Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäuremolekülen in niedriger Kon¬ zentration in zu untersuchenden Proben mittels Amplifi- kationsreaktionen, insbesondere unter Verwendung von Poly- merasen und/oder Ligasen, sowie unmarkierten und detektier¬ baren Primern.

Ein derartiges Amplifikationsverfahren ist für die molekulare Diagnostik, insbesondere für die Pathogendiagnostik, von großer Bedeutung. Eine Vielzahl von Techniken ist beschrieben worden, die geringe Mengen an spezifischer Nukleinsäure nachzuweisen vermögen. Dem erfindungsgemäßen Verfahren ähnlich ist der 5'-Nuklease-Assay (die sogenannte TaqMan- Polymerase-Chain-Reaction; Livak et al . in PCR Methods and Applications 4 (1995) , 357 - 361) . Die Basis dieser Methode ist ein am 5 ^' -Ende mit einem Reportermolekül (Fluorescein) und am 3 '-Ende mit einem Quenchermolekül (Rhodamin) mar¬ kiertes Oligonukleotid, welches am 3 '-Ende zudem über einen Phosphatrest gegen eine enzymatische Kettenverlängerung geschützt ist. Im Verlauf der PCR-Reaktion wird die Sonde

ORIGINALUNTERLAGEN

von der 5 '-3 '-Exonukleaseaktivitat der verwendeten Taq- Polymerase erkannt, wenn sie downstream zu einer pπmer- gestarteten Polymerase-Reaktion an die zu ampliflzierende Matrize hybridisiert hat. In der Folge sorgt die 5'-3'- Exonukleaseaktivitat für die Hydrolyse deε 5'-Endes der Sonde, wodurch die Fluoreszenz-Emission des Fluorescem- Reporters ansteigt, da sie nicht langer durch die Nachbar¬ schaft des Rhodamins geloscht wird. Gravierende Nachteile dieses Verfahrens sind die sehr aufwendige und kosten¬ intensive Praparation der doppeltmarkierten und endgruppen- geschutzten Oligonukleotide, die Beteiligung der enzymatischen Hydrolyse und der Einfluß von Medieneffekten auf die Fluoreszenzausbeute, d.h die Quantiflzierbarkeit

Das der Erfindung zugrundeliegende Problem besteht darin, em universell einsetzbares, leicht handhabbares und preis¬ wertes Verfahren zur qualitativen und quantitativen Detektion von kleinsten Mengen an Nukleinsäure bereitzustellen. Es ist hierbei insbesondere im Hinblick auf die Diagnostik in¬ fektiöser Pathogene wünschenswert, daß das gesamte Verfahren in Kompartimenten ablaufen kann, die nach der Zugabe der Probe verschlossen werden und im Laufe des Verfahrens nicht wieder geöffnet werden müssen

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird gelost durch em Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 Die Unteranspruche 2 bis 10 betreffen bevorzugte Ausführungs¬ formen des erfindungsgemaßen Verfahrens.

Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur Bestimmung von Nuklemsauremolekύlen m niedrigen Konzentrationen m zu untersuchenden Proben. Dabei werden Amplifikationsreaktionen eingesetzt . Diese verwenden insbesondere Polymerasen und/oder Ligasen Es werden unmarkierte Amplifikationsprimer einge¬ setzt Zudem werden detektierbare, insbesondere markierte Primer, sogenannte Detektionspπmer, verwendet Die detektierbaren Primer hybridisieren an die Nukleinsäure

und/oder werden durch die Amplifikationsreaktion in die amplifizierte Nukleinsäure eingebaut, wobei die Konzentration der freien Detektionsprimer abnimmt. Die Abnahme dieser Konzentration und/oder die Zunahme der Konzentration der Amplifikationsprodukte wird gemessen und als Maß für das Vorhandensein des zu bestimmenden Nukleinsäuremoleküls herangezogen.

Vorzugsweise sind die detektierbaren Primer mit fluores¬ zierenden Gruppen markiert. Als Amplifikationsreaktionen kommen insbesondere Primer abhängige Reaktionen wie die Polymerasekettenreaktion (PCR) , Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR) , isothermale 3SR (seif-sustained sequence repli¬ cation) , Strand Displacement Amplification (SDA) und/oder Nucleic Acid Sequence-based Amplification (NASBA) in Be¬ tracht. Desweiteren kann es bevorzugt sein, die Methode der Ligase Chain Reaction (LCR) einzusetzen. Ebenso kann die sogenannte gap-LCR (U. Landegren, Current Opinion in Biotechnology 1996, 7: 95 - 97) Verwendung finden.

Wird die Abnahme der Konzentration der detektierbaren, insbesondere markierten Primer, und/oder die Zunahme der Konzentration der Amplifikationsprodukte, wie erfindungsgemäß bevorzugt wird, mittels fluoreszenzmarkierter Primer ge¬ messen, ist die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) einsetzbar, um ein Maß für das Vorhandensein des zu be¬ stimmenden Nukleinsäuremoleküls zu ermitteln. Bei dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Amplifikationstechniken mit der Detektionsmethode Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie gekoppelt. Das er¬ findungsgemäße Verfahren erlaubt somit die Realisierung einer Endpunkttitration, wobei die nachzuweisende Sequenz während der Reaktion stufenweise oder kontinuierlich amplifiziert wird. Der Endpunkt dieser als Endpunkttitration auffaßbaren Reaktion ist erreicht, wenn der erfindungsgemäß zu ver¬ wendende Detektionsprimer durch Inkorporation in die neue synthetisierte Nukleinsäure verbraucht ist, bzw. eine weitere

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Abnahme der Konzentration des Detektionsprimers nicht mehr feststellbar ist oder einen vorher festlegbaren, zweckmäßigen Wert erreicht hat.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens können unterschiedlich markierte Detektionsprimer verwendet werden. Die Detektion und Auswertung kann vorzugs¬ weise mittels der FCS m Form der m der WO 94/16313 offen¬ barten Kreuzkorrelation durchgeführt werden.

Bei der Verwendung fluoreszenzmarkierter Primer kann es in weiteren Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugt sein, eine Variante der Fluoreszenzkorrelations- spektroskopie unter Ausnutzung von Prinzipien der Nahfeld- mikroskopie (WO 96/13744) zu verwenden oder auf Analyse¬ methoden gemäß der europäischen Patentanmeldung 96 116 373.0 zurückzugreifen. Die letztgenannte Anmeldung beschreibt eine Methode zur Analyse von Proben durch wiederholte Messung der Anzahl von Photonen pro definiertem Zeitintervall von Licht, welches von den Partikeln in der Probe emittiert, gestreut und/oder reflektiert wird, und Bestimmung der Verteilung der Anzahl von Photonen in den jeweiligen Zeitintervallen. Die Methode ist dadurch gekennzeichnet, daß die Verteilung der spezifischen Helligkeiten der Partikel aus der Verteilung der Anzahl von Photonen bestimmt wird.

Vorzugsweise wird erfindungsgemäß eine Polymerase ohne 5'-3'- Exonukleaseaktivität verwendet. Anderenfalls würde die Sonde wie im Ansatz gemäß Livak et al . abgebaut. Die Polymerasen sind kommerziell erhältlich.

Erfindungsgemäß ist es jedoch auch möglich, auf eine Ex¬ tension des Detektionsprimers während des Verfahrens zu verzichten. Dies kann z.B. durch Verwendung eines Didesoxy- nukleotides am 3 ' -Ende des Detektionsprimers oder durch die Verwendung von markierten PNA als Detektionsprimern erfolgen. Erfindungsgemaß ist auch der Anstieg der Diffusionszeiten

des Detektionsprimers durch Hybridisierung an die amplifi- zierte Nukleinsäure ausreichend für eine reproduzierbare FCS- Detektion.

Die erfindungsgemäße Maßnahme, die Abnahme der Konzentration der detektierbaren, insbesondere markierten Primer, zu messen und als Maß für das Vorhandensein des zu bestimmenden Nukleinsäuremoleküls heranzuziehen, beruht auf der Tatsache, daß zu Beginn der Reaktion der Detektionsprimer sich in einem Zustand hoher Mobilität befindet, während er am Ende der Reaktion durch die Hybridisierung bzw. durch die Amplifika- tionsreaktion (Einbau in ein Amplifikationsprodukt) weit¬ gehend bis vollständig in einen Zustand niedriger Mobilität überführt wird. Diese Mobilitätsänderung läßt sich in be¬ sonders geeigneter Weise durch die Methode der Fluoreszenz- korrelationsspektroskopie messen, wobei die Probe im ge¬ schlossenen Kompartiment verbleiben kann. Es kann erfindungs- gemäß bevorzugt sein, die Konzentration des Detektionsprimers als gering im Verhältnis zur Konzentration des Amplifi- kationsprimers zu wählen. Insbesondere kann die Konzentration des Amplifikationsprimers das 5- bis 200-fache der Kon¬ zentration des Detektionsprimers betragen.

Aus der vorzugsweise mit der Fluoreszenzkorrelations- spektroskopie ermittelten Korrelationskurve lassen sich sowohl die Anzahl der fluoreszierenden Moleküle, das relative Verhältnis fluoreszenzmarkierter Moleküle unterschiedlicher Größe als auch ihre Diffusionsmobilitäten schnell und zuver¬ lässig ermitteln. Das erfindungsgemäße Verfahren in Form einer Endpunkttitration und/oder Hybridisierung weist durch entsprechende Wahl und Konzentration der fluoreszenz¬ markierten Primer nur die Anwesenheit der gesuchten Sequenz, welche eine zum Detektionsprimer komplementäre Sequenz aufweist, nach.

Das Verfahren ist unempfindlich gegenüber unspezifischen Amplifikationen. Eine hohe Konzentration an Amplifikations-

primer ist wünschenswert, um eine sichere Amplifikation auch geringer Mengen an nachzuweisenden Nukleinsäuren zu gewähr¬ leisten. So kann zum Beispiel die Konzentration des Amplifi- kationsprimers 0, 5 μM betragen, während der Detektionsprimer vorzugsweise in einer Konzentration von 1 bis 10 nM vorliegt. Aus der entsprechenden Wahl unterschiedlicher Konzentrationen für Amplifikationsprimer und Detektionsprimer ergeben sich insbesondere die folgenden Vorteile. Bei der Amplifikations- reaktion wie der PCR muß es zu Assoziationsreaktionen zwischen Primer und Template kommen, um die Primer-Elongation zu starten. Diese Reaktionen haben normalerweise Geschwindig- keitskonstanten von k _R = 10 ⁴ - IO ⁶ M^s ^"1 . Im Zeitbereich von Sekunden bis Minuten kommt es gemäß der Beziehung l/t = k _R (C _prime , _r + C _ter-place ) nennenswert zu Komplexbildungen, wenn einer der Partner im Bereich von 0,1 bis 1 μM vorliegt. Dies gilt nur für bereits hohe Templatekonzentrationen bzw. für die Reaktion mit den Amplifikationsprimern. Erst wenn die Kon¬ zentration entsprechend hoch ist, kommt es zur gewünschten und spezifischen Hybridisierung mit dem Detektionsprimer, der sich dann in einer der erfindungsgemäßen Ausfuhrungs¬ formen in wenigen Amplifikationsschritten in gewünschter Weise verbraucht und nahezu vollständig durch Kettenver¬ längerung in Amplifikate überführt wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere in Kombination mit Probenträgern wie z.B. Polycarbonat-Folien, welche sich durch folgende Vorzüge auszeichnen. Sie sind

a) chemisch inert b) fest verschließbar (keine Kontaminationseffekte, keine Verdampfung) c) nicht fluoreszierend d) von relativ geringer Dicke (10 bis 20 μm im Bereich der Probenflussigkeit) e) von relativ hoher Wärmeleitung.

Bevorzugt lassen sich Folien mit 96 oder 384 Kompartimenten

verwenden. Die Folien werden mit Testflussigkeit und Proben- flussigkeit m ca 5 bis 20 μl Portionen befullt und ver¬ schlossen. Die Losungen werden als kleine Tropfen durch Kapillarkrafte im oberen Teil der Folie fixiert, in der das Kompartiment eine für die FCS-Methode erforderliche Wand¬ starke von 10 bis 20 μm besitzt. Die Folien lassen sich m einen thermostatisierbaren Rahmen einpassen. Sie werden mit einer dünnen Schicht Immersionsflussigkeit für das im FCS- Detektionsverfahren zu verwendende Objektiv benetzt Die Kompartimente lassen sich insbesondere für Verdunnungsreihen, Screenings oder auch für unterschiedliche Testtypen ein¬ setzen Die typische Meßzeit für eine Folie mit 96 Kom- partimenten liegt im Bereich weniger Minuten bis maximal einer halben Stunde. Durch Mitfuhrung geeigneter Standard- verdunnungen des Templates in der gleichen Folie ist die Quantifizierung der zu detektierenden Nukleinsäure in den Testkompartimenten möglich.

Die quantitative Bestimmung der zu detektierenden Nuklein¬ säure kann erfindungsgemaß durch Verwendung von mindestens zwei Amplifikationsansatzen der Probe erfolgen Hierzu wird bevorzugt eine Verdunnungsreihe des ersten Ampliflkations- ansatzes hergestellt. Aus dem Verdunnungsverhaltnis ergeben sich die relativen Konzentrationen des zweiten und ggf weiterer Amplifikationsansätze. Bei Kenntnis der Nachweiskon¬ zentration, d. h. der Detektionsschwelle des verwendeten Detektionssystems, oder eines sonstigen zweckmäßigen Schwellenwertes ist durch Bestimmung der Reaktionszeiten bzw. der Anzahl der Ampliflkationszyklen bis zum Erreichen des Schwellenwertes in den jeweiligen Amplifikationsansatzen eine Quantifizierung der nachzuweisenden Nukleinsäure möglich Der Schwellenwert sollte bevorzugt innerhalb der loga¬ rithmischen Amplifikationsphase erreicht werden, um eine hohe Quantifizierungsgenauigkeit zu erzielen In vorteilhafter Weise wirken sich bei der erfindungsgemaßen Quantifizierung Unterschiede m der Ampflifikationsefflzienz, die z B in der besonderen Struktur der nachzuweisenden Nukleinsäure

begründet sein können, nicht auf das Meßergebnis aus

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich bei Verwendung geeigneter Detektionsprimer auch zum Nachweis von Punkt- mutationen, Translokationen, Deletionen oder Haplotyp- Differenzierung. Es ist zudem im Sinne einer Multiplex-PCR einsetzbar. Bei erblichen Stoffwechselkrankheiten, wie z.B der autosomal rezessiven zystischen Fibröse, lassen sich durch Verwendung zweier Detektionsprimer mit unterschied¬ lichen Farbstoffmarkern heterozygote Patienten von homo- zygoten Patienten unterscheiden. Es ist zudem sowohl zum Nachweis von DNA- als auch RNA-Genomen geeignet (letzteres z.B. durch Einsatz m einer RT-PCR oder 3SR-Reaktιon)

Die Figur 1 betrifft eine schematische Darstellung des er¬ findungsgemaßen Verfahrens unter Verwendung der PCR.

Die Figur 2 beschreibt die Verschiebung der Korrelatlonskurve G(t) bei Anwesenheit der angegebenen initialen Template- Mengen.

Die Figur 3 betrifft die Darstellung der invertierten Korrelationsfunktion in der Form (G (t=0) -1) / (G (t) -1)

Die Figur 4a zeigt die im Ausfuhrungsbeispiel 1 durch FCS- Analyse erhaltenen Autokorrelationsfunktionen G(t) .

Die Figur 4b zeigt die Auftragung dieser Daten in linean- sierter Form.

Die Figur 5 verdeutlicht die Änderung der relativen Diffusionszeiten des Detektionsprimers im Verlauf der Ampli- fikationsreaktion gemäß Ausfuhrungsbeispiel 1.

Die Figuren 6a und b verdeutlichen das Detektionslim.it des erfindungsgemaßen Verfahrens bei Anwendung auf das Aus¬ fuhrungsbeispiel 1

Die Figur 7 zeigt den erfindungsgemäßen Einsatz eines Detektionsprimers während der NASBA im Ausführungsbeispiel 2.

Die Figur 8 zeigt die Lokalisation der verwendeten Priirrer innerhalb der gag Region des HIV-1 Genomes.

Die Figur 9 zeigt einen typischen Zeitverlauf der Ver¬ schiebung der Korrelationskurven aufgrund der Hybridisierung und Extension des Detektionsprimers im Ausführungsbeispiel 2.

Die Figur 10 verdeutlicht die Kinetik der Hybridisierungs/ Extensionsreaktion des Detektionsprimers im Ausführungsbei¬ spiel 2.

Die Figur 1 beschreibt schematisch das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung der PCR. Die in der PCR ver¬ wendeten Amplifikationsprimer pl und p2 sind als Pfeile dargestellt, der Detektionsprimer p3 ist mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Kreis) gekoppelt. Der linke Teil der Figur zeigt amplifizierte Artefakte bei Abwesenheit des Templates. Hierbei kann es sich z.B. um Primerdimere der hochkonzentrierten Primer pl und p2 handeln. Die rechte Seite der Figur zeigt p2 in Anwesenheit des Templates . Erst wenn die Amplifikate in genügend hoher Konzentration vorliegen, wirkt das Amplifikat als Template für den niedrigkonzen¬ trierten, fluoreszenzmarkierten Detektionsprimer. Die Mobili¬ tätsänderung des Primers läßt sich deutlich durch eine Verschiebung der Korrelationskurve erkennen.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erzielte Ergebnisse an Mycobacterium tuberculosis sind in den Figuren 2 und 3 dargestellt. Der Nachweis dieses pathogenen Erregers dauerte bislang aufgrund der aufwendigen Zellkulturverfahren ca. 3 bis 4 Wochen. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens läßt sich diese Nachweiszeit stark verkürzen.

In der Figur 2 wird die Verschiebung der Korrelationskurve G(t) bei Anwesenheit der angegebenen initialen Template- Mengen gezeigt Die jeweils angegebene Anzahl von Template- molekulen wurde zu Beginn der Reaktion m jeweils 50 μl Reaktionsansatz vorgelegt, durch das erfindungsgemäße Ver¬ fahren m 32 PCR-Zyklen ampliflziert und mittels der FCS- Methode analysiert . Es wurde em für den Tuberkuloseerreger Mycobacterium tuberculosis charakteristisches Template verwendet. Die Detektionsgrenze lag hier bei 100 Template- molekulen pro Ansatz. Das Verfahren ist damit empfindlich genug, um m jeder molekulardiagnostischen Anwendung einge¬ setzt zu werden.

Die Figur 3 zeigt die Auftragung der invertierten Korre- lationsfunktion in der Form (G (t=0) -1) / ( (G(t) -1) . In dieser Darstellung wurden die gleichen Daten wie m Figur 2 ver¬ wendet . Durch die invertierte Auftragung sind die Kurven im betrachteten Zeitbereich lmearisiert, wodurch ihre Inter¬ pretation erleichtert wird. Eine Verschiebung von G(t) entlang der t-Achse zeigt sich m dieser Darstellung als Abflachung der Steigung, die durch lineare Regression m einfacher Weise erhalten werden kann. Die Detektionsgrenze laßt sich deutlich als 100 Templatemolekule pro Reaktions¬ ansatz erkennen.

Die Figur 4a zeigt die durch FCS-Analyse erhaltenen Auto¬ korrelatlonsfunktionen G(t) mit zunehmender Anzahl an PCR- Zyklen der für Mycobacterium tuberculosis und M. bovis spezifischen Targetsequenz IS6110 (Ausfuhrungsbeispiel 1) . Die PCR-Amplifikation eines 106 bp-Segmentes, ausgehend von IO ⁵ Strängen der genomischen Mycobacterium tuberculosis DNA vor einem Hintergrund von 2.5 μg unspezifischer humaner Placenta-DNA in 50 μl Reaktionsvolumen, erfolgte unter Verwendung des Primerpaares S1/S2 als Amplifikationsprimer und 10 nM TMR-markierter Sonde PRI als Detektionsprimer (Tabelle 1) . Der Detektionsprimer bindet zwischen den Ampli- flkationsprimern mit derselben Orientierung wie der Amplifl-

kationsprimer S2 und überlappt mit dem 3 ^' -Ende von S2 um fünf Nukleotide. Die Amplifikationsreaktionen wurden nach einer unterschiedlichen Zahl an Zyklen gestoppt. Die Inkorporation des Detektionsprimers m die Amplifikate ist an der Ver¬ schiebung der Autokorrelationskurve zu längeren Korre- lationszeiten, welche einer Zunahme der Diffusionszeit des Detektionsprimers entspricht, deutlich erkennbar.

Die Figur 4b zeigt die Auftragung der Daten m der lmeari- sierten Form [G(t=0)] / [G(t)j . Mit zunehmender Amplifikation ist eine Abnahme der Geradensteigung zu beobachten.

Die Figur 5 verdeutlicht die Änderung der relativen Diffusionszeiten des Detektionsprimers im Verlauf der Ampli- fikationsreaktion. Die Diffusionszeiten des Detektionsprimers spiegeln eindeutig die PCR-Ampliflkationskmetik mit einer vor Erreichen des Detektionsgrenzwertes initialen lag-Phase, schneller exponentieller Anreicherung der Amplifikations¬ produkte sowie einer Plateauphase wider. Dieses Plateau zeigt eine Sättigung an, welche dem Endpunkt einer Titration vergleichbar ist. Die abnehmende Anzahl der durchschnittlich sich im Laserfokus befindlichen Moleküle des Detektions¬ primers mit zunehmender Zahl der Temperaturzyklen ist vermut¬ lich auf Adsorptionseffekte an den Wanden der Reaktionsgefaße zurückzuführen (Nebenbild der Figur 5) . Zudem ist eine scheinbare Zunahme emittierter Photonen pro Molekül und Sekunde zu beobachten (Nebenbild der Figur 5) .

Die Figuren 6a und 6b verdeutlichen das Detektionslimit des erfindungsgemaßen Verfahrens bei Anwendung auf das Aus¬ fuhrungsbeispiel 1. Die PCR-Amplifikationsreaktionen wurden unter Verwendung unterschiedlicher Amplifikations- und Detektionsprimer durchgeführt (Tabelle 1) . Vor einem Hinter¬ grund von 2.5 μg unspezifischer humaner Plazenta-DNA m 50 μl Reaktionsvolumen wurde eine konstante Anzahl an PCR-Zyklen (entweder 36 oder 40 Zyklen) mit jeweils unterschiedlichen Ausgangskonzentrationen an Targetgenomen durchgeführt. Bei

Verwendung der Amplifikationsprimer S1/S2 mit 1 nM Detektionsprimer PRI (Figur 6a) oder der Amplifikationsprimer B1B/B2B mit 5 nM Detektionsprimer PR3 (Figur 6b) liegt das Detektionslimit unterhalb von 100 Mycobacterium tuberculosis Genomen. Eine Quantifizierung von bis zu lediglich 10 Target¬ genomen kann durch Vergleich mit einem Verdunnungsstandard erfolgen. Die mittels FCS bestimmten Diffusionszeiten des Detektionsprimers stimmen gut mit den Ergebnissen der dem Fachmann m bekannter Weise durchgeführten Sequenzanalyse uberein (Figur 6a) . Nichtbindende Sonden, wie z.B. der Primer HS3, zeigen bei Amplifikation der Targetsequenz keine Ver¬ änderung der Autokorrelatlonsfunktion bzw. ihrer Diffusionzeiten (Figur 6b) .

Die Figur 7 zeigt den erfindungsgemaßen Einsatz eines De¬ tektionsprimers wahrend der Amplifιkatιonsreaκtιon gemäß Ausfuhrungsbeispiel 2. Die von van Genem et al . (PCR Methods and applications 4, 177-184, 1995) beschriebene NASBA-Methode wurde erfindungsgemaß folgendermaßen variiert:

1. Em Detektionsprimer (gagl) wurde dem Reaktionsansatz zugesetzt. Dieser hybridisierte an einer spezifischen Sequenz des 145 b RNA-Stranges Durch Reverse Transkription mittels AMV-RT entstand ein ds DNA-Molekul mit 130 bp, wahrend das unter Verwendung der Primer 1 und 2 entstandene AmplifI- kationsprodukt 167 bp aufwies.

2. Alle Komponenten der NASBA-Reaktion einschließlich des Detektionsprimers und der Enzyme wurden auf Eis gemischt; der m der Literatur beschriebene Denaturierungsschritt konnte ohne Einfluß auf Reaktionsspezifitat entfallen.

3. In Standard-NASBA-Verfahren wird die ampliflzierte RNA mittels Hybπdisierungstechniken wie ELGA (enzyme-lmked gel assay) und ECL (Elektrochemilummeszenz) detektiert und quantifiziert. Diese Techniken erfordern die Öffnung der Probentrager mit der Gefahr von carryover-Kontammationen

Durch die Verwendung von FCS als Detektionsmethode ist es erfindungsgemaß in vorteilhafter Weise möglich, die Proben- losung ohne Öffnung der Probentrager zu analysieren.

Die Figur 8 zeigt die Lokalisation der verwendeten Primer innerhalb der gag Region des HIV-1-Genomes .

Die Figur 9 zeigt emen typischen Zeitverlauf der Vers¬ chiebung der Korrelationskurven (— 10 mm, 20 mm,

-.- - 35 mm, 50 mm, 60 mm nach Beginn der

Amplifikation) aufgrund der Hybridisierung sowie Extension des Detektionsprimers Die Anfangskonzentration der HIV-1 RNA-Molekule betrug 5000 pro ml Plasma Hinsichtlich der theoretischen Beschreibung der Autokorrelationskurven eines Zweikomponentensystems wird auf das Ausfuhrungsbeispiel 1 verwiesen. Im vorliegenden Beispiel wurden der hybridisierte (gagl-145 b RNA) Detektionsprimer und die durch Extension entstandene 130 bp-Komponenten aufgrund ihrer annähernd gleichen Diffusionszeiten als eine Komponente behandelt. Zur Bestimmung der Kinetik der hybridisierten/extendierten Detektionsprimers wurden die Korrelationskurven unter Ver¬ wendung der dem Fachmann bekannten Gleichung zur Beschreibung der Autokorrelationsfunktion eines Zweikomponentensystems geflttet .

Die Figur 10 verdeutlicht die Kinetik der Hybridisierungs- /Extensionsreaktion des Detektionsprimers. Die Bedeutung der verwendeten Symbole ist wie folgt :

D negative Kontrolle; O falsch-positive Probe; ■ Anfangs¬ konzentration von 1000 HIV 1 RNA-Molekülen pro ml Plasma; • Anfangskonzentration von 2000 HIV-1 RNA-Molekulen pro ml Plasma; ▼ Anfangskonzentration von 5000 HIV-1 RNA-Molekulen pro ml Plasma, A Anfangskonzentration von 20000 HIV-1 RNA- Molekulen pro ml Plasma. Bei geringer Anfangskonzentration ist die Kurve zu längeren Inkubationszeiten verschoben Bei

einer mit wenigen Molekülen kontaminierten falsch-positiven Probe ist diese Verschiebung besonders auffällig, so daß eine klare Unterscheidung zwischen falsch-positiven und positiven Proben möglich ist.

Der Wert der initialen Konzentration an HIV-1 RNA Molekülen erlaubt eine Unterscheidung zwischen positiven und falsch¬ positiven Proben. Die direkte quantitative Analyse der Anfangskonzentration an RNA-Molekülen in einer Probe kann erfindungsgemaß wie folgt ermittelt werden. Die Zeitabhängig¬ keit der Konzentration der Amplifikationsprodukte in einer NASBA-Reaktion ist annähernd durch folgende Exponential¬ funktion beschreibbar: P(t)= P _n exp(kt) , wobei k eine für den Amplifikationsmechanismus repräsentative Konstante darstellt. Der Logarithmus der in der Probe enthaltenen Moleküle stellt eine lineare Funktion der zur Erzielung eines bestimmten Primerbindungsgrades notwendigen Inkubationszeit dar (Neben¬ bild der Figur 10) . Mittels einer Verdünnungsserie läßt sich somit die Anfangskonzentration an RNA-Molekülen ermitteln.

Im vorliegenden Ausführungsbeispiel wurde der kombinierte Ansatz aus Hybridisierung und Extension des Detektionsprimer dargestellt. Die mittels der FCS erhaltenen Daten wurden durch Sequenzierung konfirmiert. Es konnte bei mehr als 50 durchgeführten Analysen keine unspezifische Bindung des Detektionsprimers festgestellt werden, so daß sich hiermit die Möglichkeit ergibt, auf eine Extension des Detektions¬ primers während der Analysen zu verzichten. Dies kann z.B. durch Verwendung eines Didesoxynucleotides am 3 '-Ende des Detektionsprimers oder durch Verwendung von PNA-Primern erfolgen. Erfindungsgemaß ist auch der Anstieg der Diffusionszeiten des Detektionsprimers durch Hybridisierung an die amplifizierte RNA ausreichend für eine reproduzierbare FCS-Detektion.

Ausführuncrsbeispiel 1

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens wird als Amplifikationsmethode die Polymerase- kettenreaktion (PCR) mit einer auf der Methode der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) beruhenden Detektionstechnik unter Verwendung eines mit fluoreszierenden Gruppen markierten Detektionsprimers, wie z.B. einem N, N, N' , N' -tetramethyl-5-carboxyrhodamm (TMR) -markierten Detektionsprimer, kombiniert. Die Detektionsprimer werden durch die Ampliflkationsreaktion in die amplifizierte Nu¬ kleinsäure eingebaut, wobei der Einbau mit einer Zunahme der Diffusionszeit des Detektionsprimers einhergeht, welche mittels FCS beobachtet werden kann.

Verwendete Materialien: Die Oligodesoxynukleotide (Tabelle 1) wurden m HPLC-remer Qualität bei der Fa. NAPS (D- Göttingen) erworben. Die Markierung der Sonden PRI, PR3, HS1 und HS3 erfolgte mit dem 5-Isomer von TMR an ihrem 5' -Ende über einen Aminohexyllinker. Die Konzentrationen wurden unter Berücksichtigung der Absorption des TMR-Labels bei 260 nm (mit A ₂₆₀ / A ₅₅₄ = 0.49) bestimmt, und der Substitutionsgrad (DOS) , entsprechend einem Markierungslabel pro Molekül, wurde mitteis folgender Formel bestätigt:

DOS = [ (10 x N / 86) x A ₅₅₄ ) ] / [A ₂₆₀ - (0,49 x A ₅₅₄ )] , wobei N die Anzahl der Basen m der Probe angibt .

2'-Desoxynucleosιd-5'-Triphosphate (dNTPs) wurden von der Fa. Pharmacia erworben; das 5 ^' -3 ^' -exonukleasefreie Stoffel- fragment der Thermus aquaticus DNA-Polymerase von der Fa. Perkm-Elmer. Die humane Placenta DNA wurde bei der Fa. Sigma erworben. Zudem wurde genomische DNA von Mycobacterium tuberculosis verwendet .

PCR m Gegenwart von Detektionsprimer: Die Ampliflkations¬ reaktion erfolgte entweder m 50 μl oder 25 μl Proben mit

10 mM Tris-HCl (pH 8.3) , 50 mM KCI, 2.5 mM MgCl ₂ , 0.1 mg/ml Gelatine, jeweils 0 5 μM der beiden Amplifikationsprimer, jeweils 200 μM der vier dNTPs, 50 ng/μl humaner Placenta-DNA als Überschuß unspeziflscher DNA, 1 bis 20 nM des TMR- markierten Detektionsprimers, und 0 05 U/μl des 5'-3'-exo- nukleasefreien Stoffelfragmentes der Thermus aquaticus DNA- Polymerase . Die Menge an genomischer Mycobacterium tuber¬ cul osi s DNA (im Bereich von 0 bis IO ⁶ Moleküle je 50 μl der Reaktionsmischung) betrüg wie angegeben. Die PCR-Reaktion erfolgte in Reaktionsrohrchen (Multiple-Safecap tubes) der Fa. Sarstedt . Es wurde folgendes Temperaturprogramm in einem TRIO-Thermoblock-Cycler der Fa Biometra (Gottingen) ange¬ wendet Denaturierung bei 94°C für 30 s, Pπmerbmdung bei 56°C (Primerpaar S1/S2) oder 60°C (Primerpaar B1B/B2B) für 20 s, und Elongation bei 72°C für 30 s, jeweils für die angegebene Zahl der Zyklen.

FCS-Messung und Bestimmung relativer Diffusionszeiten- Im Anschluß an die PCR wurden 10 μl der Reaktionsmischung mittels FCS unter Verwendung eines 63x1.2 Wasser-Immersions¬ objektives untersucht. Eine detaillierte Beschreibung der FCS ist in dem Artikel von Eigen und Rigler (Proc. Natl. Acad Sei USA 91.5740-5747) zu finden. Die Autokorre¬ lationsfunktion für eine Mischung von Partikeln mit schnellen und langsamen Translationsdiffusionszeiten ist bei Thompson (Topics in Fluorescence Spectroscopy, Vol. I, Lakowicsz, JR (ed) , Plenum 1991) beschrieben.

Ausfuhrungsbeispiel 2

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die isothermale Ampliflkationsmethode NASBA (nucleic acid sequence-based amplification) mit der Detektionsmethode FCS kombiniert Das erfindungsgemäße Verfahren wird in diesem Ausfuhrungsbeispiel verwendet, um eine simulierte HIV-In¬ fektion nachzuweisen.

Verwendete Materialien: Die Komponenten für die RNA-Iso¬ lierung sowie für die Amplifikationsmethode NASBA wurden bei der Fa. Organon Teknika (Eppelheim) erworben. Der mit TMR- markierte Detektionsprimer gagl wurde von der Fa. NAPS (Göttingen) synthetisiert. Die Probenträger mit 96 Reaktions- kompartimenten wurden in der Feinmechanikwerkstatt des Max- Planck-Institutes für Biophysikalische Chemie angefertigt; jedes Kompartiment besitzt ein Volumen von 40 μl und eine Wandstärke von 40 μm. Das verwendete Plasma war Hepatitis B- und C-, CMV- und HIV-1-negativ.

Simulation einer HIV-1-Infektion: Jeweils 1 ml Plasma wurde mit unterschiedlichen Mengen (1000, 2000, 5000, 20000 Mole¬ küle) an genomischer HIV-1 RNA (HXB2) versetzt. 9 ml Lyse- Puffer (5.25 M Guanidmthiocyanat, 50 mM Tris pH 6.4 , 20 mM EDTA, 1.3 % w/v Triton X-100) wurden zugesetzt.

Isolierung von Nukleinsäuren aus dem Plasma: Die Nuklein¬ säuren wurden an aktivierte Kieselerde (50 μl Suspension, 1 mg/ml) , welche der Lyse-Mischung zugesetzt wurde, gebunden. Nach einem Wasch- und Trocknungsschritt wurden die Nuklein¬ säuren mit 50 μl Elutionspuffer (1 mM Tris pH 8.5) eluiert und bei -70°C gelagert.

NASBA-Amplifikation der isolierten HIV-1 RNA: Typische Reaktionen wurden durchgeführt m einem 20 μl Reaktions- volumen, enthaltend 40 mM Tris pH 8.5, 12 mM MgCl ₂ , 42 mM KCI, 5 mM DTT, 15 % v/v DMSO, jeweils ImM dNTP, jeweils 2mM NTP, 0.1 U RNase H, 0.1 μg/μl BSA, 40 U T7 RNA-Polymerase, 8 U AMV Reverse Transkriptase, 0.2 μM Primer 1,2 und 5 μl isolierte Nukleinsäure (enthaltend 100, 200, 500, 2000 HIV-1 RNA-Moleküle) . In negativen Kontrollreaktionen wurden diese 5 μl isolierter Nukleinsäure durch 5 μl bidestilliertes Wasser ersetzt. Die Sequenzen der Amplifikationsprimer smd innerhalb der gag Region des HIV-1-Genomes lokalisiert (Figur 8) . Sie weisen die folgenden Sequenzen auf:

Primer 1 : 5'- AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GTG CTA TGT CAC

TTC CCC TTG GTT CTC TCA -3 ^' (antisense NT 1471-1499 von HXB2 , T7 Promotor unterstrichen)

Primer 2: 5'- AGT GGG GGG ACA TCA AGC AGC CAT GCA AA - 3' (sense NT 1358-1386 von HXB2) .

Zum Reaktionsansatz wurden 1 μl TMR-markierter gagl- Detektionsprimer (Endkonzentration: 4.5 nM) zugesetzt:

gagl: 5'- TMR-GAG ACC ATC AAT GAG GAA GCT GCA GAA TGG GAT - 3' (sense NT 1395-1427 von HXB2)

Diese Amplifikationsansätze von jeweils 21 μl wurden in ver¬ schließbare Probenträger, insbesondere Polycarbonatfolien mit 96 Vertiefungen, überführt und in die auf 42°C vor¬ temperierte Temperierungseinheit eines dem Fachmann bekannten FCS-Gerätes eingesetzt. In einem typischen Experiment wurden 10 Amplifikationsreaktionen einschließlich negativer Kon¬ trollen in parallelisierter Form durchgeführt. Die FCS- online-Detektion erfolgte unter Verwendung eines Wasser- Immersionsobjektives (Zeiss Plan Neofluar 40x0.9) . Das durch den Laserstrahl und ein Pinhole in einer dem Fachmann be¬ kannten Weise definierte Detektionsvolumen lag in der Größen- ordung von IO ^"15 1.

Table 1. Amplifikatioπs- und Detektionsprimer für die DNA-Amplifikation von IS6110 mittels PCR.

Oligodeoxynukleotid Sequenz (5'→3')" Lokalis. T, m auf (°C) c IS6110 ^h

51 accgcatcgaatgcatgtctcgggtAAGGCGTACTCGACC 970-984 41.7

52 cgattccgctccagacttctcggGTGTACTGAGATCCCCT 1025-1011 39.3

B1B AGCGCCGCTTCGGAC 769-783 55.1

B2B TCGATGTGTACTGAGATCCCCT 1032-1011 54.7

PRI TMR-CCCCTATCCGTATGGTGG 1015-998 52.0

PR3 TMR-CCCCTATCCGTATGGTGGATAACGTCTTTC 1015-986 66.4

HS1 TMR-gacattgttcgtcggccgc

HS3 TMR-tgctagagatctctaagttataacacatcaatgtcaa

^* Kleinbuchstaben = Zur Targetsequenz IS6110 nicht komplementäre Basen. ^b Bindungsstelle auf der Targetsequenz IS6110. ^c Schmelzpunkt der jeweiligen Targetsequenz bei Konzentrationen von 1 nM DNA und 50 mM Salz.