener Keime)

4.Kompetitive (z.B. Inaktivierung von Enterotoxinen) .

Die Applikation bestimmter Milchsäurebakterien, entweder über den Nahrungsmittelweg oder über die Einnahme spezieller pharma-

zeutischer Präparate, erscheint daher aus den oben genannten Gründen als zielführend. Im Vordergrund stehen heute diäteti¬ sche, prophylaktische und therapeutische Indikationen, wie u.a. bei Reisediarrhoe, regulierende Funktion bei Stress-Situationen, Krebstherapie, Behandlung von Obstipationen, Zahnfleischentzün¬ dungen, Vaginitis, bei diversen Diätformen, etc..

Für eine effiziente Wirkung milchsäurehältiger Präparate ist es unbedingt notwendig, daß hohe Konzentrationen der Mikroorganis¬ men in den Darm gelangen. Dadurch sind herkömmliche Lebensmittel mit lebenden Mikroorganismen nicht in allen Fällen anwendbar, da sie die Mikroorganismen oft in relativ niedriger Konzentration enthalten und die Gesamtmenge, die dann zugeführt werden müßte, zu groß ist (Laulund, "Commercial Aspects of Formulation, Production and Marketing of Probiotic Products" in "Human Health: The Contribution of Microorganisms", S.A.W. Gibson Ed. (1994), Springer Verlag, Seite 160).

Lebende Mikroorganismen sind schwer stabilisierbar, weswegen sie in Präparationen meist in getrockneter Form vorliegen; die Dar¬ stellung kann durch unterschiedliche Trocknungsprozesse, wie z.B. der Lyophilisation, Sprühtrocknung, etc. erfolgen.

Weiters ist bei der peroralen Verabreichung lebender Mikroorga¬ nismen zu beachten, daß je nach Bakterienart bzw. -stamm ein Teil der Bakterien bereits im Magen, der eine natürliche Barrie¬ re für Mikroorganismen darstellt, zerstört wird und nur eine geringe Anzahl überlebender Keime in den Darm gelangt (Füller, J.Appl.Bact. 66, 1989, 365-378). Die Verarbeitung zu Tabletten mit magensaftresistenten Filmüberzügen ist insofern problema¬ tisch, da die Anzahl der lebensfähigen Mikroorganismen bereits durch den Tablettiervorgang aufgrund der einwirkenden Scher¬ kräfte meist stark reduziert wird. Es ist sogar aus der Litera¬ tur bekannt, daß durch den Tablettiervorgang eine beträchtliche Keimzahlreduktion hervorgerufen wird, wodurch eine gewisse De¬ kontamination erzielt werden kann (Fassihi et al., Zbl. Pharm. 116 (1977), 1267-1271; Plumpton et al. , Int.J.Pharmac. 30 (1986), 237-240; Plumpton et al. , Int.J.Pharmac. 30 (1986), 241-

246). Die Verabreichung in magensaftresistenten Hartgelatine¬ kapseln bleibt aufgrund der speziellen und teuren Technologie auf den pharmazeutischen Bereich beschränkt. Die Verarbeitung von probiotischen Formulierungen mit magensaftresistenten Film¬ überzügen wie in der pharmazeutischen Industrie (z.B. mit Über-

® zugsmaterial wie Eudragit ) ist im übrigen auch darum nicht möglich, da diese Stoffe für Lebensmittelprodukte nicht zuge¬ lassen sind.

Schließlich ist bei vielen auf dem Markt befindlichen Produkten eine erhebliche Qualitätsschwankung festzustellen, was haupt¬ sächlich darin liegt, daß die großtechnische Herstellung und Verarbeitung von probiotisch wirksamen Formulierungen aufgrund ihrer biologischen Natur heikel und nur schwer reproduzierbar sind (Brennan et al., J.Food Prot.46 (1983), 887-892).

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, eine probiotisch wirksame Formulierung zur Verfügung zu stellen, wel¬ che einen hohen Grad an Magensaftresistenz aufweist, einfach als Lebensmittel-Zusatzstoff zu verarbeiten ist und in reproduzier¬ barer Weise auch großtechnisch hergestellt werden kann.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch eine probiotisch wirksame Formulierung umfassend durch Trocknung stabilisierte Mikroorganismen und magensaftresistente Matrixkomponenten, wel¬ che Formulierung in trocken granulierter Form vorliegt.

Die Voraussetzungen für die Wirksamkeit von Bakterien werden er¬ findungsgemäß dadurch geschaffen, daß Formulierungen hergestellt werden, die aus durch Trocknung haltbar gemachten, lebensfähigen Mikroorganismen sowie aus Matrixkomponenten, die sowohl für die Herstellung der Formulierungen unverzichtbar sind, als auch einen hohen Grad an Magensaftresistenz sicherstellen, bestehen. Erst aufgrund der Einbettung von Mikroorganismen in geeignete magensaftresistente Matrixkomponenten ist es möglich, daß eine ausreichend hohe Anzahl von gewünschten, überlebenden Mikroorga¬ nismen in den Darm gelangen können. Der erfindungsgemäße Her¬ stellungsprozeß stellt eine Granulierung von Pulvermassen auf

trockenem Weg dar, wobei der Verarbeitungsvorgang selbst nur eine geringe Verminderung der Überlebenskeimzahl verursacht.

Erst die Einbettung in geeignete magensaftresistente Matrixkom¬ ponenten ermöglicht, daß eine überraschend hohe Anzahl von le¬ benden Zellen in den Darm gelangen können. Dabei ist es wichtig, daß die durch Trocknung stabilisierten Mikroorganismen in trocken-granulierter Form vorliegen. Die Trockengranulierung ist ein ausreichend schonendes Verfahren, bei dem ein hoher Prozent¬ satz der verwendeten Mikroorganismen den Herstellungsprozeß le¬ bensfähig überstehen, und im gegenständlichen Fall überraschen¬ derweise geeignet, auch eine ausreichende Magensaftresistenz zu gewährleisten. Weiters wird durch das Vorliegen der Mikroorga¬ nismen in trocken-granulierter Form eine allenfalls angeschlos¬ sene weitere Verarbeitung erheblich erleichtert bzw. für die Verwendung als Lebensmittel-Zusatzstoff überhaupt erst ermög¬ licht (im Gegensatz zu der aus der Pharmaindustrie bekannten magensaftresistenten Lacken wie Eudragit ) .

Besonders bevorzugte magensaftresistenten Matrixkomponenten sind Alginate (z.B. Natriumalginat), Zellulose bzw. deren Derivate (z.B. Hydroxypropylmethylzellulose (HPMC), HPMC-Acetat-Succinat, HPMC-Phthalat, Methacrylsäurederivate, Schellack, Galactomannane sowie Mischungen dieser Komponenten. Diese Substanzen haben sich in der Pharma- und/oder Lebensmittelindustrie bereits bewährt, gelten als unbedenklich und zeigen auch ausgezeichnete Eigen¬ schaften im Hinblick auf die durch Trocknung stabilisierten Mikroorganismen. Besonders vorteilhafte Beispiele von HPMC bzw. HPMC-Derivaten umfassen HPMC-50SH 4000, HPMCP-HP 55 (gemäß US- Pharmacopeia XXIII, NF18, Nr. 2910 und Nr. 200731), und HPMC- Acetat-Succinat-LF (HPMC-AS-LF) (Firma Shin-Etsu, Japan).

Als Mikroorganismen werden im besonderen Milchsäurebakterien, vorzugsweise aus den Gattungen Streptococcus, Lactobacillus, Enterococcus und Bifidobacterium, aber auch Enterobacteriaceae, vorzugsweise die Gattungen Enterobacter und Escherichia in den erfindungsgemäßen Formulierungen verwendet, wobei die Geni bzw. Species Lactobacillus delbrückii subsp. bulgaricus, Lactobacil-

Ius acidophilus, Lactobacillus casei subsp. casei, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus lactis, Lactobacillus salivarius, Lac¬ tobacillus plantarum, Streptococcus salivarius subsp. thermophi- lus, Enterococcus faecium, Bifidobacterium bifidum, Bifidobakte- rium infantis, Bifidobakterium longum, etc., physiologische Escherichia coli sowie Mischungen dieser Mikroorganismen beson¬ ders bevorzugt sind.

Bei den erwähnten Arten ist ihre probiotische Wirkung schon hin¬ länglich beschrieben worden; ihre lebensmitteltechnisch und pharmazeutisch große Bedeutung macht sie zu bevorzugten Mikro¬ organismen im Rahmen der vorliegenden Erfindung.

Die erfindungsgemäße Formulierung umfaßt günstigerweise tech¬ nisch notwendige Hilfsstoffe, also z.B. pharmazeutische Träger¬ stoffe und/oder Formulierungshilfsstoffe, wie Tablettierungs¬ mittel, konsistenzerhöhende Mittel, Stabilisatoren, lebensmit¬ teltechnische Zusatzstoffe, etc..

Die erfindungsgemäße probiotisch wirksame Formulierung umfaßt in der Regel

- 10 bis 90 Gew.-% durch Trocknung stabilisierte Mikroorga¬ nismen,

- 10 bis 90 Gew.-% magensaftresistente Matrixkomponenten und

0 bis 50 Gew.-% technisch notwendige Hilfsstoffkomponten

Besonders bevorzugt sind Formulierungen welche 30 bis 70, insbe¬ sondere 30 bis 55 Gew.-%, an stabilisierten Mikroorganismen auf¬ weisen.

Formulierungen, welche erfindungsgemäß ganz besonders bevorzugt werden, sind solche, die durch Trocknung stabilisierte Mikroor¬ ganismen der Spezies Enterococcus faecium und/oder Lactobacillus acidophilus, sowie Natriumalginat und/oder Hydroxypropylmethyl- zellulose oder eines ihrer Derivate und Magnesiumstearat umfas¬ sen.

Bei diesen Formulierungen konnte in vitro die höchste Resistenz

gegenüber Magensaft (0,1 N HCI) festgestellt werden.

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen probiotisch wirksamen For¬ mulierungen als Zusatzstoffe für Lebensmittel und zur Herstel¬ lung von Medikamenten, insbesondere zur Herstellung von Präpa¬ rationen zur Behandlung von Störungen der Darmflora.

Noch ein Aspekt der vorliegenden Erfindung liegt in einem Ver¬ fahren zur Herstellung von probiotisch wirksamen Formulierungen, welches die folgenden Schritte umfaßt:

Bereitstellen von durch Trocknen stabilisierten Mikroorga¬ nismen,

Mischen der stabilisierten Mikroorganismen mit magensaft¬ resistenten Matrixkomponenten, Trocken-Granulieren der erhaltenen Mischung, wobei gemäß einer besonderen Ausführungsform mehr als ein Granu- lierungsschritt vorgesehen wird.

Die Erfindung wird anhand der nachfolgende Beispiele, auf die sie jedoch nicht beschränkt sein soll, noch weiter erläutert.

B e i s p i e l e :

Herstellung von Granulaten (Trockengranulierung):

Die Mikroorganismen werden mit den entsprechenden magensaftresi¬ stenten Matrixkomponenten und gegebenenfalls mit weiteren, ins¬ besondere zur Kompaktierung notwendigen Hilfsstoffkomponenten gemischt (Kubusmischer, Firma ERWEKA) und mit einer Exzenter¬ presse (Type EK 0, Firma KORSCH) zu Komprimaten mit einem Durch¬ messer von 10 mm verpreßt. Der dabei aufgewendete Preßdruck be¬ trägt 15 kN. Die erhaltenen Preßlinge werden in weiterer Folge mittels eines Trockengranuliergerätes (Gerätetype TG 2/S, Firma ERWEKA) zum Granulat verarbeitet und dieses wird anschließend unter Verwendung eines Siebturms (Firma RETSCH) klassiert. Gra¬ nulate mit Partikeldurchmessern von 2,0 bis 4,0 mm werden wei-

teren Untersuchungen, wie z.B. der Bestimmung von Ausgangskeim¬ zahlen, Überlebenskeimzahlen, etc., zugeführt.

Da das Einbringen der Granulate in eine 0,9 %-ige NaCl-Lösung eine starke Quellung der Hilfsstoffe bedingt, wird vor der Keim¬ zahlbestimmung mit Glaskügelchen geschüttelt, um eine Zerstörung der gequollenen Hilfsstoffhülle und dadurch die Freisetzung der Bakterien aus den trockenen Granulatkernen zu gewährleisten. Hierfür werden den Bakterien-Suspensionen sterile Glaskügelchen zugesetzt und mehrmals in horizontaler Bewegung geschüttelt. Im Anschluß daran werden die Keimzahlen mittels Koch'schem Platten- gußverfahren ermittelt.

Bestimmung der Überlebenskeimzahl nach Inkubation in 0,1 N HCI:

Zur Simulation einer Magenpassage wird 1,00 g der Probe mit 94,0 ml 0,1 N HCI versetzt und 1 h am Schüttelwasserbad (Firma GFL, Type 1083) bei 37°C inkubiert. Anschließend wird mit 2 ml 5 N NaOH und 3 ml einer wäßrigen 1 M Na _? HP0 ₄ -Lösung neutralisiert (ca. pH 7) und die Keimzahl nach dem Koch'sehen Plattengußver- fahren bestimmt.

Bei der Untersuchung von reinen Lyophilisaten hinsichtlich Ma- gensaftresistenz kann folgender Umstand zu verfälschten Ergeb¬ nissen führen: Das Lyophilisat kann sich bereits bei der Be¬ schickung der Verdünnungsflaschen an die Glaswandung anlagern, wodurch die Bakterien im trockenen Film unter einer feuchten Schutzschicht teilweise überleben. Bei Untersuchungen mit reinen Lyophilisaten muß daher die Verdünnungsflasche von Anfang an einer gleichmäßigen Schüttelbewegung unterzogen werden um das Absetzen des Lyophilisats am Boden zu verhindern.

1. Verarbeitung von Enterococcus faecium M74-Bakterien

Eine kommerziell erhältliche Praparation des Stammes Entero¬ coccus faecium M74 (Firma Medipharm AB, Schweden) - Lactiferm L- 50 - wurde für die vorliegenden Untersuchungen herangezogen und ein erfindungsgemäßes Granulat entsprechend den oben beschriebe-

nen Verfahren mit unterschiedlichen Hilfsstoffkomponenten herge¬ stellt. Die kulturelle Lebendkeimzahlbestimmung wurde für das Ausgangs-Lyophilisat, das Ausgangs-Granulat, sowie für die Prä¬ parationen nach Inkubation in 0,1 N HCI ("Überlebenskeimzahl") vorgenommen. Der Nachweis erfolgte durch Plattierung auf Entero- kokken-Selektivagar (Slanetz und Bartley; Milieu: aerob für 48 h bei 37 ^β C).

1.1.: Granulat mit Natriumalginat

Rezeptur der Formulierung:

10,0 g lyophil. Enterococcus faecium M74 10,0 g Natriumalginat

1,0 g Magnesiumstearat 10,0 g CaHP0 ₄

1.2.: Granulat mit HPMC-Phthalat

Rezeptur der Formulierung:

10,0 g lyophil. Enterococcus faecium M74 10,0 g HPMC-Phthalat 1,0 g Magnesiumstearat

1.3.: Ergebnisse der Prüfung hinsichtlich Magensaftresistenz:

Ausgangskeimzahl Überlebenskeimzahl nach Inkubation in 0,1 N HCI

Lyophilisat 2,8 x 10 10 4,0 x 10 ^!

Granulat mit

Natriumalginat 9,5 x IO ⁹ 6,0 x IO ⁶ HPMC-Phthalat 1,2 x 10 ¹ ° 3,0 x 10 ⁷

Tabelle 1

Angaben in Kolonien bildende Einheiten (colony forming units (CFU)/g

Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen, daß mit den erfindungsge¬ mäßen Präparationen die Überlebenszahlen der Bakterien deutlich (z.T. um über 2 Zehnerpotenzen) gesteigert werden konnte.

2. Verarbeitung von Enterococcus faecium SF-68-Bakterien

Eine kommerziell von der Firma Chr. Hansen's bio Systems, Horsholm, Dänemark, erhältliche Praparation des Stammes Entero¬ coccus faecium SF-68 (APP 396), wurde für die im folgenden be¬ schriebenen Untersuchungen herangezogen und ein erfindungsge¬ mäßes Granulat gemäß den oben beschriebenen Herstellungsverfah¬ ren mit unterschiedlichen Matrixkomponenten hergestellt. Keim¬ zahlbestimmungen erfolgten für das Ausgangs-Lyophilisat, das Ausgangs-Granulat, sowie für die Präparationen nach Inkubation in 0,1 N HCI ("Überlebenskeimzahl").

2.1.: Granulat mit HPMC-Acetat-Succinat

Die Komponenten für einen ersten Kompaktiervorgang werden ge¬ mischt und komprimiert. Anschließend werden die Komprimate zu einem Granulat A als Zwischenprodukt granuliert. Das Granulat A wird erneut mit weiteren notwendigen Komponenten (z.B. mit glei¬ chen Masseteilen HMPC-Acetat-Succinat-Granulat) komprimiert und zu einem Endprodukt (Granulat B) granuliert. Durch diese Her¬ stellungstechnologie wird die Einbettung der Mikroorganismen in die stabilisierend wirkende Matrix durch mehrere einfach durch¬ führbare Verfahrensschritte optimiert.

Rezeptur der Formulierung: (Granulat A)

12,0 g Hansen APP 396 (Ent. faec. SF-68)

8,0 g HPMC-Acetat-Succinat-LF 12,0 g Magnesiumstearat

Die gemäß dem oben angegebenen Mischungsverhältnis hergestellte Pulvermischung wurde trocken granuliert, das Granulat an¬ schließend 1:1 mit HPMC-AS-LF-Granulat gleicher durchschnittli¬ cher Korngröße gemischt und nochmals dem Trockengranulierungs- prozeß unterzogen.

2.2.: Granulat mit HPMC-Phthalat

Rezeptur der Formulierung:

10,0 g Hansen APP 396 (Ent. faec. SF-68) 10,0 g HPMC-Phthalat

1.0 g Magnesiumstearat

2.3.: Granulat mit Natriumalginat und HPMC

Rezeptur der Formulierung:

10,3 g Hansen APP 396 (Ent. faec. SF-68) 12,8 g HPMC 60SH-4000

5.1 g Natriumalginat 1,4 g Magnesiumstearat

2.4.: Ergebnisse der Prüfung hinsichtlich Magensaftresistenz:

Ausgangskeimzahl Überlebenskeimzahl nach Inkubation in 0,1 N HCI

Lyophilisat 1,4 x 10 12 8 x IO ⁹

Granulat mit

HPMC-AS-LF 3,7 x 10 ¹ ° 3,2 x IO ⁸ HPMC-Phthalat 1,2 x 10 ¹¹ 1.4 x IO ⁹ Natriumalginat +HPMC60SH-4000 2,4 x 10 1 1 1,7 x 10 10

Tabelle 2

Angaben in CFU/g

3. Verarbeitung von Lactobacillus acidophilus-Keimen

Eine kommerziell von der Firma Wiesby erhältliche Praparation des Stammes Lactobacillus acidophilus (Wiesby L. acidophilus Nr.145) wurde für die vorliegenden Untersuchungen herangezogen und ein erfindungsgemäßes Granulat entsprechend den oben be¬ schriebenen Verfahren mit unterschiedlichen Hilfsstoffkomponen¬ ten hergestellt. Die kulturelle Lebendkeimzahlbestimmung wurde

für das Ausgangs-Lyophilisat, das Ausgangs-Granulat sowie für die Präparationen nach Inkubation in 0,1 N HCI ( "Überlebenskeim- zahl") vorgenommen. Der Nachweis erfolgte durch Plattierung auf Rogosa-Agar (Milieu: anaerob für 72 h bei 37 ⁰ C; Lit.: Mitsuoka, Zbl.Bakt.I. Orig., 210 (1969), 32-51); die Bestimmung der Über¬ lebenskeimzahlen erfolgte in gleicher Weise.

3.1.: Granulat mit Natriumalginat und HPMC

Rezeptur der Formulierung: 61,5 g L. acidophilus-Lyophilisat

25,6 g HPMC 60 SH-4000

10,2 g Natriumalginat

2,7 g Magnesiumstearat

3.2.: Granulat mit HPMC-Acetat-Succinat

Rezeptur der Formulierung: 49,5 g L. acidophilus-Lyophilisat

49,5 g HPMC-Acetat-Succinat - LF 1,0 g Magnesiumstearat

3.3.: Granulat mit größeren HPMC-Acetat-Succinat-Anteilen ( "Granulatgemisch" )

Herstellung: siehe 2.1.

Rezeptur der Formulierung: 20 g L.acidophilus-Lyophilisat

20 g Magnesiumstearat 60 g HPMC-Acetat-Succinat - LF

3.4.: Untersuchungen zur Magensaftresistenz:

Granulat- bzw. Lyophilisat-Proben wurden jeweils nach 0, 15, 30, 45 und 60 min Inkubation in 0,1 N HCI gezogen und deren Keimzahl bestimmt. Die Ergebnisse der Untersuchungen sind in Tabelle 3 dargestellt.

Zu Vergleichszwecken wurde reines Bakterienlyophilisat und granuliertes Lyophilisat in die Untersuchungen einbezogen.

Zeit Keimgehalt Keimgehalt Keimgehalt Keimgehalt Keimgehalt (min) Na-alg.+HPMC HPMC-AS-LF HPMC-AS-LF Lyophilisat Lyophilisat

Granulat Granulat Granulat- Granulat gemisch

0 5,0 X IO ⁷ 2,3 x IO ⁷ 1,0 x IO ⁷ 4,4 x IO ⁸ 2,2 x IO ⁹

15 1,1 X 10 ⁶ n.b. n.b. n.b. n.b.

30 4,0 X IO ⁵ 5,2 x IO ⁵ 2,3 x IO ⁶ n.b. n.b.

45 3,6 X IO ⁵ n.b. n.b. n.b. n.b.

60 3,4 X IO ⁵ 1,1 x IO ⁵ 1,7 x IO ⁶ 0 0

n.b. nicht bestimmt Angaben in CFU/g

Tabelle 3

Diese Ergebnisse belegen deutlich, daß die erfindungsgemäßen Formulierungen eine umfassende Magensaftresistenz der verab¬ reichten Mikroorganismen gewährleisten, sodaß eine zufrieden¬ stellende Wirkung im Darmbereich erzielt werden kann. Es zeigte sich weiters, daß die erfindungsgemäßen Formulierungen auch eine erhöhte Lagerbeständigkeit gegenüber herkömmlichen Formulierun¬ gen ermöglichen.