La présente invention se rapporte au domaine de l'obtention de compositions enrichies en certains polyphénols, respectivement dihydroquercétine ou tannins.

ART ANTERIEUR

Les polyphénols, ou composés phénoliques, sont des molécules organiques, produits du métabolisme secondaire des plantes. Ils sont caractérisés chimiquement par la présence de plusieurs groupements phénoliques.

Il a été montré que les polyphénols présentaient des effets bénéfiques sur la santé humaine. En effet, leurs propriétés d' antioxydants naturels pourraient jouer un rôle dans la prévention et le traitement du cancer, des maladies inflammatoires, cardiovasculaires et neurodégénératives. Ces composés chimiques sont également utilisés comme additifs dans les industries agroalimentaire, pharmaceutique et cosmétique.

Parmi les polyphénols, la famille des flavonoïdes comprend plus 6000 composés, regroupés en 4 principaux groupes: les flavones, les flavonones et dihydrofiavonones (flavanonols), les flavanols et les anthocyanes.

Cette large famille comprend à la fois des composés monomériques et des composés polymériques.

Les tanins sont des composés polymériques. Il existe principalement deux catégories de tanins : les tanins catéchiques aussi appelés tanins condensés ou procyanidines, et les tanins hydrolysables comprenant majoritairement les gallotanins et les ellagitanins. Sur le plan chimique, ils sont constitués soit d'oligomères ou polymères de flavanols (tanins condensés), soit de polyols auxquels sont attachés des unités galloyles ou leurs dérivés (tanins hydrolysables).

Les tanins sont naturellement présents dans de nombreux végétaux, notamment le raisin. Ils sont utilisés depuis des siècles dans le tannage des peaux, car ils présentent la propriété naturelle de faire précipiter les protéines. Us sont également intéressants pour leur capacité à chélater les ions métalliques et notamment les cations lourds. En oenologie, on utilise des tanins pour le collage des vins car ils présentent une forte aptitude à se combiner aux protéines. L'application des tanins s'étend à de nombreux autres domaines tels que ceux de l'agroalimentaire, de la pharmacie, de la cosmétique, de la céramique, et du textile.

La dihydroquercétine, aussi appelée taxifoline, est un composé organique monomérique de la famille des flavanonols. Les flavanonols (3-hydroxyflavanone ou 2,3- dihydroflavonol) sont une classe de flavonoïdes dérivant de la 3-hydroxy-2,3-dihydro-2- phenylchromén-4-one.

La taxifoline est naturellement présente dans l'açaï (Euterpe oleracea), le mélèze de Sibérie (Latrix sïbiricd) et la silymarine extraite des graines de chardon-Marie. La taxifoline est principalement produite par extraction en Russie.

La taxifoline possède de nombreuses propriétés potentiellement bénéfiques pour la santé. On a notamment montré in vitro que la taxifoline protège les membranes cellulaires, améliore l'activité des capillaires et la micro-circulation sanguine. On a aussi montré que la taxifoline possèdes des activités anti-inflammatoires, anti-allergie ou encore hépato-protectrice. On sait aussi que les propriétés anti-oxydantes de la taxifoline sont supérieures à celles des autres flavonoïdes ou encore celles de la vitamine E. De plus, la taxifoline n'exerce pas d'effet mutagène et possède des propriétés de toxicité très réduite. En particulier, la taxifoline est encore moins toxique que le composé quercétine qui lui est apparenté.

Du fait de ses nombreuses propriétés bénéfiques pour la santé, la taxifoline est largement utilisée dans le domaine pharmaceutique, dans l'industrie alimentaire et dans le domaine cosmétique.

Dans le domaine pharmaceutique, la taxifoline peut être prescrite notamment dans les traitements complexes de l'avitaminose, des maladies cardio-vasculaires, de la cardiopathie ischémique et de l'athérosclérose. Certaines études incitent à l'utilisation de la taxifoline pour le traitement de cancers. Concernant les propriétés médicales de la taxifoline, l'homme du métier peut avantageusement se référer à l'article de Weidmann (2012, European Journal of Pharmacology, Vol. 684 : 19-26).

Dans l'industrie alimentaire, la taxifoline est utilisée comme antioxydant, en particulier dans la fabrication de produits alimentaires contenant des matières grasses. La taxifoline est notamment utilisée dans la préparation de produits à base de viande ou de poisson, produits laitiers, ou encore de confiseries. Il existe ainsi une demande croissante des industriels pour la disponibilité de grandes quantités de taxifoline. Toutefois, la production actuelle de taxifoline est insuffisante pour satisfaire les besoins du marché. En conséquence, la taxifoline est commercialisée à des prix très élevés.

La quasi-totalité des méthodes d'obtention de la taxifoline consistent en des méthodes d'extraction hydro-alcooliques à haute température, les étapes d'extraction proprement dites étant suivies par une ou plusieurs étapes de purification de la taxifoline contenue dans les extraits. La purification des extraits de taxifoline est principalement réalisée par chromatographie ou par re-crystallisation.

L'extraction des tanins est également réalisée par l'utilisation d'un ou plusieurs solvants, tels que l'acétone et l'acétate d'éthyle. Elle peut être suivie d'une étape de dépolymérisation, une méthode analytique de routine qui repose sur la rupture acido- catalysée des liaisons intermonomériques.

Un exemple de ces méthodes connues d'extraction de polyphénols par solvant, ici à l'échelle du laboratoire, est illustré par l'article de Bocalandro et al. (2012, Industrial Crops and Products, Vol. 38 : 21-26). Bocalandro et al. décrivent un procédé dans lequel des copeaux d'écorce de Pinus radiata sont soumis à une étape d'extraction hydroalcoolique à 120°C. L'extrait ainsi obtenu a ensuite été soumis à une étape d'évaporation afin d'éliminer l'éthanol résiduel. L'extrait aqueux résultant est filtré afin de séparer la fraction polyphénolique hydrosoluble et la fraction polyphénolique non-hydrosoluble. La fraction polyphénolique hydrosoluble est ensuite lyophylisée puis stockée dans des conteneurs scellés. Au sein des polyphénols qui ont été extraits, la taxifoline est présente à raison d'environ 17 mg par gramme d'extrait. Les tanins sont présents à raison d'environ 330 à 340 mg, par gramme d'extrait.

Un exemple d'obtention de taxifoline mettant en œuvre une étape d'extraction hydro-alcoolique est décrit dans la demande de brevet européen n° EP 2 639 232. Après élimination des tissus du tronc, du bois de mélèze sibérien est fragmenté et séché à une température de 40-50 °C jusqu'à obtenir une humidité résiduelle de 15-25 %. Le bois séché est ensuite broyé puis la sciure résultante est soumise à une étape d'extraction hydro- alcoolique à la température de 40-50 °C. L'agent d'extraction hydro-alcoolique est ensuite distillé et la sciure est soumise à un pressage mécanique afin de récupérer l'alcool résiduel. Puis la partie aqueuse de l'extrait est refroidie aux fins d'éliminer les impuretés résineuses. La portion aqueuse de l'extrait exempte d'impureté résineuse est soumise à une étape de chromatographie et la taxifoline est récupérée dans une ou plusieurs fractions de l'éluat, selon le degré de pureté de taxifoline recherché. Puis, après évaporation de l'éthanol résiduel, le produit d'élution est crystallisé.

Une autre méthode d'obtention de taxifoline par extraction par solvant est décrite dans la demande PCT n° WO 2013/137844. Selon encore une autre méthode, décrite par Wang et al. (201 1, Food Chemistry, Vol. 126 : 1178-1185), l'étape d'extraction des polyphénols est réalisée, à partir de sciure de bois, à l'aide d'une solution aqueuse contenant une combinaison d'enzymes, respectivement une cellulase, une pectinase et une beta-glucosidase. Toutefois, la méthode de Wang et al. est analytique et ne comprend pas d'étape de séparation préparative de la taxifoline des autres polyphénols contenus dans l'extrait enzymatique.

Ces procédés d'extraction à partir d'écorces de conifère broyées n'incluent pas une sélection des particules d'écorce en fonction de leur taille, et aucune fraction enrichie en dihydroquercétine et/ou en tanins n'a été identifiée.

Il résulte de ce qui précède que les méthodes connues d'obtention de taxifoline et de tanins comprennent une pluralité d'étapes de pressage et de lavage intense avec de l'eau ou des solvants organiques. La mise en œuvre de ces méthodes d'obtention de la taxifoline et des tanins est onéreuse, du fait notamment des grands volumes de solvants requis et du coût en énergie. De plus, la mise en œuvre d'étapes répétées d'extraction et de séparation peuvent contribuer à la dégradation des composés phénoliques, notamment de la taxifoline, puisque ce composé est rapidement oxydé au contact de l'air.

Les méthodes connues d'extraction de la taxifoline présentent, du fait des inconvénients techniques précités, un rendement faible.

De même, il n'existe pas de méthodes d'extraction des tanins dites « par voie sèche », basées sur la pré-sélection d'une fraction d'écorce enrichie en tanins.il existe un besoin dans l'état de la technique pour la disponibilité de méthodes d'obtention de taxifoline et de tanins, alternatives ou améliorées par rapport aux méthodes connues.

RESUME DE L'INVENTION L'invention est relative à un procédé pour l'obtention d'une composition à base d'écorce de conifère enrichie en dihydroquercétine et/ou en tanins, comprenant les étapes suivantes :

a) broyage de copeaux séchés d'écorce d'un conifère pour obtenir un broyât de particules d'écorce de conifère, et

b) sélection, à partir du broyât de particules obtenu à l'étape a), de la fraction de particules d'écorce:

- de plus grande taille représentant au plus 50 % en poids, par rapport au poids total du broyât de particules obtenu à l'étape a), cette fraction étant enrichie en dihydroquercétine ; ou

- de plus petite taille représentant au plus 40% en poids, par rapport au poids total du broyât de particules obtenu à l'étape a), cette fraction étant enrichie en tanins.

Selon un premier aspect, la présente invention se rapporte à un procédé d'obtention d'une composition enrichie en tanins comprenant des étapes d'enrichissement en tanins qui sont réalisées par voie sèche, sans requérir l'utilisation de solvant.

La présente invention est ainsi relative à un procédé pour l'obtention d'une composition à base d'écorce de conifère enrichie en tanins, comprenant les étapes suivantes :

a) broyage de copeaux séchés d'écorce d'un conifère pour obtenir un broyât de particules d'écorce de conifère, et

b) sélection, à partir du broyât de particules obtenu à l'étape a), de la fraction de particules de plus petite taille représentant au plus 40% en poids, par rapport au poids total du broyât de particules obtenu à l'étape a).

Selon une variante du procédé ci-dessus, ledit procédé comprend les étapes suivantes :

a) broyage de copeaux séchés d'écorce d'un conifère pour obtenir un broyât de particules d'écorce de conifère,

bl ) séparation selon leur taille des particules d'écorces contenues dans le broyât obtenu à l'étape a) en une pluralité de fractions comprenant des particules de taille distincte, et b2) sélection d'une fraction de particules d'écorce enrichie en tanins, ladite fraction étant constituée de particules d'écorce ayant une taille inférieure à 0,30 mm, et préférentiellement de particules d'écorce ayant une taille inférieure à 0,16 mm.

Dans certains modes de réalisation du procédé ci-dessus, ledit conifère est un pin maritime.

L'invention concerne aussi une fraction de particules d'écorce enrichie en tanins susceptible d'être obtenue par le procédé ci-dessus.

L'invention a aussi trait à une composition enrichie en tanins susceptible d'être obtenue par le procédé ci-dessus.

Selon un second aspect, la présente invention se rapporte à un procédé d'obtention d'une composition enrichie en taxifoline comprenant des étapes d'enrichissement en taxifoline qui sont réalisées par voie sèche, sans requérir l'utilisation de solvant.

La présente invention est ainsi relative à un procédé pour l'obtention d'une composition à base d'écorce de conifère enrichie en dihydroquercétine, comprenant les étapes suivantes :

a) broyage de copeaux séchés d'écorce d'un conifère pour obtenir un broyât de particules d'écorce de conifère, et

b) sélection, à partir du broyât de particules obtenu à l'étape a), de la fraction de particules de plus grande taille représentant au plus 50% en poids, par rapport au poids total du broyât de particules obtenu à l'étape a).

Selon une variante du procédé ci-dessus, ledit procédé comprend les étapes suivantes :

a) broyage de copeaux séchés d'écorce d'un conifère pour obtenir un broyât de particules d'écorce de conifère,

bl) séparation selon leur taille des particules d'écorces contenues dans le broyât obtenu à l'étape a) en une pluralité de fractions comprenant des particules de taille distincte, et

b2) sélection d'une fraction de particules d'écorce enrichie en dihydroquercétine, ladite fraction étant constituée de particules d'écorce ayant une taille supérieure à 0,6 mm, et préférentiellement de particules d'écorce ayant une taille supérieure à 1 mm. Dans certains modes de réalisation des procédés ci-dessus, les copeaux séchés utilisés à l'étape a) ont une taille de l'ordre de quelques cm.

Dans certains modes de réalisation des procédés ci-dessus, l'étape a) de broyage étant réalisée selon une méthode choisie parmi (1) un broyage dans un dispositif broyeur à couteaux, (2) un broyage dans un dispositif broyeur à boulets, et (3) un broyage dans un dispositif broyeur à couteaux suivi d'un broyage dans un broyeur à jet d'air.

Toutefois, comme cela est précisé plus loin dans la description, lorsqu'un dispositif broyeur à jet d'air est utilisé à l'étape a), il est préférable de pratiquer à l'étape a) un pré-broyage des copeaux à l'aide d'un dispositif broyeur à couteaux puis de soumettre le broyât grossier ainsi obtenu à un broyage fin à l'aide d'un broyeur à jet d'air.

Dans certains modes de réalisation des procédés ci-dessus, ceux-ci comprennent de plus une étape c) d'extraction par solvant des tanins ou de la dihydroquercétine contenu(s)(e) dans les particules de la fraction enrichie en tanins ou dihydroquercétine, obtenue à l'étape b) ou b2).

Dans certains modes de réalisation du procédé ci-dessus, ledit conifère est un pin Douglas.

L'invention concerne aussi une fraction de particules d'écorce enrichie en dihydroquercétine susceptible d'être obtenue par le procédé ci-dessus.

L'invention a aussi trait à une composition enrichie en dihydroquercétine susceptible d'être obtenue par le procédé ci-dessus.

DESCRIPTION DES FIGURES

Figure 1 : Pourcentage massique de chaque fraction de particules d'écorce Fl (taille de particule supérieure à 1 mm), F2 (taille de particule inférieure à 1 mm et supérieure à 0,56 mm), F3 (taille de particule inférieure à 0,56 mm et supérieure à 0,16 mm) et F4 (taille de particule inférieure à 0,16 mm). En ordonnées : pourcentage par rapport à la masse totale de l'échantillon de particules d'écorce de départ (fraction F0).

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

La présente invention fournit un procédé amélioré pour l'obtention d'une composition enrichie en certains polyphénols, et plus particulièrement d'une composition enrichie en dihydroquercétine et d'une composition enrichie en tanins. Il est montré selon l'invention que, de manière inattendue, une composition enrichie en dihydroquercétine peut être obtenue à partir d'une fraction particulière des tissus formant l'écorce d'un conifère. Les inventeurs ont notamment montré que certains tissus constitutifs de l'écorce d'un conifère, en particulier le pin Douglas, sont particulièrement riches en dihydroquercétine. Les inventeurs ont aussi montré que l'ensemble de ces tissus d'écorce de conifère ayant une teneur élevée en dihydroquercétine renferme une grande partie de la quantité totale de dihydroquercétine contenu dans l'écorce de ces arbres.

Par ailleurs, les inventeurs ont aussi montré que d'autres tissus constitutifs de l'écorce d'un conifère étaient particulièrement riches en d'autres polyphénols, comme les tanins.

Le demandeur a mis au point un procédé spécifiquement adapté à l'obtention de fractions des tissus d'écorce qui ont été identifiées comme ayant une teneur élevée en certains polyphénols, et en particulier respectivement la fraction de tissu d'écorce ayant une teneur élevée en dihydroquercétine ou la fraction de tissu d'écorce ayant une teneur élevée en tanins.

De manière inattendue, le demandeur a montré que les fractions de tissus d'écorce d'intérêt peuvent être séparées des autres fractions de tissus d'écorce par broyage, puis séparation, selon leur taille, des particules d'écorces contenues dans le broyât résultant.

Les inventeurs ont ainsi montré que la dihydroquercétine présente dans l'écorce de conifère est principalement localisée dans certains des tissus constitutifs de cette écorce. Il découle des résultats obtenus par les inventeurs qu'une composition enrichie en dihydroquercétine peut être obtenue à partir d'écorce de conifère par l'intermédiaire d'un procédé qui permettrait d'obtenir un produit enrichi en le ou les tissu(s) dans le(s)quel(s) est principalement localisée la dihydroquercétine.

Un tel procédé, adapté pour l'obtention d'une composition à base d'écorce de conifère, enrichie en dihydroquercétine est fournie selon l'invention.

Les inventeurs ont également montré que les tanins présents dans l'écorce de conifère sont principalement localisés dans certains des tissus constitutifs de cette écorce. Il découle des résultats obtenus par les inventeurs qu'une composition enrichie en tanins peut être obtenue à partir d'écorce de conifère, par l'intermédiaire d'un procédé qui permettrait d'obtenir un produit enrichi en le ou les tissu(s) dans le(s)quel(s) sont principalement localisés les tanins.

Selon un premier aspect, la présente invention se rapporte à un procédé pour l'obtention d'une composition à base d'écorce de conifère enrichie en tanins, comprenant les étapes suivantes :

a) broyage de copeaux séchés d'écorce d'un conifère pour obtenir un broyât de particules d'écorce de conifère, et

b) sélection, à partir du broyât de particules obtenu à l'étape a), de la fraction de particules d'écorce de plus petite taille représentant au plus 40% en poids, par rapport au poids total du broyât de particules obtenu à l'étape a).

Selon une variante du procédé ci-dessus, ledit procédé comprend les étapes suivantes :

a) broyage de copeaux séchés d'écorce d'un conifère pour obtenir un broyât de particules d'écorce de conifère,

bl) séparation selon leur taille des particules d'écorces contenues dans le broyât obtenu à l'étape a) en une pluralité de fractions comprenant des particules de taille distincte, et

b2) sélection d'une fraction de particules d'écorce enrichie en tanins, ladite fraction étant constituée de particules d'écorce ayant une taille inférieure à 0,30 mm, et préférentiellement de particules d'écorce ayant une taille inférieure à 0,16 mm.

Selon un second aspect, la présente invention est relative à un procédé pour l'obtention d'une composition à base d'écorce de conifère enrichie en dihydroquercétine, comprenant les étapes suivantes :

a) broyage de copeaux séchés d'écorce d'un conifère pour obtenir un broyât de particules d'écorce de conifère, et

b) sélection, à partir du broyât de particules obtenu à l'étape a), de la fraction de particules de plus grande taille représentant au plus 50% en poids, par rapport au poids total du broyât de particules obtenu à l'étape a).

Dans ces deux procédés, l'étape a) de broyage peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier. Elle peut être réalisée notamment, selon des techniques connues, en utilisant un dispositif broyeur choisi parmi (1) un dispositif broyeur à couteaux, (2) un dispositif broyeur à boulets, et (3) un dispositif broyeur à jet d'air. Dans certains modes de réalisation de l'étape a) de broyage, on utilise une combinaison de plusieurs de ces dispositifs.

L'étape b) de sélection de la fraction de particules :

- soit de plus petite taille représentant au plus 40% en poids, par rapport au poids total du broyât de particules obtenu à l'étape a);

- soit de plus grande taille représentant au plus 50% en poids, par rapport au poids total du broyât de particules obtenu à l'étape a),

peut être réalisée selon toute technique connue de séparation de particules selon leur taille.

A titre illustratif, l'étape b) peut être réalisée par tamisage, en utilisant une série de tamis successifs de taille de maille de plus en plus réduite.

Dans ce mode de réalisation, (i) le poids du broyât de particules obtenu à l'étape a) est déterminé, puis (ii) il est procédé à l'opération de tamisage, laquelle entraîne la séparation des particules dudit broyât en une pluralité de fractions de particules de gammes de taille distinctes, le poids de chaque fraction de particules étant aussi déterminé, puis (iii) on sélectionne la ou les fractions comprenant les particules de plus petite taille et/ou de plus grande taille, étant entendu que le poids de la fraction de particules sélectionnée, ou le poids de la pluralité de fractions sélectionnées, représente au plus 40% ou 50% du poids total du broyât de particules obtenu à l'étape a).

Comme cela est montré dans les exemples, les particules du broyât obtenu à l'étape a) qui sont le plus enrichies en tanins sont celles qui sont de plus petite taille. En conséquence, la fraction de particules est sélectionnée à l'étape b) selon, notamment, le degré d'enrichissement en tanins de la composition finale qui est désiré. Lorsqu'un enrichissement modéré en tanins pour la composition finale est souhaité, on peut sélectionner à l'étape b) la fraction de particules de plus petite taille qui représente au plus 40%> du poids total du broyât de particules obtenu à l'étape a). Dans d'autres situations, dans lesquels on recherche un degré d'enrichissement en tanins plus important pour la composition finale, on peut sélectionner à l'étape b) la fraction de particules de plus petite taille qui représente au plus 30% ou 20% du poids total du broyât de particules obtenu à l'étape a).

Comme cela est montré dans les exemples, les particules du broyât obtenu à l'étape a) qui sont le plus enrichies en dihydroquercétine sont celles qui sont de plus grande taille. En conséquence, la fraction de particules est sélectionnée à l'étape b) selon, notamment, le degré d'enrichissement en dihydroquercétine de la composition finale qui est désiré. Lorsqu'un enrichissement modéré en dihydroquercétine pour la composition finale est souhaité, on peut sélectionner à l'étape b) la fraction de particules de plus grande taille qui représente au plus 50% du poids total du broyât de particules obtenu à l'étape a). Dans d'autres situations, dans lesquels on recherche un degré d'enrichissement en dihydroquercétine plus important pour la composition finale, on peut sélectionner à l'étape b) la fraction de particules de plus grande taille qui représente au plus 40%, 30% ou 20% du poids total du broyât de particules obtenu à l'étape a).

Aux fins de la présente description, une fraction de particules représentant au plus 40% en poids, par rapport au poids total du broyât de particules obtenu à l'étape a), englobe une fraction de particules représentant au plus 39%), 38%), 37%, 36%, 35%, 34%o, 33%, 32%, 31 %, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21 %, 20%, 19%, 18%), 17%), 16%) et 15% en poids, par rapport au poids total du broyât de particules obtenu à l'étape a).

Aux fins de la présente description, une fraction de particules représentant au plus 50% en poids, par rapport au poids total du broyât de particules obtenu à l'étape a) englobe une fraction de particules représentant au plus 49%o, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%), 41 %, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21 %, et 20% en poids, par rapport au poids total du broyât de particules obtenu à l'étape a).

Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, le demandeur pense que la sélection d'une fraction de particules représentant plus de 50% en poids, par rapport au poids total du broyât obtenu à l'étape a), aboutit à l'obtention d'une composition finale qui est insuffisamment enrichie en dihydroquercétine aux fins d'une utilisation industrielle.

Egalement, le demandeur est d'avis que la sélection d'une fraction de particules représentant moins de 20% en poids, par rapport au poids total du broyât obtenu à l'étape a), aboutit à l'obtention d'une composition finale qui est substantiellement enrichie en dihydroquercétine, mais qu'une quantité trop importante de la dihydroquercétine contenue initialement dans le produit de départ est de ce fait inutilisée. A titre illustratif, pour les deux procédés selon l'invention, l'étape a) de broyage peut être réalisée à l'aide d'un dispositif broyeur à couteaux, par exemple à l'aide d'un dispositif broyeur à couteaux équipé d'une grille de sortie de 6mm.

Selon un aspect préféré, à l'étape b), on sélectionne, par tamisage, soit :

- une fraction de particules d'écorce enrichie en tanins, constituée de particules d'écorce ayant une taille inférieure à 0,30 mm, préférentiellement inférieure à 0,16 mm ; soit

- une fraction de particules ayant une taille de particule supérieure à 1 mm. Dans le mode de réalisation du procédé qui est illustré dans les exemples, la fraction de particules ayant une taille inférieure à 0,16 mm représente environ 16 % en poids, par rapport au poids total du broyât de particules obtenu à l'étape a).

Dans le mode de réalisation du procédé qui est illustré dans les exemples, la fraction de particules ayant une taille de particule supérieure à 1 mm représente environ 26 % en poids, par rapport au poids total du broyât de particules obtenu à l'étape a).

Le procédé selon l'invention permet l'obtention de compositions enrichies en polyphénols, en particulier en tanins ou en dihydroquercétine, à l'aide d'étapes physiques d'enrichissement, réalisées à température ambiante ne mettant pas en œuvre de solvant, évitant ainsi une dégradation des polyphénols d'intérêt, spécifiquement la taxifoline. Les étapes d'enrichissement en polyphénols, spécifiquement en tanins ou en taxifoline, du procédé ci-dessus, du fait qu'elles ne nécessitent pas de chauffage ni de solvant, sont moins onéreuses que les étapes d'extraction par solvant connues, lesquelles sont réalisées à haute température.

Dans certains modes de réalisation du procédé pour l'obtention d'une composition à base d'écorce de conifère enrichie en dihydroquercétine, ledit procédé comprend les étapes suivantes :

a) broyage de copeaux séchés d'écorce d'un conifère pour obtenir un broyât de particules d'écorce de conifère,

bl) séparation selon leur taille des particules d'écorces contenues dans le broyât obtenu à l'étape a) en une pluralité de fractions comprenant des particules de taille distincte, et

b2) sélection d'une fraction de particules d'écorce enrichie en dihydroquercétine, ladite fraction étant constituée de particules d'écorce ayant une taille supérieure à 0,6 mm, et préférentiellement de particules d'écorce ayant une taille supérieure à 1 mm.

Ainsi, dans la variante ci-dessus du procédé selon l'invention, l'étape b) comprend elle-même les étapes bl) et b2) spécifiées.

Par « copeaux d'écorce», on entend des fragments d'écorce sans distinction de taille ou de forme. En général, les copeaux d'écorce ont, dans leur plus grande longueur, une dimension pouvant varier de quelques centimètres à plusieurs dizaines de centimètres, par exemple de 5 cm à 30 cm. L'épaisseur des copeaux varie en général de quelques millimètres à quelques centimètres, par exemple de 1 mm à 5 cm, et souvent de 1 mm à 3 cm.

Par « tanins » on entend les tanins condensés, tels que les polymères de flavonoïdes, et les tanins hydrolysables, tels que les esters d'acide gallique ou d'acide ellagique.

Préférentiellement, le terme tanins fait référence aux polymères de flavonoïdes.

Par « composition enrichie en tanins », on entend selon l'invention une composition obtenue à partir d'un matériel de départ et ayant une teneur en tanins sensiblement supérieure à la teneur en tanins dudit matériel de départ, en particulier ayant une teneur en tanins qui est au moins le double de la teneur en tanins du matériel de départ. Aux fins de la présente description, une composition enrichie en tanins englobe les compositions issues du procédé dont la teneur en tanins est au moins 20% supérieure à la teneur en tanins du produit de départ, à savoir les copeaux séchés d'écorce de conifère. On précise que, aux fins de la présente description, deux valeurs de teneur en tanins sont comparées après prise en compte du taux d'humidité des matériaux comparés respectifs.

Par « dihydroquercétine », on entend le composé (2R, 3R)-2-(3,4- dihydroxyphényl)3,5,7-trihydroxy-2-3-dihydrochromen-4-one, qui est aussi couramment désigné « taxifoline », et dont la référence CAS est CAS 480-18-2.

Par « composition enrichie en dihydroquercétine », on entend selon l'invention une composition obtenue à partir d'un matériel de départ et ayant une teneur en dihydroquercétine sensiblement supérieure à la teneur en dihydroquercétine dudit matériel de départ, en particulier ayant une teneur en dihydroquercétine qui est au moins le double de la teneur en dihydroquercétine du matériel de départ. Aux fins de la présente description, une composition enrichie en dihydroquercétine englobe les compositions issues du procédé dont la teneur en dihydroquercétine est au moins 20% supérieure à la teneur en dihydroquercétine du produit de départ, à savoir les copeaux séchés d'écorce de conifère. On précise que, aux fins de la présente description, deux valeurs de teneur en dihydroquercétine sont comparées après prise en compte du taux d'humidité des matériaux comparés respectifs.

Aux fins de la présente description, la taille de particules est préférentiellement déterminée selon une méthode par tamisage, pour laquelle on utilise une succession de tamis de taille de maille de plus en plus réduite. A titre illustratif, on peut utiliser une succession de tamis dont la taille de maille est respectivement de 10,0 mm, 6,0 mm, 4,0 mm, 3,0 mm, 2,0 mm, 1 ,0 mm, 0,50 mm, 0,40 mm, 0,30 mm, 0,25 mm, 0,20 mm, 0,15 mm, et 0,10 mm.

Etape a) de broyage

A l'étape a), des copeaux séchés d'écorce de conifère sont broyés afin d'obtenir un ensemble de particules d'écorce de petite taille, aptes à subir une seconde étape de broyage.

De préférence, le broyât obtenu à la fin de l'étape a) comprend un ensemble de particules ayant des caractéristiques de granulométrie telles que ces particules ont une taille de particule supérieure à 1 μηι.

De préférence, le broyât obtenu à la fin de l'étape a) comprend des particules ayant une taille égale ou inférieure à 10 mm, et de manière tout à fait préférée une taille égale ou inférieure à 6 mm.

Avantageusement, le profil granulométrique des particules contenues dans le broyât peut être du type unimodal ou multi-modal, avec une taille de particule pouvant aller jusqu'à 6 mm.

Les particules d'écorce issues de l'étape a) de broyage sont collectées pour la poursuite du procédé.

Comme précédemment indiqué, l'étape a) est réalisée avec des copeaux séchés. Les inventeurs ont montré que l'utilisation de copeaux très humides, c'est-à-dire de copeaux dont le taux d'humidité est supérieur à 50 %, à l'étape a) provoquait un colmatage du dispositif broyeur. Le colmatage du dispositif broyeur est illustré notamment par un colmatage de la grille de sélection, ce qui empêche les particules de sortir du broyeur et d'être collectées pour la suite du procédé. En particulier, les particules demeurent dans la cuve du dispositif broyeur de manière non désirée, ce qui résulte, à la fin de l'étape a), en un broyât difficile à collecter et sont donc impropres pour la poursuite du procédé.

Avantageusement, préalablement à l'étape a), les copeaux sont soumis à une étape de séchage à une température variant de 30 °C à 40 °C pendant une durée variant de 6 heures à 36 heures, mieux de 10 heures à 30 heures, avantageusement d'environ 24 heures. L'homme du métier sait adapter la température et la durée du procédé selon le degré d'humidité des copeaux de départ.

Une température de séchage inférieure à 30 °C est inefficace. Une température de séchage supérieure à 40 °C doit être évitée afin de ne pas détériorer les polyphénols contenus dans l'écorce, et en particulier ne pas détériorer la taxifoline ou les tanins contenus dans l'écorce.

Avantageusement, les copeaux séchés utilisés à l'étape a) ont une humidité résiduelle égale ou inférieure à 40 %, de préférence une humidité résiduelle égale ou inférieure à 15 %.

Aux fins de la présente description le taux d'humidité résiduelle est déterminé par la méthode gravimétrique selon les indications suivantes : l'humidité résiduelle est éliminée du produit testé par chauffage. Le taux d'humidité résiduelle du produit testé est calculé en fonction de la perte de poids du produit au cours du cycle de séchage. Le taux d'humidité résiduelle est calculé selon la technique conventionnelle consistant à (i) réaliser une première pesée d'un ensemble de copeaux d'écorce, (ii) réaliser un séchage dudit ensemble de copeaux d'écorce, par exemple par passage dans une étuve à 120 °C, par exemple pendant 24 heures, par exemple à pression réduite, (iii) réaliser une seconde pesée dudit ensemble de copeaux d'écorce après séchage, et (iv) calculer la teneur en eau initiale (humidité résiduelle) dudit ensemble de copeaux d'écorce ) partir du calcul de la quantité d'eau évaporée.

Pour la mise en œuvre des deux procédés décrits, l'étape a) peut être réalisée en utilisant tout type de dispositif broyeur permettant l'obtention, à partir de copeaux d'écorce, l'obtention de particules d'écorce ayant la taille de particule spécifiée dans la présente description. Notamment, l'homme du métier peut utiliser un dispositif broyeur choisi parmi (1) un broyage dans un dispositif broyeur à couteaux, (2) un broyage dans un dispositif broyeur à boulets, et (3) un broyage dans un dispositif broyeur à jet d'air et, le cas échéant une combinaison de plusieurs de ces dispositifs, c'est-à-dire d'au moins deux de ces dispositifs. Ainsi, l'étape a) de broyage peut être réalisée selon une méthode choisie parmi (1) un broyage dans un dispositif broyeur à couteaux, (2) un broyage dans un dispositif broyeur à boulets, et (3) un broyage dans un dispositif broyeur à jet d'air, ou encore selon une combinaison d'au moins deux de ces méthodes.

Dans certains modes de réalisation, l'étape a) est réalisée en utilisant un dispositif broyeur à couteaux d'un type connu. L'homme du métier peut par exemple utiliser un broyeur à couteaux du type Retsch SM100 commercialisé par la société Retsch.

Avantageusement, l'étape a) de broyage est réalisée à une vitesse du rotor d'environ 1 500 tours par minute. On précise que, lorsqu'un broyage à couteaux est utilisé à l'étape a), le broyage est réalisé préférentiellement en continu. Ainsi, le broyât de particules est généré en continu à l'étape a) avant séparation des particules constitutives du broyât, à l'étape b).Avec ce type de broyeur, la durée de l'étape de broyage n'est pas déterminante, puisque la taille maximale des particules contenues dans le broyât est déterminée par la taille de maille de la grille de sélection, en sortie du broyeur. A titre illustratif, on équipe le broyeur avec une grille de sortie de 6 mm si la taille maximale désirée des particules constitutives du broyât obtenu à la fin de l'étape a) est de 6 mm.

Dans d'autres modes de réalisation, l'étape a) est réalisée en utilisant un dispositif broyeur à boulets, aussi appelé broyeur à billes, d'un type connu. L'homme du métier peut par exemple utiliser un broyeur à boulets commercialisé par la société Faure (France). A titre illustratif, il peut être utilisé un broyeur à boulet dans lequel ont été introduits des boulets de différents diamètres, respectivement des boulets de diamètres de 1 ,2 cm, de 1 ,6 cm et de 2,6 cm. Par exemple, on peut introduire dans la cuve du broyeur les boulets de 1 ,2 cm, de 1 ,6 cm et de 2,6 cm dans les proportions de 1/3, 1/3 et 1/3.

Alternativement, dans ces modes de réalisation, l'étape a) comprend deux étapes de broyage, respectivement les étapes suivantes :

al) une première étape comprenant le broyage de copeaux séchés d'écorce de conifère en utilisant un dispositif broyeur à couteaux, afin d'obtenir un broyât de copeaux, et a2) une seconde étape comprenant le broyage du broyât de copeaux obtenu à l'étape al) en utilisant un dispositif broyeur à boulets, afin d'obtenir un broyât de particules d'écorces de conifère.

Avec un broyeur à boulets, l'étape a) de broyage est préférentiellement réalisée à 70% de la vitesse critique. On précise que la vitesse critique est définie comme étant la vitesse à partir de laquelle les boulets se retrouvent localisés sur les parois de la cuve du fait de la force centrifuge. On comprend que la vitesse critique dépend notamment de la taille et densité des boulets utilisés ainsi que du diamètre de la cuve du dispositif broyeur.

A titre illustratif, lorsque l'étape a) est réalisée avec un broyeur à boulets, l'étape a) peut être réalisée pendant une durée pouvant varier de 10 minutes à 120 heures, par exemple en appliquant une vitesse de rotation de la cuve d'environ 120 tours par minute.

Dans encore d'autres modes de réalisation, l'étape a) est réalisée en utilisant un dispositif broyeur à jet d'air d'un type connu. L'homme du métier peut par exemple utiliser un broyeur à jet d'air commercialisé par la société Hosokawa-Alpine. A titre illustratif, on peut utiliser un broyeur à jet d'air à une pression de 4,5 bars et une vitesse de rotation de la turbine de sélection d'environ 2 000 tours par minute.

Selon une première alternative, dans ces modes de réalisation, l'étape a) comprend deux étapes de broyage, respectivement les étapes suivantes :

al) une première étape comprenant le broyage de copeaux séchés d'écorce de conifère en utilisant un dispositif broyeur à couteaux, afin d'obtenir un broyât de copeaux, et

a2) une seconde étape comprenant le broyage du broyât de copeaux obtenu à l'étape al) en utilisant un dispositif broyeur à jet d'air, afin d'obtenir un broyât de particules d'écorces de conifère.

Selon une seconde alternative, dans ces modes de réalisation, l'étape a) comprend deux étapes de broyage, respectivement les étapes suivantes :

al) une première étape comprenant le broyage de copeaux séchés d'écorce de conifère en utilisant un dispositif broyeur à couteaux équipé d'une grille de sélection de 6mm, afin d'obtenir un premier broyât de copeaux, a2) une seconde étape comprenant le broyage du broyât de copeaux séchés obtenu à l'étape al) en utilisant un dispositif broyeur à couteaux équipé d'une grille de sélection de 1 mm, afin d'obtenir un second broyât de copeaux,

a3) une troisième étape comprenant le broyage du second broyât de copeaux obtenu à l'étape a2) en utilisant un dispositif broyeur à jet d'air, afin d'obtenir un broyât de particules d'écorces de conifère.

Etape b) de sélection ou étapes bl) et bl) de séparation puis de sélection. L'étape b), ou l'étape bl) dans certains modes de réalisation du procédé, comprend la séparation des particules d'écorce obtenues à l'étape a), afin d'obtenir une pluralité de fractions comprenant des particules de tailles distinctes.

Dans certains modes de réalisation du procédé, les conditions opératoires de l'étape b), ou bl), sont adaptées pour l'obtention d'une pluralité de fractions de particules d'écorce, respectivement au moins :

(i) une fraction de particules d'écorce ayant une taille de particule égale ou supérieure à 0,60 mm, par exemple une taille de particules égale ou supérieure à 1,00 mm, et

(ii) une fraction de particules d'écorce ayant une taille de particule inférieure à 1 ,00 mm, par exemple une taille de particules inférieure à 0,60 mm.

Dans certains modes de réalisation du procédé, les conditions opératoires de l'étape b), ou bl), sont adaptées pour l'obtention d'une pluralité de fractions de particules d'écorce, respectivement au moins :

(i) une fraction de particules d'écorce ayant une taille de particule égale ou supérieure à 0,60 mm, par exemple une taille de particules égale ou supérieure à 1 ,00 mm, et

(ii) une fraction de particules d'écorce ayant une taille de particule égale ou inférieure à 0,30 mm, par exemple une taille de particules égale ou inférieure à 0,16 mm.

Aux fins de la présente description, une taille de particule supérieure à 0,60 mm englobe une taille de particule supérieure à 0,65 mm, 0,70 mm, 0,75 mm, 0,80 mm 0,90 mm, 0,95 mm, 1,00 mm, 1 ,05 mm et 1,10 mm, 1,15 mm, 1,20 mm, 1 ,25 mm et 1 ,30 mm, Aux fins de la présente description, une taille de particule inférieure à 1,00 mm englobe une taille de particule inférieure à 0,90 mm, 0,80 mm, 0,70 mm et 0,65 mm.

Aux fins de la présente description, une taille de particule égale ou inférieure à 0,30 mm englobe une taille de particule inférieure à 0,25 mm, 0,20 mm et 0,16 mm.

Dans certains modes de réalisation de l'étape b) de séparation, ou de l'étape bl) dans certaines variantes du procédé, on obtient d'autres fractions de particules d'écorce, additionnelles aux fractions (i) et (ii) ci-dessus, par exemple des fractions dont la taille de particules est intermédiaire entre les fractions (i) et (ii) ci-dessus, comme cela est illustré dans les exemples.

Dans certains modes de réalisation, l'étape b), ou bl), de séparation des particules d'écorce est réalisée par tamisage. A titre illustratif, les particules d'écorce obtenues à l'étape a) sont séparées à l'étape b) en utilisant successivement :

- un premier tamis dont la taille de maille peut varier de 0,60 mm à 1,30 mm, par exemple un tamis dont la taille de maille est de 1,00 mm, aux fins d'obtenir la fraction (i) de particules d'écorce ci -dessus qui est retenue par le tamis, et

- un second tamis dont la taille de maille peut varier de 0,10 mm à 0,30 mm, par exemple un tamis dont la taille de maille est de 0,16 mm, aux fins d'obtenir la fraction (ii) de particules d'écorce ci-dessus, qui n'est pas retenue par le tamis.

Dans d'autres modes de réalisation, on utilise à l'étape b) des tamis additionnels dont la taille de maille est intermédiaire entre les tailles de maille respectives du premier et du second tamis décrit ci-dessus, comme cela est illustré dans les exemples.

Poursuite de l 'étape b) ou réalisation de l 'étape b2) de sélection

A l'étape b), ou à l'étape b2) dans certaines variantes des procédés, on sélectionne la ou les fractions de particules d'écorce de conifère qui sont enrichies en tanins ou en dihydroquercétine, c'est-à-dire dont la teneur en tanins ou en dihydroquercétine est sensiblement supérieure à la teneur en tanins ou en dihydroquercétine des copeaux d'écorce de conifère utilisés comme matériau de départ.

Préférentiellement, on sélectionne à l'étape b), ou à l'étape b2), la fraction comprenant des particules d'écorce ayant une taille de particule égale ou supérieure à une taille de particule variant de 0,6 mm à 1 ,00 mm, et préférentiellement de particules d'écorce ayant une taille supérieure à 1 ,00 mm. Comme cela est montré dans les exemples, il s'agit d'une fraction de particules de conifère qui possède une haute teneur en dihydroquercétine. Cette fraction de particules d'écorce contient, en moyenne, au moins 50% en poids de la totalité de la dihydroquercétine contenue dans le matériau d'écorce de départ.

Par ailleurs, comme cela sera exposé plus loin dans la description, les inventeurs ont également montré que la fraction (ii) de particules d'écorce de conifère ayant une taille de particule égale ou inférieure à une taille de particules variant de 0,10 mm à 0,30 mm, par exemple une taille de particules égale ou inférieure à 0,16 mm, était enrichie en d'autres polyphénols, et spécifiquement en tanins.

De la même manière, dans le procédé destiné à obtenir une composition enrichie en tanins, on sélectionne à l'étape b) ou b2) la ou les fractions de particules d'écorce de conifère qui sont enrichies en tanins, c'est-à-dire dont la teneur en tanins est sensiblement supérieure à la teneur en tanins des copeaux d'écorce de conifère utilisés comme matériau de départ.

Etapes additionnelles du procédé

La fraction de particules d'écorce enrichie en tanins obtenue à l'étape b) ou b2) du procédé peut ensuite être utilisée aux fins d'obtenir des compositions purifiées de tanins.

Par exemple, une composition purifiée de tanins est obtenue en mettant en œuvre des méthodes connues d'extraction et de purification en utilisant comme produit de départ la fraction enrichie en tanins issue de l'étape b) ou b2) du procédé décrit ci-dessus.

Ainsi, selon certains modes de réalisation, le procédé décrit-ci-dessus comprend une étape additionnelle c) d'obtention d'une composition purifiée de tanins par extraction des tanins contenus dans les particules de la fraction enrichie en tanins obtenue à l'étape b) ou b2).

On peut utiliser notamment une méthode d'extraction par solvant des tanins, en utilisant une solution hydro-alcoolique ou bien en utilisant un mélange eau/acétone. Pour les méthodes utilisant un solvant eau/acétone, l'étape d'extraction peut être suivie d'une étape de distillation visant à éliminer l'acétone puis une étape d'élimination des pigments et des lipides par solvant, par exemple en utilisant le solvant hexane.

A titre illustratif, pour l'obtention d'une composition purifiée de tanins à partir de la fraction de particules d'écorce de conifère sélectionnée à l'étape b) du procédé, l'homme du métier peut mettre en œuvre le procédé d'extraction qui est décrit dans la demande PCT n° WO 91/01989.

De même, la fraction de particules d'écorce enrichie en dihydroquercétine obtenue à l'étape b) du procédé, ou à l'étape b2) dans certaines variantes du procédé, peut ensuite être utilisée aux fins d'obtenir des compositions purifiées de dihydroquercétine.

Par exemple, une composition purifiée de dihydroquercétine est obtenue en mettant en œuvre des méthodes connues d'extraction et de purification en utilisant comme produit de départ la fraction enrichie en dihydroquercétine issue de l'étape b), ou b2), du procédé décrit ci-dessus.

Ainsi, selon certains modes de réalisation, le procédé décrit-ci-dessus comprend une étape additionnelle c) d'obtention d'une composition purifiée de dihydroquercétine par extraction de la dihydroquercétine contenue dans les particules de la f action enrichie en dihydroquercétine obtenue à l'étape b), ou b2).

A titre d'exemple, l'homme du métier peut mettre en œuvre à l'étape c) une méthode d'obtention de dihydroquercétine telle que la méthode décrite dans la demande de brevet européen n° EP 2 639 232 ou encore la méthode décrite par Wang et al. (2011 , Food Chemistry, Vol. 126 : 1178-1185).

Dans des modes de réalisation avantageux, l'étape c) comprend les étapes suivantes :

cl) réaliser une extraction par solvant des polyphénols contenus dans la fraction de particules d'écorce de conifère enrichie en dihydroquercétine sélectionnée à l'étape c) du procédé, afin d'obtenir un extrait de polyphénols, et

c2) purifier la dihydroquercétine à partir de l'extrait de polyphénols obtenu à l'étape dl).

L'étape cl) peut être réalisée selon toute méthode connue.

Dans certains modes de réalisation, l'étape cl) peut comprendre une extraction des polyphénols à l'aide d'un solvant hydro-alcoolique, par exemple avec un solvant ayant un rapport en poids éthanol/eau de 25/75, par exemple à une température de 40 °C, comme décrit par exemple dans la demande de brevet européen n° EP 2 639 232.

Selon d'autres modes de réalisation, l'étape cl) comprend une extraction des polyphénols à l'aide d'un solvant aqueux comprenant une enzyme ou une pluralité d'enzymes telles qu'une cellulase, une pectinase et/ou une beta-glucosidase, comme décrit dans l'article de Wang et al. (2002, précité).

Selon encore d'autres modes de réalisation, l'étape cl) comprend une extraction des polyphénols à l'aide d'eau à température élevée, comme décrit le brevet US 3,189,596. Toutefois, cette dernière méthode n'est pas privilégiée du fait qu'une température élevée est susceptible de détériorer une partie de la dihydroquercétine contenue dans les particules d'écorce de conifère.

Pour réaliser l'étape cl), l'homme du métier peut bien entendu recourir à toute autre méthode connue, telle que la méthode décrite dans la demande PCT · n° WO 2013/172693 ou encore la méthode décrite par Ma et al. (2012, Int J Mol Sci, Vol. 13(7) : 8789-8804).

L'étape c2) peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier. L'étape d2) est avantageusement une étape de purification par chromatographie ; comme décrit par exemple dans la demande de brevet européen n° EP 2 639 232 ou dans l'article de Wang et al. (2002, précité).

Tout type de support chromatographique approprié peut être utilisé, tel que des supports de chromatographie en phase inverse (p. ex. les supports du type HIQ sil commercialisés par la société Chromatek, les supports chromatographiques en phase diol commercialisés par exemple par la société YMC Europe ou encore les supports de type Cl 8 commercialisés par la société Kinetex). On privilégie les supports de type Cl 8, notamment les supports de ce type commercialisés par la société Kinetex

Autres caractéristiques du procédé

Selon les genres d'arbres, les caractéristiques anatomiques et physiologiques des tissus de l'écorce peuvent varier considérablement. Il apparaît que les conifères présentent une écorce de structure et de constitution spécifiques, ce qui a permis la mise au point du procédé d'enrichissement en polyphénols, tout particulièrement en tanins et en dihydroquercétine, qui est défini dans la présente description.

Comme cela est montré dans les exemples, les tissus constitutifs de l'écorce du pin Douglas ont une structure et une constitution telles que :

- les tanins se retrouvent concentrés dans un tissu particulier, broyé en très fines particules, cette fraction étant désignée 'F4' dans les exemples ; et - la dihydroquercétine est retrouvée à haute teneur dans un tissu particulier localisé au cœur de l'écorce, tissu qui a été désigné « T2 » dans les exemples.

Avantageusement, le procédé selon l'invention est réalisé en utilisant des copeaux d'écorce d'un conifère choisi parmi le cèdre, le cyprès, le pin, le sapin, le genévrier, l'agathis, le mélèze, le pin maritime (pinus pinaster), le pin Douglas et le séquoia.

On utilise préférentiellement des copeaux de pin Douglas {Pseudotsuga) pour le procédé d'obtention d'une composition enrichie en dihydroquercétine, et des copeaux de pin maritime (pinus pinaster) pour le procédé d'obtention d'une composition enrichie en tanins.

La présente invention est également relative à une fraction de particules d'écorce enrichie en tanins susceptible d'être obtenue par le procédé défini dans la présente description.

L'invention concerne aussi une composition enrichie en tanins susceptible d'être obtenue par le procédé défini dans la présente description.

La présente invention est également relative à une fraction de particules d'écorce enrichie en dihydroquercétine susceptible d'être obtenue par le procédé défini dans la présente description.

L'invention concerne aussi une composition enrichie en dihydroquercétine susceptible d'être obtenue par le procédé défini dans la présente description.

Les compositions enrichies en tanins ou en dihydroquercétine peuvent être utilisées notamment pour la préparation de compositions cosmétiques ou de compositions pharmaceutiques.

Il est connu dans l'état de la technique que la dihydroquercétine possède des propriétés de protection contre les radicaux libres (effet antioxydant), des propriétés antibactériennes et anti-fongiques, des propriétés anti-inflammatoires, des propriétés d'inhibition des effets délétères provoqués par un excès de certaines cytokines comme l'interféron-gamma, des effets d'accroissement de la quantité de lipides dans la peau, ou encore des effets cicatrisants.

Il est aussi connu que la dihydroquercétine possède notamment des propriétés de protection et de renforcement du réseau vasculaire capillaire. La dihydroquercétine est utile notamment dans le traitement de l'avitaminose, de l'ischémie cardiaque, de l'athérosclérose, du diabètes mellitus, des maladies du foie, de la prostate, du rein, du tractus gastro-intestinal, du tractus urinaire, des maladies cardio-vasculaires ou encore de certains cancers.

La composition enrichie en dihydroquercétine peut être utilisée pour la préparation de compositions cosmétiques.

Les tanins sont principalement utilisés pour tanner les cuirs et peaux, et également pour colorer certaines étoffes. Concernant leur utilisation en santé et cosmétique, il est connu que les tanins possèdent des propriétés anti-oxydantes qui en font des composés de choix pour la protection contre l'action oxydative des radicaux libres.

Procédé d'obtention de compositions enrichies en dihydroquercétine ou en tanins

Comme cela a été précisé précédemment dans la présente description, l'étape b), ou bl), du procédé d'obtention d'une composition à base d'écorce de conifère enrichie en dihydroquercétine permet d'obtenir simultanément au moins une fraction de particules d'écorce de conifère enrichie en dihydroquercétine et au moins une fraction de particules d'écorce de conifère enrichie en tanins.

Les inventeurs ont montré que la fraction (ii) de particules d'écorce de conifère ayant une taille de particule égale ou inférieure à une taille de particules variant de 0,10 mm à 0,30 mm, par exemple une taille de particules égale ou inférieure à 0,16 mm, laquelle fraction est obtenue à l'étape b) du procédé, était enrichie en d'autres polyphénols, et spécifiquement était enrichie en tanins.

Ainsi, dans certains modes de réalisation du procédé, l'étape b), ou b2), comprend la sélection, d'une fraction de particules d'écorce enrichie en tanins, ladite fraction étant constituée de particules d'écorce ayant une taille inférieure à 0,30 mm, et préférentiellement de particules d'écorce ayant une taille inférieure à 0,16 mm.

Selon une alternative de ces modes de réalisation particuliers du procédé, ledit procédé comprend de plus une étape d) d'obtention d'une composition purifiée de tanins par extraction des tanins contenue dans les particules de la fraction enrichie en tanins obtenue à l'étape b), ou b2). L'invention est également relative à un procédé d'obtention d'une composition à base d'écorce de conifère enrichie en dihydroquercétine et d'une composition à base d'écorce de conifère enrichie en tanins comprenant les étapes suivantes :

a) broyage de copeaux séchés d'écorce d'un conifère pour obtenir un broyât de particules d'écorce de conifère,

bl) séparation selon leur taille des particules d'écorces contenues dans le broyât obtenu à l'étape a) en une pluralité de fractions comprenant des particules de taille distincte, et

b2) sélection :

- d'une part, d'une fraction de particules d'écorce enrichie en dihydroquercétine, ladite fraction étant constituée de particules d'écorce ayant une taille supérieure à 0,6 mm, et préférentiellement de particules d'écorce ayant une taille supérieure à 1 mm, et

- d'autre part, d'une fraction de particules d'écorce enrichie en tanins, ladite fraction étant constituée de particules d'écorce ayant une taille inférieure à 0,30 mm, et préférentiellement de particules d'écorce ayant une taille inférieure à 0,16 mm.

On peut obtenir des compositions purifiées de dihydroquercétine à partir de la fraction de particules enrichie en dihydroquercétine obtenue à l'étape 3), selon des méthodes connues auxquelles il est fait référence ailleurs dans la présente description.

Ainsi, dans certains modes de réalisation du procédé ci-dessus, ledit procédé comprend de plus une étape 4) d'obtention d'une composition purifiée de tanins par extraction des tanins contenue dans les particules de la fraction enrichie en tanins obtenue à l'étape 3).

On peut aussi obtenir des compositions purifiées en tanins à partir de la fraction de particules enrichies en tanins obtenue à l'étape 3), selon des méthodes connues de l'homme du métier, et notamment selon le même type de méthodes qui comprennent au moins une étape d'extraction des polyphénols par solvant et une étape de purification, de préférence par chromatographie. On peut utiliser notamment une méthode d'extraction par solvant des tanins en utilisant une solution hydro-alcoolique ou bien en utilisant un mélange eau/acétone.

Pour les méthodes utilisant un solvant eau/acétone, l'étape d'extraction peut être suivie d'une étape de distillation visant à éliminer l'acétone puis une étape d'élimination des pigments et des lipides par solvant, par exemple en utilisant le solvant hexane.

A titre illustratif, pour l'obtention d'une composition purifiée de tanins à partir de la fraction de particules d'écorce de conifère sélectionnée à l'étape 3) du procédé, l'homme du métier peut mettre en œuvre le procédé d'extraction qui est décrit dans la demande PCX n° WO 91/01989.

Le procédé de fractionnement par voie sèche qui est défini dans la présente description présente de nombreux avantages, notamment pour sa mise en œuvre dans l'industrie. Le procédé d'obtention de compositions enrichies en dihydroquercétine ou en tanins peut s'insérer efficacement dans les processus industriels de bioraffinerie de la biomasse et en particulier des déchets forestiers, agricoles et industriels, et être compatible avec une économie industrielle visant un développement durable. En effet, le procédé selon l'invention comprend des étapes d'enrichissement en des polyphénols d'intérêt, respectivement dihydroquercétine et tanins, qui est réalisé par voie sèche, et qui en ne requiert donc pas de consommation d'eau ni, par conséquent, de nécessité le séchage d'effluents.

La présente invention est en outre illustrée, sans y être limitée, par les exemples ci-après.

EXEMPLES

Exemple 1 : Procédé d'obtention d'une composition enrichie en dihydroquercétine et d'une composition enrichie en tanins

A. Identification des tissus constitutifs de l'écorce avant une forte teneur en dihydroquercétine ou en tanins

Sur un morceau d'écorce de Pin Douglas, un premier examen visuel permet de distinguer trois tissus différents, respectivement un tissu Tl de couleur marron clair, un tissu T2 de couleur beige clair et un tissu T3 de couleur beige plus foncée que le tissu T2.

Une dissection manuelle de l'écorce a été réalisée et la composition en flavonoïdes de chaque tissu a été déterminée par analyse en UPLC-MS.

Les résultats d'analyse UPLC-MS représentés sur la figure 1 montrent que la taxifoline est exclusivement localisée dans le tissu T2, alors que les tanins se situent dans le tissu Tl . Ces résultats justifient l'intérêt de concevoir un procédé permettant d'obtenir sélectivement (i) au moins une fraction provenant d'écorce enrichie en taxifoline et (ii) au moins une fraction provenant d'écorce enrichie en tannins. B. Description du procédé

On a utilisé des copeaux d'écorce de Pin Douglas issues d'une récolte de Pin Douglas au mois d'avril 2013.

Les copeaux d'écorce ont été séchés à l'étuve pendant 24 h à une température de 30 °C à 40 °C (cette étape de séchage est nécessaire pour éviter tout colmatage au moment du broyage) puis broyées et séparées par tamisage.

Le broyage a été effectué au sein d'un broyeur à couteaux Retsch SM 100 sur une grille de 6 mm. Les sollicitations mécaniques générées au sein d'un broyeur à couteaux sont principalement de la découpe et du cisaillement.

L'échantillon est convoyé par une trémie jusqu'à la chambre de broyage au sein de laquelle, un rotor (vitesse de rotation intermédiaire : 1 500 tr/min) muni de couteaux assure la mise en mouvement de l'échantillon et son broyage entre ses propres couteaux et les contre-couteaux situés dans le carter de la chambre.

Lorsque les particules atteignent une taille inférieure ou égale à celle de la maille de la grille de sélection, elles quittent la chambre de broyage et sont évacuées vers le récipient collecteur. La fraction collectée a été appelée F0. Le temps de séjour dans la chambre de broyage est relativement court, de l'ordre de quelques secondes.

L'opération de tamisage consiste à diviser ou séparer les particules broyées en les faisant passer à travers une succession de tamis dont les mailles des grilles sont de plus en plus fines. Sur chaque tamis les particules dont la taille est supérieure à la maille sont retenues. Chaque fraction récupérée correspond au diamètre du tamis qui l'a retenue. Le tamisage a été effectué sur une station ROTEX pendant 20 min. Le tamisage a été effectué dans une colonne de tamisage munie de plusieurs plateaux cylindriques de mailles respectives 1 mm, 0,56 mm et 0,16 mm ainsi qu'un couvercle empêchant la perte de particules. La colonne est agitée par un dispositif de vibration dont la vitesse peut être contrôlée. Quatre fractions ont été obtenues à l'issue de ce tamisage, désignées fractions Fl à F4. C. Méthode de quantification de la taxifoline présente dans les différentes fractions par UPLC-MS

• Dépolymérisation des tanins contenus dans les fractions F0-F4

Suspension A : les fractions F0 à F4 (200 mg) ont été placées en suspension dans 2 mL de méthanol.

Solution B : la solution de dépolymérisation est préparée en ajoutant 400 iL d'acide thioglycolique dans 4.96 mL de méthanol contenant de l'acide chlorhydrique à 0,2 mol/L.

Dans des tubes à essai, 2 mL de la suspension A et 2 mL de la solution B sont mélangés. Le tube est scellé et le mélange réactionnel est chauffé à 90 °C pendant 6 min.

• Les analyses UPLC-ESI/MS

Le système de chromatographie en phase liquide est un Acquity UPLC (Waters, Milford, MA) équipé d'un détecteur à barrette de diodes. La colonne (HSS 100x2 T3, 1 mm, 1,8 mm) est un Nucléosil 120-3 endcapped C18 (Macherey-Nagel, Suède). Le débit est de 0,55 mL.min-1 , et les conditions de gradient sont les suivantes : solvant A (H ₂ 0/HCOOH, 99/1 , v / v) ; solvant B (CH ₃ CN/H ₂ 0/HCOOH, 80/19/1 , v / v / v); conditions initiales 0,1 % de B; 0-5 min, 40 % de B linéaire; 5-7min, 99 % de B linéaire; 7- 8min, 99 % de B et 8-9 min, 0,1 % de B linéaire.

Les analyses MS ont été réalisées sur un spectromètre de masse AmaZon X ESI Trap (Bruker Daltonics, Bremen, Allemagne). Dans la source, la pression du nébuliseur est de 44 psi, la température du gaz sec a été fixée à 200 °C avec un débit de 12 L.min-1 et la tension capillaire a été mise à 4,5kV. Les spectres de masse ont été acquis sur un intervalle de masse de 70-2 000 Da dans le mode d'ionisation positive. La vitesse d'acquisition du spectre de masse a été fixée à 8,1 m/z.min-1.

D. Méthode de quantification en tanins présents dans les différentes fractions L'analyse et la quantification des tanins sont réalisées après une étape de dépolymérisation.

La réaction de dépolymérisation des tanins est une méthode analytique de routine. Le principe de cette méthode repose sur la rupture acido-catalysée des liaisons inter-monomériques. La rupture de ces liaisons se fait de manière hétérolytique de sorte que les unités d'extension sont libérées sous forme de carbocations, piégés extemporanément par le nucléophile (dans ce travail l'ester méthylique de l'acide thioglycolique) présent en large excès dans le milieu. Par conséquent, la distinction entre unités d'extension (qui sont détectées sous forme de dérivés thioethers) et unités terminales (qui sont libérées telles quelles, sans modification) pennet d'estimer le degré de polymérisation moyen des polymères présents dans la fraction. Cette réaction de dépolymérisation peut se faire sur des tanins, préalablement extraits du végétal ou d'un produit transformé issu du végétal comme elle peut se faire sur la matière végétale directement, en l'occurrence l'écorce.

Sur les cinq fractions F0, Fl, F2, F3 et F4 étudiées, la réaction de dépolymérisation a été effectuée directement sur la poudre. Elle a été réalisée dans des tubes scellés, avec du méthanol acidifié (0.2N avec du HCl) et porté à 90 °C en présence d'acide thioglycolique (qui est converti en ester méthylique lors de la préparation de la solution du réactif) comme agent nucléophile. E. Résultats d'analyse des fractions de particules d'écorce obtenues selon le procédé

A l'issue des opérations de fractionnement par voie sèche, quatre fractions, désignées Fl à F4, ont été collectées :

- Fraction Fl : particules retenues sur le tamis de 1 mm

- Fraction F2 : particules retenues sur le tamis de 0.56 mm

- Fraction F3 : particules retenues sur le tamis de 0.16 mm

- Fraction F4 : particules passant à travers les 3 tamis

La fraction désignée F0 est la fraction récupérée après broyage et avant tamisage.

Les fractions récoltées ont été pesées et le pourcentage massique de chaque fraction est représenté sur la Figure 1.

Toutes les analyses ont été effectuées en triplicata afin d'estimer l'intervalle d'incertitude de la mesure. Les résultats d'analyse et de quantification par UPLC-MS sont regroupés dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 : teneur en tanins et en taxifoline dans les fractions FO à F4.

Les résultats du Tableau 1 montrent que les écorces de pin Douglas contiennent 2,6 % de taxifoline. De plus, la mise en œuvre du procédé selon l'invention a permis d'isoler la majeure partie (environ 50 %),de la quantité totale de taxifoline contenue dans les écorces, laquelle est contenue dans la fraction Fl .

Les résultats du Tableau 1 montrent aussi que les tanins condensés sont localisés dans la fraction F4. Ainsi, le procédé selon l'invention peut également être le moyen d'extraire les tanins condensés qui peuvent être utilisés, notamment, comme précurseurs de résines époxy à base d'un matériau naturel.

L'ensemble de ces résultats montrent que le procédé selon l'invention permet d'obtenir simultanément (i) une fraction de particules d'écorce de conifère, spécifiquement de pin Douglas, enrichie en dihydroquercétine et (ii) une fraction de particules d'écorce de conifère, spécifiquement de pin Douglas, enrichie en tanins.

Les observations réalisées à l'œil nu sur les différentes fractions, ont mis en évidence que les différentes fractions (Fl à F4) sont constituées de particules d'écorces de couleurs et de constitutions différentes laissant supposer une origine histologique différente. La fraction Fl est notamment constituée de trois populations de particules :

- Fia, fibreuse, de couleur claire,

- Flb solide, de couleur marron,

- Fi e solide, de couleur plus claire.

Une analyse UPLC-MS, après dépolymérisation, de ces trois sous-fractions révèlent que la sous-fraction Fie est la plus riche en taxifoline (tableau 2). Tableau 2 : teneur en tanins et taxifoline dans les fractions Fia à Fi e.

Exemple 2 : Reproductibilité du procédé d'obtention d'une composition enrichie en dihydroquercétine et d'une composition enrichie en tanins.

Le procédé décrit à l'exemple 1 a été reproduit, sur des écorces de pin Douglas.

Les écorces de pin ont été broyées sur un broyeur à couteaux puis tamisées sur la série de tamis précédemment sélectionnés (tamis 1 mm, 0.56 mm, 0.16 mm). Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 3.

Tableau 3 : Comparaison des rendements et teneur en tanins et taxifoline obtenus lors des essais réalisés à l'exemple 1 et dans le présent exemple 2.

Les résultats du Tableau 3 mettent en évidence des différences de rendement assez importantes sur les deux séries d'essais, cette différence pouvant être expliquée par des différences de certaines conditions opératoires distinctes des caractéristiques principales du procédé de l'invention, en particulier les conditions d'alimentation du dispositif broyeur. Ce problème technique a été résolu par la mise en place d'un système automatique régulé d'alimentation du dispositif broyeur.

Exemple 3 : Mise en œuyre du procédé avec une étape de broyage réalisée avec un dispositif broyeur à boulets

Les échantillons issus du broyage à couteaux sur la grille de 6 mm, fraction F0, ont été soumises à une seconde étape de broyage au sein d'un broyeur à boulet de type Faure, dans une jarre de 5 L. 1 kg de copeaux séchés d'écorce de pin a été introduit avec 2 kg de boulets (1/3 de boulets de diamètre 1,2 cm, 1/3 de boulets de diamètre 1 ,6 cm et 1/3 de boulets de diamètre 2,6 cm) avec une vitesse de rotation de 120 rpm.

Des prélèvements ont été effectués au bout de 75 min et 12 h de broyage et ont été tamisées sur les grilles de 1 mm, 0,56 mm et 0,16 mm.

Les teneurs en taxifoline et en tanins ont été déterminées dans la fraction de particules de taille supérieure 1 mm et dans la fraction de particules de taille inférieure à 0,16 mm, présentant les plus fortes teneurs respectivement en taxifoline et en tanins (Tableau 4).

Tableau 4 : Rendement et teneur en taxifoline obtenus lors de la purification par le broyage à boulet et le tamisage.

Les résultats de ces essais mettent en évidence une très forte concentration de la taxifoline dans la fraction de particules de taille supérieure à 1 mm, ce qui a permis d'isoler plus de 80 % de la taxifoline des phénols totaux dans le cas de 12 h de broyage. Ce résultat montre qu'il est possible, par un procédé facile à mettre en œuvre et peu coûteux, d'obtenir des produits finaux de très grande pureté en taxifoline ou en tanins.

Exemple 4 : Procédé d'obtention d'une composition enrichie en tanins.

Le procédé décrit à l'exemple 1 a été reproduit sur des écorces de pin maritime commerciales.

L'étape de broyage a conduit à la fraction FO-M dont le tamisage a donné lieu à 4 fractions: Fl-M, F2-M, F3-M et F4-M.

Comme indiqué en figure 1 , les fractions Fl à F4 sont caractérisées par les tailles de particules suivantes :

- Fl : taille de particule supérieure à 1 mm

- F2 :taille de particule inférieure à 1 mm et supérieure à 0,56 mm

- F3 : taille de particule inférieure à 0,56 mm et supérieure à 0,16 mm

- F4 : taille de particule inférieure à 0,16 mm.

Les teneurs en tanins et taxifoline des 5 fractions citées ci-dessus sont présentées dans le tableau 5.

Tableau 5 : Composition phénolique des fractions générées après broyage et tamisage des écorces de pin maritime.

Rendement

tanins +

de chacune Tanins taxifoline %

des % %

Fraction taxifoline mg/g

fractions mg/g tanins+

tanins taxifoline d'écorce

mg/g d'écorce taxifoline

%

FO-M 100% 38,70669 38,46849 0,23819 3.87 3.85 0.02

Fl-M 40,4% 30,24864 29,96348 0,28515 3.02 3.00 0.02

F2-M 27,1% 28,50223 28,24776 0,25447 2.85 2.82 0.03

F3-M 20,8% 41 ,04847 40,72690 0,32156 4.10 4.07 0.03

F4-M 1 1 ,7% 80,91985 80,57130 0,34854 8.09 8.05 0.04 Le pin maritime est moins riche en composés phénoliques que le pin Douglas. De plus, contrairement au pin Douglas, la quantité de taxifoline dans le pin maritime est plus réduite.

En revanche, la fraction F4-M qui contient les particules les plus fines (< 0.16 μηι) est substantiellement enrichie en tanins (rendement = 11 ,7%).