Die Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zur isoelektrischen Trennung von Teilchen, deren Ladungseigen¬ schaften vom pH-Wert einer Fuhrungsflussigkeit abhängen, insbesondere zur Trennung ampholytischer suspendierter Teilchen, Kolloide oder biologischer Zellen. Die Erfindung betrifft insbesondere die Trennung derartiger Teilchen aus einer Führungsflüssigkeitströmung.

Aus der Molekularbiologie, Biochemie, Medizin und Biotech¬ nologie sind zahlreiche Trenntechniken bekannt, deren Funktion auf Ladungsunterschieden von Molekülen innerhalb einer zu trennenden Substanz beruht. Bei zwitterionischen Verbindungen (sogenannte Ampholyte oder ampholytische Moleküle) hängt die Molekülladung vom pH-Wert der Umgebungslösung ab. Der iso¬ elektrische Punkt (im folgenden: IP) einer Verbindung ist der pH-Wert, bei dem die Nettoladung der amphoterischen Moleküle gleich null ist. Die Ladung des Moleküls ist bei einem pH-Wert kleiner als dem IP positiv bzw. im entgegengesetzten Fall negativ.

Bei der isoelektrischen Fokussierung (im folgenden IEF) werden Proteine mit unterschiedlichen IP's unter Verwendung räum¬ licher pH-Gradienten entlang einer Trennstrecke getrennt (s. R. A. M. Osher et al. in "The Dynamics of Electrophoresis" (Hrsg. B. J. Radola VCH, Weinheim, 1992, S. 163-231)) . Die IEF wird beispielsweise unter Verwendung poröser Gelmatrizen oder für analytische Trennungen geringster Probenmengen unter Verwendung dünner Kapillaren als sogenannte cIEF (s. F. Foret

et al. "Capillary Electrophoresis" , in "Advances in Electro- phoresis", Band III (Hrsg. A. Chrambach et al. VCH, Weinheim, 273-347) ) ausgeführt.

Die herkömmliche IEF ist aus den folgenden Gründen nachteilig und in der Anwendbarkeit beschränkt. Die Rückgewinnung der getrennten Substanzen aus einem Trägermaterial, insbesondere für weitere Bearbeitungsschritte wie weitere Analysen, Medikamentanwendungen oder dergl . , erfordert aufwendige Prozeduren, durch die gegebenenfalls die getrennten Substanzen selbst modifiziert werden oder die zu Substanzverlusten führen. Der notwendige Einsatz von Zusatzstoffen zur Bildung eines möglichst breit und linear geformten pH-Gradienten führt zu Beschränkungen in Bezug auf die weitere Verwendbarkeit der aufgetrennten Proben. Die als Zusatzstoffe eingesetzten, sogenannten Carrier-Ampholyte sind eine chemisch sehr diverse Substanzmischung, die schwer von den getrennten Protein¬ fraktionen trennbar ist. Die cIEF ist darüber hinaus auf geringste Probenmengen beschränkt, die nicht gesondert auf¬ gefangen werden können und nicht von den Carrier-Ampholyten trennbar sind.

Speziell beim Einsatz von sogenannten IPG-Membranen zur Bildung des pH-Gradienten besteht das Problem darin, daß Proteine beim notwendigen Durchtritt durch eine solche Membran ein Milieu passieren müssen, dessen Ionenstärke sehr gering ist. Daher können empfindliche Proteine in diesem Bereich denaturieren oder ausfallen. Aus diesem Grunde werden bei der IEF an die Gleichmäßigkeit der Spannungsgradienten in der Trennstrecke höchste Anforderungen gestellt. Schließlich können bei der IEF Probleme in Form elektroosmotischer Erscheinungen in extremen pH-Bereichen auftreten, wobei sich beispielsweise das Trägermittel (Gel) stark aufheizt und verändert (Zerstörung des Gels) .

Zur Überwindung der genannten Nachteile wurden Systeme entwickelt, bei denen eine Ampholytentrennung unter Wirkung eines äußeren elektrischen Feldes unter Ausschluß modifizie¬ render Zusatzstoffe erzielt wird. Es ist beispielsweise ein Trennsystem bekannt, das nach der Methode der sogenannten elektrischen Feld-Fluß-Fraktionierung (eFFF) arbeitet (s. K.D. Caldwell et al. in "Science", Band 176, 1972, S. 296-298) . Bei diesem Trennsystem wird durch einen schmalen Kanal zwischen zwei ionenstromdurchlässigen Membranen ein kontinuierlicher Flüssigkeitsstrom geführt, in den die zu trennende Probe als schmale Bande eingespritzt wird. Äußere Elektroden, die über eine Umgebungsflüssigkeit mit dem Kanal in elektrischem Kontakt stehen, bewirken eine ladungsabhängig verschieden starke Retardierung der Proteinmoleküle im Flüssigkeitsstrom. Die Anwendung dieses Verfahrens ist jedoch auf Proteinmoleküle mit relativ weit auseinander liegenden IP's beschränkt. Außerdem konnte keine vollständige Proteintrennung erzielt werden. Eine Steuerung des pH-Werts des Flüssigkeitsstroms (und somit des Molekülladungszustands) erfolgt bei diesem bekannten Trenn¬ system nicht .

Das eFFF-System ist in der Praxis nicht anwendbar. Die Proben konnten zwar (unvollständig) getrennt werden. Jedoch wurde ein Auffangen der getrennten Fraktionen nicht realisiert. Außerdem treten inakzeptable hohe Trennzeiten auf . So lieferte eine Weiterentwicklung des oben erwähnten eFFF-Systems (L.F. Kesner et al . in "Analytical Chemistry" , Band 48, 1976, S. 1834-1839) selbst im Labormaßstab Analyse- oder Trennzeiten im Bereich mehrerer Stunden.

Ein von Lightfoot et al. ("Separation Science and Technology", Band 16, 1981, S. 619-656) beschriebenes, abgewandeltes eFFF-System verwendet eine zylindrische Kanalgeometrie. Dieses System zeigte ebenfalls für die Praxis inakzeptable Trenn¬ leistungen. Ferner ergab sich eine komplexe Abhängigkeit der Proteinretardierung von einer Vielzahl von Parametern, wie z. B. den verwendeten Pufferionen, der Probenmenge, der

Proteinsorte und Eigenschaften der Kanalwand. Ferner ist auch dieses bekannte System nicht für eine pH-Steuerung oder etwa zur Trennung von Proteinen mit unterschiedlichen IP's vor¬ gesehen.

Es besteht ein starkes Interesse an der Substanztrennung zur Herstellung hochreiner Substanzen über die Labordimension hinaus im industriellen Maßstab. Wegen der genannten Beschrän¬ kungen und Nachteile ist jedoch mit den genannten Systemen bislang keine kontinuierliche Substanztrennung mit einer für die Praxis ausreichenden Trennleistung und Trenngeschwindigkeit bekannt.

Aufgabe der Erfindung ist es, verbesserte Verfahren zur isoelektrischen Teilchentrennung anzugeben, die sich insbe¬ sondere durch eine erhöhte Trenngeschwindigkeit, eine erhöhte Zuverlässigkeit und einen erweiterten Einsatznereich in Bezug auf die trennbaren Teilchen und die eingesetzten Umgebungs¬ lösungsmittel auszeichnet. Aufgabe der Erfindung ist es ferner, entsprechende kontinuierliche isoelektrische Reinigungsver¬ fahren anzugeben. Die Aufgabe der Erfindung besteht auch darin, Vorrichtungen zur Implementierung der Verfahren zur Teilchentrennung und weitere Anwendungsmöglichkeiten anzugeben.

Die genannten Aufgaben werden durch Verfahren mit den Merk¬ malen entsprechend Patentanspruch 1 bzw. mit Vorrichtungen mit den Merkmalen entsprechend Patentanspruch 12 gelöst. Vorteil¬ hafte Ausführungsformen der Erfindung ergeben εich aus den abhängigen Ansprüchen.

Die erfindungsgemäße Trenntechnik basiert auf der Idee, in einer Führungsflüssigkeit, in der die zu trennenden Teilchen elektrischen Feldkräften ausgesetzt sind, eine pH-Wert¬ steuerung oder -einstellung vorzunehmen, so daß alle Teilchen¬ arten mit einer Nettoladung eine ladungsabhängige Bewegung ausführen und die übrigen, im wesentlichen neutralen Teilchen keine Änderung ihres Bewegungszustandes erfahren, wobei die

ladungsabhängig bewegten Teilchen zu Auffangmitteln (Auffang¬ einrichtung) bewegt werden. An den Auffangmitteln werden die Teilchen zumindest zeitweilig festgehalten. Das Festhalten umfaßt ein Fixieren auf der Oberfläche oder im Volumen der Auffangmittel . Die Dauer der Fixierung wird durch die Trenn¬ bedingungen, insbesondere eine zeitliche Modulation der elektrischen Feldkräfte, einer Veränderung des pH-Wertes die Struktur der Auffangmittel und/oder eine relative Bewegung zwischen den Auffangmitteln und der Fuhrungsflussigkeit bestimmt.

Ein wesentlicher Unterschied gegenüber der oben beschriebenen eFFF-Technik besteht somit darin, daß die Teilchen nicht ladungsabhängig verschieden retardiert werden, sondern daß durch die pH-Wertsteuerung in der Führungsflüssigkeit eine Bedingung eingestellt wird, mit der festgelegt wird, welche Teilchenart unter Wirkung eines äußeren elektrischen Feldes in einen zumindest zeitweilig fixierten Zustand bewegt und ggf. wieder freigegeben wird. Im Unterschied zur eFFF-Technik wird die erfindungsgemäße isoelektrische Trennung daher die pH-ge¬ steuerte Elektroretentions-Chromatographie genannt. Die Auf- fangmittel wirken als echte Rückhaltemittel. Es wird somit ein Verfahren zur inversen isoelektrischen Teilchentrennung angegeben, bei dem Teilchen mit pH-Wert abhängiger Ladung in einer Führungsflüssigkeit an einem Auffangmittel vorbeigeführt werden und der pH-Wert der Führungsflüssigkeit so eingestellt bzw. modifiziert wird, daß nur die ungeladenen Teilchen in der Führungsflüssigkeit verbleiben, während die geladenen Teilchen durch ein elektrisches Feld gegen das Auffangmittel bewegt und somit zumindest temporär pH-abhängig fixiert werden.

Die erfindungsgemäß induzierte Bewegungsänderung der vorbe¬ stimmten Teilchenart ist so auf die Auffangmittel gerichtet, daß sich die vorbestimmte, zu trennende Teilchenart an oder hinter den Auffangmitteln anordnet oder sammelt. Die Auffang¬ mittel werden beispielsweise durch eine Auffanganordnung gebildet, die zwischen Elektrodenmitteln zur Erzeugung des

äußeren elektrischen Feldes und der Führungsflüssigkeit ange¬ ordnet ist. Es ist möglich, das Auffangmittel in Bezug auf die Führungsflüssigkeit zu bewegen.

Die Auffanganordnung ist vorzugsweise substanzabhängig teil¬ durchlässig. Die Teildurchlässigkeit kann zum Beispiel bedeuten, daß die Auffanganordnung für die Moleküle der Führungsflüssigkeit bzw. für in der Führungsflüssigkeit gelöste Ionen durchlässig, für die abzutrennende Substanz oder Teilchenart jedoch undurchlässig ist (Barrierewirkung) . Es kann auch vorgesehen sein, daß die Teildurchlässigkeit so eingerichtet ist, daß ein Teil der abzutrennenden Teilchenart mit kleineren Teilchengrößen durchgelassen und der Rest der abzutrennenden Teilchen mit größeren Teilchengrößen nicht durchgelassen wird. Die Auffanganordnung stellt vorzugsweise eine Begrenzung der Führungsflüssigkei mic den zu trennenden Teilchen dar. Außerhalb der Auffanganordnung sind in einer Umgebungslösung mit einstellbarem pH-Wert die Elektrodenmittel zur Bildung des elektrischen Feldes vorgesehen.

Die Erfindung kann mit einer ruhenden oder mit einer strömen¬ den Führungsflüssigkeit realisiert werden. In beiden Fällen bildet die Auffanganordnung ein Kompartiment oder ein Gefäß, das mindestens eine Öffnung zur Zufuhr bzw. Abfuhr der zu trennenden Probe besitzt.

Die Trennwirkung ist besonders gut und schnell, wenn der Verschiebeweg der Teilchen vom Probenort in der (ggf. tangential zu den angrenzenden Auffangmitteln strömen¬ den) Führungsflüssigkeit zu den Auffangmitteln möglichst klein gehalten wird. Die Auffanganordnung besitzt vorzugsweise charakteristische Dimensionen, die in Strömungsrichtung der Fuhrungsflussigkeit wesentlich größer als der Verschiebeweg sind. Der Verschiebeweg bzw. die Innenmaße der Komparti- mente sind beispielsweise in der Größenordnung von mm oder geringer.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist als Auffang¬ anordnung mindestens ein längliches, hohles Element (z. B. rohrförmig) vorgesehen, das eine teildurchlässige oder poröse Wandung besitzt und von der Führungsflüssigkeit mit der zu trennenden Teilchenprobe durchströmt wird. Es sind jedoch auch Auffanganordnungen mit anderen Gestalten, insbesondere mit nicht-kreisrunden, sondern eckigen Querschnitten möglich. Gemäß einer besonders vorteilhaften und bevorzugten Ausfüh¬ rungsform besteht die Auffanganordnung aus mindestens einer geraden oder gekrümmten Hohlfaser mit einer zumindest in Teilbereichen teildurchlässigen Wandung.

Die erfindungsgemäße isoelektrische Trennung ist mit ampho- lytischen Molekülen oder allen anderen synthetischen oder biologischen Teilchen (insbesondere Zellen oder Viren) reali¬ sierbar, die entsprechende elektrische Eigenschaften wie ampholytische Moleküle, insbesondere eine pH-Abhängigkeit der Nettoladung oder der Ladungsdichte von der Umgebung, aufweisen.

Je nach Anwendungsfall kann das Ziel der erfindungsgemäßen isoelektrischen Trennung darauf gerichtet sein, die vorbe¬ stimmte Teilchenart, die eine ladungsabhängige Bewegungs¬ änderung im elektrischen Feld erfährt, oder die restlichen Teilchen ohne Änderung des Bewegungszustandes zu gewinnen.

Eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur isoelektrischen Teilchen¬ trennung enthält Elektrodenmittel zur Bildung eines elek¬ trischen Feldes in einer Führungsflüssigkeit mit den zu trennenden Teilchen und pH-Einstellmittel, die zur Steuerung oder Einstellung des pH-Werts in der Führungsflüssigkeit eingerichtet sind. Es sind ferner Auffangmittel zwischen den Elektrodenmitteln und der Führungsflüssigkeit vorgesehen, die neben einer Sammlungsfunktion für eine abzutrennende Teilchen¬ art eine Abgrenzungsfunktion gegenüber einer Umgebungslösung mit einstellbarem pH-Wert besitzt. Die Auffangmittel sind mindestens für Ionen, die in der Umgebungslösung und der Führungsflüssigkeit gelöst sind, durchlässig, so daß durch

Einstellung des pH-Wertes der Umgebungslösung auch der pH-Wert der Führungsflüssigkeit einstellbar oder steuerbar ist.

Bevorzugte Anwendungsformen der Erfindung sind alle Trenn¬ vorgänge an Probengemischen, die mindestens eine Teilchenart mit ampholytischen Eigenschaften enthalten, und/oder Unter¬ suchungen von bestimmten Substanzen zur Ermittlung des iso¬ elektrischen Punktes, von Titrationskurven oder des Aggrega¬ tionsverhaltens. Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist auch zur Verringerung der Ionenstärke der Führungsflüssigkeit im Bereich der pH-gesteuerten Elektrodialyse einsetzbar.

Die erfindungsgemäße isoelektrische Teilchentrennung besitzt die folgenden Vorteile.

Die Fraktionierung oder Trennung erfolgt ohne Zusatzsubstanzen, insbesondere ohne Carrier-Ampholyte oder andere Mittel, etwa zur Erzeuung eines pH-Gradienten. Da kein pH-Gradient erzeugt wird, ergibt sich eine wesentliche Erleichterung einer präparativen Verfahrensweise im Durchflußsystem bzw. eine erleichterte Sammlung der gewünschten (ggf. aller) getrennten Fraktionen. Die getrennten oder gereinigten Fraktionen stehen nach der Trennung für weitere Manipulationen zur Verfügung, ohne gegenüber der ursprünglichen Form verändert zu sein. Die getrennten Fraktionen befinden sich insbesondere immer in dem¬ selben Lösungsmittel mit gleicher, ggf. geringfügig verringer¬ ter oder sogar höherer Konzentration. Das erfindungsgemäße System ist sowohl für die diskontinuierliche als auch für die kontinuierliche Trennung von Teilchen in Abhängigkeit von deren IP's einsetzbar und automatisierbar. Es sind sowohl räumliche als auch durch Variation des pH-Wertes während des Trennvorgangs zeitliche Fraktionierungen möglich. Es ergibt sich eine hohe Trenngeschwindigkeit im Bereich von Minuten, wie es im einzelnen unten beispielhaft angegeben wird. Das Trennsystem ermöglicht eine Anordnung der Elektrodenmittel auf engstem Raum, so daß im Vergleich zu herkömmlichen Trenn¬ verfahren mit verhältnismäßig geringen Spannungen genügend

große Feldstärken erzielbar sind. Damit wird der Energie¬ verbrauch erfindungsgemäßer Systeme minimiert und eine Schonung temperaturempfindlicher Proben erzielt.

Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung von Ausführungsformen unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen ersichtlich. Es zeigen:

Fig. 1: eine Prinzipdarstellung zur Erläuterung der bei der erfindungsgemäßen Trennung auftretenden Kräfte;

Fig. 2: eine Kurvendarstellung zur Illustration einer erfindungsgemäßen Proteintrennung;

Fig. 3: eine Kurvendarstellung zur Illustration einer weiteren erfindungsgemäßen Proteintrennung;

Fig. 4: eine Kurvendarstellung einer Modellrechnung zur Illustration der erfindungsgemäß erzielbaren Trennschärfe;

Fig. 5: eine Kurvendarstellung zur Illustration einer weiteren erfindungsgemäßen Proteintrennung;

Fig. 6: eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Trennvorrichtung;

Fign. 7, 8 und 9: schematische Darstellungen zu modifizierten Hohlfaseranordnungen;

Fig. 10 eine schematische Darstellung einer kombinierten Trenn- und Konzentrierungsvorrichtung;

Fig. 11: eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Multikompartimentsystems; und

Fig. 12: eine schematische Darstellung einer modifizierten Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Trennvor¬ richtung.

Bei der folgenden Erläuterung wird beispielhaft auf eine Realisierung der Erfindung Bezug genommen, bei der die Auffangmittel durch eine Hohlfaser gebildet werden. Die erläuterten Prinzipien sind jedoch in gleicher Weise auch bei anderen geometrischen Formen der Auffangmittel realisierbar. Ferner ist die Erfindung nicht auf die beispielhaft erwähnte Proteintrennung bschränkt, sondern mit beliebigen Teilchen oder Partikeln mit ampholytischen Eigenschaften implementierbar

Entsprechend einer Ausführungsform der Erfindung (Einzelheiten siehe unten, Figur 6) wird ein Reaktionsraum, der die Um¬ gebungslösung, mindestens zwei Elektroden und pH-Einstell¬ mittel enthält, von einer dünnen Hohlfaser durchsetzt. Die Elektroden sind dazu eingerichtet, mit einer vorbestimmten Gleichspannung beaufschlagt zu werden. Die Wandung der Hohlfaser ist zur Bildung der Teildurchlässigkeit mit einer Vielzahl von Poren definierter Größe versehen. Die Porengröße ist derart gewählt, daß das Lösungsmittel (zum Beispiel Wasser) und den elektrischen Strom transportierende Ionen durchge¬ lassen werden, jedoch die zu trennenden Moleküle nicht durch die Wandung hindurchtreten können. Die Hohlfaser kann bei¬ spielsweise einen Innendurchmesser (oder lichte Weite oder sogenanntes Lumen) im Bereich von Millimeter bis Mikrometer besitzen. Die pH-Einstellmittel sind dazu vorgesehen, den pH-Wert der Umgebungslösung mit einem an sich bekannten, herkömmlichen Verfahren, z. B. elektrisch oder titratorisch, zu steuern oder einzustellen.

Die zu trennende Probe wird mit einer zweiten Flüssigkeit, der Führungsflüssigkeit, durch das Lumen der Hohlfaser geführt. Die Führungsflüssigkeit besitzt vorzugsweise den¬ selben pH-Wert oder dieselbe Ionenzusammensetzung wie die Umgebungslösung. Hierzu kann die Führungsflüssigkeit beispiels-

weise dem Reaktionssraum entnommen werden. Es ist jedoch alternativ auch möglich, daß die Führungsflüssigkeit einen anderen pH-Wert besitzt. Am stromaufwärts gelegenen Ende der Hohlfaser sind Mittel zur Einführung der zu trennenden Probe in die Führungsflüssigkeit und am stromabwärts gelegenen Ende der Hohlfaser Detektor- und/oder Sammlermittel vorgesehen. Im folgenden werden die bei der erfindungsgemäßen Trennung auf¬ tretenden Kräfte unter Bezug auf Fig. 1 erläutert.

Fig. 1 zeigt in schematischer Schnittdarstellung einen Ab¬ schnitt einer Hohlfaser 11, die von der Führungsflüssigkeit mit einem bestimmten pH-Wert und der zu trennenden Probe 13a, 13b und 13c durchströmt wird. Die Hohlfaser 11 ist zwischen zwei Gleichspannungselektroden 12a, 12b angeordnet, so daß die Führungsflüssigkeit mit der Probe ein elektrisches Feld durch¬ strömt .

Entsprechend dem pH-Wert der Führungsflüssigkeit umfaßt die Probe negativ geladene Moleküle 13a, positiv geladene Moleküle 13b und ungeladene Moleküle 13. Unter der Wirkung der elek¬ trischen Feldkräfte werden die geladenen Moleküle an den Rand der Führungsflüssigkeit bewegt. Am Rand des Flüssigkeits¬ stromes, d. h. an der als Auffangmittel wirkenden Hohlfaser werden die geladenen Moleküle vom Weitertransport mit der Führungsflüssigkeit ausgeschlossen und somit örtlich fixiert. Die örtliche Fixierung kann generell mit einem genügend starken elektrischen Feld, das eine Komponente senkrecht zur Strömungsrichtung der Fuhrungsflussigkeit (v^) besitzt, und eine haftungsfordernde (z. B. rauhe oder poröse) Innenober¬ fläche der Hohlfaser erzielt werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Geometrie der Hohl- faser und die Strömungsgeschwindigkeit der Führungsflüssigkeit jedoch so ausgewählt, daß das in Fig. 1 illustrierte Strömungs- profil mit einer im wesentlichen parabelförmigen Gestalt gebildet wird. Ein solches Strömungsprofil ist dadurch gekenn¬ zeichnet, daß die Strömungsgeschwindigkeit in der Mitte der Führungsflüssigkeit, d. h. in der Mitte der Hohlfaser am

größten ist und zum Rand hin abnimmt. Ein solches Strömungs¬ profil wird beispielsweise bei Erzeugung einer laminaren Führungsflüssigkeitsströmung durch die Hohlfaser erzielt. In unmittelbarer Nachbarschaft zur Wandung der Hohlfaser ist die Strömungsgeschwindigkeit gleich null. In diesem Fall werden die Moleküle vollständig vom Weitertransport im Führungs- flüssigkeitsstrom ausgeschlossen (Elektroretention) .

Ein Molekül, dessen IP mit dem in der Führungsflüssigkeit herrschenden pH-Wert übereinstimmt, besitzt keine elektrische Nettoladung und bleibt daher vom elektrischen Feld unbeeinflußt Somit wird in Abhängigkeit vom pH-Wert eine bestimmte Molekül- art durch die Hohlfaser zum Beispiel zu einem Detektor oder Sammler geführt, während die geladenen Teilchen an der Hohl- faserwandung zurückgehalten werden.

Die Fign. 2 und 3 zeigen experimentelle Ergebnise zur Proteintrennung. Die Kurvendarstellungen zeigen Absorptions- werte, die mit einem Detektor am stromabwärts gelegenen Ende der Hohlfaser in Abhängigkeit von der Zeit aufgenommen werden. In Fig. 2 wird bei Punkt 1 der Führungsflüssigkeit eine definierte Proteinmenge zugeführt und ohne elektrische Feldeinwirkung im Zeitverlauf (Maximum bei rd. 5 min) detek- tiert. Bei Punkt 2 wird erneut eine Proteinmenge der Führungs¬ flüssigkeit zugeführt, jetzt aber mit einem elektrischen Feldeinfluß. Es zeigt sich keine (bzw. eine meßsystembedingt geringe negative) Absorptionsänderung, da das Protein zurück¬ gehalten wird. Erst nach Abschalten des elektrischen Feldes (Punkt 3) wird das zurückgehaltene Protein dem Trägerstrom wieder zugeführt und somit detektiert (Maximum bei rd. 20 min) .

Fig. 3 zeigt einen entsprechenden Versuch, wobei hier jedoch das Protein einen IP besitzt, der mit dem pH-Wert der Um¬ gebungslösung bzw. der Führungsflüssigkeit übereinstimmt. Zwischen den Punkten 1 und 2 (ohne Feldeinfluß) bzw. 2 und 3 (mit Feldeinfluß) zeigt sich jetzt, daß das Protein wegen der fehlenden Nettoladung unbeeinflußt bleibt und unverändert den

Detektor erreicht. Bei Abschalten des Feldes (Punkt 3) wird keine Absorption des Proteins detektiert, sondern nur noch Verunreinigungen, die in der Ausgangsprobe enthalten sind. Dies zeigt den Reinigungseffekt, der durch den Proteindurch¬ lauf durch das elektrische Feld, in dessen Verlauf die Verun¬ reinigungen aus der Probe gezogen wurden, erzielt wurde.

Neben der Abtrennung von Proteinen mit einem vom pH-Wert abweichenden IP gemäß Fig. 2 oder der Abtrennung von Verun¬ reinigungen gemäß Fig. 3 sind folgende Varianten der erfindungs- gemäßen Verfahrensweisen möglich.

Es ist möglich, den pH-Wert der Umgebungslösung und somit der Führungsflüssigkeit zeitlich zu verändern. Wird die zeitliche Variation auf die Hohlfaserlänge bzw. die Strömungsgeschwin¬ digkeit der Fuhrungsflussigkeit abgestimmt, so kann bei kon¬ tinuierlicher Feldeinwirkung durch die Variation des pH-Wertes eine zeitlich versetzte Trennung von Komponenten aus der Probe in der Reihenfolge ihrer IP's erfolgen. Die kontrollierte, trägerfreie pH-Variation läßt sich über einen weiten Bereich mit einer Genauigkeit von rd. 0,1 bis zu 0,01 pH-Einheiten mit einem pH-Staten erzielen. Bei dieser zeitlichen Fraktionierung wird somit der pH-Wert in Abhängigkeit von der Zeit derart vergrößert oder verkleinert, daß der pH-Wert jeweils für die Dauer eines Zeitbereiches einem IP einer Komponente der Probe entspricht. Der Zeitbereich ist so gewählt, daß eine voll¬ ständige Trennung der jeweiligen Komponente aus der Probe erfolgen kann und eine räumliche Trennung der Auftragung auf der Innenwandung der Hohlfaser von der jeweils nächsten Komponente realisiert wird (Fraktionierung eines Substanz- gemisches) .

Neben der pH-Variation zur Ladungsvariation der Moleküle bzw. Teilchen ist es ferner möglich, anstelle der oben genannten Gleichspannung zwischen den Elektroden eine zeitliche und/oder räumliche Modulation des elektrischen Feldes vorzusehen. Im Ergebnis läßt sich wiederum die Trennung der Probe optimieren.

Eine weitere Alternative besteht in der Variation der hydro¬ dynamischen Strömung durch die Hohlfaser (Variation der Strömungsgeschwindigkeit) . So ist es möglich, die Führungs- flüssigkeitsströmung zeitlich zu begrenzen oder anzuhalten, wenn sich die Probe im Hohlfaserelement unter Feldeinwirkung befindet .

Eine Variation eines erfindungsge äßen Trenn- oder Reinigungs¬ verfahrens wird bei Ausbildung einer Teildurchlässigkeit der Hohlfaser (Wahl der Porengröße) derart ermöglicht, daß auch ein Durchtritt zumindest eines Teils der gelösten, voneinander zu trennenden Moleküle möglich is . In der Umgebungslösung der Führungsflüssigkeit wird ein pH-Wert eingestellt, der dem IP der zu isolierenden Komponente entspricht. Nach Einspritzung der Probe als schmale Bande oder bei kontinuierlicher Proben¬ zuführung werden alle Komponenten, deren IP nicht dem einge¬ stellten pH-Wert entspricht, aus dem Hohlfaserlumen durch die Wandporen in die Umgebungslösung verschoben. Die in der Hohl¬ faser verbleibende, nun gereinigte Komponente kann mit dem Führungsflüssigkeitstrom hinter der Trennstrecke aufgefangen werden. Die Konzentration der gereinigten Komponente nimmt lediglich durch die Diffusion durch die Hohlfaserwand gering¬ fügig ab, kann jedoch über eine nachgeschaltete Aufkonzen- trierungseinheit (s. Fig. 10) wieder erhöht werden.

Fig. 4 zeigt das Ergebnis einer Modellrechnung zur Illustration der Wirkung des elektrischen Feldes auf Moleküle, deren IP nicht mit dem pH-Wert der Führungsflüssigkeit übereinstimmt. Parameter der graphischen Darstellung sind die Zeit, die relative Konzentrationsänderung c/c ₀ und der Betrag oder die Absolutabweichung zwischen dem IP und dem pH-Wert (abs(pH-IP)) . Es zeigt sich, daß bereits bei geringfügigen Abweichungen des IP vom pH-Wert die Konzentration der jeweiligen Komponente aufgrund der starken elektrischen Feldwirkung in kurzer Zeit auf null abnimmt.

Bei der kontinuierlichen Verfahrensweise wird die sich mit den abgetrennten Komponenten anreichernde Umgebungslösung simultan durch frische Umgebungslösung ersetzt.

Fig. 5 zeigt die experimentelle Bestätigung der hohen Trennungsgeschwindigkeit am Beispiel mit einer für die Komponenten durchlässigen Hohlfaser. Ein kontinuierliche Probestrom wird durch die Hohlfaser geführt und an deren stromabwärts gelegenen Ende noch ohne Feldeinfluß detektiert (Punkt 1 bis Punkt 2) . Nach Anlegen des elektrischen Feldes (Punkt 2) wird das Protein mit einer geringen Ansprechzeit (Größenordnung: Minute) vollständig aus der Hohlfaser entfernt (Rückgang der Absorption) , da der pH-Wert der Umgebungslösung nicht dem IP des Proteins entspricht.

Fig. 6 zeigt schematisch den Aufbau einer erfindungsgemäßen Trennvorrichtung zur IP-abhängigen Trennung ampholytischer Moleküle. In einem Reaktionsraum 64 sind die Hohlfaser 61 und zwei Elektroden 62a, 62b angeordnet. Die Hohlfaser und die Elektroden verlaufen parallel zueinander, wobei sich die Hohlfaser zwischen den Elektroden befindet. Der Reaktionsraum 64 ist mit der Umgebungslösung 63 gefüllt und mit einem Reservoir 66 verbunden. Mit der pH-Einsteilvorrichtung 67 wird der pH-Wert der Umgebungslösung eingestellt. Wegen der Teil¬ durchlässigkeit der Hohlfaser folgt der pH-Wert der Führungs- flüssigkeit dem pH-Wert der Umgebungslösung. Zur Gewähr¬ leistung der räumlichen pH-Konstanz ist mindestens ein Rühr¬ mittel 65 vorgesehen. Am stromaufwärts gelegenen Ende der Hohlfaser 61 ist eine Pumpe 68 zur Förderung der Führungs¬ flüssigkeit 69 vorgesehen. Die Pumpe 68 ist über eine Ver¬ bindung 610 (z. B. Verbindungsschlauch) mit dem Reaktionsraum 64 und/oder mit einem separaten Flüssigkeitsreservoir 611 verbunden. Alternativ zu der Pumpe 68 zum Führungsflüssigkeit- Vorschub kann auch am stromabwärts gelegenen Ende der Hohl- faser eine Saugvorrichtung vorgesehen sein, die für die erforderliche Bewegung der Führungsflüssigkeit in Strömungs- richtung sorgt.

Die Zufuhr der Probe 612 in den Führungsflüssigkeitstrom als schmale Bande erfolgt über einen Dreiwege-Einspritzblock 613, der mit einem Dosiermittel (zum Beispiel Hamilton-Spritze 614) ausgestattet ist. Es können jedoch auch Mikrokanäle in der Hohlfaserwand zur Probenzufuhr vorgesehen sein.

Am stromabwärts gelegenen Ende der Hohlfaser befindet sich eine Detektoreinheit 615 zur Identifizierung der sich nach Durchtritt durch die Hohlfaser im Lumen befindlichen Substanzen sowie ein Dreiwegehahn 616 zur kontrollierten Überführung von Flüssigkeit aus der Hohlfaser in einen Fraktionssammler 617. Die Detektoreinheit 615 kann z.B. für eine optisch-spektros¬ kopische Messung eingerichtet sein. Besteht die Hohlfaser aus UV-durchlässigem Glas, so können Proteine mit einer Absorption im UV-Bereich direkt in der Hohlfaser detektiert werden.

Teilchen mit einem vom pH-Wert abweichenden IP werden an der Faserinnenwand fixiert. Teilchen mit einem IP entsprechend dem pH-Wert durchlaufen die Faser ungehindert. Durch Variation des pH-Wertes während der Trennung lassen sichg einzelne Fraktionen trennen, die dann in Folge aus dem Faservolumen gespült werden.

Die Vorrichtung gemäß Fig. 6 ist je nach Gestaltung der Hohlfaser sowohl als Trennvorrichtung als auch als Reinigungs- vorrichtung gemäß den oben erläuterten Verfahrensweisen ein¬ setzbar. Es ist möglich, den Reaktionsraum zur Aufnahme mehrerer Umgebungslösungen zu unterteilen, die sich in ihrem pH-Wert unterscheiden. Die Elektroden werden dann entsprechend unterbrochen und getrennt ansteuerbar. Es können mehrere Vorrichtungen gemäß Fig. 6 als Kaskade angeordnet werden.

Bei der erfindungsgemäßen Gestaltung der Auffanganordnung als Hohlfaser besitzt die Führungsflüssigkeit einen Strömungsquerschnitt, der wesentlich geringer als die Länge der Trennstrecke ist. Damit können die Elektroden, zwischen denen sich die Hohlfaser befindet, mit einem geringen Abstand

angeordnet werden, so daß geringe Spannungen zur Erzeugung einer hohen Feldstärke ausreichen. Übliche Trennanordnungen können beispielsweise mit einer Spannung im Bereich von 1 bis 10 V betrieben werden. Bei derart geringen Spannungen kann eine übermäßige Wärmeproduktion und die Erzeugung von Elektrolyseprodukten vermieden werden, so daß hitzeempfindliche Proben geschont werden. Im Vergleich zu der eingangs erläuterten cIFF-Technik wird die Strecke, über die ein elektrisches Feld angelegt wird, erfindungsgemäß um rd. drei Größenordnungen verringert .

Weitere Vorteile der Erfindung liegen in den geringen Analyse¬ oder Trennzeiten (rd. 10 Minuten oder weniger) . Der Möglichkeit zur automatisierten und permanenten Detektierbarkeit im Durch¬ flußsystem sowie der leichten Handhabbarkeit mit herkömmlichen, aufwendigen Gel- oder IPG-IEF-Techniken. Ferner lassen sich erfindungsgemäß abgetrennte Komponente zeitweilig festhalten und nach vorbestimmter Feld- oder pH-Änderung wieder freigeben.

Eine weitere Variante der erfindungsgemäßen isoelektrischen Trennung besteht in einer Konzentrierungsprozedur. Eine verdünnte Lösung mit einer oder mehreren Komponenten wird kontinuierlich durch die Hohlfaser geströmt und dem Feld¬ einfluß ausgesetzt. Die nicht-isoelektrischen Komponenten werden an der Hohl aserwand räumlich fixiert. Nach der Durch¬ strömung wird das Feld abgeschaltet und die Hohlfaser mit einem Lösungsmittelvolumen (Spülvolumen) durchströmt, das kleiner als Gesamtvolumen der vorher verdünnten Lösung ist. Das Spülvolumen löst die an der Wand fixierten Moleküle, die somit gleichzeitig freigegeben werden und das Faservolumen verlassen, worauf sich eine resultierende Lösung höherer Konzentration als der ursprünglichen verdünnten Lösung ergibt.

Eine weitere Anwendung besteht in der Beschleunigung von Dialyseprozessen. Besitzt die Umgebungslösung eine geringere Ionenstärke (Ionenkonzentration) als die Führungsflüssigkeit,

so werden Ionen aus der Hohlfaser diffundiert. Der Vorgang kann durch das elektrische Feld stark beschleunigt werden.

Mit der dargestellten Vorrichtung läßt sich aber auch eine Substanz hinsichtlich ihrer isoelektrischen Parameter charakterisieren. Dies ist insbesondere bei der Charakte¬ risierung von Isoenzymen von Interesse.

Im folgenden werden Modifizierungen der Vorrichtung gemäß Fig. 6 unter Bezug auf die Fign. 7 bis 12 erläutert.

Die Fig. 7 zeigt ein Ausführungsbeispiel, bei dem im Reaktionsraum 72 eine gekrümmte Hohlfaser 71 angeordnet ist. Die Hohlfaser besitzt eine spiralförmige Geometrie. Die Elektroden 73a, 73b sind an die Geometrie der Hohlfaser angepaßt. Beim dargestellten Beispiel sind die Elektroden 73 Ringelektroden, mit denen der Spiralquerschnitt gerade abgedeckt wird. Die spiralförmige Fasergestaltung erlaubt es, größere Probenmengen simultan zu trennen, da eine größere Probenmenge im Wandbereich, in dem die Strömungsgeschwindig¬ keit null ist, (s. Fig. 1) festgehalten werden kann. Im mikro- präparativen Maßstab ist hierdurch auch eine kontinuierliche Probenzufuhr möglich.

Fig. 8 zeigt ebenfalls eine spiralförmig gestaltete Hohlfaser 81, die auf eine zylindrisch geformte Elektrode 82a auf¬ gewickelt ist. Die Gegenelektrode 82b (gepunktet dargestellt) kann z. B. als Hohlzylinder über die Anordnung geschoben werden. Der zwischen den Elektroden verbleibende Spalt kann von der Umgebungslösung durchströmt werden. Die Anordnung gemäß Fig. 8 ist durch hohe Lade- oder Trennkapazitäten bei gleichzeitig geringem Platzbedarf und niedrigen Spannungen gekennzeichnet.

Die bisher als separate Bauteile beschriebenen Elektroden- und Auffangmittel können gemäß Fig. 9 auch miteinander verbunden werden. Fig. 9 zeigt den Querschnitt einer Hohlfaser

91 mit Elektroden 92a, 92b, die als dünne Schicht auf die Hohlfaseraußenwand aufgebracht worden sind. Damit lassen sich noch geringere Spannungen zum Erzielen hoher Feldstärken einstellen. Die Umgebungslösung beeinflußt das Hohlfaserinnere durch die frei gebliebenen Bereiche der Hohlfaser. Es ist jedoch auch möglich, das erfindungsgemäße System ohne die Umgebungslösung zu betreiben.

Fig. 10 zeigt die Kombination einer Trennvorrichtung (Reaktions- raum 101 mit Hohlfaser und Elektroden 102a, 102b) mit einer Aufkonzentrierungsvorrichtung 104. Diese kombinierte Anordnung wird derart betrieben, daß zunächst im Trennbereich eine erfindungsgemäße Fraktionierung eines Substanzgemisches erfolgt. In der Aufkonzentrierungsvorrichtung 104, deren Umgebungslösung 105 einen anderen pH-Wert als die Umgebungs¬ lösung 103 im Trennbereich besitzt, kann die gereinigte Fraktion mit den Elektroden 106a, 106b als schmale Bande fixiert und nach Abschalten des elektrischen Feldes an diesen Elektroden als konzentrierte Fraktion dem Fraktionssammler 107 zugeführt werden.

Das Multikompartimentsystem gemäß Fig. 11 realisiert ein Gegenstromprinzip, bei dem die Umgebungslösung 114 im jeweiligen Reaktionsraum in eine Strömungsbewegung versetzt wird. Die Strömungsrichtung ist vorzugsweise der Strömungs- richtung in der Hohlfaser 112 entgegengesetzt. Um eventuell an den Elektroden lila, 111b auftretende Elektrolyseprodukte aufzufangen, wird zwischen den Elektroden und der Hohlfaser 112 eine Membran 113a, 113b angebracht. Die Strömung der Umgebungslösung dient auch der pH-Stabilisierung im Reaktions¬ raum.

Erfindungsgemäß ist es nicht unbedingt erforderlich, daß die Führungsflüssigkeit eine Strömung aufweist. Die Führungs¬ flüssigkeit kann auch ruhen. Es ist auch möglich, das Auffang¬ mittel relativ zur Führungsflüssigkeit zu bewegen. Dies wird in Fig. 12 illustriert. Eine Kammer 123 ist mit einem Protein-

gemisch 121 gefüllt und wird durch stromdurchlässige Membranen 122 begrenzt. Die Kammer 123 wird in den pH-regulierten Bereich 124 gebracht. Unter Anlegung des elektrischen Feldes über die Elektroden 125a, 125b wandern einzelne Proteine nach dem erfindungsgemäßen Prinzip zu den Membranen 122. Die Membranen können mit beweglichen, proteinbindenden Zwischen¬ membranen versehen sein, die nach Belegung mit den getrennten Proteinen in Pfeilrichtung abgezogen werden. Es ist alternativ auch möglich, einen Elutionsstro in Pfeilrichtung vorzusehen, um die getrennten Proteine aus dem Membranbereich zu spülen.

Erfindungsgemäß kann eine Trennvorrichtung auch mit mehreren, kaskadenartig angeordneten Auffangmitteln oder mehreren hinter¬ einander oder parallel angeordneten Trennbereichen ausgerüstet sein. Die Auffangmittel können statt durch die beschriebene Hohlfaser auch durch beliebige poröse Membranen oder Lamellen gebildet werden, die entsprechende Kompartimente zur Aufnahme der Führungsflüssigkeit bilden, neben denen die Elektroden¬ mittel plaziert sind.

Die Teildurchlässigkeit des Auffangmittels (z. B. der Hohlfaser) kann über die Länge in Durchströmungsrichtung variieren, so daß abschnittsweise bestimmte Ionen der Führungsflüssigkeit und/oder Umgebungslösung und/oder nur bestimmte Moleküle durchgelassen werden.

Es ist ferner möglich, die Innenwandung der Hohlfaser durch chemische oder physikalische Methoden zu modifizieren, um die Wirkung des elektrischen Feldes zu verändern. Es ist möglich, die Hohlfaser innen mit Gelen, Mikropartikelsuspensionen oder Granulaten zu füllen oder auch im Reaktionsraum ein Gel vorzusehen. Es ist möglich, die Hohlfaser in einem bestimmten Abstand um eine beliebig geformte Elektrode zu wickeln und die Gegenelektrode an diese Geometrie anzupassen.

Die Auffangmittel können durch ein mehrfaseriges Array gebildet werden, das aus einer Vielzahl von Hohlfasern besteht,

die sämtlich mit der Führungsflüssigkeit durchströmt werden. Die Durchströmung erfolgt jedoch in den Fasern verschieden schnell, so daß substanzabhängig die Trenneffektivität beeinflußt werden kann.

Die mindestens zwei Elektroden können mit einer Gleichspannung oder Wechselspannung oder mit einem anderen, frei programmier¬ baren Spannungsverlauf beaufschlagt werden, so daß die Feld¬ stärke in der Führungsflüssigkeit entsprechend variiert wird. Dies erlaubt die Bildung vorbestimmter Trennmuster auf den Auffangmitteln.

Die Elektroden können zur Reduzierung ggf. auftretender elektrolytischer Reaktionen wie folgt modifizierte Oberflächen bzw. Materialien aufweisen. Die Elektroden können porös ausgeführt sein oder Beschichtungen (z. B. Gele, Spacer) tragen.

Die Auffangmittel können durch flächige Membranen umgrenzt werden, die ein Kompartiment für die Führungsflüssigkeit bilden. Das Kompartiment kann mit Hilfe weiterer Membranen unterteilt sein, die jeweils für die Aufnahme verschiedener Proteinfraktionen vorgesehen sind. Bei einer derartigen Anordnung kann die Zufuhr der zu trennenden Probe durch Ein¬ führung einer Membran realisiert werden, auf der die Probe adsorbiert ist.

Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäßen Trennvorrichtung besteht in ihrer Miniaturisierbarkeit. Es ist daher gemäß einer bevorzugten Ausführungsform vorgesehen, mindestens Teile der Elektroden durch elektronische Bauelemente wie Transistoren oder Dioden zu bilden und anzusteuern und die dreidimensionale Anordnung der Elektroden, Kanäle, Hohlfaser- halterungen und des Reaktionsraumes mit den Technologien der Halbleiterstrukturierung herzustellen.