Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Immobilisierung bzw. Ablagerung von Molekülen bzw. Substanzen auf einem Träger,

Bisher werden für die Immobilisierung von Makromolekülen Polymere mit schwammartiger Struktur (Gele) von verschiedenem chemischen Aufbau (z.B. Agarose, modifiziertes Polyacrylamid) verwendet. Aufgrund der zufälligen Anordnung der Polymerketten mit unterschiedli¬ chem Molekulargewicht in dem Gelkürper weisen vorhandene funktionelle Gruppen weder eine definierte Position, noch eine definierte Orientierung auf. Die Verteilung von funktioneilen Gruppen an der Oberfläche und im Inneren der Gelmatrix ist daher "zufällig". Werden diese Gruppen für eine Immobilisierung von Makromolekülen aktiviert, so wird auch die Anordnung der Fremdmoleküle in "zufälliger" Verteilung erfolgen.

Für die sogenannte Teststreifentechnologie (z.B. Glukose-Teststicks zur Bestimmung des Blut- oder Harπzuckergehaltes) werden Enzyme in gelöster Form in Qualitä spapiere eingesaugt und getrocknet. Wie bei dem zuvor beschriebenen Gel liegen auch hier die Fremdmolekü¬ le in statistischer Verteilung in der relativ groben Fasermatrix des Papieres vor. Ein weiterer Nachteil ist, daß die Enzyme nicht kovalent gebunden sind, so daß es bei Untersuchungen im wässrigen Milieu zu Enzymverlusten kommen kann. Dadurch ist eine Quantifizierbarkeit des Analyten nicht mehr garantiert.

Um einerseits eine kovalente Bindung von Fremdmole¬ külen zu sichern, andererseits aber dünne Trägerfilme zu haben, wurden Proteinfilme aus Serum Albumin oder Kollagen erzeugt. Durch Einbringen von Glutaraldehyd gelang es, den Proteinfilm zu vernetzen, und gleichzeitig Fremdmoleküle kovalent zu binden. Auch mit dieser Methode gelang es aber nicht, Fremdmoleküle in definierter

Position und Orientierung in monomolekularer Schicht kovalent an einen Trägerfilm zu binden.

Er indungsgemäß wird nun als Träger eine Struktur eingesetzt, welche wenigstens eine sich entlang ebener, gekrümmter, zylindrischer oder vesikulärer Flächen erstreckende Membran aufweist, die aus wenigstens einer Schicht identischer Protein enthaltender Moleküle besteht, die in Form eines Kristallgitters mit einer Gitterkonstante von 1 bis 50 nm angeordnet sind. Dadurch wird erreicht, daß die immobilisierten Moleküle stets in räumlich definierter Anordnung an den mit den Substraten in Verbindung stehenden Oberflächen angeordnet sind, so daß eine möglichst dichte Belegung der freien Oberflächen mit den zu bindenden Molekülen ermöglicht ist. Die reaktiven Gruppen der Proteine ^• nehmen nämlich nicht nur in der Polypeptidkette eine genau festgelegte Position ein, sondern haben auch nach Faltung des Proteins im Kristallgitter eine exakt festgelegte Lage und Orientierung. Dies gilt in gleicher Weise auch für an der Membran eventuell noch vorhandene Kohlenhydratanteile und deren Hydroxylgruppen.

Vorteilha terweise kann eine Membran eingesetzt werden, die Poren mit einem Durchmesser von 0,5 bis 40 nm aufweist. Durch das Vorhandensein der Poren kann eine Behandlung des Substrats auch dadurch erreicht werden, daß dieses langsam durch die Membran hindurchge ührt wird, wobei dann während des Durchführens bzw. Entlβngführeπs die gewünschte Umsetzung bzw. Reaktion durch die an der Membran immobilisierten Moleküle erfolgt. Weiters wird damit erreicht, daß die Membran beidseitig mit den Molekülen bzw. Substanzen beladen sein kann, da aufgrund der Poren das zu behandelnde Substrat an beide Seiten der Membran gelangen und dann reagieren kann .

Für die Veränderung der Oberflächeneigenschaften der Membran können auf dieser Protein- und/oder Peptidmolekü- le immobilisiert werden. Dadurch wird unter anderem eine Oberflächenvergrößerung erreicht, wodurch für Immobili- sierung weiterer Moleküle ein zusätzlicher Raum geschaffen wird, der aufgrund der definierten Anordnung der Protein- und/oder Peptidmoleküle ebenfalls genau definierte Raumstruktur aufweist. Weiters kann dadurch erreicht werden, daß die Oberfläche entweder hydrophil bzw. hydrophob wird. Durch solche Veränderungen der Oberflächeneigenschaf en wird unter anderem auch erzielt, daß die Membranen eine geringer unspezifische Adsorption aufweisen. Gleiche Eigenschafen können auch dadurch erzielt werden, daß auf der Membran Glycoprotein- und/oder Glycopep idmoleküle immobilisiert werden. Ebenso können auf der Membran Polysaccharide und/oder Oligosaccharide und/oder Zucker immobilisert werden, wobei all die angeführten Moleküle je nach dem späteren Verwendungszweck eingesetzt werden können. Es können jedoch zur Erzielung dieser Eigenschaften auch Lipidmoleküle immobilisiert werden, wobei diese Moleküle zusätzlich noch für die Aufbringung von monomolekularen Lipidschichten , z.B. Langmuir Blodget- Fil en, dienen können, oder aber als Träger für andere Polymerschichten, insbesondere hydrophobe Membranen, dienen können. Für spezielle Zwecke können auch auf der Membran Lipopolysaccharide immobilisiert werden, welche gleichfalls die angeführten Effekte erbringen können..

Für einen Einsatz bei enzymatischen Umsetzungen können auf der Membran Enzyme und/oder Coenzy e immobilisiert werden. Soll die erfindungsgemäße Membran für bio echnologische Zwecke verwendet werden, dann kann auf der Membran eine Substanz der Gruppe, enthaltend Antigene, Antikörper, Lektine, Biotin, Avidin, Protein A und Haptene, immobilisiert werden. Für gewisse Zwecke

können auch Nucleiπsäuren immobilisiert werden, welche sich unter anderem auch für Hybridisierungstests und Sondenmoleküle in der Gentechnologie eignen.

Wenn auf der Membran Farbstoffe, insbesondere Fluoreszenzfarbstoffe, immobilisiert werden, dann kann die er indungsgemäße Membran als Testmembran dienen, z.B. als Indikatormembraπ bzw. als Membran, welche insbesonde¬ re für optoelektronische Auswertung (optische Sensoren} geeignet ist. Es können dabei für die Auswertung Membrangruppen verwendet werden, von welchen jede Membran einen unterschiedlichen Farbstoff aufweist, so daß gleichzeitig unterschiedliche Reaktionen gemessen werden können .

Es können auf der Membran, gegebenenfalls leitende, Materialien, wie Metalle und/oder MetallVerbindungen und/oder Kohlenstoff und/oder Siliciumoxide und/oder Kunststoffe immobilisiert bzw. abgelagert werden. Dadurch ist die Möglichkeit gegeben, die Membranen für Sensoren einzusetzen, und zwar beispielsweise als biologische Feldef ekttransistoren oder chemische Feldeffekttran¬ sistoren, da die geschaffenen Strukturen ioneπselektiv sind und damit als sogenannte ioneπselektive Feldeffekt¬ transistoren C ISFET) eingesetzt werden können. Für die Steuerung der Struktur bzw. die physikalischen Eigenscha ten und Herstellung von Legierungen auf der Membran können Mischungen der Materialien bzw. getrennte Schichten mehrerer Materialien abgelagert werden.

Um eine gesteuerte Elektronenübertragung bzw. Ioneπableitung aus dem Medium zu erzielen, können auf der Membran Mediator- bzw. Transmittermoleküle immobilisiert werden. Um bei enzymgesteuerten Prozessen ein leichtes Rückgewinnen der eingesetzten Enzyme zu erzielen, kann eine Membran mit darauf immobilisierten Enzymen und/oder Coeπzymeή als Eπzymmembran verwendet werden. Es wird dann das Substrat mit der Enzymmembran in Kontakt gebracht

bzw., wenn die Membran vesikulöre Form hat, diese Vβsikel in dem Substrat suspendiert, wonach dann nach Beendigung der Reaktion das Substrat von der Membran getrennt wird bzw. die Vesikel, z.B. durch Filtration, abgeschieden werden.

In besonders bevorzugter Weise kann eine Membran mit darauf immobilisierten Antigenen, Antikörpern, Lektinen, Biotin, Avidin, Protein A oder Haptenen als ELISA-Membran verwendet werden. Für die Durchführung von Diagnosereak- tionen kann eine Membran mit darauf immobilisierten Enzymen, bzw. Coenzymen, Antigenen, Antikörpern, Biotin, Avidin, Lektinen, Protein A, Haptenen, Nucleinsäuren oder Mediator- bzw. Transmittermolekülen als Diagπosereagens verwendet werden. Insbesondere bei den Enzymen ist eine Biolumineszenzreaktion interessant, weil dadurch eine lichtop ische Auswertung von Reaktionen ermöglicht ist. Eine Membran mit darauf immobilisierten Enzymen bzw. Coenzymen, Antigenen, Antikörpern, Biotin, Avidin, Lektinen, Protein A, Haptenen, Nucleinsäureπ oder Mediator- bzw. Transmit ermolekülen , kann auch als Sensormembran verwendet werden, welche einen direkten Einsatz für die Prüfung von Substanzen auf vorhandene Komponenten ermöglicht. Für bestimmte Formen der Signalableitungen, insbesondere für Redoxsysteme , können die an der Membran immobilisierten Substanzen und die Membran mit einer leitenden Schicht, z.B. Metall oder leitendem Kunststoff, versehen werden. In besonders einfacher Weise kann die leitende Schicht durch Sputtern aufgebracht werden. Für bestimmte Materialien kann es jedoch angezeigt sein, daß die leitende Schicht durch Aufdampfen aufgebracht wird. Schließlich kann die Kunststoffschicht durch Plasmapolymerisation aufgebracht werden .

Für eine gesteuerte Freisetzung der abgelagerten bzw. immobilisierten Substanzen, insbesondere bei

pharmazeutischen Wirkstoffen, können diese Substanzen von der Membran eingeschlossen sein.

Die Erfindung wird nachstehend noch anhand von Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1 :

Immobilisierung von Poly-L-Lysiπ an kristallinen Proteinmembranen ( S-Schichten)

Vesikuläre Strukturen, die aus kristallinen Proteinmem¬ branen von Clostridium thermohydrosul uricum L111-69 bestehen, werden zur Stabilisierung mit Glutaraldehyd vernetzt. Dazu werden 0.5 g feuchtes Pellet der vesikulären Strukturen (erhalten nach Zenferifugation bei 20,000 x g) in 50 ml 0.1 M Natriu -Cacodylat-Puffer, pH 7.2, suspendiert und nach Zugabe von 0.5 ml Glutaraldehyd (50 %) 20 Minuten bei 20° C inkubiert. Nach Stoppen der Reaktion durch Zugabe von Äthanolamin wird die Suspension bei 20,000 x g zentrifugier , dreimal mit Aqua dest. gewaschen und neuerlich pelletiert. Zur chemischen Aktivierung der Carboxylgruppen werden 0.2 g des erhaltenen Pellets in θ ml Aqua dest. suspendiert, 60 mg 1-Ethyl-3,3' dimethyK amiπoprαpyl.. cαrbαdiimid ( EDG) zugefügt, der pH-Wert der Suspension durch Zugabe von 0.1 N NaOH oder 0.1 N HC1 auf 4.63 eingestellt und dieser während der 80 Minuten dauernden Reaktion konstant gehalten. Nach Zentri ugation bei 20,000 x g wird .das Pellet mit eiskaltem Aqua dest. gewaschen und nach neuerlichem Zentri ugieren bei 20,000 x g in einer Lösung aus Poly-L-Lysin (MG 30,000 ; 2 mg/ml Aqua dest.) suspendiert. Nach 4-stündiger Inkubation bei 20 C wird zur Entfernung von nicht kovalent gebundenem Poly-L-Lysin zentrifugiert, mit Aqua dest., und in der Folge mit 0.1 M Kaliumphosphat Puffer (pH 7.0) gewaschen.

Durch Immobilisierung von Poly-L-Lysin können aufgrund der freien Aminogruppen der im Polymer vorhandenen Lysinreste die Oberflächeneigenschaf en der vesikulären Strukturen (Proteinfragmente) gezielt verändert und eine positive Nettoladung erzeugt werden. Zudem können die vorhandenen Aminogruppen für eine Immobilisierung von weiteren Fremdmolekülen aktiviert werden.

Beispiel 2:

Immobilisierung von Phosphatidylethanolamin

Vesikuläre Strukturen werden, wie oben beschrieben, zur chemischen S abilisierung mit Glutaraldehyd vernetzt und an der kristallinen Matrix vorhandene Carboxylgruppen mit EDC aktiviert. Nach einer Aktivierungszeit von BO Minuten wird die Suspension bei 20,000 x g zentrifugiert , die Pellets mit Dioxan bei einer Temperatur von 4 C gewaschen und neuerlich sedimentiert . In der Folge werden die Pellets in einer Lösung aus Phosphatidylethanolamin (PE; 3 mg/ml Dioxan) gelöst und 20 h bei 20 C inkubiert. Zur Entfernung von nicht kovalent gebundenem PE werden die vesikulären Strukturen nach dem Zentrifugieren fünfmal mit Dioxan und anschließend mit einer Mischung aus Chloroform-Methanol (50/50) gewaschen. Durch Reaktion der freien Aminogruppen von PE mit den Carboxylgruppen des S-Schicht-Proteins gelingt es, PE so an die kristalline Matrix zu binden, daß der hydrophile Teil, zu der Membranoberfläche gerichtet ist, während die hydrophoben Reste nach außen exponiert bleiben. Die so erzeugte hydrophobe Oberfläche dient zur Anlagerung von Monoschich en aus Tensiden (z.B. Arachinsäure) , die nun ihrerseits mit ihrem hydrophoben Teil binden, während der hydrophile Teil nach außen exponiert ist. Nun ist eine weitere Anlagerung einer Monoschicht von Arachinsäure

möglich, wobei nun die Moleküle mit ihrer hydrophilen Seite binden. Nach diesem Prinzip können mehrere Monoschichten von Tensidmolekulen an der Oberfläche einer kristallin geordneten vesikulären Struktur angelagert werden.

Beispiel 3:

Immobilisierung von Glucoseoxidase an kristallinen vesikulären Strukturen

Zur Immobilisierung von Glucoseoxidase werden vesikuläre Strukturen, wie oben beschrieben, mit Glutaraldehyd vernetzt, und in der Folge im Kristallgitter vorhandene Carboxylgruppen mit EDC aktiviert. Nach dem Waschen mit Eiswasser und neuerlichem Zentrifugieren bei 20,000 x g wird dos aktivierte Pellet- aus vesikulären Strukturen in einer Lösung aus Glucoseoxidase (3 mg/ml Aqua dest.) o suspendiert und 6 Stunden bei 20 C inkubiert. In der Folge wird die Suspension zentrifugiert und, wie in Beispiel 1 beschrieben, zur Entfernung von nicht kovalent gebundenem Material gewaschen. Unter Anwendung dieser Methode ist es möglich, 1 mg Glucoseoxidase pro mg S-Schicht-Protein kovalent zu binden. Das bedeutet, daß pro S-Schicht-Untereinheit ein Glucoseoxidase-Molekül immobilisiert werden kann, was der dichtest möglichen Packung eines Fremdmoleküles an einer kristallinen Matrix entspricht. Immobilisierte Glucoseoxidase zeigte im Vergleich zu dem nativen Enzym eine Aktivität von 50 % .

Beispiel 4:

Belegen von kristallinen S-Schichten mit einer Metallschicht

Kristalline geordnete Membranen (S-Schichten) werden in Aqua dest. suspendiert und unter einem Druck von 2 bar in einer 10 ml Ultrafiltrationszelle auf einen mikroporösen Träger ( Mikrofiltrationsmembran aus Polycarbonat der Firma Nuclepore; Porendurchmesser 0.1 μm) angeschwemmt. Die einzelnen Membran ragmente werden in der Folge mit Glutaraldehyd (0.5 % in 0.1 M Natrium Cacodylat Puffer, pH 7.0) vernetzt. Nach einer Inkubationszeit von 20 Minuten wird durch Waschen mit Aqua dest. überschüssiges Reagens entfernt, die Mikrofiltrationsmembran mit den abgelagerten Protein-Fragmenten der Ultrafiltrationszelle entnommen und luftgetrocknet. Anschließend wird die

Struktur in eine Sputter Coater Anlage (Polaron

-2

Instruments) eingelegt und bis zu einem Vakuum von 5.10 Torr evakuiert. Nun wird durch Anlegen einer Spannung von 2.000 V bei einem Stromfluß von etwa 20 mA Gold auf die Oberfläche der kristallinen Membranfragmente gesputtert, wodurch eine zusammenhängende Meta11Schicht mit einer Stärke von etwa 40 nm erzeugt wird. Nach dem Entnehmen aus der Sputter Coater Anlage wird die Struktur vorsichtig in ein mit Chloroform gefülltes Becherglas transferiert und so eingelegt, daß die Pαlycarbonat-Trä- germembran mit der Flüssigkeit direkt in Kontakt kommt, wodurch das vorhandene Polymer aufgelöst wird. An der Flüssigkeitsoberfläche verbleibt nun eine extrem dünne Struktur, die aus der Goldschicht und den darunterliegen¬ den S-Schicht-Fragmenten besteht. Diese Struktur kann nun durch vorsichtiges Abheben auf beliebige Oberflächen aufgebracht werden. Durch Aufsputterπ von Gold auf kristallin geordnete Membranfragmente ist es möglich, einen direkten Kontakt zwischen Metall und dem Träger zu erzielen .

Beispiel 5

Immobilisierung von Fluoreszenzfarbstoffen an kristallin geordnete Strukturen

Vesikuläre Strukturen, die aus kristallin angeordneten Proteinuntereinheiten bestehen, werden zur kovalenten Bindung des Fluoreszenzfarbstoffes 7-Hydroxy-Cumarin-3- -carbonsäure C HCC) , der einen pH-sensitiven Farbstoff darstellt, verwendet. 50 mg des Farbstoffes werden in Aqua dest. aufgelöst, der pH-Wert durch Zugabe von 0.1 N HC1 oder 0.1 N NaOH auf 4,75 eingestellt und in der Folge 20 mg EDC zugesetzt. Nach einer Aktivierung der Carboxylgruppen von HCC während einer Reaktionszeit von Θ0 Minuten wird dieser Ansatz mit 0,5 g feuchtem Pellet vesikulärer Strukturen (erhalten nach Zentrifugation bei 20,000 x g) vermischt und die Suspension 2 Stunden bei 20 C inkubiert. Während dieser Zeit können die EDC-aktivierten Carboxylgruppen von HCC mit freien Aminogruppen des S-Schicht-Proteins reagieren und der Farbstoff kovalent an die kristalline Matrix gebunden werden. Zur Entfernung überschüssigen Reagens wird die Suspension in einen vorgeweichten Dialysierschlauch übergeführt und 4Θ h lang bei einer Temperatur von 4 C gegen Aqua dest. dialysiert. Niedermolekulare Verbindun¬ gen, wie HCC oder EDC, können während der Dialyse entfernt werden. Die Suspension wird in der Folge zentrifugiert, mit Aqua dest. und 1 N NaCl zur Entfernung von unspezifisch adsorbiertem Material gewaschen. Der an den vesikulären Strukturen immobilisierte Fluoreszenz¬ farbstoff reagiert auf Änderungen des pH-Wertes im entsprechenden Milieu durch eine Änderung in der Wellenlänge der ausgesandten Fluoreszenz.

Beispiel 6:

Immobilisierung von Glucoseoxidase an kristalline Protein-Fragmente und Belegung mit einer MetallSchicht

Die Immobilisierung von Glucoseoxidase erfolgt an kristallin geordnete Protein-Fragmente, die auf einem mikroporösen Träger ( Mikrofiltrationsmembran aus Nylon der Firma Pall; Porendurchmesser 0.1 m) abgelagert wurden. Die Mikrofiltrationsmembran wird in eine Ultrafiltrationszelle mit einem Durchmesser von 25 mm eingelegt, und 3 ml einer Suspension, die die Protein- Fragmente enthält, werden auf die Membranoberfläche pipettiert. Nach Anlegen von einem Druck von 2 bar und Ablagerung der Protein-Fragmente an der porösen Trägermembran wird vorhandenes Protein durch Zugabe von Glutaraldehyd (0.5 % in 0.1 M Natrium-Cacodylat-Puffer, pH 7.2) kovalent vernetzt. Nach dem Waschen der Membran mit Aqua dest. wird diese aus der Ultrafiltrationszelle entnommen und in ein Becherglas, das 10 ml Aqua dest. enthält, eingelegt. Nach Zugabe von 50 mg EDC zur Aktivierung von Carboxylgruppen wird der pH-Wert während der folgenden 80 Minuten auf 4.65 konstant gehalten. Durch Eintauchen der Membranen in Eiswβsser läßt sich überschüssiges Reagens entfernen. Die Membran wird in die Ultrafiltrationszelle nun so eingelegt, daß die mit Protein-Fragmenten belegte Seite nach oben gerichtet ist. In der Folge werden 2 ml einer Glucoseoxidβse-Lösung (2 mg/ml) zugefügt und zur kovalenten Bindung des Enzyms 2 Stunden bei 20 C inkubiert. Nicht kovalent gebundenes Enzym kann durch Waschen mit Aqua dest. und Puffer (siehe oben) entfernt werden. Nach dem Entnehmen der Membran aus der Ultrafiltrationszelle wird diese luftgetrocknet , in eine Sputter Coater Anlage (Polaron Instruments)

-2 eingelegt und bei einem Druck von 5.10 Torr mit Platin bei einer Stromstärke von 20 mA während eines Zeitraumes von 2 min besputtert. Die Meta11Schicht , die eine Stärke

von 30 nm aufweist, ist direkt mit dem Enzym, das in dichtest möglicher Packung an eine kristalline Matrix gebunden ist, in Kontakt. Dadurch ist es möglich, daß die an dem Enzym während der enzymatischen Reaktion entstehenden Elektronen direkt von der Platiπschicht abgesaugt werden.

Beispiel 7:

Herstellung von Diagπosemembranen unter Verwendung von Antikörpern

Als Ausgangsmaterial werden an mikroporöse Träger gebundene Protein-Fragmente verwendet. An der Oberfläche der Protein-Fragmente vorhandene Carboxylgruppen werden mit EDC aktiviert C Durchführung siehe o.a. Beispiele) .

Anschließend wird die aktivierte Membran in eine

Ultrafiltrationszelle mit einem Durchmesser von 25 mm eingelegt und 2 ml einer Antikörper-Lösung (0.4 mg/ml) (Antikörper A, erzeugt gegen Virusprotein) auf die

Membranoberfläche pipettiert und 4 Stunden bei 20 C inkubiert. Nach Abdekantieren der Antikörper-Lösung wird die Membran aus der Ultrafiltrationszelle genommen und 2 h mit 0.2 M Kalium-Phosphat-Puffer, pH 7.2, gewaschen. Die Antikörper-Moleküle wurden im Zuge der Immobilisie¬ rung in Form einer Monoschicht in dichtest möglicher Packung an die Oberfläche der kristallinen Matrix gebunden. Die mit Antikörper beladene Membran kann daher zum Nachweis von Virusprotein verwendet werden. Dazu wird die Membran mit einer Flüssigkeit, die Viren enthält, in Kontakt gebracht und 2 h bei 20 C inkubiert. In der Folge wird zur Entfernung von überschüssigem Antigen mit 0,2 M Phosphat-Puffer, pH 7.0, und mit Aqua dest. gewaschen. Zur quantitativen Auswertung der gebundenen Virusproteinmenge wird nun die Membran in eine weitere

Lösung, die biotinylierteπ Antikörper A enthält, gelegt (0.1 mg/ml 0.1 N Natriumhydrogencarbonat) und 30 Minuten inkubiert. Der biotinylierte Antikörper bindet nun an noch freie Hβptene des Virusproteins. Nach Entnehmen der Membran aus der Antikörper-Lösung wird diese wieder 20 Minuten mit 0.1 M Phosphat-Puffer, pH Θ.0, gewaschen. Zur quantitativen Auswertung wird nun ein Peroxidese-Avidin- Konjugat eingesetzt. Avidin bindet spezifisch an Biotin, und demnach an den Jeweiligen biotinylierten Antikörper. Nach einer Inkubationszeit von 10 Minuten wird die Membran entnommen, wieder 20 Minuten mit Phosphat-Puffer gewaschen und schließlich 1 ml einer 0.01 % Wasserstoff¬ peroxid-Lösung, die 1 mg des Farbstoffes o-Dianisidin enthält, auf die Membran getropft. Nach 10 Minuten wird die Reaktion durch Zugabe von 5N HCl gestoppt und der gebildete Farbstoff quantitativ durch Messung bei einer Wellenlänge von 400 nm bestimmt, über eine entsprechend erstellte Eichkurve kann die Menge an gebundenem Virusprotein gemessen werden. Kristallin geordnete Protein-Fragmente bieten den Vorteil, daß der Antikörper A in dichtest möglicher Packung an eine definierte Oberfläche gebunden werden kann und dadurch die Nachweisgrenze für das zu untersuchende Protein entsprechend niedriger ist.

Beispiel 8:

Immobilisierung von biotiny1ieten Proteinen an vesikuläre Strukturen

Vesikuläre Strukturen, die aus Proteinkristallen bestehen, werden entsprechend der oben angeführten Vorschrift chemisch mit Glutaraldehyd vernetzt und die an der Oberfläche vorhandenen Carboxylgruppen mit EDC aktiviert. 0.1 g des feuchten, EDC-βktivierten Pellets

werden mit 2 ml einer Lösung von biotinylierte Ovalbumin (1 mg/ml Aqua dest.) vermischt und 2 h bei 20° C inkubiert. Anschließend wird bei 20,000 x g zentrifugiert und das Pellet fünfmal mit 0.1 M Kalium-Phosphat-Puffer, pH 7.0, gewaschen. Pro Protein-Untereinheit der kristallinen Matrix konnten 2 Moleküle von biotinyliertem Ovalbumin gebunden werden, was wieder der dichtest möglichen Bindungsdichte eines Fremdmoleküles an eine kristalline Matrix entspricht. Immobilisiertes biotinyliertes Ovalbumin kann nun durch Zugabe von Avidin-Peroxidase-Koπjugat und im folgenden durch Messung des entwickelten Farbstoffes durch Peroxidase-Aktivität nachgewiesen werden. Dazu werden 50 mg des feuchten Pellets aus vesikulären Strukturen mit daran immαbili- siertem biotinylierteπ Ovalbumin in 1 ml 0.1 M Natriumhydrogencarboπat , pH 8.5, suspendiert und 200 μl 0.2 % Avidin-Peroxidase-Konjugat dazugefügt. Nach 20 Minuten Inkubation bei 20 C wird zentrifugier , das Pellet fünfmal mit 0.2 M Kalium-Phosphat-Puffer (pH 7.0) gewaschen und 20 mg des Pellets (bestehend aus vesikulären Strukturen, biotinyliertem Ovalbumin und daran gebundenen Avidin-Peroxidase-Koπjugat) mit 200 ^ul einer Lösung von 0.01 % Wasserstoffperoxid, die 1 mg o-Dianisidin enthält, vermischt. Der entwickelte Farbstoff wird, wie oben beschrieben, gemessen.