"PROCESSO DE OBTENÇÃO DE EXTRACTOS PEPTIDICOS BIOACTIVOS ATRAVÉS DA HIDRÓLISE DE PROTEÍNAS DE SORO DE LEITE COM ENZIMAS DE CYNARA CARDUNCULUS, REFERIDOS EXTRACTOS E

RESPECTIVAS UTILIZAÇÕES"

Domínio técnico da invenção

A presente invenção refere-se a um processo para produção de concentrados peptídicos derivados de proteínas do soro, através de hidrólise enzimática e técnicas de filtração. Os concentrados resultantes do processo, de acordo com a presente invenção, compreendem na sua constituição péptidos com diversas actividades biológicas, como por exemplo anti- hipertensiva, anti-inflamatória, antiulcerativa e antioxidante, que podem ser aplicados nas indústrias alimentar e farmacêutica.

Antecedentes da Invenção

Nos dias de hoje, é cada vez mais importante ter uma dieta saudável; a maioria das pessoas predispõe-se a fazê-lo, desde que não altere demasiado o seu padrão de alimentação. A barreira levantada pelos consumidores à mudança dos seus hábitos alimentares tem levado ao aparecimento de um leque alargado de alimentos, que apresentam aparência idêntica aos convencionais, mas que, devido à existência de certos ingredientes funcionais, trazem benefícios adicionais à saúde (podendo estes alimentos actuar sobre esta de forma preventiva) (Korhonen e Pihlanto, 2006).

Um alimento pode ser considerado "funcional" se, para além do seu efeito nutritivo, apresentar benefícios sobre uma ou mais funções do organismo, susceptíveis de melhorar o estado de saúde ou bem-estar, ou reduzir o risco de doença. Esta é a definição proposta por FUFOSE (Functional Food Science in Europe) , cabendo-lhe igualmente diferenciar três aspectos importantes: (1) o efeito funcional é distinto do nutritivo; (2) o beneficio apresentado deve ser cientificamente fundamentado; e (3) o efeito em causa pode consistir numa melhoria das funções fisiológicas (incluindo o bem-estar) ou numa redução do risco de desenvolvimento de um processo patológico. Actualmente, e devido à crescente preocupação dos consumidores pelo binómio alimentação/ saúde, o mercado dos alimentos funcionais encontra-se em grande expansão.

A possibilidade da obtenção de um novo produto alimentar que reduza ou controle uma doença crónica é bastante promissor, assim como o potencial dos alimentos funcionais para mitigar doenças, promover a saúde e reduzir os custos dos cuidados de saúde (Korhonen e Pihlanto, 2006; Hartmann e Meisel, 2007) .

Durante muito tempo, pensou-se que as proteínas alimentares tinham apenas como função fornecer aminoácidos para o organismo construir novos tecidos. Avanços recentes na bioquímica nutricional e diversas pesquisas biomédicas têm ajudado a desvendar as complexas relações existentes entre nutrição e doenças, sugerindo que proteínas dos alimentos e péptidos delas derivados, quer através do processo digestivo quer por proteólise in vitro, podem desempenhar funções importantes na prevenção e/ou tratamento de patologias associadas à nutrição, infecções por agentes patogénicos ou associados a doenças crónicas. Alguns desses agentes funcionais afiguram-se como importantes na preservação da saúde, na promoção do bem-estar e no aumento da longevidade. 0 soro das queijarias é um subproduto da indústria de lacticínios, o qual tem sido considerado ao longo dos anos como resíduo, para além do seu carácter poluente devido ao elevado teor em lactose e proteínas. Todavia, o soro representa uma mistura rica e variada de proteínas que, sob certas circunstâncias, aparentam desempenhar acções fisiológicas in vivo e/ou in vitro; por isso, concentrados de soro têm sido utlizados como suplemento proteico em diversos alimentos funcionais (Smithers, 2008).

No caso do leite bovino, são produzidos aproximadamente 9 L de soro a partir de 10 L de leite durante a produção de queijo. Tendo em consideração que em 2002 se produziram aproximadamente 12.6 milhões de toneladas de queijo no mundo (USDA Foreign Agricultural Service, 2003) e que essa produção tem tendência a aumentar, a utilização de tal quantidade de soro (evitando, assim, a sua eliminação) torna-se num problema, já que para alguns produtos se está próximo da saturação de mercado. Por razões ambientais, o soro não pode ser despejado nos rios devido à sua elevada carência bioquímica e química de oxigénio.

Por razões estritamente económicas, é difícil a utilização de soro na alimentação animal ou como fertilizante. De facto, apesar de conter c. 93% de água, o soro é um reservatório de componentes de alto valor, uma vez que contém c. de 50% dos nutrientes encontrados no leite. Essa composição depende da forma como o queijo é manufacturado, mas o resíduo produzido em maior quantidade é a lactose, para além de proteínas e minerais, particularmente cálcio, e vitaminas, tais como tiamina, riboflavina e piridoxina. É por isso crucial encontrar formas de valorização deste sub-produto através da obtenção de produtos de elevado valor acrescentado. As proteínas do soro apresentam uma mistura de variadas proteínas secretadas, tais como cc-lactalbumina ( oc-La) , β- lactoglobulina ( β-Lg) , lactoferrina, lactoperoxidase, imunoglobulinas e caseinomacropéptido (CMP) , e bem assim um conjunto de factores de crescimento.

A utilização destas proteínas, após concentração ou até isolamento, ou de péptidos biologicamente activos obtidos a partir delas, como suplementos nutracêuticos constitui uma utilização economicamente apelativa (e até desejável) para o soro. Os estudos efectuados até à data comprovam uma série de efeitos biológicos destas proteínas, que vão desde efeito anticancerígenos até efeitos benéficos na função digestiva, passando por actividade antimicrobiana in vitro e in vivo (Smithers, 2008) .

A maior parte dos componentes bioactivos do leite estão igualmente presentes no soro, à excepção das caseínas.

Os péptidos bioactivos são sequências de aminoácidos que estão em forma inactiva nas proteínas que os originam, mas que uma vez libertados por processos enzimáticos e/ou fermentativos passam a desempenhar um papel fisiológico. Existem, como já foi referido, vários tipos de péptidos bioactivos em função da sua actividade: péptidos inibidores de ACE (Enzima Conversora de Angiotensina ) e/OU anti— hipertensivos , antitrombóticos , hipocolesterolémicos, opiáceos, fosfopéptidos (quelantes de minerais), reguladores de saciedade, imunomoduladores , antimicrobianos , antivirais, antitumorais e antioxidantes.

Desses peptídeos bioactivos, devem ser destacados os peptídeos inibidores da ACE, dada a incidência que a hipertensão tem na população dos países desenvolvidos, tratando-se de um problema mundial que afecta 15 a 20% dos adultos, e também porque lhe estão associadas outras complicações .

Os péptidos bioactivos derivados de proteínas lácteas podem obter-se à escala industrial, principalmente através de hidrólise com enzimas similares às digestivas mas de origem microbiana, vegetal ou animal, e bem assim por fermentação com culturas lácteas de arranque. Em alguns estudos, verificou-se que a combinação destes processos pode ser determinante para a obtenção de péptidos funcionais de pequeno tamanho (Korhonen e Pihlanto, 2006) . As aplicações potenciais destes hidrolizados em leites fermentados, e/ou dos péptidos seus derivados como suplementos dietéticos, preparações farmacêuticas ou ingredientes funcionais, emergem com especial interesse para as indústrias farmacêutica e alimentar - por serem alimentos e por terem uma acção terapêutica, respectivamente. Existem, por isso, algumas patentes relacionadas - que passam a descrever-se de seguida de forma sumária.

O documento WO1999065326 descreve um processo para obtenção de produtos proteicos por hidrólise parcial do soro do leite com proteases essencialmente do tipo Protease Ρ ^β , Protease A, Protease , Peptidase, Neatrase, Validase e AFP 2000, tendo por objectivo a incorporação em produtos na indústria alimentar, proporcionando assim produtos alimentares funcionais dotados de propriedades organolépticas melhoradas, nomeadamente com sabor mais doce e com menores níveis de aditivos .

Por outro lado, o documento WO2008108649 descreve um processo de obtenção de um produto alimentar à base de péptidos com actividade anti-hipertensiva por hidrólise de proteínas de soro do leite, e subsequente separação e/ou concentração da fracção rica em pentapéptido IIAEK, IPAVF e/ou hexapéptido IPAVFK. Para tal, o referido processo utiliza designadamente tripsina, quimotripsina ou uma combinação de ambas.

Sumário

A presente invenção diz respeito a um processo para a obtenção de extractos peptidicos, caracterizados por estes serem produzidos por reacções de hidrólise de proteínas do soro do leite através da acção de pelo menos uma enzima de extractos aquosos de C. candunculus .

Num processo, a concentração do extracto de flores de C. candunculus deve estar compreendida entre 1 e 5 %(v/v), e preferencialmente ser de 1,6 %(v/v).

Noutro exemplo mais detalhado, o processo pode compreender os seguintes passos:

Desnatação do soro de leite (1), preferencialmente por centrifugação ;

Redução da carga microbiana (2), preferencialmente por microfiltração;

Ultrafiltração do soro utilizando uma membrana de 10.000-20.000 Da, preferencialmente de 20.000 Da devido ao tamanho das proteínas do soro, obtendo-se assim um concentrado rico em proteínas (3-retido RUFi) e um extracto de péptidos (4-filtrado FUFi) ;

Diafiltração do concentrado rico em proteínas (3), por diluição sucessiva e concentração por uma membrana de 10.000-20.000 Da, preferencialmente de 20.000 Da devido ao tamanho das proteínas do soro;

Hidrólise do extracto rico em proteínas (5) resultante de d) (RUF ₂ ) , com enzimas do extracto de flores de C. candunculus, preferencialmente durante 7 h (condições óptimas ) ;

Ultrafiltração do hidrolisado final com uma membrana de 10.000-20.000 Da, preferencialmente de 20.000 Da devido à dimensão das proteínas do soro;

Concentração do retido RUF ₃ (6) e do filtrado FUF ₃ (7), preferencialmente por osmose inversa, tendo em vista a obtenção de um concentrado rico em proteínas do soro (proteínas não hidrolisadas) e um concentrado rico em péptidos libertados durante a referida hidrólise, respectivamente; e

Nanofiltração do FUF ₃ (7) com membrana de 1000-5000 Da, preferencialmente de 3000 Da.

Numa realização prática, a fracção <3000 Da deve ser isolada da restante fracção, através de uma técnica de separação por membranas. Mais especificamente, tal separação deverá ser por nanofiltração, com membrana de tamanho de poro entre 1000 e 5000 Da, preferencialmente de 3000 Da.

A presente invenção diz ainda respeito aos extractos obtidos através dos processos anteriormente descritos. Estes extractos apresentam actividades biológicas, como por exemplo inibição da actividade da ACE, antioxidante, antinociceptiva e/ou anti-inflamatória .

Numa concretização ainda maior, os extractos obtidos através dos processos anteriormente descritos contêm ainda pelo menos um dos seguintes péptidos, identificados com as sequências: SEQ.ID.N°1, SEQ.ID.N°2, SEQ.ID.N°3, SEQ.ID.N°4, SEQ.ID.N°5, SEQ.ID.N°6 ou SEQ.ID.N°7. Ainda com maior detalhes, refira-se o péptido SEQ.ID.N°7. Em casos ainda mais preferenciais, os extractos poderão conter pelo menos um dos péptidos identificados com as sequências SEQ.ID.N°8, SEQ.ID.N°9, SEQ.ID.N°10, SEQ.ID.N°11, SEQ.ID.N°12, SEQ.ID.N°13,

SEQ.ID.N°14 e SEQ.ID.N°15.

Os referidos extractos poderão ser utilizados:

na preparação de um inibidor da actividade da ACE, ou de preparados com actividade antioxidante, antinociceptiva e/ou anti-inflamatória;

na preparação de uma composição farmacêutica para a prevenção e/ou tratamento de patologias associadas à hipertensão, a condições oxidativas e a neoplasias, e/ou como analgésico; ou

na preparação de suplementos e/ou aditivos alimentares .

A presente invenção ainda diz respeito aos péptidos obtidos através dos processos anteriormente descritos - sendo que tais péptidos apresentam actividade biológica, por exemplo como inibidores da actividade da ACE, antioxidantes, agentes antinociceptivos , antimicrobianos e/ou anti-inflamatórios .

Numa outra aplicação preferencial, os péptidos compreendem uma das seguintes sequências de aminoácidos: SEQ.ID.N°1, SEQ.ID.N°2, SEQ.ID.N°3, SEQ.ID.N°4, SEQ.ID.N°5, SEQ.ID.N°6 ou SEQ.ID.N°7; ou poderão ainda compreender as sequências de aminoácidos: SEQ.ID.N°8, SEQ.ID.N°9, SEQ.ID.N°10,

SEQ.ID.N°11, SEQ.ID.N°12, SEQ.ID.N°13, SEQ.ID.N°14 e SEQ . ID .N° 15.

Os referidos péptidos poderão ser utilizados:

na preparação de inibidores da actividade da ACE, ou como antioxidantes, agentes antinociceptivos e/ou agentes anti-inflamatórios ; na preparação de composições farmacêuticas para a prevenção e/ou tratamento de patologias associadas à hipertensão, a condições oxidativas, e a neoplasias e/ou como analgésico;

na preparação de suplementos e/ou aditivos alimentares .

Descrição geral da invenção

A presente invenção refere-se a um processo de preparação de péptidos e extractos peptidicos bioactivos, a partir de proteínas do soro do leite por acção hidrolítica de cardosinas e enzimas similares. Outro aspecto da presente invenção é o desenvolvimento e optimização de um processo de filtração por membranas, o qual permite obter concentrados proteicos e peptidicos com baixo teor em lactose e sais, e que apresentam actividades biológicas.

Um aspecto suplementar da presente invenção é a utilização destes extractos peptidicos em produtos alimentares e farmacêuticos que apresentem benefícios para a saúde, designadamente no tratamento e/ou prevenção de patologias.

A. Extractos peptidicos bioactivos

A.l. Obtenção dos extractos peptidicos bioactivos

No âmbito da presente invenção, os péptidos e extractos contendo péptidos bioactivos foram obtidos por reacções de hidrólise de soluções de proteínas de soro do leite catalizadas por enzimas provenientes de Cynara cardunculus .

Foram utilizados os sistemas proteolíticos : CC-Lactoalbumina (OC-La) , a segunda proteína quantitativamente mais representativa do soro de leite bovino; Caseinomacropéptido (CMP) , fracção heterogénea de polipéptido derivado da quebra da ligação Pheios-Met106 da κ-caseina ( K-CN) ; e Concentrado Proteico de Soro (CPS) bovino, como substratos; e cardosinas, como enzimas de hidrólise.

Sistema 1. No sistema de hidrólise composto por CPS:extracto de cardo comercial, a reacção de hidrólise ocorre a temperaturas entre 50 e 60 °C e a valores de pH entre 4,8 e 6,2. Preferencialmente, a reacção de hidrólise ocorre a uma temperatura de 55 °C e a um valor de pH de 5,2, durante um período de 7 horas.

Na forma de realização preferencial do sistema de hidrólise constituído por Concentrado de Soro Proteico (CPS ): extracto de cardo comercial, a concentração de extracto de cardo comercial situa-se entre 1 e 5 %(v/v), e preferencialmente terá o valor de 1,6 %(v/v) . A concentração da solução de CPS a hidrolisar é preferencialmente de 40 g/L, sem limitar a aplicação a soluções de CPS com outros valores de concentração em que o sistema é também eficaz. Nas condições preferenciais, o grau de hidrólise das proteínas de CPS é de 18%.

Sistema 2. No sistema de hidrólise composto por concentrado -La : extracto de cardo comercial, a reacção de hidrólise ocorre a temperaturas entre 50 e 60 °C e a valores de pH entre 4,8 e 6,2. Preferencialmente, a reacção de hidrólise ocorre a uma temperatura de 55 °C e a um valor de pH de 5,2, durante um período de 7 horas.

Na forma de realização preferencial do sistema de hidrólise constituído por α-La : extracto de cardo comercial, a concentração de extracto de cardo comercial situa-se entre 1 e 5 %(v/v), e preferencialmente terá o valor de 1,6% (v/v). A concentração da solução de -La a hidrolisar é preferencialmente de 40 g/L, sem limitar a aplicação a soluções de α-La com outros valores de concentração em que o sistema é também eficaz. Nas condições preferenciais, o grau de hidrólise da proteína α-La de 8%.

Sistema 3. No sistema de hidrólise composto por CMP:extracto de cardo comercial, a reacção de hidrólise ocorre a temperaturas entre 50 e 60 °C e a valores de pH entre 4,8 e 6,2. Preferencialmente, a reacção de hidrólise ocorre a uma temperatura de 55 °C e a um valor de pH de 5,2, durante um período de 7 horas.

Na forma de realização preferencial do sistema de hidrólise constituído por CMP : extracto de cardo comercial, a concentração de extracto de cardo comercial situa-se entre 10 e 15 %(v/v) e preferencialmente terá o valor de 11,5 %(v/v) . A concentração da solução de CMP a hidrolisar é preferencialmente de 40 g/L, sem limitar a aplicação a soluções de CMP com outros valores de concentração em que o sistema é também eficaz. Nas condições preferenciais, o grau de hidrólise de CMP é de 10%.

A.2. Screening da actividade biológica dos extractos

Verificou-se que os extractos obtidos através das reacções de hidrólise dos sistemas 1, 2 e 3 (CPS, -La e CMP, respectivamente) possuem actividade inibidora da ACE, apresentando um índice IC ₅₀ de 105,4, 47,6 e 296,0 μg/mL, respectivamente, para a fracção total. Verificou-se também que as fracções <3000 Da e >3000 Da dos referidos extractos peptídicos apresentam efeitos inibitórios distintos sobre a ACE . A primeira apresenta valores de IC ₅₀ de 25, 6, 22, 5 e 63,0 μg/mL, para os sistemas 1, 2 e 3, respectivamente. Por outro lado a fracção >3000 Da apresenta valores de IC ₅ o de 717,0, 539,5 e 717,0 μg/mL, para os mesmos sistemas.

Portanto, a fracção <3000 Da do hidrolisado apresenta muito boa actividade inibitória da ACE relativamente à fracção >3000 Da, evidenciando assim que os péptidos de menor peso molecular são os principais responsáveis pela actividade inibitória dos péptidos bioactivos sobre a ACE.

Os extractos obtidos dos sistemas 1, 2 e 3 (fracção total) apresentam também actividade antioxidante de 0,96 ± 0,08 1,12 ± 0,13 e 0,22 ± 0, 002 μιηοΐ de equivalentes de Trolox/mg de proteína do hidrolisado, respectivamente.

B. Sistema piloto de tratamento de soro para produção de concentrados peptidicos

Outro aspecto da presente invenção compreende o desenvolvimento de um novo processo de tratamento de soro de leite, o qual converte o soro em derivados de elevado valor comercial incluindo extractos peptidicos bioactivos também de acordo com a presente invenção.

O processo de tratamento envolve a aplicação sucessiva de técnicas de filtração selectiva, associadas à hidrólise por enzimas existentes no extracto de cardo, de acordo com o descrito na figura 1. As condições experimentais da reacção de hidrólise são idênticas às definidas anteriormente para a obtenção dos extractos peptidicos nos sistemas 1 e 2.

O processo da presente invenção compreende os seguintes passos, aos quais podem ser adicionados outras etapas caso a amostra de soro necessite de tratamentos adicionais, e que não desvirtuam o espirito da invenção:

Desnatação do soro (1), por exemplo através de centrifugação .

- Redução da carga microbiana (2), por exemplo através de microfiltração.

- Ultrafiltração do soro utilizando uma membrana de 10.000- 20.000 Da, preferencialmente de 20.000 Da, obtendo-se assim um concentrado rico em proteínas (3-retido RUFi) e um extracto de péptidos (4-filtrado FUFi) .

- Diafiltração do concentrado rico em proteínas (3), tendo sido por isso diluído sucessivamente e concentrado por uma membrana de 10.000-20.000 Da, preferencialmente de 20.000 Da, com a finalidade de diminuir o teor de lactose e de sais presentes (que fica no filtrado FUF 2), sendo retido um extracto rico em proteínas (5 - retido RUF ₂ ) .

- Hidrólise do extracto rico em proteínas (5 - retido RUF ₂ ) sob condições definidas para os sistemas 1 e 2 de hidrólise, ou seja, com o pH entre 4,8-6,2, preferencialmente pH de 5,2 concentração de extracto de cardo entre 1 e 5 % (v/v), preferencialmente 1,6% (v/v), a uma temperatura entre 50-60 °C, preferencialmente de 55 °C, e também preferencialmente durante 7 h.

- Ultrafiltração do hidrolisado final com uma membrana de 10.000-20.000 Da, preferencialmente de 20.000 Da, de forma a separar a proteína não hidrolisada (6 - retido RUF3) dos péptidos obtidos por hidrólise (7 - filtrado FUF3) .

- Concentração do retido RUF ₃ (6) e do filtrado FUF ₃ (7), por exemplo por osmose inversa, tendo em vista a obtenção de um concentrado rico em proteínas do soro (proteínas não hidrolisadas) e um concentrado rico em péptidos libertados durante a hidrólise, respectivamente. - Nanofiltração do FUF3 (7) com membrana de 1.000-5.000 Da, preferencialmente de 3.000 Da, de molde a separar grandes péptidos de pequenos péptidos.

Do processo desenvolvido conforme descrito acima, aproveitam- se três fracções de valor acrescentado: um concentrado peptidico com 73% de proteína e baixo teor em lactose (7 - filtrado FUF ₃ , que é um hidrolisado peptidico considerado na sua fracção total), a respectiva fracção <3000 Da resultado de 87% de degradação de -La, e um concentrado de proteína não hidrolisado com 90% de proteína e baixo teor em lactose (6 - RUF ₃ concentrado) , tratando-se de concentrado de β-Lg com elevada pureza e que pode ser facilmente aplicado em grande escala na indústria alimentar e a custo reduzido, quando comparado com métodos de separação alternativos.

As fracções proteicas e peptídicas obtidas nos processos de filtração foram caracterizadas em termos fisico-químicos e microbiológicos .

C. Actividade biológica dos extractos obtidos Cl e C.4. Actividade inibidora ACE :

Os estudos iniciais (secção A) demonstraram uma acção inhibidora ACE in vitro dos extractos obtidos, especialmente nos extractos contendo péptidos originários da hidrólise da α-La e respectiva fracção <3000 Da.

C.2 Actividade microbiana e prebiótica

O concentrado peptidico obtido por hidrólise (7), gerado no processo da secção B (CPSH) , apresenta actividade antimicrobiana in vitro para Staphylococcus aureus na fracção <3000 Da. Relativamente à acção prebiótica (CPS comercial, CPSH fracção total e <3000 Da) sobre Lactobacillus acidophilus (Ki e LAFT ^® L10) e Lactobacillus paracasei, verificou-se um maior poder potenciador para o caso do CPS comercial.

C.3 Actividade anticancerigena

Dos estudos efectuados respeitantes à actividade anticancerigena para o CPSH, na sua fracção total e <3000 Da, verificou-se que nenhum dos extractos peptidicos apresenta actividade citocida, sendo que apresentam actividade citostática em praticamente todas as linhagens, para concentrações superiores a 1000 pg/mL, excepto para a linhagem de leucemia (K562) que apresentou efeitos inibitórios de crescimento à concentração de 25 pg/mL. Os hidrolisados não apresentam toxicidade para as células normais analisadas.

C.5 Actividade antiulcerogénica

No estudo da actividade antiulcerogénica in vivo, no modelo de úlcera induzida por etanol absoluto, das fracções de CPSH total e <3000 Da administradas por gavagem, observou-se em todas as concentrações actividade antiulcerativa — com inibição do ILU. Em dose repetitiva de 100, 200 e 350 mg/kg de peso corporal (pc) , e de dose única de 30, 100, 300 e 350 mg/kg _pc , não se verificou relação entre os índices de lesão ulcerativa e as diferentes concentrações de extracto (dose/efeito) . O tratamento agudo de toma única apresentou efeitos maiores, com valores de 48,5 e 71,7% para fracção total e <3000 Da, respectivamente. Sendo assim, o tratamento mais indicado para se verificar esta actividade é o tratamento agudo, de toma única, de 100 mg/kg _pc . C . 7 Actividade antinociceptiva

A actividade antinociceptiva foi determinada através de modelos clássicos que avaliam diferentes mecanismos de analgesia, seja ela de origem central, periférica ou inflamatória. Foram utilizados os seguintes dois modelos de nocicepção: Térmico (Placa Quente) (dor neurogénica, acção central directa) e Algesia Induzida por Formalina (dor neurogénica e inflamatória) .

Verifica-se que os CPSH não aumentaram o tempo de reacção dos animais ao estimulo álgico térmico (56 ± 0,1°C), sendo que os estudos efectuados permitem concluir que os extractos não apresentam actividade antinociceptiva de acção central directa .

Utilizando o teste da formalina em ratinhos, que é um modelo químico de nocicepção, utilizou-se a dose de 1 g/kg para avaliar a acção dos CPSH. Na fase I (0-5 min) do teste, observou-se que o CPSH - fracção total reduz em 42%, e o CPSH - <3000 Da em 32%, a reactividade dos animais; no caso do CPSH - total, a eficácia é superior ao grupo controle positivo morfina (35%) , demonstrando que a acção antinociceptiva dos extractos pode estar relacionada com mecanismos periféricos. Na fase II (20 min do início), utilizou-se a indometacina como controle positivo. A indometacina reduziu em 36%, e os extractos de CPSH reduziram em 38 e 37%, para a fracção total e <3000 Da, respectivamente, a reactividade dos animais, evidenciando a acção analgésica dos extractos na dor de origem inflamatória. A determinação da actividade antinociceptiva através da avaliação de algesia induzida por calor e pelo modelo de dor neurogénica e inflamatória induzida pela formalina, permitiram determinar que os extractos possuem acção antinociceptiva, e que esta está relacionada com a dor de origem neurogénica e inflamatória. Os extractos nao apresentaram actividade anti-edematológica .

D . Identificação e caracterização dos péptidos

No âmbito da presente invenção estão também os péptidos provenientes da hidrólise e os extractos contendo os péptidos, com as seguintes sequências de aminoácidos:

SEQ.ID.N ⁰ 3: DKVGINY (97-103),

SEQ.ID.N ⁰ 4: KVGINYW (98-104),

SEQ.ID.N ⁰ 5: DKVGINYW (97-104), provenientes da degradação da -La, bem como o péptido SEQ.ID.N ⁰ 15: DAQSAPLRVY (33-42) proveniente da degradação da β-Lg, apresentando resíduos hidrofóbicos na posição C-terminal e por isso potenciais substratos ou inibidores competitivos da ACE, e o péptido com a sequência

SEQ.ID.N ⁰ 1: KGYGGVSL (16-23),

SEQ.ID.N ⁰ 2: RELKDL (10-15), provenientes da degradação da -La, bem como o péptido com a sequência SEQ.ID.N ⁰ 14: RELEEL (1-6), proveniente da degradação da β-CN, apresentando resíduos de Leu no C-terminal, assim como o péptido com a sequência

SEQ.ID.N ⁰ 7: KTEIPIN (116-123) proveniente da hidrólise da K- CN (CMP) , que apresentam um resíduo de Pro na antepenúltima posição, favorecendo a união do péptido com a ACE. Estes péptidos são obtidos no sistema piloto de tratamento de soro para produção de concentrados peptídicos fracções 7 filtrado FUF3 (hidrolisado peptídico fracção total) e a respectiva fracção <3000 Da.

Nestes extractos, verifica-se também a presença de péptidos, ou péptidos análogos aos já descritos, com as seguintes sequências de aminoácidos:

SEQ.ID.N ⁰ 9: MAIPPKKNDQD (106-115); SEQ.ID. N° 8: AIPPKKNDQD (107-115), provenientes da reacção de hidrólise da κ-CN (CMP) , assim como o péptido com a sequência SEQ.ID. ° 6: KGYGGVSLPEW (16-26), proveniente da degradação da -La, cujos efeitos inibitórios sobre a ACE são já conhecidos.

No âmbito da presente invenção, estão também os péptidos provenientes de hidrólise, e os extractos contendo os péptidos, com as seguintes sequências de aminoácidos:

SEQ.ID. ° 1: KGYGGVSL (16-23),

SEQ.ID. ° 2: RELKDL (10-15),

SEQ.ID. ° 3: DKVGINY (97-103),

SEQ.ID. ° 4: KVGINYW (98-104),

SEQ.ID. ° 5: DKVGINYW (97-104),

SEQ.ID. ° 6: KGYGGVSLPEW (16-26), provenientes da degradação da -La, bem como os péptidos com as sequências

SEQ.ID. ° 7: KTEIPTIN (116-123),

SEQ.ID. ° 10: TVQVTSTAV (161-169),

SEQ.ID. ° 11: QVTSTAV (163-169),

SEQ.ID. ° 12: VQVTSTAV (162-169), provenientes da degradação da K-CN, o péptido SEQ.ID. ° 14: RELEEL (1-6), proveniente da degradação da β-CN e o péptido SEQ.ID. ° 15: DAQSAPLRVY (33-42) proveniente da degradação da β-Lg, apresentando resíduos hidrofóbicos em uma ou mais posições do tripéptido C-terminal, especialmente os péptidos que apresentam resíduos Pro, Trp, Tyr, Phe ou Leu no C-terminal, ou Pro na antepenúltima posição, o que favorece a união do péptido com ACE, sendo por isso potenciais substratos ou inibidores competitivos da ACE. Tais péptidos são obtidos no sistema piloto de tratamento de soro para produção de concentrados peptídicos fracções 7 - filtrado FUF ₃ (hidrolisado peptídico fracção total), e a respectiva fracção <3000 Da.

As sequências, SEQ.ID.N ⁰ 9: MAIPPKKNDQD (106-115) e

SEQ.ID. N° 8: AIPPKKNDQD (107-115), provenientes da reacção de hidrólise da κ-CN (CMP) , não apresentam potencial actividade inibidora da ACE; porém, quando analisado o tripéptido C-terminal, verifica-se que contém na sua constituição o tripéptido IPP, dotado de potente actividade antihipertensiva comprovada.

Nestes extractos, verifica-se também a presença de péptidos análogos já descritos, com as seguintes sequências de aminoácidos :

SEQ.ID.N ⁰ 10: TVQVTSTAV (161-169),

SEQ.ID.N ⁰ 11: QVTSTAV (163-169),

SEQ.ID.N ⁰ 12: VQVTSTAV (162-169),

SEQ.ID.N ⁰ 15: DAQSAPLRVY (33-42) e

SEQ.ID.N ⁰ 6: KGYGGVSLPEW (16-26), que incluem as sequências VTSTAV, SAPLRVY e VSLPEW, assim como a sequência LKGYGGVSLPEW - cujos efeitos inibitórios sobre a ACE são já conhecidos .

Na determinação da actividade inhibidora da ACE, os péptidos puros mostram valores de IC ₅ o de 99.9 ± 8.1 μΜ para o péptido com a sequência SEQ.ID.N ⁰ 3: DKVGINY (97-103), 11.3 ± 0.9 μΜ para o péptido com a sequência SEQ.ID.N ⁰ 15: DAQSAPLRVY (33- 42), 9.7 ± 0.4 μΜ para o péptido com a sequência SEQ.ID.N ⁰ 5: DKVGINYW (97-104) e 0.9 ± 0.07 μΜ para o péptido com a sequência SEQ.ID.N ⁰ 6: KGYGGVSLPEW (16-26). De entre os referidos péptidos, encontram-se por isso 3 com potente actividade inibidora ACE.

Os resultados obtidos na presente invenção demonstram que são maioritariamente os péptidos obtidos da hidrólise da - La os responsáveis pelo incremento inesperado da actividade inibitória dos extractos obtidos sobre a ACE. Breve Descrição das Figuras

Figura 1. Obtenção dos concentrados proteicos de soro de leite em sistema piloto e hidrólise do concentrado proteico final, sob condições previamente optimizadas. Foram efectuados os passos de desnatação através de centrifugação, seguida de microfiltração para reduzir a carga microbiana. De seguida, efectuaram-se dois passos de ultrafiltração (com diafiltração) , para concentrar as proteínas do retido e reduzir o teor em lactose e minerais. Após hidrólise, efectuou-se uma nova ultrafiltração para separar o hidrolisado (FUF ₃ ) do não hidrolisado (RUF ₃ ) , que posteriormente foram sujeitos a osmose inversa, sendo a fracção FUF ₃ submetida a nanofiltração .

Tabela 1. Identificação dos péptidos da fracção <3000 Da do hidrolisado resultante da hidrólise durante 7 h de CPS a 40 g/L, com 1,6% (v/v) de extracto de cardo a pH 5,2 e 55 °C. Indicação das sequências de aminoácidos (SEQ. ID. No), e composição em aminoácidos (obtida por sequenciação ) da fracção de proteína de soro respectiva.

SEQ IDL NO sequência fracção proteína

1 KGYGGVSL (16-23) a- La

2 RELKDL (10-15) a- La

3 DKVGINY (97-106) a- La

4 KVGNYW (98-104) a- La

5 DKVGNYW (97-104) a- La

6 KGYGGVSLPEW (16-26) a- La

7 ΤΗ ΡΠ Ν (116-123) k-CN

8 AIPPKKNQP (107-115) k-CN

9 MM PPKKNQP (106-115) k-CN

10 TVQVTSTAV (161-169) k-CN

11 QS TSTAV (163-169) k-CN

12 VQV STAV (162-169) k-CN

13 AVEST (138-142) k-CN

14 RELEEL (1-6) β-CN

15 DAQgAPLRVY (33-42) β-Lg Descrição detalhada da invenção A. Extractos peptidicos bioactivos

A.l. Obtenção dos extractos peptidicos bioactivos - Reacção de proteólise :

Avaliação da actividade do extracto enzimático comercial do cardo, a diferentes concentrações, ao longo do tempo, sob condições óptimas de pH e temperatura. Um CPS (Lacprodan) , CMP (Davisco ^® ) e α-La (Sigma) foram usados como substrato, de forma a determinar as condições óptimas no que se refere à razão enzima/substrato e ao tempo de reacção, em função das seguintes variáveis: grau de hidrólise, actividade inibitória da ACE e actividade antioxidante. A monitorização do grau de hidrólise foi realizada pelo método de TNBS conforme modificado por Spadaro et al . (1979), e a determinação da actividade inibitória ACE foi realizada de acordo com o método de Sentandreu e Toldrá (2006) com modificações, enquanto o método de ORAC descrito por Ou et al . (2001) e modificado por Dávalos et al . (2004) foi usado para avaliar a actividade antioxidante.

O efeito da razão enzima/substrato (R) e o tempo ( Γ) sobre as diferentes variáveis resposta (grau de hidrólise, actividade inibitória ACE e actividade antioxidante) , foi estudado através de um projecto experimental factorial. Foram efectuadas um total de 10 experiências com extracto enzimático: quatro pontos para o desenho factorial completo, quatro pontos estrela (a = 1.414 de distância), e dois pontos centrais para verificar os erros experimentais. Mediante o uso deste desenho experimental, as duas variáveis foram testadas a 5 níveis experimentais: razão enzima/substrato a 1,6, 3,0, 6,5, 10,0 e 11,4, e o tempo a 0, 1, 3,5, 6 e 7 h, correspondendo aos seguintes códigos: 1.414, -1, 0, +1, +1.414, respectivamente. O modelo quadrático polinomial proposto para cada variável resposta foi (1) : γ± = β ₀ + βι-R + β ₂ τ + _lrl R ² + β ₂ , ₂ τ ² + βι, ₂ £Γ + ε (ΐ)

Onde β ₀ é uma constante, βι e β ₂ são coeficientes lineares, βι,ι e β ₂ ,2 são coeficientes quadráticos, βι, ₂ é o coeficiente de interacção, e ε é o erro. Os parâmetros do modelo foram estimados por regressão múltipla linear (MLR) , usando o programa Stat-graphics Plus v.5.1. (Statistical Graphics Corporation, Manugistics Inc., MD, USA, 2000) - o qualpermite a criação e análise de desenhos experimentais.

O efeito de cada termo no modelo e a sua significância estatística, para cada variável resposta, foram analisados a partir do gráfico tipo Pareto Standard. Os termos que não diferem significativamente de zero (P>0,10) foram excluídos do modelo, e o modelo matemático foi reajustado por MLR. O melhor ajuste do modelo foi avaliado pelo coeficiente de determinação (R ² ) e o residual standard desviation (RSD) . Para os novos modelos ajustados, foram obtidas as superfícies de resposta estimadas e as condições óptimas que maximizam cada variável de resposta.

Materiais :

Substrato . CPS comercial (Lacprodan) , CMP (Davisco ^® ) e -La (Sigma) . Enzimas e reagentes. Extractos de coalho vegetal (0,25 RU (mg de proteína para coagular 10 mL de leite) ) (enzima de extracto de flores de C. candunculus com actividade padronizada - Formulab, Maia, Portugal), Abz-Gly-Phe ( O ₂ ) -Pro ( o-aminobenzoilglicil-p-nitrofenilalanilprolina) (Bachem

Feinchemikalien, Bubendorf, Suíça); fluoresceína (Sigma Chemical, St. Louis, MO, EUA); ácido 6-hidroxi-2 , 5 , 7 , 8- tetrametilcromano-2-carboxílico (Trolox) (Aldrich Chemie, Munich, Alemanha); 2 , 2 ' -azo-bis- ( 2-metilpropionamidina) dihidrocloro AAPH (Aldrich Chemie) .

Procedimento experimental :

Reacção de hidrólise em sistema modelo: 25 mL de CPS, 25 mL de CMP e 25 mL de -La, com teor de proteína de 40 g/L, foram hidrolisados nas condições acima referidas a pH 4,8-6,2 com extractos de cardo. As amostras foram sujeitas a hidrólise enzimática por incubação num banho com agitação, a 50-60°C com extractos de cardo (Barros e Malcata, 2001), e retiradas em diferentes períodos de tempo (determinados pelo desenho factorial) . A reacção foi parada colocando as amostras num banho a 95°C durante 30 min. Após paragem da reacção, todos os hidrolisados foram centrifugados a 10.000-20.00 Oxg durante 15 min a 2-6°C, e os sobrenadantes foram devidamente recolhidos. Os sobrenadantes dos hidrolisados foram submetidos a um processo de ultrafiltração através de uma membrana hidrofílica, com tamanho de poro de 1000-5000 Da (Centricon, Amicon Inc., Beverly, MA, EUA) .

Determinação do teor proteico: As determinações do teor proteico foram efectuadas pelo método de Kjeldahl (norma IDF standard 20B - IDF 1993) e pelo método do ácido bicinconinico .

Avaliação da hidrólise enzimática: O grau de hidrólise (DH) é entendido como a percentagem do número total de ligações peptidicas numa proteína clivadas durante a hidrólise - sendo útil para a monitorização da extensão da degradação proteica. O DH foi avaliado para todas as amostras resultantes dos sistemas hidrólise modelo, obtidos com a fracção total. O grau de hidrólise foi determinado pelo método TNBS (ácido trinitrobenzenosulfónico ) segundo Fields (1971), com modificações por Spadaro et al. (1979).

A.2. Screening da actividade biológica dos extractos

A obtenção de CPS, CMP e -La foi realizada através de técnicas de filtração selectiva, associadas a hidrólise por enzimas existentes no extracto de cardo comercial, utilizando a razão óptima de enzima/substrato e o tempo de reacção óptimo obtidos na secção A. Foram utilizadas membranas de filtração (nanofiltração) para separar os macropépt idos não hidrolisados .

A avaliação das actividades biológicas in vitro dos extractos péptidos específicos mais promissores (separados e purificados através de métodos preparativos) foi efectuada através de ensaios químicos e biológicos.

Materiais :

Substrato. CPS comercial - Lacprodan, CMP - Davisco ^® , -La (Sigma) . Enzimas. Extractos de coalho vegetal (0,25 RU (mg de proteína para coagular 10 mL de leite) ) (enzima de extracto de flores de C. candunculus com actividade padronizada - Formulab, Maia, Portugal) .

Procedimento experimental :

Reacção de hidrólise sob condições optimizadas: 500 mL dos substratos CPS, CMP e -La, com teor de proteína de 40 g/L, foram hidrolisados a pH 5,2 com extracto de cardo a 1,6% (v/v) para CPS e -La, e 11,5% para CMP. As amostras foram sujeitas a hidrólise enzimática por incubação num banho com agitação, a 55°C durante 7 h (condições óptimas determinadas em 1) . A reacção foi parada através de aquecimento num banho a 95°C durante 30 min. Após paragem da reacção, o hidrolisado foi centrifugado a 10.000-20.00 Oxg durante 15 min a 2-6°C, e os sobrenadantes foram devidamente recolhidos.

Os sobrenadantes dos hidrolisados foram submetidos a um processo de nanofiltração, através de uma membrana com tamanho de poro de 3000 Da e área efectiva de filtração de 50 cm ² (Pall Life Science, MI, EUA) . O equipamento de ultrafiltração era um Minimate TFF System (Pall Life Science, MI, EUA) . As fracções <3000 Da obtidas foram usadas para caracterizar os hidrolisados finais.

A.2.1 Actividade inibidora da ACE:

O potencial inibidor da ACE dos extractos ricos em biopéptidos foi efectuado através do método de Sentandreu e Toldrá (2006) modificado, que se baseia na hidrólise do substrato fluorescente o-aminobenzoilglicil-p- nitrofenilalanilprolina por acção da ACE. Tal inibição foi avaliada para todos os extractos resultantes da hidrólise, e finalmente para os extractos de CPS, CMP e de α-La com extracto de cardo sob condições óptimas de hidrólise, quer com a fracção total quer com <3000 Da. Recorde-se que a enzima ACE converte a angiotensina I em angiotensina II, que aumenta a pressão sanguínea e os níveis de aldosterona, e inactiva a acção vasodilatadora da bradiquinina .

0 composto usado como substrato da ACE foi o Abz-Gly- Phe (NO ₂ ) -Pro ( o-aminobenzoilglicil-p-nitrofenilalanilprolina) , o qual foi dissolvido em tampão Tris-HCl a 150 mM e pH 8,3, com cloreto de sódio a 1125 mM, de forma a obter uma concentração final de 0,45 mM de substrato a pH 8,3. Para a realização do ensaio, misturaram-se 160 IL de substrato, com 40 IL de cada uma das amostras para as quais se pretendia determinar a actividade inibitória da ACE, e adicionou-se 2 mU da enzima ACE, dissolvida em glicerol a 50% e preparada numa solução tampão Tris-HCl a 150 mM com 0,1 μΜ de ZnCl ₂ a pH 8,3, numa microplaca de poliestireno preta (Nunc, Denmark) . A reacção foi levada a efeito a 37°C durante 30 min. Fizeram-se medidas da fluorescência ao fim de 30 min num fluorímetro FluoSTAR ÓPTIMA (BMG Labtech, Offenburg, Alemanha) (Fig. 2), tendo-se usado o comprimento de onda de excitação de 355 nm e o de emissão de 405 nm. O software utilizado foi Fluostar Control v. 1.32 R2.

A actividade inibitória da ACE foi calculada como a quantidade de proteína solúvel necessária para inibir 50% da enzima (IC ₅₀ ) (em μg de proteína/mL) . Para ser realizado esse cálculo, foi feito um ajuste não linear dos dados, com o software PRISM v. 4.02 para Windows (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, EUA) . A actividade de cada amostra foi determinada em triplicado. Para calcular a actividade inibitória de cada amostra, utilizou-se a seguinte fórmula (3) :

„ . (F controlo - Fbranco) - F amostra - Fbranco amostra) .„„ (3)

% Actividade inibitória = x 100

Fcontrolo - Fbranco

Sendo F _{co nt r} oio a Fluorescência emitida pelo grupo o- aminobenzoilglicina através da acção da ACE sobre o substrato fluorescente Abz-Gly-Phe (N0 ₂ ) -Pro sem inibidor, F _branco a Fluorescência emitida pelo substrato fluorescente Abz-Gly- Phe (N0 ₂ ) -Pro, F _{amo s t} ra a Fluorescência emitida pelo grupo o- aminobenzoilglicina através da acção da ACE sobre o substrato fluorescente Abz-Gly-Phe (Ν0 ₂ ) -Pro na presença de inibidor, e Fbranco amo stra a Fluorescêncίa emitida pelo substrato fluorescente Abz-Gly-Phe ( NO 2 ) -Pro na presença de inibidor.

O branco recebeu o mesmo tratamento que as amostras, mas em vez de se adicionar a enzima, adicionou-se água; o controlo positivo foi também submetido ao mesmo tratamento, colocando- se 40 IL de água em vez da amostra.

A.2.2 Actividade antioxidante

O screening da actividade antioxidante foi executada através de método fluorométrico (método ORAC) , tendo sido feitas avaliações para todas as amostras resultantes dos sistemas hidrólise modelo na sua fracção total, e para os extractos resultantes da hidrólise de CPS, CMP e -La com extracto de cardo nas condições óptimas de hidrólise, igualmente na sua fracção total.

A capacidade de absorção do radical de oxigénio (ORAC Fluoresceina) foi determinada segundo o método desenvolvido por Ou et al . (2001), adaptado por Dávalos et al . (2004), utilizando um leitor de fluorescência de microplacas, com algumas modificações. Este método permite determinar in vitro a actividade antioxidante, baseando-se na oxidação da fluoresceina pelos radicais peroxilos produzidos in situ por decomposição térmica do 2 , 2 ' -azo-bis- ( 2- metilpropionamidina) dihidrocloro (AAPH) . A oxidação da fluoresceina causa um decréscimo da fluorescência; no entanto, este processo pode ser evitado ou retardado na presença de substâncias antioxidantes.

A solução de fluoresceina foi preparada diariamente a uma concentração de 116,66 nM, a partir de uma solução mãe de fluoresceina 1166,1 μΜ em tampão fosfato a 75 mM (pH 7,4) . Como antioxidante de referência, foi utilizado o ácido 6- hidroxi-2, 5, 7, 8-tetramet ilcromano-2-carboxí lico (Trolox) (análogo solúvel da vitamina E) , que foi preparado a 0,1 mM em tampão fosfato (solução mãe) . Esta foi diluída por forma a obter diferentes concentrações (0,0002, 0,0004, 0,0006, 0, 0008, 0, 0010, 0, 0012, 0, 0014 e 0,0016 μπιοΐ), para a construção de uma curva de calibração de referência (Trolox) conforme a seguir se explica. O AAPH foi dissolvido em tampão fosfato até uma concentração final de 46,6 mM.

Para a realização do ensaio, misturaram-se 20 LL da amostra ou tampão fosfato (no caso do controlo) com 120 [IL de fluoresceina e 60 LL de AAPH, numa microplaca de poliestireno preta (Nunc) , que foi incubada a 40°C. Fizeram-se 104 medidas da fluorescência durante 137 min num fluorimetro FluoSTAR ÓPTIMA (BMG Labtech) , tendo sido o comprimento de onda de excitação de 485 nm e o de emissão de 520 nm. O software utilizado foi Fluostar Control v. 1.32 R2. Todas as análises foram feitas em triplicado. As medidas de fluorescência foram normalizadas, tendo por base uma curva de calibração (sem oxidante) . A partir das curvas normalizadas, a área calculou-se da seguinte forma: (4)

AUC= 1+ ∑ fi /fo onde fo é a fluorescência inicial medida ao tempo 0 min e fi é a fluorescência medida num ciclo i. 0 AUC da amostra foi calculado segundo a fórmula:

AUC = AUC antioxidante - AUC controlo

Construiu-se um gráfico de AUC em função da quantidade de oxidante, e calculou-se a regressão linear. 0 valor final de 0RAC-F1 foi expresso como o quociente entre o declive da curva da amostra e a de Trolox (μιηοΐ de equivalentes de Trolox/mg de proteina/péptido ) .

B. Sistema piloto de tratamento de soro para produção de concentrados peptidicos

A obtenção de concentrados proteicos e peptidicos de soro de vaca foi realizada, em unidade piloto, através de técnicas de filtração selectiva, associadas a hidrólise por enzimas existentes no extracto de cardo comercial, utilizando a razão óptima de extracto enzimático e o tempo de reacção óptimo previamente obtidos.

As fracções proteicas e peptidicas obtidas nos processos de filtração foram caracterizadas em termos fisico-quimicos e microbiológicos .

0 conhecimento da concentração das proteínas do soro, que são hidrolisadas sob estas condições experimentais, é de extrema importância para a posterior caracterização dos péptidos. Assim, avaliou-se o grau de hidrólise dos extractos por FPLC.

Materiais :

Substrato. 0 soro de leite foi obtido como subproduto da produção de queijo de vaca tipo prato, e cedido pela Escola Superior Agrária de Coimbra.

Meios de cultura. Os PCA (Plate Count Agar), BPA (Baird Parker Agar) , VRBGA (Violet Red Bile Glucose Agar) , RB (Rose Bengal Agar) e suplemento de gema de ovo-telúrio, foram todos adquiridos na LabM (Bury, RU) .

Enzimas. Extractos de coalho vegetal (0,25 RU (mg de proteína para coagular 10 mL de leite) - enzima de extracto de flores de C. candunculus com actividade padronizada - Formulab, Maia, Portugal) .

Procedimento experimental :

Obtenção dos concentrados proteicos de soro de vaca. O soro de leite foi sujeito a uma sequência de processos de filtração selectiva, em equipamento semi-industrial . As condições óptimas para a obtenção dos concentrados são apresentadas na Figura 1.

Partiu-se de 200-500 L de soro (1), o qual foi submetido ao desnate para retirar a gordura existente através de uma centrifugação, e a uma microfiltração para reduzir ao máximo a carga microbiana presente (2) . O soro obtido foi sujeito a uma ultrafiltração com membrana de 10.000-20.000 Da, preferencialmente 20.000 Da, onde foram separadas as proteínas dos péptidos presentes no soro, obtendo-se assim um concentrado rico em proteínas (3-retido RUF i ) e um extracto de péptidos (4-filtrado FUF i ) .

0 extracto rico em proteínas (5-retido RUF ₂ ) foi obtido por diafiltração, tendo sido por isso diluído sucessivamente e concentrado por uma membrana de 10.000-20.000 Da, preferencialmente 20.000 Da, com a finalidade de diminuir o teor de lactose e de sais presentes.

O concentrado proteico retido na membrana (5-retido RUF ₂ ) foi sujeito a hidrólise sob condições previamente definidas (após o estudo dos resultados obtidos no ponto 1); sendo assim, a hidrólise enzimática do retido com pH de 4,8-6,2, preferencialmente pH de 5,2, decorreu com 1,6% (v/v) de extracto durante 7 h a 50-60 °C, preferencialmente a 52 °C. O hidrolisado final foi ultrafiltrado com uma membrana de 10.000-20.000 Da, preferencialmente 20.000 Da, de forma a separar a proteína não hidrolisada (6-retido RUF3) dos péptidos obtidos por hidrólise (7-filtrado FUF3) .

Os extractos foram posteriormente concentrados por osmose inversa, tendo em vista a obtenção de um concentrado rico em proteínas do soro (proteínas não hidrolisadas) e um concentrado rico em péptidos libertados durante a hidrólise; este último foi submetido a nanofiltração com membrana de 1000-5000 Da, preferencialmente 3000 Da, de forma a separar grandes péptidos de pequenos péptidos, descritos como tendo maior actividade biológica.

Caracterização físicoquímica das fracções proteicas e peptidicas . O teor de proteína total presente nas fracções obtidas ao longo do processo de filtração selectiva e hidrólise foi determinado pela técnica de micro-Kjeldahl, de acordo com a norma NP 1986: 1991; o teor de matéria gorda pela técnica de Gerber, processo corrente de acordo com a norma NP 1923: 1987; o teor de acidez pela NP 470: 1983; o teor de lactose pela NP 676: 1973; o peso seco de acordo com a NP 477: 1983; e as análises microbiológicas por enumeração de microrganismos viáveis (em meios específicos) das amostras referentes às diferentes etapas do processo.

Análise microbiológica: foram realizadas diluições decimais em água peptonada a 0,1% estéril, as quais foram plaqueadas em duplicado para a contagem de microrganismos viáveis em diferentes meios: enumeração de microrganismos totais mesófilos em PCA com incubação aeróbia durante 3 dias a 30°C; enumeração de Staphylococcus em BPA com suplemento de gema de ovo com telurito, incubadas sob condições aeróbias durante 48 h a 37°C; enumeração das Enterobacteriaceae em VRBGA sob condições aeróbias durante 24 h a 37°C; e enumeração das leveduras em RB sob condições aeróbias durante 5 dias a 25°C. Todas as determinações utilizaram a técnica do plaqueamento, excepto o VRBGA que utilizou o método de incorporação.

Avaliação do grau de hidrólise. O grau de hidrólise foi determinado por métodos cromatográficos usando um sistema de FPLC, associado a uma coluna de filtração por gel Superose 12 HR 10/30 (Amersham Biosciences, Hong Kong, China), de acordo com Lamas et al . (2004) .

C. Actividade biológica dos extractos obtidos Avaliação de actividades biológicas in vitro A avaliação das actividades biológicas in vitro dos concentrados obtidos foi efectuada através de ensaios químicos e biológicos.

Materiais :

Substrato. Concentrados peptídicos obtidos na secção A (CPS e CMP (Davisco ^® ) hidrolisado e oc-La (Sigma) hidrolisada) e na secção B ( F i - CPSH - fracção total e F ₂ - CPSH - <3000 Da) . As linhagens celulares utilizadas neste trabalho eram originárias de neoplasias humanas, e foram cedidas pelo National Câncer Institute (NCI) dos EUA.

Microrganismos. Staphylococcus aureus ATCC 25923, Salmonella spp . (isolada de produtos alimentares), Escherichia coli ATCC 25922 e Listeria inoccua (isolada de produtos alimentares) e Lactobacillus paracasei, Lactobacillus acidiphilus Ki e Lactobacillus acidophilus LAFT ^® L10.

Meios de cultura, caldo de Mueller Hinton, Mueller Hinton agar e infusão BHI (Brain Heart Infusion) .

Enzimas e reagentes. Tripsina (Sigma Chemical Co, St Louis, MO, EUA), meio de cultura RPMI-1640 (Gibco, NY, EUA), soro fetal bovino (SFB) (Gibco), Hank's (Sigma Chemical Co ^' , St Louis, MO, EUA), dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma Chemical Co), ácido tricloroacético (TCA) (Merck, Darmstadt, Germany) .

Cl. Actividade inibitória ACE

0 potencial de inibição da ACE pelos extractos ricos em biopéptidos foi efectuado através do método de Sentandreu e Toldrá (2006) modificado, que se baseia na hidrólise do substrato fluorescente o-aminobenzoilglicil-p- nitrofenilalanilprolina por acção da ACE . Foi avaliada para os extractos resultantes da hidrólise de CPS, CMP e -La com extracto de cardo nas condições óptimas de hidrólise, usando a CPSH fracção total e <3000 Da, de acordo com o descrito em A.2.1.

C.2. Actividade antimicrobiana e prebiótica

A determinação da actividade antimicrobiana dos extractos ricos em péptidos (CPS e CMP comercial, extractos resultantes da hidrólise de CPS e CMP com extracto de cardo nas condições óptimas de hidrólise, por fracção total e <3000 Da, foi realizada sobre estirpes patogénicas e contaminantes alimentares (Escherichia coli, S. aureus, Salmonella spp . e Listeria inoccua) previamente seleccionadas, e a determinação da actividade estimulante sobre estirpes de bactérias probióticas foi realizada para Lactobacillus paracasei, Lactobacillus acidiphilus Ki e Lactobacillus acidophilus LAFT ^® L10 presentes na flora intestinal (por forma a avaliar a ausência de inibição das mesmas) . A avaliação desta actividade foram efectuadas, para os microrganismos teste, em meios específicos e de acordo com as normas internacionais.

C.2.1. Avaliação da actividade antimicrobiana. A actividade antimicrobiana foi testada para as seguintes estirpes; Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, Listeria inócua e Salmonella spp. (isoladas de produtos alimentares).

Prepararam-se tubos contendo meio de cultura Mueller Hinton Broth, tendo sido adicionados diferentes volumes do extracto peptidico a testar, partindo de uma solução de 100 mg/mL, de forma a obter concentrações de 10,0 mg/mL (1%), 5,0 mg/mL (0,5%), 2,5 mg/mL (0,25%) e 1,0 mg/mL (0,1%). Todas as soluções de péptido foram filtradas através de filtros 0,22 μιη. Seguidamente, inocularam-se os diferentes eurotubos com 100 μ de microrganismo a testar a diferentes concentrações, nomeadamente, IO ³ , 10 ⁵ e IO ⁷ ufc/mL. Os inóculos foram preparados em meio liquido BHI, com crescimento durante a noite (37°C / 12 h) ; terminado este período, realizaram-se diluições de modo a obter as concentrações de inoculo desejadas. Transferiram-se 300 pL do conteúdo de cada eurotubo para as microplacas, as quais permaneceram 24 h no leitor Bio-Rad ^® a 37°C, tendo sido registadas as leituras da absorvância a λ=660 nm.

C.2.2. Actividade prebiótica. A actividade prebiótica foi testada para as estirpe L. paracasei, L. acidophilus Ki e L. acidophilus LAFT ^® L10 pelo método da leitura em microplacas. Prepararam-se tubos contendo meio de cultura MRS, aos quais se adicionaram diferentes volumes do extracto peptidico a testar, partindo de uma solução de 100 mg/mL, de forma a obter concentrações de 30,0 mg/mL (3%), 20,0 mg/mL (2%), 10 mg/mL (1%), 5,0 mg/mL (0,5%) e 1,0 mg/mL (0,1%) . Todas as soluções de péptido foram filtradas através de filtros 0,22 μιη. Seguidamente, inoculou-se cada eurotubo com 2% de microrganismo a testar, contendo uma concentração de IO ⁷ cfu/mL. Os inóculos foram preparados em meio líquido MRS broth com cisteína, para cada uma das estirpes utilizadas, por um período de 48 h a 37°C sob anaerobiose. Transferiram- se 250 μL do conteúdo de cada eurotubo para as microplacas, e de seguida adicionaram-se 50 μL de parafina líquida estéril. As microplacas permaneceram 48 h no leitor Bio-Rad ^® a 37°C, e as leituras da absorvância ocorreram a λ=660 nm.

C.3. Actividade anticancerigena

Foi determinada a actividade anticancerigena para os concentrados peptídicos CPSH - fracção total e <3000 Da, através da realização da triagem in vitro, usando as linhagens K562 (leucemia), MCF-7 (mama), NCI-ADR (mama com fenótipo de resistência a múltiplas drogas), UACC-62 (melanoma) , NCI460 (pulmão), PC03 (próstata), HT29 (cólon), OVCAR (ovário) e 786-0 (rim), expostas aos péptidos a testar. Foi também determinada a citotoxicidade dos extractos peptidicos sobre linhagens de células normais VERO (fígado) , V79 (fibroblasto) e 3T3 (fibroblasto) .

Determinação da actividade anticancerigena e citotoxicidade das amostras :

Para testar a actividade anticancerigena, foi seguido o protocolo desenvolvido pelo National Câncer Institute (EUA) , que utiliza essa metodologia há mais de quinze anos (Skehan et al, 1990; Monks et al, 1991; Rubistein et al, 1990) .

Avaliação de actividades biológicas in vivo

A avaliação das actividades biológicas in vivo dos concentrados peptidicos CPSH - fracção total e <3000 Da, foi efectuada através de ensaios químicos e biológicos.

Materiais :

Substrato. Concentrados peptidicos obtidos na secção B (Fi - CPSH - fracção total e F ₂ - CPSH - <3000 Da) .

Enzimas e reagentes. NEM, L-Name, indometacina, carbenoxolona .

Animais. Os animais foram adquiridos ao Centro de Bioterismo (CEMIB) da UNICAMP (Brasil), e utilizados nos ensaios após período mínimo de sete dias de adaptação ao biotério, em ciclo de claro-escuro de 12 h e temperatura ambiente de 20°C, com água e ração comercial ad libitum; foram utilizados ratos machos SHR, com 2 semanas de idade.

Procedimento experimental :

C.4. Determinação da actividade antiulcerogénica. Foi feita a avaliação clinica e anatomopatológica em ratos (com administração tópica dos péptidos a testar) , com úlceras induzidas por etanol (Robert, 1979), os quais foram sacrificados por deslocamento cervical, sendo os estômagos retirados, abertos ao longo da maior curvatura e lavados em solução salina, para realização de contagens e avaliação das lesões produzidas. 0 índice de Lesões Ulcerativas (ILU) foi calculado, de acordo com a metodologia descrita por Gamberini (1991) .

Neste estudo, foram efectuados tratamentos com doses únicas de 30, 100 e 300 mg/kg _pc das amostras de péptidos a testar, e tratamentos de 3 doses consecutivas de 100, 200 e 350 mg/kg _pc .

Determinação da dose efectiva 50% (DE ₅₀ )

A dose efectiva 50% (DE ₅ o) corresponde à dose necessária para produzir inibição de 50% nas lesões observadas, em comparação com o controlo negativo.

Participação das substâncias sulfidrilo na citoprotecção gástrica

Para estudar a possível participação de compostos sulfidrilo na citoprotecção gástrica, utilizou-se o modelo de úlcera induzida por etanol (Robert, 1979) .

Foram utilizados ratos wistar machos, pesando entre 200 e 250 g, divididos em grupos de 6 animais. Após jejum de 16 h, com livre acesso à água, um grupo controlo negativo e os grupos teste receberam tratamentos prévios com uma solução aquosa de N-etilmaleimida (NEM) a 10 mg/kg (2,5 mL/kg _pc ) de peso corpóreo, por via subcutânea, de acordo com a metodologia descrita por Szabo, Trier, Frankel (1981) . Os ratos foram sacrificados por deslocamento cervical, sendo os estômagos retirados, abertos ao longo da maior curvatura e lavados em solução salina, para realização de contagens e avaliação das lesões produzidas. O índice de Lesões Ulcerativas (ILU) foi calculado, de acordo com a metodologia descrita por Gamberini (1991) .

Participação de prostaglandinas na citoprotecção gástrica

Para estudar a possível participação de prostaglandinas na citoprotecção gástrica, utilizou-se o modelo de indução de úlcera por etanol absoluto (Robert, 1979).

Para tal, foram utilizados ratos wistar machos, pesando cada um entre 200 e 250 g, divididos em grupos de 6 animais. Após jejum de 16 h, o grupo controlo negativo e os grupos teste receberam tratamentos prévios de indometacina, numa dose de 5 mg/kg _pc , em solução aquosa, na forma de 10 mL/kg _pc por via subcutânea, de acordo com a metodologia descrita por Szabo, Trier, Frankel (1981) . Os ratos foram sacrificados por deslocamento cervical, sendo os estômagos retirados, abertos ao longo da maior curvatura e lavados em solução salina, para realização de contagem e avaliação das lesões produzidas. O índice de Lesões Ulcerativas (ILU) foi então calculado, de acordo com a metodologia descrita por Gamberini (1991) .

Participação do óxido nítrico (NO) na citoprotecção gástrica Para estudar a possível participação do óxido nítrico na citoprotecção gástrica, utilizou-se o modelo de úlcera induzida por etanol (Robert, 1979) .

Foram utilizados ratos wistar machos, pesando cada um entre 200 e 250 g, divididos em grupos de 6 animais. Após jejum de 16 h, com livre acesso à água, um grupo controlo negativo e os grupos teste receberam tratamentos prévios com uma solução aquosa de L-Name na dose de 5 mg/kg _pc , por via intraperitoneal , de acordo com a metodologia descrita por Konturek e Pawlink (1986) . Os ratos foram sacrificados por deslocamento cervical, sendo os estômagos retirados, abertos ao longo da maior curvatura e lavados em solução salina, para realização de contagem e avaliação das lesões produzidas. O índice de Lesões Ulcerativas (ILU) foi então calculado, de acordo com a metodologia descrita por Gamberini (1991) .

Análise estatística

Todos os resultados dos ensaios envolvendo as fracções proteicas, relativos à protecção da mucosa gástrica, foram submetidos a análise de variância (ANOVA) e ao teste de Duncan, para os quais foi utilizado como critério de significância estatística o nível de 5% de probabilidade (p<0, 05) .

C.5. Determinação da actividade anti-inflamatória

Dermatite induzida por óleo de Cróton. Foi providenciada a administração por via oral dos péptidos a testar em ratinhos. Entretanto, foi aplicada uma solução de óleo de cróton na superfície interna da orelha direita. Na orelha esquerda, foi aplicado um volume equivalente do solvente (acetona) . Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical, e foram retiradas porções das duas orelhas — sendo a diferença de peso considerada como derivada do edema produzido pelo óleo de cróton, de acordo com o método de Tubaro (1985) e Schintarelli (1982) .

C.6 Determinação da actividade antinociceptiva

Avaliação de algesia induzida por calor. Esta decorreu segundo o método de Mazella (1991) .

Modelo de dor neurogénica e inflamatória induzida pela formalina . Esta foi efectuadasegundo o método de Hunskaar

(1985) .

D. Identificação e caracterização dos biopéptidos

A determinação do perfil peptidico do extracto e a sequenciaçao dos principais péptidos foram realizadas por LC- MS (Liquid Chromatography, acoplada a Mass Spectrometry ) tendo em vista anticipar a sua bioactividade, baseada no aparecimento de sequências especificas de aminoácidos conforme registada numa base de dados, ou avaliar se se tratava de algum biopéptido desconhecido. Os péptidos identificados foram sintetizados in vitro, e foi avaliada a sua actividade inibidora de ACE . Foram analisados os extractos contendo péptidos específicos mais promissores, e concentrados peptídicos obtidos na secção B (Fi - CPSH - fracção total e F ₂ - CPSH - <3000 Da) .

Materiais :

Amostras. Concentrados peptídicos obtidos na secção B (Fi - CPSH - fracção total e F ₂ - CPSH - <3000 Da), e péptidos sintéticos . Procedimento experimental :

RP-HPLC a escala semipreparativa: 0 equipamento utilizado (Waters Series 600 HPLC, da Waters Corp., Mildford, MA, EUA) constava de uma bomba (modelo delta 600), um controlador de gradiente (modelo 600), um injector (modelo 717 plus), um detector ultravioleta de comprimento de onda variável (modelo 996), um colector de fracções e um software de aquisição e processamento de dados (Millenium 3.2) . A coluna usada foi uma Prep Nova Pak® HR Cig (300 x 7, 8 mm d.i., com 6 pm de tamanho de partícula e 60 À de tamanho de poro) (Waters) . O solvente A é uma mistura de água e ácido trifluoracético (1000:1) e o solvente B é uma mistura de acetonitrilo e ácido trifluoracético (1000:0, 8) . O fluxo foi de 4 mL/min, e a absorvância do solvente foi medida a 214 nm.

Para efectuar o isolamento de fracções peptidicas, o permeado <3000 Da liofilizado procedente do processo de ultrafiltração foi dissolvido em água a uma concentração de 100 mg/mL, e foi forçado através de um filtro com tamanho de poro de 0,45 pm. A amostra foi eluída com um gradiente de solvente B de 0% a 35% em 70 min, a 35°C. Em cada análise cromatográfica, o volume de amostra injectada foi de 500 pL, e as fracções separadas foram recolhidas num total de 12 vezes; uma vez removido o acetonitrilo por vaporização, foram liofilizadas e guardadas a -20°C. Posteriormente, determinou-se a actividade inibidora ACE, seguindo o método descrito na secção A.2.1.

Identificação dos péptidos mediante espectrometria de massas:

As análises por espectrometria de massas foram efectuadas num equipamento HP Agilent 1100 System (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemanha) , ligado em linha a um Esquire-LC, detector de massas Ion Trap (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemanha) . O sistema de HPLC estava equipado com uma bomba quaternária, um desgasificador interno e um injector automático (todos da 1100 Series, Agilent Technologies), tendo sido utilizado como sistema de aquisição de dados o programa ChemStation (Agilent Technologies) . Usou-se uma coluna de fase inversa Wide-Pore C18 (250 x 4,6 mm d.i., com 5 [Lm de tamanho de partículas) (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, EUA) .

O volume de injecção utilizado foi de 50 L . Como solvente A, utilizou-se uma mistura de água e ácido trifluoroacético (1000:0,37 (v/v)), e como solvente B uma mistura de acetonitrilo e ácido trifluoroacético (1000:0,27 (v/v)) . Os péptidos foram eluidos a um fluxo de 0,8 mL/min, sob um gradiente variável dependendo da fracção analisada.

A absorvância do solvente foi monitorizada a 214 nm e, na saída do detector, o fluxo de 0,8 mL/min foi dividido numa razão de 1:40 - originando assim um fluxo final de aproximadamente 20 L/min para o nebulizador do MS, através de um detector tipo T-piece (Valco, Houston, TX, EUA) , que o transportava para o espectrómetro de massas através da interface electrospray . O MS utilizou como gás nebulizador o azoto e de secagem o hélio, a uma pressão estimada de 5xl0 ^~3 bar, e os espectros de massa foram adquiridos com um intervalo máximo de 100-1500 m/ z . O capilar foi mantido a uma voltagem de 4 kV. Cerca de 5 espectros foram analisados no analisador de MS e de MS ⁿ . O limite de intensidade para as análises de MS/MS foi de 10000 (i.e. 5% do sinal total) . Os iões precursores foram isolados com um intervalo de 4 m/z, e fragmentados com uma rampa de voltagem de 0.35 a 1.4 V.

Os dados espectrais foram processados e transformados em valores de massas, utilizando o programa Data Analysis™ v. 3.0 (da Bruker Daltonik) . O programa BioTools v. 2.1 (da Bruker Daltonik) foi usado para processar os espectros MS/MS, e levar a cabo a sequenciaçao dos péptidos.

Procedeu-se finalmente à produção dos péptidos identificados, segundo o método Fmoc, com uma pureza superior a 90%, e posteriormente determinou-se a actividade inibidora ACE seguindo o método descrito na secção A.2.1.