Beschreibung

Effektive und kostengünstige Reinigungsverfahren spielen bei der Herstel¬ lung chemischer und biologischer Produkte eine zentrale Rolle. Im Zuge der Entwicklung der Bio- und Gentechnologie in den letzten Jahren hat insbe¬ sondere die Verfahrensentwicklung zur Reinigung von Proteinen, Peptiden und Vitaminen im technischen Maßstab zunehmend Bedeutung erlangt.

Ein wichtiger Schritt bei der Isolierung der meisten zellulären Inhaltsstoffe ist die Fraktionierung des Ausgangsmaterials oder einer Zwischenstufe im Verlauf der Reinigung. Hierzu werden in der Regel (fraktionierte) Fällungen oder Verteilungschromatographien angewendet. Zur Durchführung von Fällungen werden die Eigenschaften des Lösungsmittels durch die Zugabe entsprechender Reagenzien derart verändert, daß die Löslichkeit des Proteins stark abnimmt und dieses ausfällt. Die Löslich¬ keit kann durch die Zugabe von Salzen wie Ammoniumsulfat oder organischen Lösungsmitteln wie Ethanol oder durch eine Veränderung des pH-Wertes oder der Temperatur variiert werden, (Green, A.A. & Hughes W.L. in "Methods in Enzymology", Band I, S. 67-90 (1955); Belter et al, 1988, Seite lOOff. in "Bioseperations", Hrsg.: Belter, P.A., Cussler, E.L. & Hu, W.-S.).

Auch Flüssig-Flüssig-Zwei-Phasen Verteilungschromatographien werden seit langem zur Reinigung von Biomolekülen eingesetzt. In den 40er und 50er Jahren wurden ausschließlich organisch-wäßrige Zwei-Phasen-Systeme mit nicht mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln verwendet. Diese sind zwar zur Anreicherung und Reinigung niedermolekularer Biomoleküle wie Antibiotika und Vitamine sehr geeignet (Schlügerl, K., 1987, in "Separations for Biotechnology", Hrsg.: Verral, M.S. & Hudson, M.J.

S. 260-269), ihrem Einsatz bei der Isolierung insbesondere von Proteinen sind jedoch enge Grenzen gesetzt. Insbesondere die Denaturierung und Präzipitation der Proteine in den organisch-wäßrigen Systemenbereiter große Probleme (Johansson G., 1985, in "Partitioning in aqueous two-phase Systems", Acad. Press, S. 161-225).

Eine andere Methode zur F üssig-Flüssig-Zwei-Phasen-Extraktion wurde Ende der 50er Jahre von Albertson entwickelt. Er verwendete 2-Phasen-Systeme mit zwei wäßrigen Phasen und konnte zeigen, daß diese insbesondere zur Anreicherung von Proteinen sehr geeignet sind (Nature 182, 709 (1958)). Zur Extraktion von Proteinen mit 2-Phasen-Systemen wurden seitdem fast ausschließlich wäßrige 2-Phasen-Systeme verwendet und weiterentwickelt.

Aufgrund der hohen Einsatzstoffkosten für die phaseninduzierenden Polymere wie Polyethylenglykol oder Dextran werden wäßrige 2-Phasen-Extraktionen im technischen Maßstab jedoch nur selten durchgeführt.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Anreicherung bzw. Reinigung von Biomolekülen, dadurch gekennzeichnet, daß man das Biomolekül in einer Mischung aus Wasser und/oder einem Puffer und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel löst und es bei der anschließend durch die Zugabe von Salzen herbeigeführten Phasentrennung in einer der sich trennenden Phasen anreichert, wobei der pH-Wert, bei dem die Anreicherung erfolgt, die Lösungsmittel, die sich für die Extraktion des Biomoleküls eignen, und die Art des Salzes in einer Versuchsreihe ermittelt werden.

Als Biomoleküle kommen besonders Vitamine und vorzugsweise Proteine und Peptide in Betracht. Zur Durchführung des Verfahrens wird das Biomolekül zunächst in Wasser oder einen Puffer und/oder unmittelbar in ein wäßrig¬ organisches Lösungsmittelsystem gebracht.

Bei der Zugabe des organischen Lösungsmittels zu der wäßrigen Phase muß darauf geachtet werden, daß das zu reinigende Protein in Lösung bleibt. Falls das Protein nicht in Lösung bleibt, empfiehlt es sich, den pH-Wert, die Temperatur, den Anteil und die Art des organischen Lösungsmittels, die Art des Puffers und dessen Konzentration, die Proteinkonzentration und die Art und Konzentration des. Salzes zu variieren. Fällt bei der Zugabe des organischen Lösungsmittel eine andere Substanz aus, wird diese abzentri- fugiert oder abfiltriert. Als Lösungsmittel eignen sich besonders 1- und 2-Propanol, Aceton, THF und Acetonitril. Zur Reinigung von Hirudin eignen sich am besten n-Butanol und 2-Propanol.

Zu der so erhaltenen Lösung wird zur Phasentrennung das Salz zugegeben. Als Salze kommen beispielsweise Alkalichloride- wie Lithium-, Natrium-, Kalium- oder Cäsiumchlorid-, Calciumchlorid, Mangen(II)chlorid, Ammonium¬ sulfat, Ammoniumnitrit, Magnesiumsulfat, Natriumfor iat, Natriumacetat, Natriumeitrat, Kalium-Natrium-Tartrat und Kaliumcarbonat in Betracht. An Stelle eines Salzes kann auch z.B. D-Sorbit verwendet werden. Welches Salz am besten geeignet ist, wird wiederum in einem Vorversuch ermittelt. Dasselbe gilt für die Salzmenge. In der Regel ist die Phasentrennung am besten, wenn so viel Salz zugegeben wird, daß die Phasen mit dem Salz gesättigt sind.

Zur Reinigung von Hirudin eignen sich besonders Natriumchlorid und Ammoniumsulfat. Bei der Wahl der richtigen Parameter ist auch darauf zu achten, daß das Protein nach der Phasentrennung ganz überwiegend in der

in der wäßrigen Phase vorliegt. Für die Wahl der Parameter läßt sich keine allgemeine Regel aufstellen, es empfiehlt sich, die Parameter in einigen Vorversuchen zu ermitteln.

Tritt bei der Phasentrennung ein Niederschlag auf, so wird dieser verworfen.

Aus der wäßrigen Phase wird das Protein in bekannter Weise beispielsweise durch hydrophobe Chromatographie oder Fällung isoliert. Es kann auch wei- teren Reinigungsschritten unterworfen werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist schnell, kostengünstig und einfach durchführbar. Es zeichnet sich gegenüber dem bisherigen organisch-wäßrigen Extraktionen dadurch aus, daß das zu reinigende Protein in der organisch- wäßrigen Mischphase gelöst bleibt und erst durch die anschließende Phasen¬ trennung bevorzugt in die sich abtrennende wäßrige Phase übergeführt wird. Ein besonderer Vorteil des neuen Verfahrens ist es, daß die Proteine sich aufgrund der Verwendung von mit Wasser mischbaren organischen Lösungs¬ mitteln ständig in einem wäßrigen Milieu befinden. Unter geeigneten Bedingungen können viele Proteine daher in aktiver Form angereichert werden.

Das Verfahren kann aber auch zur Anreicherung von inaktiven bzw. denaturierten Proteinen verwendet werden.

Beispiel 1

Organisch-wäßrige Verteilungschromatographie mit Hirudin-haltige Zell¬ extrakt

Es wurde von einem grob vorgereinigten Zellextrakt aus E. coli ausge¬ gangen, der neben Hirudin noch zahlreiche Fremdproteine, Peptide sowie teilweise gefärbte Bestandteile des Fermentationsmediums und der Zellen enthielt. Hirudin war zu etwa 10 % angereichert (bezogen auf das Protein).

Eine wäßrige Lösung dieses Extraktes mit einer Proteinkonzentration von 10 - 100 mg/ml wurde bei 0 - 20°C mit 1 Volumen i-Propanol versetzt und der pH-Wert der Mischphase mit 2N HC1 auf pH 1 - 2 eingestellt. Ausge¬ fallenes Material wurde durch Zentrifugation (30 min, 10000 g, 0 - 20°C) oder Filtration abgetrennt. Der überstand bzw. das Filtrat wurde , anschließend mit 2N NaOH auf pH 4 - 4,3 eingestellt und unter Rühren mit festen NaCl bis zur Sättigung versetzt. Nach Beendigung des Rührvorganges

setzte eine spontane Trennung der organischen und wäßrigen Phasen ein. Zugleich bildete sich zwischen der organischen und der wäßrigen Phase eine flächige massive Interphase überwiegend aus ausgefallenen Proteinen. Das Hirudin befand sich fast ausschließlich in der wäßrigen Phase. Die Ausbeute an aktivem Hirudin in der wäßrigen Phase betrug 70 - 90 %. Eine weitere Ausbeuteerhöhung ist möglich, wenn die organische Phase wiederholt mit H ₂ 0/Kochsalz extrahiert wird.

Durch die Extraktion wurde das Hirudin um mindestens den Faktor 5 angereichert. Weiterhin wurden (teilweise gefärbte) hydrophobe Verun¬ reinigung in die i-Propanolphase überführt, die nach der Phasentrennung eine stark dunkle Färbung aufwies.

Beispiel 2

Organisch-wäßrige Verteilungschromatographie mit einem grob angereichertem Protein A-Hirudin-Fusionsprotein

Als Ausgangsmaterial wurde der Niederschlag der Fällung eines Zellauf- Schlusses von E. coli verwendet. Er erhielt inaktives Hirudin in Form eines Fusionsproteins mit den N-terminalen Bereich des Protein A aus Staphylococcus aureus. Der Proteinanteil des Fusionsproteins am Gesamt¬ protein betrug ca. 40 %. Neben Fremdproteinen enthielt der Niederschlag große Mengen an Zeil- und Fermentationsbestandteilen.

Der Niederschlag wurde zu einer Konzentration von 50 g Niederschlag/1 1 in Wasser aufgenommen. Der pH-Wert der Lösung wurde mit 40 %iger H2SO bzw. 2N NaOH auf pH 5 eingestellt. Anschließend wurde 1 Volumen i-Propanol zugegeben und der pH-Wert der Mischphase erneut auf pH 5 eingestellt, un- lösliches Material wurde durch Zentrifugieren (10000 g, 15 min, 20°C) ab¬ getrennt. Der pH-Wert des Überstandes wurde nun mit 2N NaOH auf pH 7 ein¬ gestellt. Darauf wurde der überstand unter Rühren mit festem NaCl bis zu einer Konzentration von 1,5 M NaCl versetzt. Nach Beendigung des Rührvor¬ ganges erfolgte eine spontane Trennung der organischen und wäßrigen Phase, wobei sich zwischen diesen eine Interphase aus überwiegend denaturierten Proteinen bildete.

Das Protein A-Hirudin-Fusionsprotein befand sich annähernd quantitativ in der wäßrigen Phase. Das Fusionsprotein hat einen Anteil am Gesamtprotein in der wäßrigen Phase von ca. 80 %. Neben Fremdprotein wurden durch die Extraktion vor allem DNA sowie hydrophobe und unter den Extraktions-

bedingungen schlecht lösliche Zellinhaltsstoffe und Bestandteile des Fermentationsmediums stark abgereichert. Die weitere Aufarbeitung des Fusionsproteins wurde dadurch stark vereinfacht.

Eine Anreicherung des Protein A-Hirudin-Fusionsproteins ist auch in der organischen Phase möglich. Dies wird erreicht, wenn die Phasentrennung nicht wie oben beschrieben, bei pH 7, sondern bei pH 1,5 durchgeführt wird. Der pH-Wert wird vor der Salzzugabe mit 2 N HC1 eingestellt.

Das grob angereicherte Protein A-Hirudin-Fusionsprotein wurde wie folgt erhalten:

Herstellung des Expressionsplasmids

a) Konstruktion des Vektors

Der Protein A-Vektor pRIT 2T (Figur 1) ist kommerziell erhältl ich und ausführlich beschrieben (Pharmacia Bestell-Nr. 27-4808-01).

Dieser Vektor wurde wie folgt modifiziert: Er wurde mit der

Restriktionsendonuklease Hind III gespalten. Das größere Fragment (Vektor) wurde durch Elektroelution aus einem Agarosegel isoliert, in diesen Vektor wurden die komplementären 01igonukleotide Koe 1/2 (Sequenz 1) einligiert. Das entstandene Chimäre Plasmid wurde in den Lambda-Lysogenstamm N 4830-1 (Pharmacia Best.Nr. 27-4808-01) trans¬ formiert. Der Klon mit der korrekten Orientierung der 01 igonukleotide wurde mit Hilfe einer Hind HI/EcoRI Restriktionskartierung aus den möglichen Rekombinanten herausgesucht und durch DNA-Sequenzierung überprüft. Dieses Expressionsplasmid wurde pRIT 2TA genannt.

b) Einsetzen eines synthetischen Hirudingens mit Adapter

Die pRIT 2TA-DNA wurde mit EcoRI und Sall geschnitten und das größere DNA-Fragment (a) mit Hilfe der Elektroelution aus einem Agarosegel isoliert.

Ein synthetisches Hirudingen (Sequenz 6) wurde mit Hilfe eines DNA-Synthesegeräts (Applied Biosystems, Modell 380A) hergestellt. Dazu wurden 4 01 igonukleotide (Koe 3-Koe 6) angefertigt (Sequenzen 2-5). Die Oligonukleotide wurden kinasiert und mit EcoRl/Sall linearisierten Plasmid pUC 18 ligiert. Die Konstruktion wurde mit Hilfe einer DNA-Sequenzierung überprüft. Aus diesem Chimären Plasmid (pUC 18-Hir)

wurde das Hirudingen (b) inklusive Adapter mit EcoRI herausgeschnitten und über Agarosegelelektrophorese und Elektroelution isoliert. Das synthetische Hirudingen beinhaltet neben zwei Stop-Kodons am 3'-Ende un der Sall-Erkennungsstelle eine Adaptersequenz, die das Hirudingen unter Beibehaltung des Leserasters an den Protein A-Fusionspartner über die EcoRl-Spaltstelle anknüpft.

Die isolierten DNA-Fragmente a und b wurden miteinander ligiert und in den lysogenen Stamm N 4830-1 transformiert. Es entstand so der Protein A-Hirudin Expressionsvektor pRIT2TA-Hir (Fig. 2).

Expression des Fusionsproteins

Das Expressionsplasmid pRIT 2TA-Hir wurde in den Stamm E.coli N 4830-1 (Pharmacia Bestell-Nr. 27-4808-01) transformiert. Dieser Stamm enthält chromosomal den thermosensitiven Lambda-Repressor CI 857.

In einem 11 Erlenmeyerkolben mit Schikanen wurden 100 ml MΪM-Medium (MIM = 32 g Trypton, 20 g Hefeextrakt, 6 g Na ₂ HP0 ₄ , 3 g KH ₂ P0 , 0,5 g NaCl, 1 g NH ₄ C1 pro Liter und 0,1 mM MgSO«. sowie 0,001 mM FeCl ₃ ) sterilisiert und Ampicillin (ad 100 μg/ml) zugegeben. Das Medium wurde mit 1 ml einer frischen über-Nacht-Kultur des Stammes pRIT 2TA-Hir/N 4830-1 angeimpft und unter Schütteln so lange bei 28°C bebrütet, bis die Absorption bei 550 n 0,6 betrug. Dann wurden 100 ml 65°C warmes frisches MIM/amp-Medium zugegeben und weitere 4 h bei 42°C bebrütet. In dieser Zeit wurde das gewünschte Fusionsprotein synthetisiert. Durch Zugabe von Lysozy zu 75 mg/1 und Inkubation (3h, 37°C) wurde die Zellwand enzy- matisch entfernt. Die Zellen konnten dann mechanisch (Manton-Gaulin Presse, Einfrierzyklus, heftiges Rühren), durch einen Hitzeschock bis 80°C oder eine hypotone Lyse aufgeschlossen und das lösliche Fusionsprotein ins Medium freigesetzt werden.

Beispiel 3

Organisch-wäßrige Verteilungschromatographie mit Hirudin und verschiedenen Phasensystemen

Zur Durchführung der Verteilungschromatographien mit Hirudin mit verschiedenen Lösungssystemen und Salzen wurde von einer wäßrigen Hirudin- lösung der Konzentration 1 mg/ml in 20 mM Natriumacetat, pH 4,0 ausge¬ gangen.

Mit mehreren Kombinationen von verschiedenen Lösungsmitteln und Salzen konnte das Hirudin stark überwiegend in der wäßrigen Phase angereichert werden (vgl. Tab. 1).

Tabelle 1

Organisch-wäßrige Verteilungschromatographie mit Hirudin in verschiedenen Lösungsmittelsystemen und Salzen

Salzart Lösungsmittel Volumenantei1 Aktivit tsverteilung

System nach Phasentrennung (%) nach Phasentrennung % (v/v = 50/50) untere Phase obere organ. untere Phase obere organ. (H ₂ 0) Phase (H ₂ 0) Phase

2-Propanol/H2θ 48

NaCl Aceton/H ₂ 0 75

Acetonitril/H2θ 58

THF*/H ₂ 0 40 1-Propanol/H ₂ 0 48

2-Propanol/H2θ 40

(NH ₄ ) ₂ S04 Aceton/H2θ 30

Acetonitril/H2θ 40

THF H2O 40 l-Propanol/H2θ 40

*THF = Tetrahydrofuran

Tabelle 2

Organisch-wäßrige Verteilungschromatographie mit Hirudin in verschiedenen Lösungsmittelsystemen und Salzen

Salzart Lösungsmittel Volumenantei 1 Aktivit tsvertei lung

System nach Phasentrennung (%) nach Phasentrennung % (v/v = 50/50) untere Phase obere organ. untere Phase obere organ.

(H ₂ Q) Phase (H ₂ 0) Phase

NH4NO3 2-Propanol/H2θ 70 30 > 60

CsCl 60 40 > 80 40

CaCl ₂ 60 40 > 30

K-Na-Tartrat 20 80 > 40

LiCl 60 40 nicht bestimmt

MnCl ₂ 60 40 > 80

MgS0 ₄ 30 70 nicht bestimmt

CH ₃ C00Na 80 20 > 70

NaCl 48 52 > 90 < 10

Na-citrat 20 80 > 40

K ₂ C0 ₃ 50 50 nicht bestimmt

Be i spi e l 4

Organisch-wäßrige Verteilungschromatographie mit Chy otrypsin A ₄ und verschiedenen Phasensystemen.

Zur Durchführung der Verteilungschromatographien wurde von einer wäßrigen Chymotrypsinlösung der Konzentration 1 mg/ml ausgegangen.

Die Chymotrypsinlösung wurde in Aliquots zu je 5 ml aufgeteilt und die Ansätze mit 1 Volumen der verschiedenen organischen Lösungsmittel (siehe Tab. 2) versetzt und gemischt. Die Mischphasen wurden bei Raumtemperatur (20°C) mit NaCl oder D-Sorbit (siehe Tab. 3) zur Sättigung unter Rühren versetzt. Nach Beendigung des Rührvorganges setzte die Phasentrennung spontan ein. In Tab. 3 sind die Volumina der überwiegend wäßrigen unteren Phase, die Volumina der überwiegend organischen oberen Phase sowie die in diesen Phasen befindlichen Aktivitäten wiedergegeben.

Die Chymotrypsinaktivität wurde anhand des Umsatzes des Substratpeptids N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-Nitroanilin bestimmt (Anal. Biochem. 99_, 316 (1979)).

Tabelle 3

Organisch-wäßrige Verteilungschromatographie mit Chymotrypsin in verschiedenen Lösungsmittelsystemen und Salzen

Salzart Lösungsmittel- Volumenanteil Aktivitätsverteilung

System nach Phasentrennung (%) nach Phasentrennung %

(v/v = 1/1) untere Phase obere organ. untere Phase obere organ. (H ₂ Q) Phase (H ₂ Q) Phase i n-Propanol/H ₂ 0 50 50 > 80 i-Propanol/H ₂ 0 50 50 > 80

NaCl Acetonitril/H ₂ 0 60 40 > 40

D-Sorbit i-Propanol/H 0 30 70 > 80

Bei spi el 5

Organisch-wäßrige Verteilungschromatographie mit Folsäure in verschiedenen Phasensystemen.

Zur Durchführung der Verteilungschromatographien wurde von einer wäßrigen Folsäure-Lösung der Konzentration 0,1 mg/ml in 20 mM Natriumphosphat pH 7,0 ausgegangen. Je 5 ml der Folsäurelösung wurden mit jeweils 5 ml der mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln (siehe Tab. 4) bei Raumtemperatur (20°C) gemischt. Zur anschließenden Trennung der

Lösungsmittel in die wäßrige und organische Phase wurden unter Rühren verschiedene Salze (siehe Tab. 4) bis zur Sättigung zugegeben. Die Phasentrennung erfolgte spontan nach Beendigung des Rührvorganges.

Die Volumina der wäßrigen und organischen Phasen nach der Phasentrennung sowie die in diesen enthaltenen Anteile an Folsäure sind in Tab. 4 gezeigt. Die in den verschiedenen Phasen enthaltenen Folsäuremengen wurden spektroskopisch bestimmt. Hierzu wurde die Absorption der Phasen bei ^' 346 n ermittelt. Der Gehalt der Phasen an Folsäure wurde unter Berück- sichtigung der verschiedenen Volumina mittels der Absorption einer Fol¬ säurelösung bekannter Konzentration (0,1 mg/ml in 20 mM Natriumphosphat, pH 7,0) bei 346 nm berechnet.

Mit einer Vielzahl der verwendeten Lösungsmittelsysteme kann die Folsäure annähernd quantitativ in der wäßrigen Phase angereichert werden. Einige Systeme (z.B. Isopropanol/H2θ/Lithiumchlorid) ermöglichen jedoch auch eine Anreicherung in der organischen Phase.

Tabelle 4

Organisch-wäßrige Verteilungschromatographie mit Folsäure in verschiedenen Lösungsmittelsystemen und Salzen

Salzart Lösungsmittel- Volumenanteil Fols urevertei lung System nach Phasentrennung (%) nach Phasentrennung % (v/v = 1/1) untere Phase obere organ. untere Phase obere organ.

(H ₂ 0) Phase (H 0) Phase

(NH ) ₂ S0 ₄ 70 55 65 65 30

NaCl 60 40 55 55 55

Tabelle 4 (Fortsetzung)

Organisch-wäßrige Verteilungschromatographie mit Folsäure in verschiedenen Lösungsmittelsystemen und Salzen

Salzart Lösungsmittel- Volumenanteil Folsaurevertei lung System nach Phasentrennung (%) nach Phasentrennung % (v/v = 1/1) untere Phase obere organ. untere Phase obere organ,

(H ₂ 0) Phase (H 0) Phase

Ammoniumni rat lsopropanol/H2θ 60 40

Calciumchlorid 50 50

Cäsiumchlorid 60 40

Kaliumcarbonat 45 55

Kalium-Natrium-

Tartrat 20 80

Lithiumchlorid 40 60

Magnesiumsulfat 20 80

Natriu acetat 55 45

Natriumeitrat 20 80

Natriumformiat 50 50