Cberflächen des einzusetzenden Pflanzengewebes. Von diesem anfänglichen Schritt ist das weitere Gelingen der Tnkult jrnahme wesentlich abhängig. Verläuft diese Cberflächendes- infektion irigenϋgend und bleiben noch störende keimfähige -LkrOαrganismen am F-flar engewebe 5 haften, verursachen diese spätere .xisterilität, die nicht oder nur sci erig beseitigt werden kam. Ist anderseits die -tesinfektiαisteharidlurig zu stark, kam das Pflanzengewebe bis zur Letal i tat beschädigt werden. LbHctierweise werden zur De- jnfekti-rsbeharxO ng oxidatLve Sub¬ stanzen wie r C (Wasserstoffperoxid) oder Ot-l-(r-ypcx^α-rit)-]-orιen eingesetzt, wobei die Lösungen übHchsrveise wässerig sind. Die iΞxpositim der PΩarτzeπteile erfolgt in sterilen

10 Gefäßen mit den oxidativen Substanzen in Abhέrigigkeit von Art und Eigenschaften des Gewebes mit verschiedener E-iπ*arkungsd-j*uer. Anschließend wird rnehrmals mit sterilem Wasser nachge¬ spült, gegebenenfalls mit Nach- bzw. Zs-aschenspül-urigen z.B. mit Alkohol.

Die mit dieser konventionellen Desinfel ticrιsmethode erreichbaren -tesinfektionscμoten sind insbesondere im Hinblick auf einen tedriisch ökorxrr-Lschen Einsatz der πrcternen Ver-

^• ** 5 mehrungstec-nnik in großem L rfang iπrner zu gering rewesen. Hiebei ist cteutlich darauf hinzu¬ weisen, daß es sich nicht um Etehandlung von Pflanzengut handelt, das als Dauerfαrm, z.B. als Samenkörper, Getreide, Samen, Sparen u.dgl. vorliegt, sondern als gegen Eirifluß von Chemi¬ kalien und mechanische Dasintegraticriskräfte durchaus er fir liches, aktives, "lebendes" Gaebegut. 0 Es wjrden intensiv Wage gesucht, die Ü-erlebensrate des vorher desinfizierten explan- tierten F-ϊlaι-τzenga*e-jegutes signifikant anzuheben und damit die moderne Vermeh-runc tedriik wesentlich zu fordern.

Es sei an dieser Stelle weiters darauf hingewiesen, daß seit langem eine Behandlung von "hartem" Gut, also z.B. zur Fteinigung von Geräten aller Art mit stark haftenden Veruπreini-

25 gungen und später auch eine derartige Fteinigung von mechanisch wenig e pfirdLichen "harten" ROarizendauerfαrrnen wie Samen, Körnern usw. mit ULtraschall, gegebenenfall in Anwesenheit eines Desinfel tixismittels, bekamt geworden sind.

Dazu sei besonders auf DE-Al 4,306.645 und US-A 5,213.619 verwiesen, welche die Be¬ handlung und Fteinigung von technischen oder meciiz-i-τischen Artikeln wie rTLϋssigsauerstoff- 0 veπtilen, Zahnprothesen , Krieehenkl iiiiai i und Spra- prothesen sowie von botanischem, nicht mehr verιτehrungsfähigem ι terial, wie geLiυcknete Seπresblättern und Zimt unter Einsatz von Ultraschall beschreiben, wobei dort einerseits eine Kombination von Ultraschall und e--ektxischen Wschsel eldem und als Nted rn vea lichtete Fluide, wie Kohlendioxid, schwerere Edelgasen u.dgl. , welche bei E-iπwirkung von Ißtoschall einen Kavit-jtionseffekt ecπ Öglichen, 5 vorgesehen sind.

Es wurde nun gefunden, daß sich auch nicht in einer Dauerfαrm vαrliegenoes,

empfind-Liches Pflanzengewebegut, also "lebendes" Gut, mit Ultraschall behandeln läßt und daß urierviarteterweise trotz dieser eher aggressiven, πrechanischen Fteinigirigsnret ode die dadurch zu erwartende mec-h-rύsche Schädigung der Explaπtate sich in engen Grenzen hält und sich bei gleichzeitiger Anwesenheit eines Dssinfektdj-ri-jrnitΛjels, das neben seiner bioziden Wirkung auch Einfluß auf das Gewebe ausübt, ein syrergistischer Effekt einstellt, durch welchen sich die Desi fekticris- und Verrnehnjngsquσte signifikant steigern lassen.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Desinfektion von - nicht als Dauerfαrm - VOrliegenden Pflanzen, Pflanzeπteilen, FΗaπzengeweben und/oder FΩ^nzengewebe- teilen bzw. von deren Qjerflächen, welche für eine Vegetativ- bzw. vorgesehen sind, wobei die genannten Pflanzengewebe u.dgl. mit, -tesirtfektiorisπiLttel-Lösungen, welche oxidiereride Substanzen enthalten, in innigen Kontakt gebracht werden bzw. in dieselben für eine vorgegebene Verweilzeit eingebracht bzw. eingetaucht werden, wonach unter Ein¬ haltung von sterilen Etedingungen die Schritte Spülen, Trocknen, Lagern und letztlich Explaπtat bzw. Ausbringung mit jeweils vorgesehenen va-^er-enden Wi-κJerholungen und Abfolgen dieser Schritte erfolgen, das dadurch gekemzeichriet ist, daß zur Steigerung der erv»ünschten Verrnehrungsfähigkeit die genarπten, nicht als Dauerfαrm vorliegenden, zu desinfizierenden Pflanzen bzw. deren Teile , Gewebe und/oder Gewebeteile im Zuge ihres intensiven Kontaktes mit der , insbesondere während ihrer Anwesenheit in einem Bad , der wässerigen Desinfektionsmittel-Lösung der Einwirkung des oxidativ wirksamen Desinfektionsmittels in Kombination mit einer gleich¬ zeitig erfolgenden Einwirkung von Ultraschallenergie unterworfen werden .

Das Neue des Verfahrens liegt darin , daß die oxidativen Substanzen , z . B . NaOCl (Natriumhypochlorit) im Ultraschallbad angewendet werden und zwar mit Erfolg auf zu erwartenderwa.se tatsächlich leicht desintegrier- bares Gewebsgut , wie Triebe , Sprossen u . dgl .

Viele Versuche mit verschiedenen ohne Ultraschall nur unzureichend desinfizierbaren Pflanzenarten und Gewebearten zeigten , daß die Des¬ infektionswirkung durch das neue kombinierte Desinfektions- und Ultra¬ schallbad wesentliche bessere Desinfektionsquoten gegenüber den für die Desinfektion von Explantaten üblichen , herkömmlichen Verfahren bringt .

Bisher ist eine solche Ultraschall unterstützende Methode für die Desinfektion von derartigem empfindlichen Pflanzengewebsgut noch nicht versucht und beschrieben worden , was weiter nicht verwundert , da durch die an sich bekannte Desintegrationswirkung des Ultraschalls , der bekanntlich nicht einmal die metallische , meist auf Basis von Titan gebildete Ab¬ strahlfläche des Ultraschallgenerators verschont , eher eine Erhöhung der Letalitätsrate erwartet werden mußte .

-* ^• Die synergistische Wirkung - Ultraschall hat auf Mikroben praktisch keine sie selbst schädigende Wirkung - beruht vermutlich darauf, daß neben einer echt chemischen Unschädlichmachung und damit wesentlichen Re¬ duktion der Mikroorganismen-Zahl eine meschanisch durchaus wesentliche ° Wirkung in der Weise eintritt, daß die an sich fest haftenden Mikroorga¬ nismen in großer Menge von der Oberfläche abgelöst und in das letztlich abgetrennte Desinfektionsmittel eingetragen werden dürften, wo sie dem¬ selben zu ihrer Vernichtung wesentlich besser zugänglich sind, und letzt¬ lich auch eine Abtrennung der Organismen zusammen mit der zu verwerfenden Desinfektionsauslösung und Wegspülen derselben nach der Behandlung er¬ folgt.

Es wurde gefunden, daß sich auf wirtschaftliche Weise hohe Über¬ lebensquoten der Explantate bei Einhaltung von Desinfektionsmittel-Kon¬ zentrationen gemäß Anspruch 2 erzielen lassen, wobei die gemäß 5 A n s p r u c h 3 zu bevorzugenden oxidativen Substanzen besonders vor¬ teilhaft einsetzbar sind.

Was die eingebrachte synergistisch vorteilhafte Ultraschallenergie betrifft, haben sich die im A n s p ruch 4 genannten Frequenzen und weiters die im A n s p r u c h 5 genannten Energiedichten als für das 0 empfindliche lebendige, sprossende od.dgl. Pflanzengewebsgut als durchaus genügend schonend und gleichzeitig dennoch ausreichend für den Wirkstoff¬ eintritt erwiesen.

Eine Vorlauf- bzw. "Einweich"-Zeit vor Beginn der Ultraschallbe¬ handlung in den von Anspruch 6 wiedergegebenen Ausmaßen hat sich 5 auf den Erfolg der Desinfektion durchaus günstig ausgewirkt.

Verkürzte Desinfektionszeiten bringt ein Modus der Beschallung gemäß Anspruch 7.

Weiters kann in hartnäckigen Fällen alternativ oder zusätzlich eine an- und abschwellende Ultrabeschallung gemäß Anspruch 8 Vorteile 0 bringen, wobei echte Pausen, wie gemäß A n s p r u c h 9 vorgesehen, eine weitere Senkung der Letalitätswerte der so behandelten Gewebe er¬ bringen kann.

Behandlungszeiten innerhalb der im A n s p ruch 10 angegebenen Bereiche haben sich für optimierte Resultate als am günstigsten erwiesen. 5 Für besonders problematische Fälle, also bei hohem Organismusbefall auf besonders empfindlichen Geweben kann auch ein Wechsel, z.B. von einem anfänglich stärker wirksamen zu einem gegen Ende der Behandlung schwäche¬ rem Desinfektionsmittel, gegebenenfalls auch in Gradientenform gemäß

Anspruch 11 vorgenommen werden.

Letztlich wird infolge des hier gegebenen Synergismus durch Reduk¬ tion der Gesamtzeit der beschallenden Desinfektion in den im Anspruc il2 genannten Ausmaßen eine Optimierung der Ausbeutequoten erzielt. Anhand der Beispiele wird die Erfindung näher erläutert:

Beispiele: allgemein: Ultraschallgerät: El a Type T 460/H, Frequenz 35 kHz Desinfektionslösung: 4 bzw. 6%ige Natriumhypochloridlösung (NaOCj Zur Behandlung mit dem Ultraschallgerät wurde die Desinfektionslösung ca. 2/3 hoch (ca. 1,5 1) in die Ultraschallwanne gefüllt.

Ohne Ultraschallbehandlung erfolgte die Vergleichs-Desinfektion in steri¬ len Bechergläsern aus Glas.

Beispiel 1:

Winterknospen von Bergahorn wurden durch Tauchen 1,5 min lang mit 4%iger wässeriger NaOCL-Lösung behandelt. Anschließend wurden die Knospen 1 min lang in 70%iges Ethanol gelegt und nachher nochmals 5 min lang mit 4%iger wässeriger NaOCL-Lösung desinfiziert. Die Behandlung mit NaOCl erfolgte im Ultraschallbad sowie die Kontrolle ohne Ultraschall-Einsatz. Bei der Versuchsvariante mit Ultraschall wurden 88 Knospen und bei der Variante ohne Ultraschall-Behandlung 79 Knospen eingesetzt.

Die Auswertung des Versuches erfolgte 6 bzw. 12 Wochen nach Des¬ infektion und darauffolgende Ausbringung:

Tab . l : Ergebnisse des Desinfektionsversuches mit Wiπterknosp-an von EJ-πgahαm:

Behandlung : A% NaOCl : mit Ultraschall 25 kHz : ohne Ultraschall :

Infektionen : % nach 6 Wbchen 21 , 6 50, 6

Infektionen : % nach 12 Wochen 25 , 0 57 , 0

Beispiel 2:

Ausgereifte noch nicht verholzte Triebe dreier verschiedener Stiel- und Traubeneichenklone, nämlich Klone 3113, 3223 sowie 3233 wurden zu verschiedenen Zeitpunkten im Frühjahr, jeweils Mitte März, April, Mai und im Sommer (Juli) aus dem Glashaus geerntet. Die entblätterten Sproßseg¬ mente wurden unter Leitungswasser ca lh gewässert.

Im Frühjahr erfolgte die Desinfektion der noch nicht exakt abge-

längten Triebe mit 4 %iger NaOCl-Lösung und mit den Johannistrieben (Juli) mit 6 %iger NaOCl-Lösung, 10 min Einwirkungsdauer und einminütiger Behandlung mit 70 %igem EtOH. Anschließend wurde dreimal mit sterilem Wasser nachgespült. Danach wurden die Sprosse und Sproßspitzen in Explan- tatgröße von 1,5 bis 2 cm Größe geschnitten. Zur Entfernung der phenoli- scheπ Substanzen wurden die Explantate noch 15 min lang in 0,5 % steriler wässeriger Chinosollösung geschüttelt und danach auf Induktioπsmedien aufgelegt.

Für jede Versuchsvariante wurden mindestens 40 Explantate einge¬ setzt.

Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte vier bzw. sechs Wochen nach Desinfektionsbehandlung und Explantation.

Tab.2: Ergebnisse des Desinfektionsversuches mit Sproßspitzen und Nodienseg enten von Stieleiche (Juli)

Behandlung 6% NaOCl mit Ultraschall 30 kHz ohne Ultraschall Infektionen: % nach 6 Wochen 12 25

Tab.3: Infektionsraten (%) von Stiel- und Traubeneiche (Frühjahr)

11 25 kHz ohne Ultraschall

96

97 100

Die Beispiele zeigen, daß selbst unter den noch nicht voll optimier¬ ten Test-Bedingungen durchaus beachtliche Erhöhungen der Überlebensquoten der Explantate erzielt wurden.

Sie zeigen auf, daß Ultraschall also unerwarteterweise eine günstige Wirkung auf die Oberflächendesinfektion von Pflanzengewebe ausübt. In al¬ len angewendeten Beispielen, seies es unempfindlichere Knospen von Berg¬ ahorn oder frisch ausgetriebene Sprosse von Eichen zeigte sich, daß der Einsatz von Ultraschall die Desinfektionsrate und damit die Überlebens¬ rate in vitro um mindestens 10 bis zu Werten von 50% erhöhen konnte, was durchaus vorteilhaft ist.

Der verbesserte Effekt ist vermutlich auf die Ultraschallwellen zu¬ rückzuführen, die eine intensive Vibration erzeugen. Die dabei entste-

henden Strömungen und Verwirbelungen führen vermutlich dazu, daß kleinste Partikel und Mikroorganismen von der Pflanzenoberfläche gelöst werden und dadurch das Desinfektionsmittel eine gesteigerte Wirkung entfalten kann. Eventuell wird durch den Ultraschall ein Eindringen des Desinfektions¬ mittels in die besonders mikroorgaπismenbefallenen Oberflächensporen erzielt.