TECHNISCHES GEBIET

[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft Mittel und Verfah ren zur Hydroxylierung von Steroiden.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

[0002] 3,7,12-Trihydroxylierte Gallensäuren, wie z.B. Chol- säure (3a,7a,12a-Trihydroxy-5ß-cholansäure) oder Ur- socholsäure (3a,7ß,12a-Trihydroxy-5ß-cholansäure) sind industriell bedeutsame Chemikalien, unter anderem als Ausgangsstoffe zur Herstellung von Ursodesoxycholsäure (UDCA). Ursodesoxycholsäure wird als Medikament u.a. ein gesetzt zur Auflösung kleinerer Röntgen-negativer Gallen steine sowie zur Behandlung der Lebererkrankungen primär ziliare Zirrhose und primär sklerosierende Cholangitis.

[0003] Die industriell wichtigste Quelle für 3,7,12- trihydroxylierte Gallensäuren ist Gallenflüssigkeit aus Gallenblasen, die als Schlachtabfälle in der Fleischpro duktion anfallen. Neben anderen Tierarten wird häufig die Galle von Rindern verwendet. Es existiert keine industri ell relevante Totalsynthese für 3,7,12-trihydroxylierte Gallensäuren. Da die Produktion von Gallensäuren an ein anderes Produkt (Fleisch) gekoppelt ist, kann nur sehr begrenzt auf eine gesteigerte Nachfrage reagiert werden. Aus diesem Grund ist eine möglichst effiziente Nutzung des Rohstoffs Galle von großem Interesse.

[0004] Da Galle eine wässrige Mischung aus Gallensäuren, Li piden, Cholesterin und anderen Substanzen ist, kommt der Trennung der Bestandteile bei der Gewinnung von Gallen säuren eine besondere Bedeutung zu. Auch die Gallensäuren stellen wiederum ein Gemisch dar, dessen Bestandteile sich durch Anzahl und Position der Hydroxylgruppen unter scheiden. In Rindergalle ist neben Cholsäure auch ein signifikanter Anteil von Desoxycholsäure enthalten, wel che sich von Cholsäure durch das Fehlen der OH-Gruppe an Position 7 unterscheidet (3a,12a-Dihydroxy-5ß- cholansäure) . Desoxycholsäure hat einen wesentlich gerin- geren kommerziellen Wert als 3,7,12-trihydroxylierte Gal lensäuren. Es besteht daher ein industrielles Interesse an der Überführung von Desoxycholsäure in eine 3,7,12- trihydroxylierte Gallensäure durch gezielte Einführung einer Hydroxylgruppe an Position 7.

[0005] Bei Hydroxylierungen wird formal in einer Oxidations reaktion ein Sauerstoff-Atom in eine (nicht aktivierte) C-H-Bindung eingefügt. In der organischen Chemie sind dies sehr schwierig durchzuführende Reaktionen. Häufig werden OH-Gruppen durch Umwege eingefügt, z.B. durch die Addition von Wasser an einer C=C-Doppelbindung. Die se lektive Hydroxylierung an einer bestimmten Position eines komplexen Moleküls (wie z.B. einer Gallensäure) ist prob lematisch, da mehrere chemisch (nahezu) gleichwertige C- H-Bindungen vorliegen.

[0006] Es ist bekannt, dass bestimmte Aktinobakterien und filamentöse Pilze die regio- und stereospezifische Hydro xylierung von Litocholsäure („LCA") an Position 7ß zu Ur- sodesoxycholsäure („UDCA") katalysieren können (Kollerov et al., Steroids, 78 (3): 370-378 (2013); Tonin et al.

(Beilstein Journal of Organic Chemistry, 14: 470-483 (2018)).

[0007] Zudem wurde die Hydroxylierung von Desoxycholsäure an Position 7 durch filamentöse Pilze (Kollerov et al., Ste roids, 107: 20-29 (2016)), sowie Aktinobatkerien (Desh- cherevskaya et al., Journal of Molecular Catalysis B: En- zymatic, 133: S157-S165 (2016)) beschrieben.

[0008] Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung Mittel und Verfahren bereitzustellen, Steroide, wie Gallensäuren und Derivate davon, welche an Position 7 ein Wasserstoff und keine Hydroxylgruppe aufweisen, spezifisch an dieser Stelle zu hydroxylieren.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

[0009] Die erfindungsgemäße Aufgabe wird durch die Verwen dung von Cytochrom P450 oder einem funktionellen Fragment davon zur Hydroxylierung eines 7-Desoxysteroids mit der allgemeinen Formel (I) an Position 7 zu einem Steroid mit der allgemeinen Formel (II)

(II), wobei

Xi und X2 unabhängig voneinander H, Ci, F, Br, I, CF ₃ , ein Ci bis C ₆ Alkylrest, OH, ein Ci bis C ₆ Alkoxyrest, CN, N0 ₂ , N(R ₆ )2, eine Epoxygruppe, CHO oder ein C0 ₂ R ₆ -Rest sind, wobei

R ₆ -C(0)H, -C(0)CH ₃ , -C(0)CH ₂ CH ₃ , -C (0)(CH ₂ ) ₂ CH ₃ ,- C (0)CH (CH ₃ ) ₂ , -C (0)(CH ₂ ) ₃ CH ₃ , -C (0)CH (CH ₃ )CH ₂ CH ₃ , - C (0)CH2CH2(CH ₃ )2, -C(0)C(CH ₃ ) ₃ , -C (0)Ph, - C (0)CH ₂ Ph ist,

Ri und R ₂ unabhängig voneinander H, OH, OR ₇ oder 0 sind, wobei

R ₇ -C(0)H, -C(0)CH ₃ , -C(0)CH ₂ CH ₃ , -C (0)(CH ₂ ) ₂ CH ₃ ,- C (0)CH (CH ₃ )2, -C (0)(CH ₂ ) ₃ CH ₃ , -C (0)CH (CH ₃ )CH ₂ CH ₃ , - C (0)CH ₂ CH ₂ (CH ₃ ) ₂ , -C(0)C(CH ₃ ) ₃ , -C (0)Ph, - C (0)CH ₂ Ph ist, R. ₃ H, OH, ORS, ein Ci bis Cio Alkylrest, ein Ci bis Cio Alkenylrest, -CHO, -C(0)(CH ₃₎ , -C(0)(CH ₂ OH), - CH (CH ₃₎ C(0)CH ₃ , -CH (CH _{3) ( (} CH _{2) 2} CO ₂ R ₉₎ oder - CH (CH _{3) ( (} CH _{2) 2} CONHR ₉₎ ist, wobei

Rs -C (0)H, -C(0)CH ₃ , -C(0)CH ₂ CH ₃ , -C (0)(CH _{2 ) 2} CH _3, - C (0)CH (CH ₃₎ 2, -C(0)(CH _{2) 3} CH ₃ , -C(0)CH (CH ₃₎ CH ₂ CH ₃ , - C (0)CH2CH2(CH ₃₎ 2, -C(0)C(CH ₃₎₃ , -C(0)Ph, oder - C(0)CH ₂ Ph ist, und

Rg -CH ₃ , -CH2COOH, -CH ₂ CH ₃ , -CH(CH ₃₎₂ , -(CH ₂₎₂ CH ₃ , - (CH ₂₎₂ S0 ₃ H, C(CH ₃₎₃ , -(CH _{2 ) 3} CH ₃ , -CH (CH ₃₎ CH ₂ CH _{3, -} CH2CH2(CH ₃₎ 2, eine Arylgruppe oder eine Alkylaryl gruppe ist,

R4 H, OH, oder -OR10 ist, wobei

Rio -C(0)H, -C(0)CH ₃ , -C(0)CH ₂ CH ₃ , -C(0)(CH _{2) 2} CH _3, - C (0)CH (CH ₃₎ 2, -C(0)(CH _{2) 3} CH ₃ , -C(0)CH (CH ₃₎ CH ₂ CH ₃ , - C (0)CH2CH2(CH ₃₎ 2, -C(0)C(CH ₃₎₃ , -C(0)Ph, oder - C(0)CH ₂ Ph ist und

Rs H, CF ₃ , ein Ci bis C ₆ Alkylrest, ein Ci bis C ₆ Alkenyl rest, OH, 0, oder ein Ci bis C ₆ Alkoxyrest ist, wobei die gestrichelte Linie eine optionale Doppelbindung be deutet, mit der Maßgabe, dass der B-Ring keine Doppelbin dung aufweist, wenn der A-Ring eine C4-C5-Doppelbindung und der C-Ring keine Doppelbindung aufweist, wenn Xi und X2 eine Epoxygruppe ausbilden, dadurch gekennzeichnet, dass das Cytochrom P450-Enzym ei ne Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 80 %, vor zugsweise mindestens 90%, insbesondere 100%, ident ist mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1 oder 2, gelöst. [0010] Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass Cy tochrom P450 und funktionelle Fragmente davon in der Lage sind, Steroide, wie Cholsäure bzw. Derivate davon mit der Formel (I) an Position 7 zu hydroxylieren.

[0011] Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung be trifft ein Verfahren zur Herstellung eines Steroids, vor zugsweise einer Cholsäure, oder eines Derivats davon mit der allgemeinen Formel (II) wie oben definiert, umfassend den Schritt des Umsetzens eines 7-Desoxysteroids, vorzugs weise einer 7-Desoxycholsäure, oder eines Derivats davon mit der allgemeinen Formel (I) mit dem erfindungsgemäßen Cytochrom P450 oder einer funktionellen Variante davon.

BESCHREIBUNG DER AUSFÜHRUNGSFORMEN

[0012] Cytochrom P450 und funktionelle Varianten davon sind überraschender Weise in der Lage, 7-Desoxysteroide, wie z.B. 7-Desoxycholsäure, und Derivate davon selektiv an Position 7 zu hydroxylieren.

[0013] Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst das Cy tochrom P450-Enzym eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, insbesondere 100%, i- dent ist mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1 oder 2.

[0014] Cytochrome P450 katalysieren Monooxygenase-Reaktionen einer Vielzahl von endogenen sowie von exogenen Substra ten. Sie sind u.a. am Stoffwechsel von Steroiden, Eicosanoiden, Fettsäuren und Gallensäuren sowie von exo genen Substraten, wie Arzneistoffen, Insektiziden und chemischen Karzinogenen beteiligt.

[0015] Cytochrome P450 gemäß vorliegender Erfindung können beispielweise aus Bakterien, wie z.B. Actinobakterien, insbesondere z.B. der Gattung Streptomyces verwendet wer den. Dabei können die Sequenzen mit Hilfe bekannter Tech niken zum Beispiel aus genomischer DNA oder einer cDNA- Bibliothek isoliert werden.

[0016] Die Cytochrome P450 gemäß vorliegender Erfindung bzw. deren funktionelle Varianten können wahlweise in ihrem Ursprungsorganismus vorhanden oder aus diesem isoliert sein, oder sie sind rekombinant exprimiert oder synthe tisch hergestellt. Vorzugsweise werden erfindungsgemäß rekombinant exprimierte Polypeptide verwendet.

[0017] Zur rekombinanten Expression von Enzymen gemäß der vorliegenden Erfindung können verschiedene etablierte Mikroorganismen verwendet werden, wie z.B. Escherichia coli (E. coli), Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevi- siae oder Pichia pastoris. Entsprechende Protokolle sind dazu sind in der einschlägigen Fachliteratur ausführlich beschrieben oder einer fachkundigen Person bekannt. [0018] Enzyme/Polypeptide werden gemäß vorliegender Erfin dung bevorzugt als in E. coli rekombinant überexprimierte Proteine verwendet, wobei bevorzugt die entsprechenden Zell-Lysate entweder ohne weitere Bearbei tung/Aufreinigung oder nach relativ einfachen Bearbei tungsschritten (z.B. Zentrifugation, Fällung, Konzentra tion oder Gefriertrocknung) eingesetzt werden. Alternativ können auch E. coli Zellen nach rekombinanter Überexpres sion der verwendeten Enzyme ohne Zellaufschluss direkt oder zum Beispiel nach einem Zyklus Einfrieren/Auftauen in der Reaktion eingesetzt werden. Geeignete Expressions plasmide sind einer fachkundigen Person bekannt und kön nen vielfach kommerziell erworben werden.

[0019] „Funktionelle Varianten" von Cytochrom P450 können Fragmente oder Mutationsvarianten von Cytochrom P450 sein, wobei Fragmente von Cytochrom P450 auch als „funk tioneile Fragmente" bezeichnet werden können. „Funktio neile Varianten" von Cytochrom P450 sind in der Lage die selbe Reaktion zu katalysieren, wie das Protein, von dem diese abgeleitet wurden. Ob eine Variante funktionell ist, d.h. ob diese dieselbe Reaktion katalysiert wie das Protein, von dem diese abgeleitet wird, kann dadurch be stimmt werden, in dem festgestellt wird, dass die Varian te dieselbe Reaktion katalysiert. Hierfür gibt es etab lierte Methoden im Stand der Technik bzw. jene, die hier in beschrieben sind. Die Umsetzungsraten von Substraten durch die erfindungsgemäßen funktionellen Varianten kön nen von den Umsetzungsraten des Cytochroms P450, von dem diese abgeleitet wurden, abweichen.

[0020] „Derivate von 7-Desoxysteroiden" umfassen von 7-

Desoxysteroiden abgeleitete Verbindungen mit unterschied lichsten Modifikationen, wobei eine oder mehrere Modifi kationen an den Positionen 3, 12 und 17 des 7- Desoxysteroids besonders bevorzugt sind. Diese Modifika tionen umfassen vorzugsweise Substitutionen wie oben de finiert .

[0021] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorlie genden Erfindung sind Xi, X2, R ₄ und R ₅ H und Ri und R2 unabhängig voneinander H, OH, ORs oder 0, wobei Rs -C (0)H, -C(0)CH ₃ , -C(0)CH ₂ CH ₃ , -C (0)(CH ₂ ) ₂ CH ₃ ,- C (0)CH (CH ₃ ) ₂ , -C (0)(CH ₂ ) ₃ CH ₃ , -C (0)CH (CH ₃ )CH ₂ CH ₃ , - C (0)CH ₂ CH ₂ (CH ₃ ) ₂ , -C(0)C(CH ₃ ) ₃ , -C(0)Ph, -C (0)CH ₂ Ph ist,

R ₃ ein Ci bis C10 Alkylrest, ein Ci bis C10 Alkylenrest, - CH (CH ₃ )((CH ₂ ) ₂ C0 ₂ R ₉ ) oder -CH (CH ₃ )((CH ₂ ) ₂ CONHR ₉ ), wobei Rg -CH ₃ , -CH ₂ COOH, -CH ₂ CH ₃ , -CH(CH ₃ ) ₂ , -(CH ₂ ) ₂ CH ₃ , - (CH ₂ ) ₂ S0 ₃ H, C(CH ₃ ) ₃ , -(CH ₂ ) ₃ CH ₃ , -CH (CH ₃ )CH ₂ CH ₃ ,- CH ₂ CH ₂ (CH ₃ ) ₂ , eine Arylgruppe oder eine Alkyla rylgruppe ist.

[0022] Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Arylgruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Phenylrest, einem mit F,

Ci, Br, N0 ₂ oder CH ₃ substituierten Phenylrest und einem Heteroaryl .

[0023] Gemäß einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Alkylarylgruppe ausge wählt aus der Gruppe bestehend aus einer Benzylgruppe, einer halogenierten Benzylgruppe, wobei das Halogen F, Ci oder Br ist, und einer mit N0 ₂ substituierten Benzylgrup pe.

[0024] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorlie genden Erfindung ist Ri OH, R ₂ 0 oder OH, R ₃ CH(CH ₃ )((CH ₂ )2CO2R5), R4 H und R ₅ H.

[0025] Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das 7-Desoxysteroid mit der allgemeinen Formel (I) ausgewählt aus der Gruppe beste hend aus 3a,12a-Dihydroxy-5ß-cholan-24-Säure, 3a,12ß- Dihydroxy-5ß-cholan-24-Säure, 3ß,12a-Dihydroxy-5ß-cholan- 24-Säure, 3ß,12ß-Dihydroxy-5ß-cholan-24-Säure, 3ß- Hydroxy-12-Keto-5ß-cholan-24-Säure, 3-Keto,12ß-hydroxy- 5ß-cholan-24-Säure, 3-Keto,12a-hydroxy-5ß-cholan-24- Säure, 3a-Hydroxy-5ß-cholan-24-Säure, 3-keto-5ß-cholan- 24-Säure, 3ß-Hydroxy-5ß-cholan-24-Säure und Ester der jeweiligen Säure.

[0026] Die Cytochrom P450-Hydroxylase, die erfindungsgemäß zur Hydroxylierung von 7-Desoxysteroiden und Derivaten davon mit der allgemeinen Formel (I) zu einem Steroid o- der einem Derivat davon mit der allgemeinen Formel (II) eingesetzt wird, umfasst eine Aminosäuresequenz, die min destens 80%, vorzugsweise mindestens 85%, noch mehr be vorzugt mindestens 90%, noch mehr bevorzugt mindestens 95%, noch mehr bevorzugt mindestens 96%, noch mehr bevor zugt mindestens 97%, noch mehr bevorzugt mindestens 98%, noch mehr bevorzugt mindestens 99%, insbesondere 100%, ident ist mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1 oder 2 ist .

SEQ ID Nr. 1:

MLTTAETTSIAYPFNTAEGLALSERYEEARNRTGLLRVRMPYGEPAWLVTRYADARL VLGDR RFSRAEALHHDEPRQSEGRRDSGILTMDPPDHTRLRTLVAKAFTVHQVEKLRPWVRQLTH DL LDDLEAAGPPADLVDRYALPIPVGVICAMLGVPQEDRPKFRVWSDAALSTSSLSAEQFAR NT DELRAYMAGLIEDHRRTPRDDIMTSLIEARDAGDRLSELELVDLCVGILVAGHETTATQI PN FVLTLLEHPDQLRRLREDPALIQGAVEELLRFVPLGVGAAQARYATEDIEVGGTLVRSGE PV LVAVGSANRDALRFDEPGVLNVARPTTQHLGFGHGVHHCLGAPLARLELQEALGALITRF PG LRLAGDIEWKDRMLVRGPRVMPIGW

SEQ ID Nr. 2:

MPYGEPAWLVTRYADARLVLGDRRFSRAEALHHDEPRQSEGRRDSGILTMDPPDHTR LRTLV AKAFTVHQVEKLRPWVRQLTHDLLDDLEAAGPPADLVDRYALPIPVGVICAMLGVPQEDR PK FRVWSDAALSTSSLSAEQFARNTDELRAYMAGLIEDHRRTPRDDIMTSLIEARDAGDRLS EL ELVDLCVGILVAGHETTATQIPNFVLTLLEHPDQLRRLREDPALIQGAVEELLRFVPLGV GA AQARYATEDIEVGGTLVRSGEPVLVAVGSANRDALRFDEPGVLNVARPTTQHLGFGHGVH HC LGAPLARLELQEALGALITRFPGLRLAGD IEWKDRMLVRGPRVMPIGW

[0027] Aminosäuresequenzen SEQ ID Nr. 1 und 2 werden vor zugsweise durch Nukleinsäuresequenzen SEQ ID Nr. 3 und 4 kodiert, wobei Nukleinsäuresequenzen SEQ ID Nr. 5 und 6 für die Expression in E.coli optimiert sind.

SEQ ID Nr. 3: ATGTTGACCACAGCCGAGACGACATCCATCGCCTATCCCTTCAACACCGCCGAAGGGCTG GC

GCTCAGCGAGCGTTACGAAGAGGCCAGGAACCGCACCGGACTGCTCCGGGTGCGGAT GCCCT

ACGGTGAGCCCGCCTGGCTGGTCACGCGGTACGCCGACGCCCGGCTGGTGCTCGGCG ACCGG

CGCTTCAGCCGTGCGGAGGCGCTCCACCACGACGAGCCGCGGCAGTCCGAAGGCCGG CGCGA

CAGCGGCATCCTGACCATGGACCCGCCCGACCACACCCGGCTGCGCACCCTCGTCGC CAAGG

CGTTCACCGTCCACCAGGTGGAGAAACTCCGCCCCTGGGTACGCCAGTTGACCCATG ACCTG

CTCGACGACCTCGAGGCCGCCGGGCCGCCCGCCGATCTGGTGGACCGCTACGCCCTG CCCAT

TCCGGTCGGCGTCATCTGCGCCATGCTCGGCGTCCCGCAGGAGGACCGGCCCAAGTT CCGGG

TCTGGAGCGACGCCGCGCTGTCCACCAGCTCGCTGAGCGCCGAGCAGTTCGCCCGTA ACACC

GACGAGCTGCGCGCCTACATGGCCGGGCTGATCGAGGACCACCGCAGGACCCCGCGG GACGA

CATCATGACCTCGCTGATCGAGGCGCGGGACGCGGGCGACCGGCTGTCCGAGCTGGA ACTCG

TCGATCTGTGCGTGGGCATCCTGGTGGCCGGGCACGAGACCACCGCCACCCAGATCC CCAAC

TTCGTGCTGACGCTGCTGGAGCACCCGGACCAGCTGCGCCGGCTGCGCGAGGACCCC GCCCT

GATCCAGGGCGCCGTCGAGGAGCTGCTGCGCTTCGTCCCGCTGGGCGTGGGCGCCGC CCAGG

CCCGTTACGCCACCGAGGACATCGAGGTGGGCGGCACGCTGGTGCGCAGCGGGGAGC CGGTG

CTGGTCGCCGTCGGCTCGGCCAACCGCGACGCGCTGCGCTTCGACGAACCGGGCGTG CTCAA

CGTCGCCCGCCCCACCACCCAGCACCTCGGCTTCGGCCACGGTGTGCACCACTGCCT GGGCG

CGCCCCTGGCCCGTCTGGAGCTCCAGGAGGCGCTCGGCGCGCTGATCACGCGCTTCC CGGGC

CTGCGGCTGGCCGGGGACATCGAGTGGAAGGACCGCATGCTGGTCCGCGGGCCCCGT GTCAT

GCCCATCGGGTGGTGA

SEQ ID Nr. 4:

ATGCCCTACGGTGAGCCCGCCTGGCTGGTCACGCGGTACGCCGACGCCCGGCTGGTG CTCGG

CGACCGGCGCTTCAGCCGTGCGGAGGCGCTCCACCACGACGAGCCGCGGCAGTCCGA AGGCC

GGCGCGACAGCGGCATCCTGACCATGGACCCGCCCGACCACACCCGGCTGCGCACCC TCGTC

GCCAAGGCGTTCACCGTCCACCAGGTGGAGAAACTCCGCCCCTGGGTACGCCAGTTG ACCCA

TGACCTGCTCGACGACCTCGAGGCCGCCGGGCCGCCCGCCGATCTGGTGGACCGCTA CGCCC

TGCCCATTCCGGTCGGCGTCATCTGCGCCATGCTCGGCGTCCCGCAGGAGGACCGGC CCAAG

TTCCGGGTCTGGAGCGACGCCGCGCTGTCCACCAGCTCGCTGAGCGCCGAGCAGTTC GCCCG

TAACACCGACGAGCTGCGCGCCTACATGGCCGGGCTGATCGAGGACCACCGCAGGAC CCCGC

GGGACGACATCATGACCTCGCTGATCGAGGCGCGGGACGCGGGCGACCGGCTGTCCG AGCTG

GAACTCGTCGATCTGTGCGTGGGCATCCTGGTGGCCGGGCACGAGACCACCGCCACC CAGAT

CCCCAACTTCGTGCTGACGCTGCTGGAGCACCCGGACCAGCTGCGCCGGCTGCGCGA GGACC

CCGCCCTGATCCAGGGCGCCGTCGAGGAGCTGCTGCGCTTCGTCCCGCTGGGCGTGG GCGCC

GCCCAGGCCCGTTACGCCACCGAGGACATCGAGGTGGGCGGCACGCTGGTGCGCAGC GGGGA

GCCGGTGCTGGTCGCCGTCGGCTCGGCCAACCGCGACGCGCTGCGCTTCGACGAACC GGGCG

TGCTCAACGTCGCCCGCCCCACCACCCAGCACCTCGGCTTCGGCCACGGTGTGCACC ACTGC CTGGGCGCGCCCCTGGCCCGTCTGGAGCTCCAGGAGGCGCTCGGCGCGCTGATCACGCGC TT

CCCGGGCCTGCGGCTGGCCGGGGACATCGAGTGGAAGGACCGCATGCTGGTCCGCGG GCCCC

GTGTCATGCCCATCGGGTGGTGA

SEQ ID Nr. 5:

ATGCTGACCACCGCAGAAACCACCAGTAT TGCATATCCGTTTAATACCGCAGAAGGTCTGGC ACTGAGCGAACGTTATGAAGAAGCACGTAATCGTACCGGTCTGCTGCGTGTTCGTATGCC GT ATGGTGAACCGGCATGGCTGGTTACCCGTTATGCAGATGCCCGTCTGGTTCTGGGTGATC GT CGTTTTAGCCGTGCCGAAGCACTGCATCACGATGAACCGCGTCAGAGCGAAGGTCGTCGT GA TAGCGGTATTCTGACCATGGATCCGCCTGATCATACCCGTCTGCGTACCCTGGTTGCAAA AG CATTTACCGTTCATCAGGTTGAAAAACTGCGTCCGTGGGTTCGCCAGCTGACCCATGATC TG CTGGATGATCTGGAAGCAGCAGGTCCGCCTGCAGATCTGGTTGATCGTTATGCACTGCCG AT TCCGGTTGGTGTTATTTGTGCAATGCTGGGTGTTCCGCAAGAAGATCGTCCTAAATTTCG TG TTTGGAGTGATGCAGCACTGAGCACCAGCAGC CTGAGCGCAGAACAGTTTGCACGTAATACC GATGAACTGCGTGCATATATGGCAGGTCTGATTGAAGATCATCGTCGTACACCGCGTGAT GA TATTATGACCAGCCTGATCGAAGCACGTGATGCCGGTGATCGCCTGAGTGAACTGGAACT GG TGGATCTGTGTGTTGGTATTCTGGTTGCAGGTCATGAAACCACCGCAACCCAGATTCCGA AT TTTGTTCTGACCCTGCTGGAACATCCGGATCAGCTGCGTCGTCTGCGTGAAGATCCGGCA CT GATTCAGGGTGCAGTTGAAGAACTGCTGCGTTTTGTTCCGCTGGGTGTGGGTGCAGCACA GG CACGTTATGCAACCGAAGATATTGAAGTTGGTGGCACCCTGGTTCGTAGTGGCGAACCGG TG CTGGTTGCCGTTGGTAGCGCAAACCGTGATGCACTGCGCTTTGATGAACCGGGTGTTCTG AA TGTTGCACGTCCGACCACACAGCATCTGGGTTTTGGTCATGGTGTTCATCATTGTCTGGG TG CACCGCTGGCACGTCTGGAACTGCAAGAAGCACTGGGAGCACTGATTACCCGTTTTCCGG GT CTGCGTCTGGCAGGCGATATTGAATGGAAAGATCGTATGCTGGTTCGTGGTCCGCGTGTT AT GCCGATTGGTTGGTAA

SEQ ID Nr. 6:

ATGGTGAACCGGCATGGCTGGTTACCCGTTATGCAGATGCCCGTCTGGTTCTGGGTG ATCGT CGTTTTAGCCGTGCCGAAGCACTGCATCACGATGAACCGCGTCAGAGCGAAGGTCGTCGT GA TAGCGGTATTCTGACCATGGATCCGCCTGATCATACCCGTCTGCGTACCCTGGTTGCAAA AG CATTTACCGTTCATCAGGTTGAAAAACTGCGTCCGTGGGTTCGCCAGCTGACCCATGATC TG CTGGATGATCTGGAAGCAGCAGGTCCGCCTGCAGATCTGGTTGATCGTTATGCACTGCCG AT TCCGGTTGGTGTTATTTGTGCAATGCTGGGTGTTCCGCAAGAAGATCGTCCTAAATTTCG TG TTTGGAGTGATGCAGCACTGAGCACCAGCAGC CTGAGCGCAGAACAGTTTGCACGTAATACC GATGAACTGCGTGCATATATGGCAGGTCTGATTGAAGATCATCGTCGTACACCGCGTGAT GA TATTATGACCAGCCTGATCGAAGCACGTGATGCCGGTGATCGCCTGAGTGAACTGGAACT GG TGGATCTGTGTGTTGGTATTCTGGTTGCAGGTCATGAAACCACCGCAACCCAGATTCCGA AT

TTTGTTCTGACCCTGCTGGAACATCCGGATCAGCTGCGTCGTCTGCGTGAAGATCCG GCACT

GATTCAGGGTGCAGTTGAAGAACTGCTGCGTTTTGTTCCGCTGGGTGTGGGTGCAGC ACAGG

CACGTTATGCAACCGAAGATATTGAAGTTGGTGGCACCCTGGTTCGTAGTGGCGAAC CGGTG

CTGGTTGCCGTTGGTAGCGCAAACCGTGATGCACTGCGCTTTGATGAACCGGGTGTT CTGAA

TGTTGCACGTCCGACCACACAGCATCTGGGTTTTGGTCATGGTGTTCATCATTGTCT GGGTG

CACCGCTGGCACGTCTGGAACTGCAAGAAGCACTGGGAGCACTGATTACCCGTTTTC CGGGT

CTGCGTCTGGCAGGCGATATTGAATGGAAAGATCGTATGCTGGTTCGTGGTCCGCGT GTTAT

GCCGATTGGTTGGTAA

[0028] „Ident", wie hier verwendet, bedeutet, dass zwei oder mehr Aminosäuresequenzen, wenn diese übereinander gela gert werden, eine bestimmte „Identität" (übereinstimmende Aminosäurereste an identen Positionen) zueinander aufwei sen können. „Identität" wird in dieser Erfindung defi niert als die Prozentzahl der Aminosäuren der in Frage kommenden Aminosäuresequenzen, die identisch mit den Ami nosäuren der Ausgangssequenz sind, und zwar nach Abgleich der beiden Sequenzen und der Einführung von Lücken, falls notwendig, um die maximale prozentuale Sequenzidentität zu erzielen wie sie durch das Programm „Protein BLAST" (blastp; Altschul et al., J. Mol. Biol. (1997) 215:403- 410; http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi; hier im Allgemeinen als "BLAST" bezeichnet) erzeugt werden, wobei alle variablen Parameter auf Default-Werte gesetzt sind. Hierin wird der Algorithmus "blastp (Protein-Protein- BLAST) " mit folgenden Parametern verwendet: „expect threshold": 0.05; „word size": 6; Matrix: BLOSUM62; „Gap costs": „Existence" 11, „Extension" 1; bedingte komposi tioneile Score-Matrixanpassung; kein Filter und keine Maske. Ein prozentualer (%) Wert für die Aminosäurese quenzidentität wird durch die Zahl der übereinstimmenden identischen Nukleotide dividiert durch die Sequenzlänge, für welche die prozentuale Identität festgehalten wird, bestimmt.

[0029] Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung be trifft ein Verfahren zur Herstellung eines Steroids oder eines Derivats davon mit der allgemeinen Formel (II)

(II), wobei

Xi und X2 unabhängig voneinander H, Ci, F, Br, I, CF ₃ , ein Ci bis C ₆ Alkylrest, OH, ein Ci bis C ₆ Alkoxyrest, CN, N0 ₂ , N(R ₆ ) ₂ , eine Epoxygruppe, CHO oder ein C0 ₂ R ₆ -Rest sind, wobei

Re -C(0)H, -C(0)CH ₃ , -C(0)CH ₂ CH ₃ , -C (0)(CH ₂ ) ₂ CH ₃ , - C (0)CH (CH ₃ ) ₂ , -C (0)(CH ₂ ) ₃ CH ₃ , -C (0)CH (CH ₃ )CH ₂ CH ₃ , - C (0)CH ₂ CH ₂ (CH ₃ )2, -C(0)C(CH ₃ ) ₃ , -C (0)Ph, - C (0)CH ₂ Ph ist,

Ri und R ₂ unabhängig voneinander H, OH, OR ₇ oder 0 sind, wobei

R ₇ -C(0)H, -C(0)CH ₃ , -C(0)CH ₂ CH ₃ , -C (0)(CH ₂ ) ₂ CH ₃ , - C (0)CH (CH ₃ ) ₂ , -C (0)(CH ₂ ) ₃ CH ₃ , -C (0)CH (CH ₃ )CH ₂ CH ₃ , - C (0)CH2CH2(CH ₃ )2, -C(0)C(CH ₃ ) ₃ , -C (0)Ph, - C (0)CH ₂ Ph ist,

R ₃ H, OH, ORs, ein Ci bis C ₁₀ Alkylrest, ein Ci bis C ₁₀ Alkenylrest, -CHO, -C(0) (CH ₃ ) , -C (0) (CH ₂ 0H) , - CH (CH ₃ ) C (0) CH ₃ , -CH (CH ₃ ) ( (CH ₂ ) 2CO2R9) oder - CH (CH ₃ ) ( (CH ₂ ) 2CONHR9) ist, wobei

Rs -C (0)H, -C(0)CH ₃ , -C(0)CH ₂ CH ₃ , -C (0)(CH ₂ ) ₂ CH ₃ , - C (0)CH (CH ₃ )2, -C (0)(CH ₂ ) ₃ CH ₃ , -C (0)CH (CH ₃ )CH ₂ CH ₃ , - C (0)CH2CH2(CH ₃ )2, -C(0)C(CH ₃ ) ₃ , -C (0)Ph, oder - C(0)CH ₂ Ph ist, und

Rg -CH ₃ , -CH2COOH, -CH ₂ CH ₃ , -CH(CH ₃ ) ₂ , -(CH ₂ ) ₂ CH ₃ , - (CH ₂ ) ₂ S0 ₃ H, C(CH ₃ ) ₃ , - (CH ₂ ) ₃ CH ₃ , -CH (CH ₃ )CH ₂ CH ₃ ,- CH2CH2(CH ₃ ) ₂ , eine Arylgruppe oder eine Alkylaryl gruppe ist, R4 H, OH, oder -OR10 ist, wobei

Rio -C (0)H, -C(0)CH ₃ , -C(0)CH ₂ CH ₃ , -C (0)(CH ₂ ) ₂ CH ₃ ,- C (0)CH (CH ₃ )2, -C (0)(CH ₂ ) ₃ CH ₃ , -C (0)CH (CH ₃ )CH ₂ CH ₃ , - C (0)CH ₂ CH ₂ (CH ₃ )2, -C(0)C(CH ₃ ) ₃ , -C (0)Ph, oder - C(0)CH ₂ Ph ist und

R5 H, CF ₃ , ein Ci bis C ₆ Alkylrest, ein Ci bis C ₆ Alkenyl- rest, OH, 0, oder ein Ci bis C ₆ Alkoxyrest ist, wobei die gestrichelte Linie eine optionale Doppelbindung bedeutet, mit der Maßgabe, dass der B-Ring keine Doppelbindung aufweist, wenn der A-Ring eine C4-C5-Doppelbindung und der C-Ring keine Doppelbindung aufweist, wenn Xi und X ₂ eine Epoxygruppe ausbil den umfassend den Schritt des Umsetzens eines 7-Desoxysteroids oder eines Derivats davon mit der allgemeinen Formel (I) mit Cytochrom P450 oder einer funktionellen Variante davon, dadurch gekennzeichnet, dass das Cytochrom P450-Enzym eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 80 %, vorzugswei se mindestens 90%, insbesondere 100%, ident ist mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1 oder 2.

[0030] Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens können 7- Desoxysteroide bzw. Derivate davon mit der allgemeinen Formel (I) mit erfindungsgemäßem Cytochrom P450 oder ei ner funktionellen Variante davon zu Steroiden bzw. Deri vaten davon mit der allgemeinen Formel (II) umgesetzt werden .

[0031] Um die Redoxreaktion von erfindungsgemäßem Cytochrom P450 bzw. deren funktionellen Varianten davon zu unter stützen, ist es von Vorteil, das erfindungsgemäße Verfah- ren in Anwesenheit eines Reduktionsmittels durchzuführen. Als Reduktionsmittel können NAD(P)H, Flavine oder Ferre- doxine eingesetzt werden. Werden beispielsweise die Re- doxcofaktoren NAD(P)+ und/oder NAD(P)H eingesetzt, ist es von Vorteil, diese in einer Reaktionsmischung mit einer Konzentration von 0,001 mM und 10 mM, noch mehr bevorzugt zwischen 0,05 mM und 1 mM, einzusetzen.

[0032] Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise in Anwesenheit von Redoxpartnern für Cytochrom P450 durchge führt. Unter Redoxpartner versteht man Proteine der Klas sen der Ferredoxine und Ferredoxin-Reduktasen, die für die Funktion von Cytochrom P450 gemäß der vorliegenden Erfindung von Vorteil sind. Ein mögliches Paar von Redox partnern umfasst vorzugsweise Putidaredoxin und Putidare- doxin-Reduktase aus Pseudomonas putida. Eine fachkundige Person wird darüber hinaus in der Lage sein, weitere Fer- redoxin-Proteine und Ferredoxin-Reduktasen zu identifi zieren, welche potentielle Redoxpartner für das erfin dungsgemäße Cytochrom P450 sind. Die Eignung als Redox partner lässt sich in einem funktionellen Assay überprü fen, wie beispielsweise in den Beispielen 3 bis 5 be schrieben. Das in diesen Beispielen verwendete Putidare doxin und/oder die darin verwendete Putidaredoxin- Reduktase kann durch mögliche alternative Proteine bzw. Enzyme ersetzt werden. Wird eine ausreichende Bildung des gewünschten Produkts (z.B. Ursocholsäure) beobachtet, so können die getesteten Redoxpartner als funktionelle Al ternativen zu Putidaredoxin und/oder Putidaredoxin- Reduktase betrachtet werden.

[0033] Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Ferredoxin eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 85%, noch mehr bevorzugt mindestens 90%, noch mehr bevorzugt min destens 95%, noch mehr bevorzugt mindestens 96%, noch mehr bevorzugt mindestens 97%, noch mehr bevorzugt min destens 98%, noch mehr bevorzugt mindestens 99%, insbe sondere 100%, ident ist mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 7, wobei X ein Methionin-Rest oder keine Aminosäure ist.

SEQ ID Nr. 7:

XSKVVYVSHDGTRRELDVADGVSLMQAAVSNGI YDIVGDCGGSASCATCHVYVNEAFTDK VPAANEREIGMLECVTAELKPNSRLCCQI IMTPELDGIW DVPDRQW

[0034] Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Ferredoxin-Reduktase eine Aminosäu resequenz auf, die mindestens 80%, vorzugsweise mindes tens 85%, noch mehr bevorzugt mindestens 90%, noch mehr bevorzugt mindestens 95%, noch mehr bevorzugt mindestens 96%, noch mehr bevorzugt mindestens 97%, noch mehr bevor zugt mindestens 98%, noch mehr bevorzugt mindestens 99%, insbesondere 100%, ident ist mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 8.

SEQ ID Nr. 8:

MNANDNW IVGTGLAGVEVAFGLRASGWEGNIRLVGDATVIPHHLPPLSKAYLAGKATAE SLYLRTPDAYAAQNIQLLGGTQVTAINRDRQQVILSDGRALDYDRLVLATGGRPRPLPVA SGAVGKANNFRYLRTLEDAECIRRQLIADNRLW IGGGYIGLEVAATAIKANMHVTLLDT AARVLERVTAPPVSAFYEHLHREAGVDIRTGTQVCGFEMSTDQQKVTAVLCEDGTRLPAD LVIAGIGLIPNCELASAAGLQVDNGIVINEHMQTSDPLIMAVGDCARFHSQLYDRWVRIE SVPNALEQARKIAAILCGKVPRDEAAPWFWSDQYEIGLKMVGLSEGYDRI IVRGSLAQPD FSVFYLQGDRVLAVDTVNRPVEFNQSKQI ITDRLPVEPNLLGDESVPLKEIIAAAKAELS SA

[0035] Aminosäuresequenzen SEQ ID Nr. 7 und 8 werden vor zugsweise durch Nukleinsäuresequenzen SEQ ID Nr. 9 bzw.

10 kodiert, wobei Nukleinsäuresequenzen SEQ ID Nr. 11 bzw. 12 für die Expression in E.coli optimiert sind.

SEQ ID Nr. 9: ( ATG ) 0 oder 1

TCTAAAGTAGTGTATGTGTCACATGATGGAACGCGTCGCGAACTGGATGTGGCGGAT GGC

GTCAGCCTGATGCAGGCTGCAGTCTCCAATGGTATCTACGATATTGTCGGTGATTGT GGC

GGCAGCGCCAGCTGTGCCACCTGCCATGTCTATGTGAACGAAGCGTTCACGGACAAG GTG

CCCGCCGCCAACGAGCGGGAAATCGGCATGCTGGAGTGCGTCACGGCCGAACTGAAG CCG

AACAGCAGGCTCTGCTGCCAGATCATCATGACGCCCGAGCTGGATGGCATCGTGGTC GAT

GTTCCCGATAGGCAATGGTAA

SEQ ID Nr. 10:

ATGAACGCAAACGACAACGTGGTCATCGTCGGTACCGGACTGGCTGGCGTTGAGGTC GCC TTCGGCCTGCGCGCCAGCGGCTGGGAAGGCAATATCCGGTTGGTGGGGGATGCGACGGTA ATTCCCCATCACCTACCACCGCTATCCAAAGCTTACTTGGCCGGCAAAGCCACAGCGGAA AGCCTGTACCTGAGAACCCCAGATGCCTATGCAGCGCAGAACATCCAACTACTCGGAGGC ACACAGGTAACGGCTATCAACCGCGACCGACAGCAAGTAATCCTATCGGATGGCCGGGCA CTGGATTACGACCGGCTGGTATTGGCTACCGGAGGGCGTCCAAGACCCCTACCGGTGGCC AGTGGCGCAGTTGGAAAGGCGAACAACTTTCGATACCTGCGCACACTCGAGGACGCCGAG TGCATTCGCCGGCAGCTGATTGCGGATAACCGTCTGGTGGTGATTGGTGGCGGCTACATT GGCCTTGAAGTGGCTGCCACCGCCATCAAGGCGAACATGCACGTCACCCTGCTTGATACG GCAGCCCGGGTTCTGGAGCGGGTTACCGCCCCGCCGGTATCGGCCTTTTACGAGCACCTA CACCGCGAAGCCGGCGTTGACATACGAACCGGCACGCAGGTGTGCGGGTTCGAGATGTCG ACCGACCAACAGAAGGTTACTGCCGTCCTCTGCGAGGACGGCACAAGGCTGCCAGCGGAT CTGGTAATCGCCGGGATTGGCCTGATACCAAACTGCGAGTTGGCCAGTGCGGCCGGCCTG C AG GTT GAT AAC GGCATCGTGAT C AAC GAAC AC AT G CAGAC CTCTGATCCCTTGATCATG GCCGTCGGCGACTGTGCCCGATTTCACAGTCAGCTCTATGACCGCTGGGTGCGTATCGAA TCGGTGCCCAATGCCTTGGAGCAGGCACGAAAGATCGCCGCCATCCTCTGTGGCAAGGTG CCACGCGATGAGGCGGCGCCCTGGTTCTGGTCCGATCAGTATGAGATCGGATTGAAGATG GTCGGACTGTCCGAAGGGTACGACCGGATCATTGTCCGCGGCTCTTTGGCGCAACCCGAC TTCAGCGTTTTCTACCTGCAGGGAGACCGGGTATTGGCGGTCGATACAGTGAACCGTCCA GTGGAGTTCAACCAGTCAAAACAAATAATCACGGATCGTTTGCCGGTTGAACCAAACCTA CTCGGTGACGAAAGCGTGCCGTTAAAGGAAATCATCGCCGCCGCCAAAGCTGAACTGAGT AGTGCCTGA

SEQ ID Nr. 11:

(ATG ) 0 oder 1

ATGAGCAAAGTGGTCTATGTGTCGCATGATGGAACACGCCGTGAGTTAGACGTCGCT GAT

GGTGTATCCCTGATGCAAGCAGCGGTTAGCAATGGCATTTACGACATCGTTGGCGAT TGT GGTGGTAGTGCGTCATGTGCAACGTGTCACGTGTATGTTAACGAAGCGTTTACCGATAAG

GTGCCTGCTGCCAATGAACGCGAGATTGGCATGCTGGAATGCGTAACTGCCGAACTC AAA

CCGAACTCTCGCCTGTGCTGCCAGATCATCATGACCCCGGAATTGGACGGGATTGTC GTT

GATGTGCCAGATCGTCAGTGGTAA

SEQ ID Nr. 12:

ATGAACGCCAATGATAATGTTGTTATTGTTGGCACCGGTCTGGCAGGCGTTGAAGTT GCA TTTGGTCTGCGTGCAAGCGGTTGGGAAGGTAATATTCGTCTGGTTGGTGATGCAACCGTT ATTCCGCATCATCTGCCTCCGCTGAGCAAAGCATATCTGGCAGGTAAAGCAACCGCAGAA AGCCTGTATCTGCGTACACCGGATGCCTATGCAGCACAGAATATTCAGCTGCTGGGTGGT ACACAGGTTACCGCAATTAATCGTGATCGTCAGCAGGTTATTCTGAGTGATGGTCGTGCA CTGGATTATGATCGTCTGGTGCTGGCAACCGGTGGTCGTCCGCGTCCGCTGCCGGTTGCA AGTGGTGCAGTTGGTAAAGCCAATAACTTTCGTTATCTGCGCACCCTGGAAGATGCAGAA TGTATTCGTCGTCAGCTGATTGCAGATAATCGCCTGGTTGTGATTGGTGGTGGTTATATT GGTCTGGAAGTTGCAGCAACCGCCATTAAAGCAAATATGCATGTTACCCTGCTGGATACC GCAGCACGTGTTCTGGAACGTGTTACCGCACCGCCTGTTAGCGCCTTTTATGAACATCTG CATCGTGAAGCCGGTGTTGATATTCGTACCGGCACCCAGGTTTGTGGTTTTGAAATGAGC ACCGATCAGCAGAAAGTTACCGCAGTTCTGTGTGAAGATGGCACCCGTCTGCCTGCAGAT CTGGTTATTGCAGGTATTGGCCTGATTCCGAATTGTGAACTGGCAAGCGCAGCAGGTCTG CAGGTTGATAATGGTATTGTTATTAACGAACACATG CAGACCAGCGATCCGCTGATTATG GCAGTTGGTGATTGTGCACGTTTTCATAGCCAGCTGTATGATCGTTGGGTTCGTATTGAA AGCGTTCCGAATGCACTGGAACAGGCACGTAAAATTGCAGCAATTCTGTGTGGTAAAGTT CCGCGTGATGAAGCAGCACCGTGGTTTTGGAGCGATCAGTATGAAATTGGTCTGAAAATG GTTGGTCTGAGCGAAGGTTATGATCGCATTATTGTTCGTGGTAGCCTGGCACAGCCGGAT TTTTCAGTTTTTTATCTGCAGGGTGATCGTGTGCTGGCAGTTGATACCGTTAATCGTCCG GTTGAATTTAACCAGAGCAAACAAATTATCACCGATCGTCTGCCGGTGGAACCGAATCTG CTGGGAGATGAAAGCGTGCCGCTGAAAGAAAT TATTGCAGCAGCAAAAGCAGAACTGAGC AGCGCATAA

[0036] Die Expression des erfindungsgemäßen Cytochroms P450 und etwaigen Ferredoxinen und Ferredoxin-Reduktasen in Bakterien, insbesondere in E. coli, ist besonders vor teilhaft unter Verwendung von Nukleinsäuren mit den Nuk leinsäuresequenzen SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 11 und/oder SEQ ID Nr. 12. Daher betreffen weitere Aspek te der vorliegenden Erfindung eine Nukleinsäure (DNA und/oder RNA) mit einer Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 11 und SEQ ID Nr. 12 und Vektoren und/oder Zellen, insbesondere E. coli Zellen, umfassend mindestens eine dieser Sequenzen.

[0037] Es hat sich gezeigt, dass es besonders vorteilhaft ist, wenn die oben genannten Ferredoxine und Ferredoxin- Reduktasen gemeinsam mit Cytochrom P450 in einem Produk tionsstamm (z.B. E. coli Stamm) gemeinsam exprimiert (co- exprimiert) werden. Durch die Co-Expression der drei Pro teine bzw. Enzyme, idealerweise unter demselben Promoter, kann ein ideales Gleichgewicht zwischen den Enzymen her gestellt werden, welches sich besonders vorteilhaft auf die enzymatische Umsetzung eines Substrats auswirkt.

[0038] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorlie genden Erfindung wird das erfindungsgemäße Verfahren bei einer Temperatur von 10°C bis 40°C, vorzugsweise von 15°C bis 38°C, noch mehr bevorzugt von 20°C bis 30°C, noch mehr bevorzugt von 22°C bis 26°C, durchgeführt. Es hat sich erfindungsgemäß gezeigt, dass die Enzymaktivität von Cytochrom P450 für die erfindungsgemäße Reaktion in die sem Bereich besonders hoch ist.

[0039] Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das erfindungsgemäße Verfah ren bei einem pH Wert von 6,5 bis 8,5, vorzugsweise von 7 bis 8, noch mehr bevorzugt von 7,2 bis 7,8, durchgeführt. Die Enzymaktivität von Cytochrom P450 ist bei diesem pH Wert am höchsten, um einen entsprechenden Umsatz des Sub strats zu gewähren.

[0040] Die Hydroxylierung von Desoxysteroiden bzw. Desoxys- teroidderivaten kann regioselektiv an der Position 7 des Steroid-Grundgerüsts erfolgten. Dadurch kann insbesondere stereoselektiv eine 7beta-Hydroxylgruppe eingeführt wer den, so dass z.B. Ursocholsäure und/oder Ursocholsäurede- rivate hergestellt werden können.

[0041] Bei dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Isolierung des Produkts auf unterschiedliche Art und Weise erfolgen. Beispielsweise kann das Produkt durch ein geeignetes organisches Lösungsmittel aus der Reakti- onsmischung extrahiert werden. Je nach Substrat sind sol che Lösungsmittel in der Literatur beschrieben. Cholsäu- ren und deren Derivate gemäß der vorliegenden Erfindung können aus Reaktionsmischungen zum Beispiel mit Ethyl- acetat isoliert werden, ggf. nach Ansäuern der Reaktions mischung, z.B. mit HCl. Einen speziellen Fall stellt ein Verfahren dar, bei dem Gallensäuren in Form eines Salzes, z.B. eines Natriumsalzes in wässriger Lösung vorliegen.

In diesem Fall kann eine Fällung des Produkts durch An säuern der Reaktionsmischung erfolgen. Dazu kann der Re aktionsmischung, z.B. HCl oder verdünnte HCl in ausrei chender Menge zugesetzt werden. Wird dabei ein pH-Wert von zum Beispiel 1 bis 4, vorzugsweise von 2 bis 3 er reicht, liegt das Produkt überwiegend in Form einer Sus pension vor. Das Produkt kann dann durch gängige Metho den, wie z.B. Filtration oder Zentrifugation aus der Re aktionsmischung entfernt werden. Eine weitere Alternati ve, die beispielsweise zur Produktisolierung verwendet werden kann sind chromatographische Methoden, wie z.B. Säulenchromatographie oder Flashchromatographie. Weiter hin ist beispielsweise die Gewinnung von Produkt durch die Verdampfung des Reaktions-Lösungsmittels möglich.

[0042] Alternativ kann bei einem Verfahren gemäß der vorlie genden Erfindung das/die Produkt(e) nach der Reaktion auch in der Reaktionsmischung verbleiben, z.B. um noch weitere Reaktionen durchzuführen und ggf. nach Anschluss dieser Reaktionen ein Endprodukt zu isolieren. Ebenso ist es denkbar, dass das Substrat/die Substrate für das Ver fahren gemäß vorliegender Erfindung durch vorangegangene oder parallel ablaufende Reaktionen im selben Reaktions ansatz erzeugt werden.

BEISPIELE

[0043] Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele eingehender dargelegt, ohne jedoch darauf be schränkt zu sein.

[0044] Beispiel 1: Test von Bakterienstämmen [0045] Die folgenden bakteriellen Stämme wurden bei der Deutschen Stammsammlung für Mikroorganismen und Zellkul turen (DSMZ) bezogen: Saccharothrix longispora (DSM- 43749), Catellatospora citrae (DSM-44097), Streptomyces hygroscopicus subsp. hygroscopicus (DSM-40578) und Asanoa ferruginea (DSM-44099). Die Stämme wurden unter Standard bedingungen kultiviert, wie von DSMZ empfohlen. Sobald das Wachstum der Kulturen zu einer sichtbaren Trübung ge führt hatte, wurde Desoxycholsäure (0,5 mM) zugegeben und für bis zu 72 h weiter kultiviert. Überstände der Kultu ren wurden nach einem Zentrifugationsschritt mit Ethyl- acetat extrahiert und mittels HPLC und GC/MS analysiert. Im HPLC-Chromatogramm der Reaktion mit Streptomyces hyg roscopicus wurde ein Peak registriert, dessen Retentions zeit mit der von Ursocholsäure übereinstimmt. Die GC/MS- Analyse ergab einen Hinweis darauf, dass der potentielle Ursocholsäure-Peak von einer Gallensäure mit 3 Hydro xylgruppen stammt. Die Untersuchung der anderen Stämme ergab keinen Hinweis auf 7-hydroxylierte Produkte von Desoxycholsäure .

[0046] Beispiel 2: Genomsequenzierung und Annotierung der P450-Gene

[0047] Nach Kultivierung von Streptomyces hygroscopicus subsp. hygroscopicus (DSM-40578) entsprechend der Vor schrift von DSMZ wurde die genomische DNA des Stamms iso liert (Kieser et al. (2000), Practical Streptomyces ge- netics (Norwich: John Innes Foundation)). Das Genom wurde mittels Illumina MiSeq sequenziert und ein Assembly ba sierend auf dem bekannten Genom von Streptomyces ra- pamycinicus durchgeführt (Microsynth GmbH, Switzerland). Durch Homologie-Vergleiche konnten 42 P450-Gene identifi ziert werden.

[0048] Beispiel 3: Klonierung Expressions-System

[0049] Unter Verwendung des Restriktionsenzyms Xhol wurde folgendes Konstrukt umfassend kodierende Regionen für Putidaredoxin-Reduktase (PtR) und Putidaredoxin (Ptx) in das Plasmid pJ411 (DNA 2.0) kloniert. [0050] Synthetische DNA (Life Technologies): 5', Xhol- Schnittstelle, Hindlll-Schnittstelle, ca. 50 bp spacer- DNA, ribosome binding site (rbs), ORF (open reading fra- me; offener Leserahmen) Putidaredoxin-Reduktase (PtR), ca. 50 bp spacer-DNA, rbs, ORF Putidaredoxin (Ptx), Xhol- Schnittstelle, 3'.

[0051] Das Ergebnis des Klonierungs-Schritts wurde mittels Restriktionsenzym-Verdau und DNA-Sequenzierung überprüft.

[0052] Anschließend wurde unter Verwendung der Restriktions enzyme Ndel und Hindlll jeweils ein ORF kodierend für die P450-Hydroxylasen, die in Beispiel 2 identifiziert wur den, in die oben erwähnte synthetische DNA bzw. Plasmid (Life Technologies) kloniert. Das Ergebnis wurde wieder mit Restriktionsenzym-Verdau und DNA-Sequenzierung veri fiziert. Der in diesem Beispiel verwendete Expressions vektor sowie die verwendeten Redoxpartner stellen nur ei ne beispielhaft ausgewählte Möglichkeit dar, die erfin dungsgemäßen Cytochrom P450 Enzyme zu exprimieren.

[0053] Die mit den identifizierten P450-Kandidaten (s. Bei spiel 2) hergestellten Expressionsplasmide, können zur gemeinsamen Expression der jeweiligen P450 Proteine ge meinsam mit Putidaredoxin-Reduktase und Putidaredoxin verwendet werden. Die 3 ORFs der jeweiligen Expressions plasmide werden unter Kontrolle eines T7-Promotors auf einer gemeinsamen mRNA aber als getrennte Polypeptide ex- primiert .

[0054] Beispiel 4: Expression P450/Ptx/PtR

[0055] Nach der Genom-Sequenzierung von Streptomyces hyg- roscopicus subsp. hygroscopicus lagen 42 P450-Sequenzen vor, die als Kandidaten für eine mögliche Desoxycholsäu- re-7-Hydroxylase in Frage kamen. Zur Identifizierung des gesuchten Enzyms wurden ORFs der Kandidaten in das in Beispiel 3 beschriebene Expressions-System und in einen pJ411 (DNA 2.0) Expressionsvektor ohne kodierende Regio nen für Putidaredoxin-Reduktase (PtR) und Putidaredoxin (Ptx) kloniert. Zur Expression wurde folgendes Protokoll verwendet . TB-P450-Expressionsmedium:

Terrific broth (TB) Medium + 50 gg/ml Kanamycin

+ 0.5 mM 5-Aminolävulinsäure (von lOOx Stammlösung)

+ 1 mM Thiamin (von lOOx Stammlösung)

+ 1 mM MgCl2 + 2.5 mM Ammoniumsulfat + 50 mM FeCl3 (von lOOx Stammlösung)

+ 0.5 mM IPTG (von 1 M Stammlösung)

(die Zusätze wurden jeweils 0.2 gm sterilfiltriert)

P450 Lysepuffer:

100 mM Tris pH 7,5 20 % (v/v) Glycerin

1 mg/ml Lysozym

[0056] Die zu testenden Konstrukte der P450-Kandidaten wur den in den E. coli Expressionsstamm BL21 (DE3) transfor miert. Von Einzelkolonien wurden Übernachtkulturen ange impft (LB (lysogeny broth) + Kanamycin). Am nächsten Tag wurden damit 1:100 Expressionskulturen angeimpft (150 ml TB (terrific broth)-P450-Expressionsmedium) und in Schi kanenkolben (1 L) zunächst bei 37°C für 3 h geschüttelt. Anschließend wurde die Temperatur auf 24°C gesenkt und 22 h weitergeschüttelt. Die Kulturen wurden durch Zentrifu gation bei 5000 g für 10 min geerntet, lx mit 0.9 % (w/v) NaCl gewaschen und Pellets bei -80°C eingefroren. Die Zellpellets wurden aufgetaut, gewogen und mit einer äqui valenten Menge P450-Lysepuffer resuspendiert, 1 h auf Eis inkubiert und anschließend mittels Sonifier aufgeschlos sen. Nach Zentrifugation (30 min, 21000 g) wurden die Überstände für Test-Reaktionen verwendet.

[0057] Beispiel 5: Test von P450-Kandidaten auf DA- Hydroxylierung

[0058] Reaktions-Mischung:

10-80 mΐ 100 mM NADH (Redoxcofaktor) 250 mΐ 1 M Tris-HCl pH 7,5 17,5 mΐ Glycerin (50%)

100 mΐ 50 mM Desoxycholsäure-Lösung pH 8,5 (final 10 mM)

50 mΐ E. coli Lysat P450/PtR/Ptx (s. Beispiel 4) 17,5-87,5 mΐ dH ₂ 0

[0059] Die Reaktionen wurden in 1,5 ml

Schraubflaschen angesetzt und mit Deckel mit Alufolie verschlossen. Die Folie wurde an mehreren Stellen einge stochen. Es wurde für 18 h bei 24°C leicht geschüttelt. 200 mΐ des Reaktionsansatzes wurden mit 600 mΐ Aceto nitril / 5 mΐ H3PO4 (50%) verdünnt und 15 Minuten bei 55 °C inkubiert. Anschließend wurden die Proben 5 Minuten bei 20817 rcf zentrifugiert und mittels HPLC/DAD analy siert (z.B. Agilent 1200 Series; Säule: Merck Purospher STAR RP-18e 125 x 4 mm, 5 pm; Flussrate: 1,5 ml/min, Gra dient H2O+H3PO4 (pH=2.6) / Acetonitril). Einer der unter suchten Kandidaten („P450_c866") war in der Lage, Desoxy- cholsäure zu Ursocholsäure zu hydroxylieren. Dabei wurde die eingesetzte Desoxycholsäure umgesetzt (s. folgende Tabelle) . Die Identität des Produkts Ursocholsäure wurde durch GC/MS-Analyse sowie durch 2D-NMR verifiziert.

[0060] In diesem Beispiel wird ein Redoxcofaktor (NADH) durch die P450/Ptx/PtR Reaktion oxidiert.